Name: Een eenvoudige en snelle protocol bij niet-enzymatisch distantiëren Verse menselijke weefsels voor de Analyse van Infiltrating Lymfocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Leer een snelle niet-enzymatische methode om vers menselijk weefsel te dissociëren voor kwalitatieve en kwantitatieve analyse van CD45+ lymfocyten. Deze techniek behoudt de oorspronkelijke toestand van de cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies fromthe Belgisch Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FNRS), Les Amis de l&#39;Institut Bordet, FNRS-Opération Televie, Plan Cancer van België, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds JC Heuson en Fonds Barsy.

OPMERKING: Alle specimens verkregen werden met behulp van een protocol dat door de Medisch Ethische Commissie van het Instituut Jules Bordet goedgekeurd met schriftelijke toestemming verkregen van elke patiënt. 1. Bereiding van het weefselhomogenaat <ol><li> Ontleden gereseceerde weefsels (maligne en normaal weefsel weggesneden uit de operatiekamer) zijn in de pathologie lab door opgeleid personeel voor onmiddellijke pickup. Tumor, NANT (die het verst van de tumor mogelijk) en normaal weefsel fragmenten worden routinematig verwerkt binnen 1-3 uur van chirurgische excisie in een BSL2 laboratorium onder toepassing van standaard biologische veiligheid procedures voor menselijke weefsels. Een stroomschema van het protocol is geïllustreerd in figuur 1. </li><li> Weeg alle weefselfragmenten (normaal, NANT en tumor) en meet de lengte, breedte en hoogte (lengte x breedte x hoogte). Dit is een belangrijke stap voor de verdere normalisatie van cel subpopulaties, geëxtraheerd RNA, etc. NOTE: Het bereik van de steekproef is 100 tot 10.000 mm 3 met geen vet, indien mogelijk. </li><li> Imprint de tumor fragment op een glasplaatje voor H &amp; E kleuring om te controleren of het weefsel is eigenlijk een deel van de tumor. <ol><li> Doe dit door het indrukken van een glazen microscoop dia op de tumor fragment en het toepassen van lichte druk met de vingers voor een paar seconden. </li><li> Bevestig de dia met isopropanol gedurende 2 min gevolgd door een wasstap met water. Tegenkleuring het weefsel gedurende 30 seconden met Mayer&#39;s hematoxyline. </li><li> Was de dia in zes baden van water. Vlekken in Phloxine B 2% gedurende 15 sec. </li><li> Wassen in een bad van water, gevolgd door vier baden van isopropanol en afwerking met een bad van water. </li><li> Incubeer in isopropanol gedurende 1 min en afvoer. Duidelijk in twee baden van xyleen. </li><li> Monteer met xyleen op basis van montage medium. Onderzoek voor tumor cellulariteit (figuur 2). OPMERKING: Hoofdzakelijk, tumorcellen vasthouden aan de bedrukte slide - de stromale, lymfoïde of adipose cellen zelden blijven, waardoor ruimten tussen de tumorcellen (figuur 2). </li></ol></li><li> Plaats het weefsel fragment in een kleine kweekschaal die 1 ml chemisch gedefinieerd serumvrij hematopoietische celmedium (hierna gemiddeld) bij kamertemperatuur en snijd het in kleine stukjes (~ 1-2 mm 2) met een steriele scalpel. </li><li> Transfer alles (weefselfragmenten + gemiddeld) om een ​​mechanische dissociator C buis. </li><li> Spoel het petrischaaltje scalpel met 2 ml medium met behulp van een Pasteur pipet en voeg deze aan de C buis (volume medium voor dissociatie = 3 ml). </li><li> Gebruik het mechanische dissociator programma A.01 voor C buizen (de meest zachtaardige programma) om het weefsel fragmenten homogeniseren in een enkele celsuspensie. Plaats de C buis in het apparaat en tweemaal start het programma in elkaar (een cyclus = 25 sec). OPMERKING: Deze homogenisering procedure is vastgesteld en gevalideerd voor menselijke borstweefsel, andere tumof of weefsel typen kan nodig zijn om een ​​ander programma te gebruiken en moet eerst worden getest. </li><li> Verwijder de C buis uit het apparaat en giet het homogenaat direct in een 40 micrometer cel zeef gezeten op een 50 ml buis. Met dezelfde Pasteur pipet als in stap 1.6, overdracht vloeistof die in de C buis naar cel zeef. </li><li> Breng de gefilterde vloeistof in een buis van 15 ml met behulp van een 1 ml micropipet tip. Tijdelijk houden de cel zeef en haar 50 ml buis. </li><li> Spoel de C buis met een extra 3 ml medium en breng dit opnieuw met dezelfde Pasteur pipet als in stap 1.6, de cel zeef nog gezeten op de 50 ml buis. Knijp een maximumbedrag van de resterende vloeistof opgesloten in de unhomogenized weefsel in de 50 ml buis door het voorzichtig bewegen rond de zeef met een schone