Name: Synthetische Methodologie voor Asymmetric Ferroceen Afgeleid Bio-conjugaat Systems via Solid Phase Resin-gebaseerde Methodologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Leer de synthese van asymmetrische ferroceen-biotine bioconjugaten via vaste-fase methode op hars. Deze techniek vereenvoudigt zuivering en maakt effectieve immobilisatie op goudoppervlakken mogelijk voor biosensortoepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

KG werd gesteund door de RA Welch Stichting subsidie ​​P-1760, TCU Andrews Instituut voor Wiskunde &amp; Science Education (KG), TCU Onderzoek en Creativiteit Activity Grant (KG) en TCU SERC Grant (tot JHS).

1. Synthese van biotine-Fc-cysteïne (1) <ol><li> Vaste fase methoden produceren hars-gebonden 1. <ol><li> Plaats biotine geladen hars (250 mg, 0.145 mmol) in een gefrit spuit en zwellen van de hars door het opstellen dimethylformamide (5 ml) en schudden van de spuit op een lab schudder gedurende 20 min. Verdrijf de oplossing en herhaal dimethylformamide zwelling nog een keer. </li><li> Verwijder de Fmoc beschermende groep door toevoeging van 4-6 ml 20% piperidine in dimethylformamide om de injectiespuit gevolgd door 10-15 min schudden. Herhaal de ontscherming procedure voor elke 4-6 ml piperidine. Spoel de hars met een reeks 3x dimethylformamide, 3x dimethylformamide: methanol (1: 1), 3x methanol: dichloormethaan (1: 1), 3x dichloormethaan, ~ 5 ml elk. Doe een ninhydrine test (+) op een kleine steekproef (~ 10) van de kralen succesvolle deprotectie door de aanwezigheid van blauwe bij verhitting bevestigen. </li><li> Meng een oplossing die 1&#39;-Fmoc-amino-ferroceen-1-carbonzuur(203.3 mg, 0,4350 mmol), 1-hydroxybenzotriazool hydraat (58.8 mg, 0.413 mmol), diisopropyl carbodiimide (0,0673 ml, 0,435 mmol), diisopropylethylamine (0,0757 ml, 0,435 mmol) en een 4: 1 mengsel van dichloormethaan en dimethylformamide. Trekken deze in de fritted spuit en schud op een lab shaker gedurende 6 uur. Verdrijven vervolgens de oplossing uit de naald en was zoals eerder beschreven. </li><li> Voer de ninhydrinetest (-) zoals hierboven beschreven koppeling bevestigen. De ninhydrine test kan nog steeds nuttig bij de bevestiging koppeling ondanks de oranje kleur van de kraal afgeleid van de bevestiging van het ijzer bevattende deel zijn. </li><li> Verwijder de Fmoc-groep door de toevoeging van 20% piperidine in dimethylformamide en gewassen zoals hierboven beschreven. De ninhydrine test (+) gebruiken om Fmoc verwijdering te bevestigen. </li><li> Bereid een oplossing bestaande uit Fmoc-Cys (Trt) -OH (254,8 mg, 0,4350 mmol), 1-hydroxybenzotriazool hydraat (58,8 mg, 0,4125 mmol), diisopropyl carbodiimide (0,0673 ml, 0,4350mmol), diisopropylethylamine (0,0757 ml, 0,4350 mmol) en een 4: 1 mengsel van dichloormethaan en dimethylformamide. Voeg dit cysteïnekoppeling cocktail de fritted spuit en schud gedurende 6 uur. Was met het eerder beschreven protocol. </li><li> Bevestig koppeling met de ninhydrinetest (-), gevolgd door verwijdering van de Fmoc component met 20% piperidine en wassen. Controleer de vrije terminale amine met de ninhydrinetest (+). </li></ol></li><li> Splitsing van 1 van de hars. <ol><li> Voeg een oplossing van TFA (9.45 ml), water (0,25 ml), 1,2-ethaandithiol (0,25 ml) en triisopropyl- silaan (0,1 ml), het aan de spuit en schud voorzichtig 4 uur. </li><li> Verzamel de resulterende rood-bruine oplossing in een Eppendorf buisje en damp de TFA langzaam met een luchtstroom. </li><li> Voeg koude diethylether (~ 15 ml) aan de Eppendorf buis precipiteren 1, die zacht schudden zal vormen. Isoleer het product door centrifugatie (1 g, 5 min). Tduivin herhalingscycli diethylether wassingen (~ 60 ml totaal) en de centrifuge te verkrijgen 1 als een rood / bruine vaste stof. </li></ol></li></ol> 2. Karakterisering en analyse van 1 <ol><li> Controleer of de identiteit overeenkomt met de verbinding en de samenstelling getoond in figuur 2 met 1H (16 scans) en 13C NMR (512 scans) in gedeutereerd methanol (300 ui) en ESI-MS analyse. Verwachten dat de volgende resultaten: 1H NMR spectrum (CD3OD) δ / ppm: 1,407-1,684 (m, 6H), 2,245 (t, 2H), 2,665-3,150 (m, 12H), 4,015 (t, 1H), 4,104 (d, 2H ), 4,274 (q, 1H), 4,426 (d, 2H), 4,479 (q, 1H), 4,595 (t, 1H) en 13C NMR spectrum (CD3OD) δ / ppm: 24,644 (CH2), 25,472 (CH2), 28,051 (CH2) 28,300 (CH2) 35,474 (CH2) 38,698 (CH2) 39,241 (CH2) 39,717 (CH2), 55,340 / 55,538 (Cp-ring), 60,286 (CH), 61,964 (CH), 62,521 / 62,821 (Cp-ring), 66,038 / 66,170 (Cp-ring), 69,153 / 69,328 (Cp-ring), 71,468 / 71,593 (Cp-ring), 76,466 (CH), 171,770 (C = O), 175,361 (C = O). ESI-MS (m / z): Gevonden: 639,00 [1 + Na] +, Theoretisch: 639,1 [1 + Na] + en HR-MS (m / z): Gevonden: 617,2049 [1 + H] +, Theoretisch: 617.1622 [1 + H] +. </li><li> Voer een HPLC, elementaire analyse om de samenstelling van geïsoleerde 1 bevestigen. Voer HPLC chromatogrammen van een C8 omgekeerde fase kolom met 100% MeOH bij een stroomsnelheid van 0,5 ml / min. Opmerking: retentie HPLC tijden waren: 3,198-4,674 min. </li></ol> 3. Immobilisatie van 1 op een Gold Surface <ol><li> Cut polymeer gesteund goud slides in vierkanten van ~ 0,25 in 2. </li><li> Vul een 50 ml beker met DI-water oplossing van 1 (~ 1 mM). </li><li> Voeg de gouden dia aan de beker en dek af met een horlogeglas. Alleow het glaasje te incuberen O / N bij RT zonder agitatie. </li><li> Verwijder het goud dia uit de oplossing en laat het drogen aan de lucht. </li><li> Verkrijgen scanning elektronenmicroscopie beelden met een scanning elektronenmicroscoop (of gelijkwaardig) te observeren geïmmobiliseerd 1. </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De synthese van asymmetrische ferroceenderivaten is een uitdaging in oplossing. Pogingen produceren 1 in oplossing resulteerde in een lage opbrengst van het gewenste product (minder dan 20%). Ook reacties gebruikmaking 1&#39;-amino-ferroceencarbonzuur (sans Fmoc) en hars gebonden biotine resulteerde in onoplosbaar product in overeenstemming met het gepolymeriseerde product gerapporteerd door Baristic et al. en minimale artikel. 47 Dit wordt verder gecompliceerd door ferrocee...

