Een eenvoudige en snelle protocol bij niet-enzymatisch distantiëren Verse menselijke weefsels voor de Analyse van Infiltrating Lymfocyten
6 december 2014
Dit protocol beschrijft de snelle niet-enzymatische dissociatie van verse menselijke weefselfragmenten voor kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van CD45+ cellen (lymfocyten/leukocyten) aanwezig in verschillende normale en kwaadaardige menselijke weefsels. Bovendien kan het supernatant verkregen uit het primaire weefsel homogenaat worden verzameld en bewaard voor verdere analyse of experimenten.
Het algemene doel van deze procedure is om menselijke weefselfragmenten snel te homogeniseren tot een enkele celsuspensie zonder enzymatische vertering voor kwalitatieve en kwantitatieve analyse en de isolatie van specifieke lymfocyt subpopulaties. Dit wordt bereikt door eerst een steriele scalpel te gebruiken om de weefselfragmenten in kleine stukken te snijden. Vervolgens wordt de weefselslurry overgebracht naar een mechanisch gedissocieerde buis waarna de fragmenten verder worden gehomogeniseerd tot een enkele celsuspensie.
De cellen worden vervolgens door centrifugatie verzameld voor downstream-analyse. Uiteindelijk kan flowcytometrie worden gebruikt om de infiltrerende lymfocyten, subpopulaties Aziaten te analyseren. Mijn laboratorium ontwikkelde deze techniek omdat we op zoek waren naar een manier waarop we tumorinfiltrerende lymfocyten konden bekijken zonder hun native toestand dramatisch te beïnvloeden.
We wilden iets waarmee we de cellen snel konden isoleren en analyseren zoals ze waren tijdens de operatie. Deze techniek is in ons laboratorium gebruikt op meer dan 300 borsttumoren en normaal weefsel en is gemakkelijk te gebruiken en kan dagelijks worden gebruikt. Het kan worden gebruikt om prognostische markers, respons op behandeling en langdurig klinisch resultaat te onderzoeken.
De demonstratie van deze techniek vandaag zal worden uitgevoerd door John Nicola Loic. Een technicus in mijn laboratorium Begin met het wegen van het weefselmonster en vervolgens het meten van de lengte, breedte en hoogte van het weefsel. Breng vervolgens het weefselfragment over in een kleine petrischaal bevattende één milliliter van het geschikte, chemisch gedefinieerde serumvrije hematopoietische celmedium, en gebruik een steriele scalpel om de monsters in kleine stukjes van een tot twee vierkante millimeter te snijden.
Breng vervolgens de inhoud van de schaal over in een mechanisch dissociatie-C-buis en spoel de schaal en scalpel met twee milliliter medium. Voeg het wasmiddel toe aan de C-buis en voer vervolgens het a 0,01 mechanische dissociatieprogramma twee keer achter elkaar uit om de weefselfragmenten voorzichtig te homogeniseren tot een enkele celsuspensie. Na de tweede cyclus, decanteer het homogenaat door een 40 micrometer celzeef in een 50 milliliter conische buis.
Gebruik vervolgens dezelfde pijp om de petrischaal te wassen om eventueel resterend vocht in de C-buis over te brengen naar de celzeef. Gebruik vervolgens een micropipet van één milliliter om het gefilterde vocht over te brengen naar een 15 milliliter conische buis en spoel de C-buis met nog eens drie milliliter medium. Breng dit wasmiddel door de celzeef over in de 50 milliliter buis.
Beweeg vervolgens voorzichtig het niet-gehomogeniseerde weefsel rond de zeef met een schone een milliliter tip om de maximale hoeveelheid restvocht dat in het weefsel is opgesloten in de 50 milliliter buis te persen. Plaats nu de celzeef ondersteboven op de originele C-buis en spoel de zeef met nog eens drie milliliter medium, zodat het niet-gehomogeniseerde weefsel terugvalt in de C-buis. Homogeniseer het weefsel opnieuw gedurende twee cycli zoals zojuist is gedemonstreerd en giet vervolgens dit tweede homogenaat door de zeef.
Spoel de C-buis opnieuw met nog eens drie milliliter medium. Filter vervolgens het supernatant door de zeef en pers het restvocht uit het weefsel zoals zojuist is gedemonstreerd. Op dit punt zou een volume van ongeveer 2,5 milliliter van een enkele celsuspensie in de 15 milliliter buis moeten zijn en ongeveer negen milliliter zou in de 50 milliliter buis moeten worden waargenomen.
Om het weefselsupernatant van de cellen te scheiden, centrifugeert u eerst beide buizen homogenaat gedurende 15 minuten bij 600 Gs en kamertemperatuur, decanteer het supernatant van de 15 milliliter buis in een 1,5 milliliter buis, plaats deze bij vier graden Celsius en gooi het supernatant van de 50 milliliter buis weg. Tik vervolgens zachtjes op elke buis op een hard oppervlak om elk van de celpelletten te breken. Resuspendeer de losse cellpellet in de 50 milliliter buis met 500 microliter medium en breng de cellen over naar de 15 milliliter buis om de tweede pellet te resuspenderen.
Spoel vervolgens de 50 milliliter buis met nog eens 500 microliter medium en breng het wasmiddel over naar de 15 milliliter buis voor maximale celherstel. Na het tellen van het aantal levensvatbare cellen door trian blauwe uitsluiting pellet de celsuspensie. Spin tenslotte het gereserveerde weefselsupernatant naar beneden.