Pasteur pipet of 1 ml tip die vervolgens wordt weggegooid om te voorkomen dat besmetting van het eluaat. </li><li> Plaats de cel zeef ondersteboven op thij oorspronkelijk C buis en spoel met 3 ml medium zodat de unhomogenized weefsel valt terug in de C buis. </li><li> Opnieuw homogeniseren zoals in stap 1.7 twee cycli van het A.01 programma. </li><li> Giet deze tweede homogenaat door de cel zeef gezeten op de 50 ml tube, spoel de C buis opnieuw met 3 ml medium (zoals in stap 1.10) en breng met het Pasteur pipet om de cel zeef gezeten op de 50 ml buis weer knijpen een maximum hoeveelheid vloeistof uit de resterende bindweefsel opgesloten in de cel zeef. </li><li> Op dit moment, een volume van ~ 2,5 ml in de 15 ml buis ~ 9 ml in de 50 ml buis. </li></ol> 2. Scheiding van de Tissue supernatant en Cellen <ol><li> Centrifugeer de homogenaten in de 15 ml en 50 ml buisjes gedurende 15 min bij 600 xg bij kamertemperatuur. </li><li> Decanteer de SN van de 15 ml buis in een schone buis en tijdelijk bewaren bij 4 ° C. Dit supernatant = primaire tumor, NANT of normale tissue SN (eindvolume 2,5 ml) wordt vervolgens toegelicht en in porties verdeeld voor opslag bij -80 ° C voor latere analyse (zie hieronder). </li><li> Verwijder het supernatant van de 50 ml buis. </li><li> Voorzichtig mengen zowel celpellets in een eindvolume van 1 ml medium. In het kort, eerst voorzichtig breken de celpellet in beide buizen (de buis te tikken op een hard oppervlak). Resuspendeer de losse cel pellet in 50 ml met 500 pl medium en breng deze celsuspensie aan de 15 ml buis de tweede pellet te resuspenderen. Herhaal deze stap een keer met de tweede 500 ul medium voor een maximaal herstel van de cellen. </li><li> Breng 10 pl van de celsuspensie aan een buisje, meng met 10 ui trypan blauw (verdunning 1: 1) en tel het aantal levensvatbare cellen met een hemocytometer. OPMERKING: Op dit punt een fractie van de celsuspensie kan ook worden geanalyseerd door flow cytometrie celgrootte, granulariteit beoordelen en desgewenst een beperkt aantal subpopulatie markers voor meer precise evaluatie van de relatieve celverdeling in het homogenaat voor uitgebreide analyse en experimenten. Alle analyses door flowcytometrie nemen CD45 etikettering voor normalisering van de subpopulaties. </li><li> Pellet de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. De cellen van de tumor, NANT of normaal weefsel zijn nu klaar voor verdere zuivering of analyse. Deze extra stappen zijn best wanneer uitgevoerd op dezelfde dag als de operatie. OPMERKING: Voor flowcytometrische analyse maar niet celsortering de resterende rode bloedcellen dienen na antilichaamidentificatie worden gelyseerd door toevoeging van 0,4 ml van rode bloedcellen lysisbuffer aan de celpellet, onmiddellijk vortexen 1 sec en het incuberen van ten minste 10 minuten bij kamertemperatuur temperatuur (beschermd tegen licht) voor de analyse. </li></ol> 3. Verduidelijking van de Tissue Supernatant <ol><li> Centrifugeer de buisjes van 1,5 ml met weefsel SN bij 15.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder voorzichtig tHij vloeistof zonder te raken of de pellet te verstoren. Over te dragen aan een schone buis (of buizen), afhankelijk van het aantal en de omvang van de porties gewenst. </li><li> Bewaar het supernatant bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. </li></ol> 4. Patiënt Blood <ol><li> Verzamel een bloedmonster uit elke patiënt een controle door venapunctie in gehepariniseerde buizen de dag vóór de operatie. Centrifugeer het bloed bij 400 xg gedurende 10 min bij 20 ° C met de rem van het plasma en een bufferlaag verkrijgen. </li><li> Verwijder het plasma en verduidelijkt door centrifugatie bij 10.000 xg gedurende 15 min bij 20 ° C. Aliquot en bewaar plasma bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. Verdun de buffy coat in middelgrote </li><li> Scheid de mononucleaire cellen met behulp van standaard Ficoll-Hypaque centrifugatie voor onmiddellijke analyse subpopulatie isolatie, DNA / RNA / eiwit-extractie of cryopreservatie. </li></ol> 5. flowcytometrie <ol><li> Etiket cellen volgens de fabricageinstructies r&#39;s bij 4 ° C, beschermd tegen licht. Lyse rode bloedcellen in celsuspensies van weefselfragmenten na antilichaamidentificatie door toevoeging van 0,4 ml lysis buffer op de celpellet. </li><li> Vortex onmiddellijk gedurende 1 seconde en incubeer ten minste 10 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Steek de gelabelde cellen in een flowcytometer voor gegevensverzameling zonder te wassen. </li></ol>