Biosensoren zijn kleine apparaten die biomoleculaire herkenning technologie in dienst als platform voor selectieve analyse en worden gebruikt voor hun specificiteit, snelheid en lage kosten. Elektrochemische biosensoren voor de detectie van biomoleculen bij het ​​front van dit veld vanwege hun eenvoud, kosteneffectiviteit en hoge gevoeligheid. 1,3 De algemene anatomie van deze sensoren een elektrode is voorzien van een herkenningsmolecuul specifiek voor de biologische merker plaats . Binding van de biomarker van de herkenningsmolecuul resulteert in een lokale verandering van mogelijke of feitelijke die kunnen worden gedetecteerd door meting. Om de herkenningsdeel datum kan variëren van enzymen, 4-8 antilichamen, 9-12 hele cellen, 13-16 receptoren, 17-20 peptiden 21-23 en DNA-24 en zijn grotendeels gericht op grotere, biologische moleculen. 25-28 Onderzoek inspanningen in deze arena zijn voornamelijk geconcentreerd op immunosensoren wheopnieuw een immunoglobuline wordt geïmmobiliseerd met een redox actieve kern (zoals ferroceen) en gebruikt om een ​​antilichaam van belang te detecteren. Deze studies zijn uitgesloten van klinische toepassingen te wijten aan slechte precisie en tijd het verbruik als gevolg van de complicaties die voortvloeien uit het gebruik van antigeen / antilichamen. 1,3 Groeiende aandacht is gericht op de detectie van kleine moleculen (minder dan 1 kg / mol) van biomedische , voeding en milieu interesse in aanvulling op de nationale veiligheid. 29 De bekendste voorbeelden van biosensor apparaten zijn zelftest glucose monitors, die gezeefdrukt enzym elektroden gekoppeld aan een pocket-size amperometrisch meter hebben. Deze systemen gebruiken typisch een coulometrische werkwijze waarbij de totale hoeveelheid lading die door de glucose oxidatiereactie wordt gemeten over een periode van tijd. Verhandelbare apparaten moeten draagbaar, robuust en met de hand worden gehouden om gebruik facile voor de bevolking te maken in het algemeen. Redox-tags zoals ferrocene zijn necessary om de elektrochemische detectie van biomarkers of kleine moleculen in oplossing meeste biomarkers zijn niet intrinsiek elektrochemisch actief. 30-38 Ferrocene een organometallische molecule dat een gouden standaard voor elektrochemie, waardoor het een uitstekende keuze voor integratie in elektrochemische biosensoren maakt. -Ferroceen gebaseerde redox-actieve soorten hebben al veel aandacht oogstte vanwege hun kleine formaat, goede stabiliteit, gemakkelijke synthetische toegang, gemakkelijk chemische modificatie, relatieve lipofiliteit, en het gemak van redox-tuning. 3,30-42 Kleine moleculen op basis van de ferrocene kern hebben uitgebreid gebruikt als detectoren van metaalionen en kleine moleculen. 32-38,43 Systems richt grotere soorten zoals biomoleculen hebben de bevestiging van grote antilichamen of immunoglobulinen te ferroceenderivaten die zijn ingebed op een elektrochemische oppervlak benut. 1,3,39 44 In elk geval, de potentiële en actuele intensity van de Fe III / Fe II redoxkoppel werd gewijzigd op moleculaire koppeling, waardoor een nieuwe spectroscopische handgreep die de aanwezigheid van de analyt molecuul. Deze wijziging vloeit voort uit de grote overlap ontstaat tussen de pi-systeem van het cyclopentadienyl ringen en de ijzer d-orbitalen. Als de pi-systeem gemodificeerd, dwz gederivatiseerd of reageerden dan de orbitale interactie beurt verandering. Dit zal de Fe kern beïnvloeden en kan worden waargenomen als een verschuiving in het potentieel van de Fe III / Fe II koppel. 40,45,46 deze eigenschappen dergelijk systeem aantrekkelijk voor gebruik als een van hoeveelheid middel in een immunoassay of elektrochemische biosensor. Om ferroceen met systemen voor specifieke biosensor capaciteit produceren optimaal een Cp-ring veranderen met de bio-receptor specifiek is voor een doelwitmolecuul en gebruik de andere Cp-ring als moleculaire ketting aan de elektrochemische uitlezing of electrode (Figuur 1). Synthese van deze asymmetrische ferroceenderivaten wordt uitgedaagd door nevenreacties en de vorming van dimere en polymere species gevormd bij intermoleculaire verknoping. 47 echter koppelingschemie produceren van een amidebinding is de meest directe route naar eenvoudige derivaten van ferroceen met biologische componenten bieden peptiden en hun metabolieten. Daarom kan vastefasetechnieken eerst ontwikkeld in de jaren 1950 door Merrifield voor peptidesynthese worden toegepast organometallische verbindingen die ferroceen. Door het gebruik van de orthogonaal gesubstitueerde 1&#39;-Fmoc-amino-ferroceen-1-carbonzuur molecuul, een ferroceen systeem dat een receptor groep (biotine), elektrochemische uitlezing (ferroceen), en immobiliseren-linker component (cysteine) kan bevatten, geconstrueerd en hierin beschreven. De synthese van deze bio-conjugaat wordt besproken, evenals bewijs voor immobilisatie op een gouden ondergrond. Dit werk vertegents de eerste presentatie van een systeem dat bestaat uit biotine, ferroceen en een aminozuur voor immobilisatie op een gouden oppervlak.

