Een eenvoudige en snelle protocol bij niet-enzymatisch distantiëren Verse menselijke weefsels voor de Analyse van Infiltrating Lymfocyten

Het algemene doel van deze procedure is om menselijke weefselfragmenten snel te homogeniseren tot een enkelcel-suspensie zonder enzymatische digestie, voor kwalitatieve en kwantitatieve analyse en de isolatie van specifieke lymfocyten-subpopulaties. Dit wordt bereikt door eerst een steriel scalpel te gebruiken om de weefselfragmenten in kleine stukjes te snijden. Vervolgens wordt de weefselsuspensie overgebracht naar een mechanische dissociatiebuis, waarin de fragmenten verder worden gehomogeniseerd tot een enkelcel-suspensie.

De cellen worden vervolgens door middel van centrifugatie verzameld voor verdere analyse. Uiteindelijk kan flowcytometrie worden gebruikt om de infiltrerende lymfocyten en hun subpopulaties te analyseren. Mijn laboratorium heeft deze techniek ontwikkeld omdat we op zoek waren naar een methode om tumorinfiltrerende lymfocyten te visualiseren zonder hun natuurlijke staat drastisch te beïnvloeden.

We wilden een methode waarbij we de cellen snel konden isoleren en konden analyseren in de staat waarin ze zich tijdens de operatie bevonden. Deze techniek is in ons laboratorium toegepast op meer dan 300 borsttumoren en normaal weefsel; ze is eenvoudig in gebruik en kan dagelijks worden ingezet. De techniek kan worden gebruikt voor het onderzoeken van prognostische markers, de respons op een behandeling en de klinische uitkomst op de lange termijn.

Vandaag zal John Nicola Loic deze techniek demonstreren. Een technicus in mijn laboratorium. Begin met het wegen van het weefselmonster en meet vervolgens de lengte, breedte en hoogte van het weefsel. Breng het weefselfragment daarna over in een kleine Petrischaal met 1 mL van het geschikte, chemisch gedefinieerde serumvrije hematopoëtische celmedium, en gebruik een steriel scalpel om de monsters in kleine stukjes van 1 tot 2 mm² te snijden.

Breng vervolgens de inhoud van de schaal over in een C-buis voor mechanische dissociatie en spoel de schaal en het scalpel af met twee milliliters medium. Voeg het spoelmiddel toe aan de C-buis en voer vervolgens twee keer achter elkaar het 0,01 mechanische dissociatieprogramma uit om de weefselfragmenten voorzichtig te homogeniseren tot een suspensie van enkelvoudige cellen. Giet na de tweede cyclus het homogenaat door een 40 micrometer cell strainer in een 50 milliliter conische buis.

Gebruik vervolgens dezelfde pipet waarmee de Petri-schaal is gewassen om alle resterende vloeistof uit de C-buis in de celzeef over te brengen. Gebruik daarna een micropipet van 1 ml om de gefiltreerde vloeistof over te brengen naar een conische buis van 15 ml en spoel de C-buis met nog eens 3 ml medium. Breng dit spoelmiddel via de celzeef over naar de buis van 50 ml.

Beweeg vervolgens het niet gehomogeniseerde weefsel voorzichtig met een schone tip van één milliliter over het zeefje om de maximale hoeveelheid resterende vloeistof die in het weefsel gevangen zit in de buis van 50 milliliter te persen. Plaats het celzeefje nu ondersteboven op de oorspronkelijke C-buis en spoel het zeefje af met nog eens drie milliliter medium, zodat het niet gehomogeniseerde weefsel terug in de C-buis valt. Homogeniseer het weefsel opnieuw gedurende nog twee cycli zoals zojuist gedemonstreerd, en giet vervolgens dit tweede homogenaat door het celzeefje.

Spoel de C-buis opnieuw met nog eens drie milliliter medium. Filtreer vervolgens het supernatant door het zeefje en knijp de resterende vloeistof uit het weefsel, zoals zojuist gedemonstreerd. Op dit punt moet er een volume van ongeveer 2,5 milliliter enkelcel-suspensie aanwezig zijn in de 15 milliliter buis, en moet er ongeveer negen milliliter waarneembaar zijn in de 50 milliliter buis.

Om het supernatant van het weefsel van de cellen te scheiden, worden beide buizen met homogenaat eerst 15 minuten gecentrifugeerd bij 600 Gs en kamertemperatuur. Schenk het supernatant uit de 15 milliliter buis over in een 1,5 milliliter buis en bewaar deze bij vier graden Celsius, en gooi het supernatant uit de 50 milliliter buis weg. Tik vervolgens elke buis voorzichtig tegen een hard oppervlak om de celpellets op te breken. Resuspendeer de losse celpellet in de 50 milliliter buis met 500 microliters medium en breng de cellen over naar de 15 milliliter buis om de tweede pellet te resuspenderen.

Spoel de buis van 50 milliliter vervolgens met nog eens 500 microliters medium en breng het wasmiddel over naar de buis van 15 milliliter voor een maximale herwinning van de cellen. Tel het aantal levensvatbare cellen via trypaanblauw-uitsluiting en pellet vervolgens de celsuspensie. Centrifugeer tot slot het gereserveerde weefselsupernatant.

Breng vervolgens voorzichtig het supernatant over naar ten minste één schone buis zonder de pellet aan te raken of te verstoren en bewaar dit bij -80 °C voor toekomstige downstream-analyses. In deze grafieken worden representatieve flowcytometrie-dotplots getoond van gedissocieerde tumorcelhomogenaten, gevolgd door labeling met specifieke antilichamen tegen leukocyten en epitheelcelmarkers zoals gedemonstreerd. Dit protocol beïnvloedt de levensvatbaarheid van de CD45-positieve cellen niet significant.

Er is echter sprake van een aanzienlijk verlies aan levensvatbare EPAM-positieve cellen. Ondanks dit kunnen levensvatbare EPAM-positieve en CD 45-positieve subpopulaties op basis van hun grootte en structuur worden gescheiden in grote epitheliale tumorcellen, kleine epitheliale cellen, of grote en kleine CD 45-positieve cellen. Representatieve flowcytometrie dotplots van de belangrijkste tumorinfiltrerende subpopulaties worden hier getoond, waarbij de lymfocyten zijn gegated op de levensvatbaarheid van de CD 45-positieve cellen.

Ten slotte kan de cytokine-expressie of de totale hoeveelheid immunoglobulinen in het supernatant van borstkanker worden vergeleken met het supernatant van normaal borstweefsel, wat, zoals aangetoond in dit representatieve experiment, verhogingen in beide typen eiwitten onthult die geassocieerd zijn met het tumorweefsel. Tijdens deze procedure is het belangrijk om snel en schoon te werken en de maximale hoeveelheid materiaal bij elke stap van de procedure terug te winnen om een voldoende aantal cellen te verkrijgen voor uw eindanalyse.