<ol><li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncology+meets+immunology%3A+the+cancer-immunity+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle.</a> Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+%27elite+hacker%27%3A+breast+tumors+exploit+the+normal+microenvironment+program+to+instruct+their+progression+and+biological+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment program to instruct their progression and biological diversity.</a> Cell Adh Migr. 6 (3), 236-248 (2012).</li>
<li>Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+adaptive+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment.</a> Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).</li>
<li>Quezada, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+tumor+infiltration+by+activated+T+effector+cells+restricts+the+therapeutic+activity+of+regulatory+T+cell+depletion+against+established+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Limited tumor infiltration by activated T effector cells restricts the therapeutic activity of regulatory T cell depletion against established melanoma.</a> J Exp Med. 205 (9), 2125-2138 (2008).</li>
<li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+and+functional+analysis+of+human+tumor+immune+infiltration+after+mechanical+and+enzymatic+disaggregation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation.</a> J Immunol Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).</li>
<li>McCauley, H. A., Guasch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+orthotopic+transplantation+of+epithelial+tumors+in+single-cell+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial orthotopic transplantation of epithelial tumors in single-cell suspension.</a> Methods Mol Biol. 1035, 231-245 (2013).</li>
<li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+cells+obtained+from+the+blood+but+not+from+the+tumor+can+suppress+T-cell+proliferation+in+patients+with+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Myeloid cells obtained from the blood but not from the tumor can suppress T-cell proliferation in patients with melanoma.</a> Clin Cancer Res. 18 (19), 5212-5223 (2012).</li>
<li>Zirakzadeh, A. A., Marits, P., Sherif, A., Winqvist, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+B+cell+characterization+in+blood%2C+lymph+nodes%2C+and+tumors+from+patients+with+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multiplex B cell characterization in blood, lymph nodes, and tumors from patients with malignancies.</a> J Immunol. 190 (11), 5847-5855 (2013).</li>
<li>Gu-Trantien, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29+follicular+helper+T+cell+infiltration+predicts+breast+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival.</a> J Clin Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013).</li>
<li>Buisseret, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+Infiltrating+Breast+Cancer+%3A+Density%2C+Composition+And+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes Infiltrating Breast Cancer : Density, Composition And Organization.</a> Annals of Oncology. 25 (1), 17(2014).</li>
<li>Garaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+B+Cells+Infiltrating+Human+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Characterization of B Cells Infiltrating Human Breast Cancer.</a> Annals of Oncology. 25 (1), 18(2014).</li>
<li>Gu-Trantien, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cxcl13-Producing+Follicular+Helper+T+Cells+In+Human+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Cxcl13-Producing Follicular Helper T Cells In Human Breast Cancer.</a> Annals of Oncology. 25 (1), 17(2014).</li>
<li>Yee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+endogenous+T+cells+for+adoptive+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The use of endogenous T cells for adoptive transfer.</a> Immunol Rev. 257 (1), 250-263 (2014).</li>
<li>Butler, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+of+human+CD8%2B+T+cells+using+autologous+CD4%2B+T+cell+help%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help.</a> PLoS One. 7 (1), 30229(2012).</li>
<li>Ye, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+artificial+antigen+presenting+cells+facilitate+direct+and+efficient+expansion+of+tumor+infiltrating+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes.</a> J Transl Med. 9, 131(2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict bestaat.