<table><tbody><tr><td>Biotin Novatag Resin</td><td>NovaBiochem</td><td>8550510001</td><td></td></tr><tr><td>TORVIQ 10 ml Luer Lock Fritted Syringe</td><td>Fisher</td><td>NC9299151</td><td></td></tr><tr><td>piperidine</td><td>Acros</td><td>P/3520/PB05</td><td></td></tr><tr><td>ninhydrin test</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017-1ea</td><td></td></tr><tr><td>1&rsquo;-Fmoc-amino-ferrocene-1-carboxylic acid</td><td>Omm Scientific</td><td>Special Order</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime;-Diisopropylcarbodiimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D125407-5G</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>Novabiochem</td><td>8520080025</td><td></td></tr><tr><td>trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5408</td><td></td></tr><tr><td>1,2-ethanedithiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2930</td><td></td></tr><tr><td>triisopropyl silane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233781</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes (20 ml)</td><td>any source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>any source</td><td></td><td>droog met moleculaire zeef voor gebruik &amp; bewaar in 100 ml media fles voor gemakkelijk gebruik</td></tr><tr><td>dichloromethane</td><td>any source</td><td></td><td>droog met moleculaire zeef voor gebruik &amp; bewaar in 100 ml media fles voor gemakkelijk gebruik</td></tr><tr><td>dimethylformamide</td><td>any source</td><td></td><td>droog met moleculaire zeef voor gebruik &amp; bewaar in 100 ml media fles voor gemakkelijk gebruik</td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>any source</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