Breng vervolgens voorzichtig het supernatant over naar ten minste één schone buis zonder het pellet aan te raken of te verstoren en bewaar het op negenentachtig graden Celsius voor toekomstige downstream-analyse. In deze grafieken worden representatieve flowcytometrie stipdiagrammen van gedissocieerde tumorcelhomogenaten, gevolgd door labeling met specifieke antilichamen tegen leukocyten en epitheelcelmarkers getoond zoals gedemonstreerd. Dit protocol verandert de levensvatbaarheid van de CD 45 positieve cellen niet significant.
Er is echter een aanzienlijk verlies aan levensvatbare EPAM positieve cellen. Ondanks dit kunnen levensvatbare EPAM positieve en CD 45 positieve subsets worden gescheiden op basis van hun grootte en structuur in grote epitheeltumorcellen, kleine epitheelcellen of grote en kleine CD 45 positieve cellen. Representatieve flowcytometrie stipdiagrammen van de belangrijkste tumorinfiltrerende subsets worden hier getoond met de lymfocyten gegat op de levensvatbaarheid van de CD 45 positieve cellen.
Ten slotte kan de cytokine-expressie of het totale immunoglobuline dat aanwezig is in borstkankersupernatant worden vergeleken met het supernatant van normaal borstweefsel, wat, zoals gedemonstreerd in dit representatieve experiment, toenames in beide soorten eiwitten geassocieerd met het tumorweefsel onthult. Terwijl deelnemer de procedure is, is het belangrijk om te onthouden om snel en schoon te werken en om de maximale hoeveelheid materiaal te herstellen bij elke stap van de procedure om een voldoende aantal cellen te verkrijgen voor uw eindpuntenanalyse.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor de snelle niet-enzymatische dissociatie van verse menselijke weefselfragmenten, waardoor de kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van CD45+ cellen, inclusief lymfocyten en leukocyten, mogelijk wordt. De techniek behoudt de natuurlijke toestand van de cellen, wat verdere analyse vergemakkelijkt.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- Het begrijpen van de immuuncelsamenstelling in menselijk weefsel is cruciaal voor verschillende onderzoekstoepassingen.
- Traditionele enzymatische methoden kunnen de natuurlijke toestand van cellen veranderen.
- Dit protocol streeft ernaar een niet-invasieve alternatief te bieden voor weefseldissociatie.
- Flowcytometrie wordt gebruikt voor het analyseren van specifieke lymfocytensubpopulaties.
Doel van het onderzoek
- Om een snelle methode te ontwikkelen voor het homogeniseren van menselijk weefsel in een enkele celsuspensie.
- Om kwalitatieve en kwantitatieve analyse van lymfocytpopulaties mogelijk te maken.
- Om de natuurlijke toestand van tumor-infiltrerende lymfocyten voor beeldvorming te behouden.
Gebruikte methoden
- Verse menselijke weefselfragmenten worden in kleine stukken gesneden met behulp van een steriele scalpel.
- De weefselslurry wordt overgebracht naar een mechanische dissociatiebuis voor verdere homogenisatie.
- Cellen worden verzameld door middel van centrifugatie voor downstream analyse.
- Flowcytometrie wordt gebruikt om de infiltrerende lymfocyten en hun subpopulaties te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- De methode genereert met succes een enkele celsuspensie uit menselijke weefselfragmenten.
- Kwalitatieve en kwantitatieve beoordelingen van CD45+ cellen kunnen effectief worden uitgevoerd.
- De techniek maakt het mogelijk de natuurlijke toestand van lymfocyten te behouden.
- Flowcytometrieresultaten tonen de haalbaarheid van het analyseren van specifieke lymfocytensubpopulaties aan.
Conclusies
- Deze niet-enzymatische dissociatiemethode is effectief voor het analyseren van menselijke weefsellymfocyten.
- Het protocol kan worden toegepast op verschillende normale en kwaadaardige weefsels.
- Toekomstige studies kunnen deze techniek gebruiken voor diepere inzichten in de dynamiek van immuuncellen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Rapid, non-enzymatic dissociation of fresh human tissues enables high-fidelity analysis of tumor-infiltrating lymphocytes, supporting immune-oncology discovery and translational research. This protocol preserves cell surface markers and viability, providing reliable quantitative and qualitative data for target validation and mechanistic de-risking. The approach enhances predictive confidence at the interface of early discovery and translational biomarker development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of immune cell populations within tumor microenvironments.
- Preserves native cell states for accurate phenotypic and functional analysis.
- Supports mechanistic de-risking by maintaining surface receptor expression.
- Facilitates robust target validation through quantitative lymphocyte profiling.
Screening & Assay Development
- Generates high-viability single-cell suspensions suitable for flow cytometry and molecular assays.
- Standardizes sample preparation, improving reproducibility across experiments.
- Provides quantitative outputs for downstream immunological and molecular screening.
- Enables reliable evaluation of immune cell subpopulations for assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by analyzing cells proximate to their in vivo state.
- Supports translational biomarker discovery through comparative analysis of normal and malignant tissues.
- Facilitates continuity from tissue acquisition to preclinical immune profiling.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on immune contexture data.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of tissue acquisition, immune profiling, and translational biomarker workflows, supporting early discovery through preclinical research.
- Discovery Biology: Provides high-integrity immune cell suspensions for hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cell preparations for immunophenotyping and molecular assays.
- Analytics: Enables robust measurement of lymphocyte subpopulations and soluble immune mediators.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by comparing immune profiles across tissue types.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable protocol applicable to diverse tissue sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune-oncology research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of tissue processing workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing reliable immune profiling data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunotherapy candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling and immunological assays.
- Needs access to mechanical dissociation instruments and flow cytometry platforms.
- Demands cross-team standardization for consistent sample processing.
- Adaptable to various tissue types with attention to tissue-specific characteristics.
- Cell yield and viability may vary depending on tissue composition and handling speed.