Deze studie beschrijft een geoptimaliseerde werkwijze voor de snelle bereiding van normaal en kwaadaardig borstweefsel homogenaten zonder enzymatische digestie voor daaropvolgende celsortering, extractie, cryopreservatie en / of fenotypische analyse van CD45 + subpopulaties. Het doel van deze experimentele aanpak is om beelden van de TIL die nauw geven hun in vivo staat en ze te vergelijken met normale weefsels met een minimum aan manipulatie van de weefsels vers van de operatiekamer te produceren. T...

De tumormicro-omgeving bestaat uit verschillende celtypen, waarbij talrijke studies aantonen dat ze allemaal een onderscheidende en belangrijke rol spelen in tumorigenesis1,2. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, infiltrerende immuuncellen, stromale cellen, endotheelcellen en tumorcellen3. Ex vivo studies van tumorinfiltrerende lymfocyten (TIL; CD45+ cellen of leukocyten, die voornamelijk lymfocyten zijn in borsttumoren) uit verse menselijke weefselmonsters worden bemoeilijkt door hun lage frequentie, de kleine monstergroottes die vaak beschikbaar zijn voor onderzoek en het potentieel voor verlies van levensvatbaarheid tijdens extractie. Omdat immuuncellen die tumoren infiltreren meestal aanwezig zijn als passagiers in plaats van permanente bewoners, zijn ze over het algemeen gemakkelijker te loslaten uit de weefselmatrix.
Het dissociëren van tumorweefsel terwijl de cellulaire integriteit behouden blijft, is technisch uitdagend en is traditioneel uitgevoerd met behulp van een combinatie van mechanische en enzymatische stappen om enkele celsuspensies te bereiden4-8. Deze aanpak omvat lange incubatieperioden en gaat gepaard met een significante vermindering van de celviabiliteit evenals het verlies van celoppervlaktereceptoren door enzymatische splitsing. Hoogwaardige flowcytometrische studies die TIL in de tumormicro-omgeving karakteriseren, evenals schone zuiveringen van CD45+ subpopulaties door middel van flowcytometrie of antilichaam-gecoate kralen, zijn moeilijker te bereiken uit enzym-gedigesteerd tumorweefsel. Bovendien is het supernatant (SN) van het resulterende tumorhomogenaat niet geschikt voor verdere analyse, inclusief kwantificering van gesecreteerde eiwitten (cytokinen, chemokinen, immunoglobulinen of tumorantigenen) of experimentele behandeling van normale cellen, vanwege het potentieel voor eiwitdegradatie in de enzymatische digests.
In onze zoektocht naar een methode om enkele celhomogenaten uit borstweefsels voor te bereiden [inclusief tumor, niet-aangrenzende niet-tumor (NANT) en normale (van mammaverkleiningen) borstweefsels] zonder enzymatische vertering, hebben we een verscheidenheid aan mechanische homogenisatietechnieken getest. Homogenaten bereid met behulp van een mechanische dissociator hadden een verhoogde celviabiliteit (2-voudig) en totale celherstel (2-voudig) terwijl de expressie van oppervlaktereceptoren behouden bleef. Enzymatische vertering van het resterende onoplosbare materiaal herstelde geen extra CD45+ cellen, wat suggereert dat ze allemaal vrijgelaten waren in de initiële homogenisatie. Dus, deze snelle en eenvoudige aanpak maakt zowel kwalitatieve als kwantitatieve beoordeling van de CD45+ subpopulaties die aanwezig zijn in verschillende normale en kwaadaardige menselijke weefsels mogelijk. Een extra voordeel van deze aanpak is dat het SN van de initiële homogenisatie (primaire weefsel-SN) kan worden verzameld en opgeslagen voor verdere analyse of experimenten.