synthetische methodologie voor asymmetric ferroceen afgeleid bio-conjugaat systems via solid phase resin-gebaseerde methodologie

Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

Vroege detectie is een sleutel tot een succesvolle behandeling van de meeste ziekten en in het bijzonder noodzakelijk voor de diagnose en behandeling van vele soorten kanker. De meest gebruikte technieken gebruikt worden beeldvormingsmodaliteiten zoals Magnetic Resonance Imaging (MRI), Positron Emissie Topografie (PET) en computertomografie topografie (CT) en zijn optimaal voor het begrijpen van de fysieke structuur van de ziekte, maar slechts eenmaal per vier worden uitgevoerd zes weken door het gebruik van beeldvormende middelen en de totale kosten. Met dit in het achterhoofd, de ontwikkeling van de &#39;point of care &quot;technieken, zoals biosensoren, die het stadium van de ziekte en / of werkzaamheid van de behandeling in het kantoor van de arts te evalueren en doen dat in een tijdig, zou behandelprotocollen revolutioneren. 1 als een middel voor het verkennen ferroceen gebaseerde biosensoren voor de detectie van biologisch relevante moleculen 2, zijn methoden ontwikkeld om ferroceen biotine-biologische conjugaten die hierin beschreven produceren. Dit rapport zal zich richten op een biotine-ferroceen-cysteïne systeem dat kan worden geïmmobiliseerd op een gouden ondergrond.

De hars gebonden vorm 1 wordt getoond in figuur 2. De covalente hechting van het ferroceen component ontstaat een oranje tint aan de harskorrels die persistent met continuwassen en indicatief van een geïmmobiliseerd ijzerhoudend complex tegenover ijzerabsorptie door PEG component van de harsparel. De hars- vorm 1 is identiek in kleur aan de harskorrels. Na verwijdering van de verbinding uit de hars kralen, de zuiverheid en opbrengst (68%) als gevolg van de methode is ve...

De synthese van asymmetrische soorten ferroceen is uitdagend met behulp van oplossingstechnieken. Dit rapport richt zich op de methoden die zijn uitgevoerd om een ferroceen-biotine bioconjugaat te produceren met behulp van eenvoudige en schone reacties die zijn uitgevoerd via vaste-fase synthese. Het is aangetoond dat de incorporatie van een thiolatgroep het vermogen geeft om te immobiliseren op goudoppervlakken.

Synthetische Methodologie voor Asymmetric Ferroceen Afgeleid Bio-conjugaat Systems via Solid Phase Resin-gebaseerde Methodologie

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het produceren van asymmetrische ferne-biotine-bioconjugaten die geïmmobiliseerd kunnen worden op een goudoppervlak. Dit wordt bereikt door synthese van het ferne-biotine-bioconjugaat op een vaste-fasehars. In een tweede stap wordt het bioconjugaat van de hars verwijderd, wat de isolatie en karakterisering van de verbinding mogelijk maakt.Vervolgens wordt het bio-conjugaat geïncubeerd met een goudoppervlak om adhesie van de tholaten met het goud mogelijk te maken. De resultaten tonen aan dat een ferne bio-conjugaat geproduceerd kan worden met een goede opbrengst en zuiverheid, en vervolgens geïmmobiliseerd kan worden op een goudoppervlak. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals oplossingsgebaseerde methoden, is dat de zuivering eenvoudig en ongecompliceerd is.Naast het vermijden van bijproducten die ontstaan bij oplossingsgebaseerde methoden, kregen we het idee voor deze methode toen we nadachten over de efficiëntie en praktische toepasbaarheid van de glucosesensoren die worden gebruikt voor de monitoring van diabetische patiënten. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Sean Rodi

synthetic-methodology-for-asymmetric-ferrocene-derived-bio-conjugate

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

De efficiënte solid-phase peptide synthese van een gefunctionaliseerde bis-peptide trimeer gebruik te maken van een "veiligheidspal" decollete procedure vanaf HMBA hars wordt beschreven.