<table><tbody><tr><td>GentleMacs Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>BD Medimachine is enigszins gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>of andere standaard tafelcentrifuge</td></tr><tr><td>Centrifuge 5417 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>of andere standaard microcentrifuge</td></tr><tr><td>Esco Class II A2 Biosafety Cabinet</td><td>ESCO global</td><td></td><td>of andere standaard BSL2-afzuigkap</td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Nikon eclipse TS100</td><td></td><td>of andere microscoop compatibel voor een hematocytometers</td></tr><tr><td>B&uuml;rker Chamber</td><td>Marienfield&nbsp;</td><td>640210</td><td>of andere standaard hematocytometers</td></tr><tr><td>Navios Flow Cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>of andere flowcytometer (8-10 kleuren aanbevolen)</td></tr><tr><td>GentleMacs C-Tube</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-344</td><td>BD Medimachine gebruikt Filcon</td></tr><tr><td>Cell Culture Dish</td><td>Sarstedt</td><td>72,710</td><td>of ander niet-pyrogeen kunststof</td></tr><tr><td>Disposable Scalpel</td><td>Swann-Morton</td><td>0510</td><td>of standaard eenmalig steriele scalpel</td></tr><tr><td>BD Cell Strainer 40 &micro;m</td><td>Becton Dickinson</td><td>734-0002</td><td>of ander niet-pyrogeen kunststof</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube 50 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352070</td><td>of ander niet-pyrogeen kunststof</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube 15 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352097</td><td>of ander niet-pyrogeen kunststof</td></tr><tr><td>BD FACS Tube 5 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352008</td><td>of ander niet-pyrogeen kunststof</td></tr><tr><td>Sterile Pasteur Pipette 5 ml</td><td>VWR</td><td>612-1685</td><td>of ander niet-pyrogeen kunststof</td></tr><tr><td>Microfuge Tube 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>7805-00</td><td>of ander niet-pyrogeen kunststof</td></tr><tr><td>X-Vivo 20</td><td>Lonza</td><td>BE04-448Q</td><td>serumvrij medium aanbevolen</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>standaard fysiologische PBS</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>VWR</td><td>17942E</td><td>of andere vitale kleurstof</td></tr><tr><td>VersaLyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>A09777</td><td>voor flowcytometrie-experimenten</td></tr><tr><td>Fixable viability Dye eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14</td><td>voor flowcytometrie-experimenten</td></tr><tr><td>anti-CD3 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>345763</td><td>voor flowcytometrie-experimenten</td></tr><tr><td>anti-CD3 Vio Blue</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-363</td><td>voor flowcytometrie-experimenten</td></tr><tr><td>anti-CD4 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>345769</td><td>voor flowcytometrie-experimenten</td></tr><tr><td>anti-CD4 APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-232</td><td>voor flowcytometrie-experimenten</td></tr><tr><td>anti-CD8 ECD</td><td>Beckman Coulter</td><td>737659</td><td>voor flowcytometrie-experimenten</td></tr><tr><td>anti-CD8 PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>345774</td><td>voor flowcytometrie-experimenten</td></tr><tr><td>anti-CD19 APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-643</td><td>voor flowcytometrie-experimenten</td></tr><tr><td>anti-CD45 VioGreen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-906</td><td>voor flowcytometrie-experimenten</td></tr></tbody></table>

een eenvoudige en snelle protocol bij niet-enzymatisch distantiëren verse menselijke weefsels voor de analyse van infiltrating lymfocyten

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

Het vermogen van maligne cellen aan het immuunsysteem, gekenmerkt door tumor ontsnappen van zowel aangeboren en adaptieve immuunreacties ontwijken nu aanvaard als een belangrijk kenmerk van kanker. Ons onderzoek op borstkanker richt zich op de actieve rol die tumor-infiltrerende lymfocyten spelen in tumorprogressie en prognose van de patiënt. Naar dit doel hebben we een methode voor de snelle isolatie van intacte lymfoïde cellen van normale en abnormale weefsels in een poging om hen nabij hun natieve toestand te evalueren. Homogenaten bereid met een mechanische dissociator geven beide verhoogde levensvatbaarheid en cel herstel met behoud van oppervlakte receptor expressie in vergelijking met enzym-verteerd weefsels. Bovendien, enzymatische digestie van de overblijvende onoplosbare materiaal geen bijkomende CD45 + cellen aangeeft dat kwantitatieve en kwalitatieve metingen in de primaire homogenaat waarschijnlijke gezondheidstoestand van infiltrerende subpopulaties in het weefsel Fragm herstellenent. De lymfoïde cellen in deze homogenaten kunnen gemakkelijk worden gekarakteriseerd met behulp van immunologische (fenotype, proliferatie, etc.) en moleculaire (DNA, RNA en / of eiwit) nadert. CD45 + cellen kunnen ook worden gebruikt voor subpopulatie zuivering, in vitro uitbreiding of cryopreservatie. Een bijkomend voordeel van deze benadering is dat het primaire weefsel supernatant van de homogenaten worden gebruikt om te karakteriseren en te vergelijken cytokinen, chemokinen, immunoglobulinen en antigenen aanwezig in normale en maligne weefsels. Dit protocol functioneert uitstekend voor menselijk borstweefsel en dienen voor een breed scala van normale en abnormale weefsels.

Enzymatische digestie van weefsel fragmenten met hetzij commercieel verkrijgbaar weefsel dissociatie oplossingen of diverse laboratorium mengsels van collagenase, DNase en / of hyaluronidase remmers, splitsen diverse receptoren op het celoppervlak. Onze studies, richtte zich op CD4 + T-cellen infiltrerende borsttumoren, werden snel gepresenteerd met een groot technisch probleem door splitsing van het oppervlak CD4 receptoren middels standaard enzymatische digestie protocollen 4-8. We testten versch...

Dit protocol beschrijft de snelle niet-enzymatische dissociatie van verse menselijke weefselfragmenten voor kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van CD45+ cellen (lymfocyten/leukocyten) aanwezig in verschillende normale en kwaadaardige menselijke weefsels. Bovendien kan het supernatant verkregen uit het primaire weefsel homogenaat worden verzameld en bewaard voor verdere analyse of experimenten.

Een eenvoudige en snelle protocol bij niet-enzymatisch distantiëren Verse menselijke weefsels voor de Analyse van Infiltrating Lymfocyten

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Het algemene doel van deze procedure is om menselijke weefselfragmenten snel te homogeniseren tot een enkelcel-suspensie zonder enzymatische digestie, voor kwalitatieve en kwantitatieve analyse en de isolatie van specifieke lymfocyten-subpopulaties. Dit wordt bereikt door eerst een steriel scalpel te gebruiken om de weefselfragmenten in kleine stukjes te snijden. Vervolgens wordt de weefselsuspensie overgebracht naar een mechanische dissociatiebuis, waarin de fragmenten verder worden gehomogeniseerd tot een enkelcel-suspensie.De cellen worden vervolgens door middel van centrifugatie verzameld voor verdere analyse. Uiteindelijk kan flowcytometrie worden gebruikt om de infiltrerende lymfocyten en hun subpopulaties te analyseren. Mijn laboratorium heeft deze techniek ontwikkeld omdat we op zoek waren naar een methode om tumorinfiltrerende lymfocyten te visualiseren zonder hun natuurlijke staat drastisch te beïnvloeden.We wilden een methode waarbij we de cellen snel konden isoleren en konden analyseren in de staat waarin ze zich tijdens de operatie bevonden. Deze techniek is in ons laboratorium toegepast op meer dan 300 borsttumoren en normaal weefsel; ze is eenvoudig in gebruik en kan dagelijks worden ingezet. De techniek kan worden gebruikt voor het onderzoeken van prognostische markers, de respons op een behandeling en de klinische uitkomst op de lange termijn.Vandaag zal John Nicola Loic deze techniek demonstreren. Een technicus in mijn laboratorium. Begin met het wegen van het weefselmonster en meet vervolgens de lengte, breedte en hoogte van het weefsel. Breng het weefselfragment daarna over in een kleine Petrischaal met 1 mL van het geschikte, chemisch gedefinieerde serumvrije hematopoëtische celmedium, en gebruik een steriel scalpel om de monsters in kleine stukjes van 1 tot 2 mm² te snijden.Breng vervolgens de inhoud van de schaal over in een C-buis voor mechanische dissociatie en spoel de schaal en het scalpel af met twee milliliters medium. Voeg het spoelmiddel toe aan de C-buis en voer vervolgens twee keer achter elkaar het 0,01 mechanische dissociatieprogramma uit om de weefselfragmenten voorzichtig te homogeniseren tot een suspensie van enkelvoudige cellen. Giet na de tweede cyclus het homogenaat door een 40 micrometer cell strainer in een 50 milliliter conische buis.Gebruik vervolgens dezelfde pipet waarmee de Petri-schaal is gewassen om alle resterende vloeistof uit de C-buis in de celzeef over te brengen. Gebruik daarna een micropipet van 1 ml om de gefiltreerde vloeistof over te brengen naar een conische buis van 15 ml en spoel de C-buis met nog eens 3 ml medium. Breng dit spoelmiddel via de celzeef over naar de buis van 50 ml.Beweeg vervolgens het niet gehomogeniseerde weefsel voorzichtig met een schone tip van één milliliter over het zeefje om de maximale hoeveelheid resterende vloeistof die in het weefsel gevangen zit in de buis van 50 milliliter te persen. Plaats het celzeefje