Vaste fase synthese van een gefunctionaliseerd Bis-Peptide Met behulp van &quot;Veiligheid Catch&quot; Methodologie

Dit protocol geeft de belangrijkste stappen voor de bioconjugatie van een cysteïne bevattend eiwit een maleïmide, zoals zuivering reagens, reactieomstandigheden, bioconjugaat zuivering en karakterisering bioconjugaat.

Eiwitsynthese Bioconjugaten<em&gt; via</em&gt; Cysteïne-maleïmide Chemistry

Er wordt een potentiële algemene methode gepresenteerd voor de synthese van in water oplosbare multimetallische peptidische arrays die een vooraf bepaalde sequentie van metaalcentra bevatten.

Synthese van een water-oplosbaar metaal-organisch complex Array

We presenteren een protocol voor de bouw van thioether/vinyl sulfide-aangebonden spiraalvormige peptiden met behulp van foto-geïnduceerde thiol-Ono/thiol-yne hydrothiolation.

Bouw van de Thioether/Vinyl Sulfide-aangebonden Helical peptiden Via foto-geïnduceerde Thiol-Ono/yne Hydrothiolation

Hier presenteren we een protocol om aan te tonen van een efficiënte methode voor de synthese van spirocyclic heterocycles. De vijf-stap proces maakt gebruik van solid-phase synthese en regenereren van Michael linker strategieën. Over het algemeen moeilijk te synthetiseren, presenteren we een aanpasbare methode voor de synthese van spirocyclic moleculen anders ontoegankelijk is voor andere moderne benaderingen.

Solid-phase synthese van [4.4] Spirocyclic Oximes

In dit protocol beschrijven we de synthese van PODS, een phenyoxadiazolyl methyl-sulfon gebaseerde reagens voor de site-selectieve bevestiging van cargos aan de thiolen van biomoleculen, met name antilichamen. Daarnaast beschrijven we de synthese en de karakterisering van een Peul-bevattende bifunctionele complexvormer en zijn geconjugeerde aan een model antilichaam.

Synthese en Bioconjugation van Thiol-reactieve reagentia voor de oprichting van Site-selectief bewerkt Immunoconjugates

Een protocol wordt gepresenteerd voor de synthese van informatie-gecodeerde peptoid oligomeren en voor de sequentie-gerichte zelfassemblage van deze peptoids in moleculaire ladders met behulp van amines en aldehyden als dynamische covalente reactant paren en Lewis zure zeldzame aarde metalen triflates als multi-role reagentia.

Synthese van informatiedragende Peptoids en hun reeks-geleide Dynamische Covalent Zelfassemblage

Dit protocol presenteert de synthese van cyclische peptiden via bisalkylering tussen cysteïne en methionine en de gemakkelijke thiol-yne-reactie veroorzaakt door het propargylsulfoniumcentrum.

Cyclische peptiden construeren met behulp van een on-tether sulfoniumcentrum

Dit protocol beschrijft de synthese van cyclische celdoordringende peptiden met aromatische dwarsverbanden en de evaluatie van hun permeabiliteit over biologische barrières heen.

Constructie van cyclische celdoordringende peptiden voor verbeterde penetratie van biologische barrières

De hoge druk saffier mobiele apparaat is een unieke tool om te studeren, zonder bemonstering, fasegedrag onder een breed scala van druk. Met behulp van een cathetometer, kunnen zeer nauwkeurige volume metingen worden opgenomen op vloeibare expansie en fasesamenstelling meten. Aldus kan deze synthetische werkwijze de studie van (1) fasenevenwichten mengsels multivalente en (2) de partitie gedrag van katalysator of model verbindingen als functie van de druk.

Hogedruk Sapphire Cel voor fasenevenwichten Metingen van CO<sub&gt; 2</sub&gt; / Organic / Water Systems

Leer de synthese van asymmetrische ferroceen-biotine bioconjugaten via vaste-fase methode op hars. Deze techniek vereenvoudigt zuivering en maakt effectieve immobilisatie op goudoppervlakken mogelijk voor biosensortoepassingen.

Synthetische Methodologie voor Asymmetric Ferroceen Afgeleid Bio-conjugaat Systems via Solid Phase Resin-gebaseerde Methodologie (Video) | JoVE Journal

Synthetische Methodologie voor Asymmetric Ferroceen Afgeleid Bio-conjugaat Systems via Solid Phase Resin-gebaseerde Methodologie

Meer video's verkennen