nu ondersteboven op de oorspronkelijke C-buis en spoel het zeefje af met nog eens drie milliliter medium, zodat het niet gehomogeniseerde weefsel terug in de C-buis valt. Homogeniseer het weefsel opnieuw gedurende nog twee cycli zoals zojuist gedemonstreerd, en giet vervolgens dit tweede homogenaat door het celzeefje.Spoel de C-buis opnieuw met nog eens drie milliliter medium. Filtreer vervolgens het supernatant door het zeefje en knijp de resterende vloeistof uit het weefsel, zoals zojuist gedemonstreerd. Op dit punt moet er een volume van ongeveer 2,5 milliliter enkelcel-suspensie aanwezig zijn in de 15 milliliter buis, en moet er ongeveer negen milliliter waarneembaar zijn in de 50 milliliter buis.Om het supernatant van het weefsel van de cellen te scheiden, worden beide buizen met homogenaat eerst 15 minuten gecentrifugeerd bij 600 Gs en kamertemperatuur. Schenk het supernatant uit de 15 milliliter buis over in een 1,5 milliliter buis en bewaar deze bij vier graden Celsius, en gooi het supernatant uit de 50 milliliter buis weg. Tik vervolgens elke buis voorzichtig tegen een hard oppervlak om de celpellets op te breken. Resuspendeer de losse celpellet in de 50 milliliter buis met 500 microliters medium en breng de cellen over naar de 15 milliliter buis om de tweede pellet te resuspenderen.Spoel de buis van 50 milliliter vervolgens met nog eens 500 microliters medium en breng het wasmiddel over naar de buis van 15 milliliter voor een maximale herwinning van de cellen. Tel het aantal levensvatbare cellen via trypaanblauw-uitsluiting en pellet vervolgens de celsuspensie. Centrifugeer tot slot het gereserveerde weefselsupernatant.Breng vervolgens voorzichtig het supernatant over naar ten minste één schone buis zonder de pellet aan te raken of te verstoren en bewaar dit bij -80 °C voor toekomstige downstream-analyses. In deze grafieken worden representatieve flowcytometrie-dotplots getoond van gedissocieerde tumorcelhomogenaten, gevolgd door labeling met specifieke antilichamen tegen leukocyten en epitheelcelmarkers zoals gedemonstreerd. Dit protocol beïnvloedt de levensvatbaarheid van de CD45-positieve cellen niet significant.Er is echter sprake van een aanzienlijk verlies aan levensvatbare EPAM-positieve cellen. Ondanks dit kunnen levensvatbare EPAM-positieve en CD 45-positieve subpopulaties op basis van hun grootte en structuur worden gescheiden in grote epitheliale tumorcellen, kleine epitheliale cellen, of grote en kleine CD 45-positieve cellen. Representatieve flowcytometrie dotplots van de belangrijkste tumorinfiltrerende subpopulaties worden hier getoond, waarbij de lymfocyten zijn gegated op de levensvatbaarheid van de CD 45-positieve cellen.Ten slotte kan de cytokine-expressie of de totale hoeveelheid immunoglobulinen in het supernatant van borstkanker worden vergeleken met het supernatant van normaal borstweefsel, wat, zoals aangetoond in dit representatieve experiment, verhogingen in beide typen eiwitten onthult die geassocieerd zijn met het tumorweefsel. Tijdens deze procedure is het belangrijk om snel en schoon te werken en de maximale hoeveelheid materiaal bij elke stap van de procedure terug te winnen om een voldoende aantal cellen te verkrijgen voor uw eindanalyse.

a-simple-rapid-protocol-to-non-enzymatically-dissociate-fresh-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze video beschrijft de niet-enzymatische dissociatie van vers menselijk weefsel om levensvatbare cellen te verkrijgen. De techniek wordt gebruikt voor kwalitatieve en kwantitatieve analyse van CD45 positieve cellen (lymfocyten/leukocyten) aanwezig in verschillende normale en kwaadaardige menselijke weefsels.

Mechanische dissociatie: een methode om levensvatbare cellen uit een weefsel te verkrijgen

Dit protocol detailleert een methode voor het isoleren van antigen-presenterende cellen uit humane thymus via verschillende stappen enzymatische afbraak van het weefsel, gevolgd door centrifugatie van de enkele celsuspensie en tenslotte magnetische en / of FACS sorteren van celpopulaties plaats.

Isolatie van myeloïde dendritische cellen en epitheelcellen van Human Thymus

Statische adhesietest is een krachtig instrument dat kan worden gebruikt om het model van interacties tussen T-lymfocyten en andere celtypes. Interacties worden gegenereerd door het injecteren gelabelde T-cellen in putjes bekleed met adhesiemoleculen, terwijl een plaatlezer wordt gebruikt om het aantal hechtende cellen te kwantificeren na seriële wasbeurten.

Statische Adhesie Assay voor de Studie van Integrine Activering in T-lymfocyten

Isolatie van lymfeklieronstcellen is een meervoudige procedure die enzymatische vertering en mechanische disaggregatie omvat om fibroblastische reticulaire cellen, lymfatische en bloed-endotheelcellen te verkrijgen. In de beschreven procedure wordt een korte vertering gecombineerd met geautomatiseerde mechanische disaggregatie om de degradatie van oppervlaktemarkeringen van vitale lymfeklersonstcellen te minimaliseren.

Isolatie van muizen lymfkliertest stromale cellen

We beschrijven een protocol om efficiënt huidresidente T-cellen te isoleren uit humane huidbiopsieën. Dit protocol levert voldoende aantallen vitale humane huidresidente lymfocyten op voor flowcytometrische analyse en ex vivo kweek.

Lymfocyt Isolatie van Human Skin voor Fenotypische Analyse en<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

Het doel van dit protocol is om lymfatische endotheelcellen voering de menselijke lymfatische misvorming cyste-achtige schepen en voorhuiden met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te isoleren. Latere cel kweken en uitbreiding van deze cellen maakt een nieuw niveau van experimentele verfijning voor genetische, proteomics, functioneel en celdifferentiatie studies.

Isolatie van menselijke lymfatische endotheelcellen door Multi-parameter fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting

Dit protocol beschrijft enzymatische vertering van muizenhuid in voedingsrijk medium, gevolgd door gradiëntscheiding om leukocyten te isoleren. De zo verkregen cellen kunnen voor verschillende downstream-toepassingen worden gebruikt. Dit is een effectieve, economische en verbeterde alternatief voor weefseldissociatiemachines en agressievere trypsine- en dispase-gebaseerde weefselverteringsprotocollen.

Isolatie van Infiltrating leukocyten uit Mouse huid met behulp van enzymatische Digest en Gradient Scheiding

Experimentele procedures voor de verdere winning van lymfatische weefsels voor het testen van lymfoïde dendritische cel activatie worden beschreven na behandeling van een immuniteitsverhoging nanomateriaal.

Immunostimulerende Agent evaluatie: Lymfoïde weefsel extractie en injectie Route-afhankelijke dendritische cel activeren

In dit protocol worden lymfocyten in de bovenste kamer van een transmigratiesysteem geplaatst, gescheiden van de onderste kamer door een poreus membraan. Chemokine wordt toegevoegd aan de onderste kamer, die actieve migratie langs een Chemokine gradiënt induceert. Na 48 h worden lymfocyten in beide kamers geteld tot transmigratiegekwantata.

Beoordeling van de lymfocyten migratie in een ex vivo-Transmigratiesysteem

Dit is een methode om baarmoederlymfecellen te isoleren van zowel zwangere als niet-zwangere muizen. Deze methode kan worden gebruikt voor meerdere downstream-toepassingen zoals FACS-fenotypering, celsortering, functionele assays, RNA-seq en proteomics. Het protocol hier laat zien hoe groep 1 uteriene aangeboren lymfoïde cellen kunnen worden gefenotypeerd door flowcytometrie.

Isolatie van aangeboren lymfoïde cellen van de baarmoeder voor analyse door flowcytometrie

Leer een snelle niet-enzymatische methode om vers menselijk weefsel te dissociëren voor kwalitatieve en kwantitatieve analyse van CD45+ lymfocyten. Deze techniek behoudt de oorspronkelijke toestand van de cellen.

Een eenvoudige en snelle protocol bij niet-enzymatisch distantiëren Verse menselijke weefsels voor de Analyse van Infiltrating Lymfocyten (Video) | JoVE Journal

Een eenvoudige en snelle protocol bij niet-enzymatisch distantiëren Verse menselijke weefsels voor de Analyse van Infiltrating Lymfocyten

Meer video's verkennen