Name: Radial Mobiliteit en cytotoxische functie van retrovirale replicerende vector getransduceerde, niet-klevende Alloresponsive T-lymfocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Leer de radiale migratie van niet-hechtende effector T-lymfocyten over tumorcellagen met behulp van een celbezinkingsmanifold en fluorescentiemicroscopie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar immuunresponsen in tumoromgevingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mede ondersteund door NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI Grant Aantal UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, en de Joan S. Holmes Fund Memorial Research. MJH en GCO ontvangen ondersteund vanuit de Joan S. Holmes Memorial Postdoctorale Fellowship aan de UCLA. De CSM-apparaat werd verkregen van Creative Scientific Methods: www.creative-sci.com. De lentivirale vector werd ontvangen van het UCLA Vector Core, ondersteund door CURE / P30 DK041301.

1. Schuif Voorbereiding <ol><li> Plaats Cell Sedimentatie Manifold dia&#39;s in sterilisatie zakjes en sluit met autoclaaf tape. Het gezicht van de Teflon-gecoate zijde van de schuif het papier-kant van de tas aan plastic afzettingen op de putten te vermijden. </li><li> Autoclaaf zakjes gedurende 15 minuten bij 121 ° C. </li><li> Verwijder dia uit sterilisatie zakje binnenin een bioveiligheid kast en plaats in een steriele 150 x 15 mm steriele petrischaal. Er kunnen maximaal vier dia&#39;s kunnen passen per gerecht. Plaats een 35 x 10 mm petrischaal naast de dia. Voeg 2-3 ml steriele H 2 O tot luchtbevochtiging. </li><li> Pre-coat slides met poly-D-lysine bij 100 ug / ml met voldoende volume om de hele afdekken. Na één uur bij KT, zuigen de oplossing en spoel het oppervlak van de put tweemaal pipetteren 1x PBS over het oppervlak van de putjes. </li><li> Voeg desgewenst fibronectine of andere ECM componenten sterker tumorcel hechting te garanderen. Fibronectine Opslaan bij 5 ug / ml in voldoende volume that de putjes droogt niet binnen een korte tijdsperiode bij kamertemperatuur. <ol><li> Na 1 uur, zuig het overgebleven oplossing en tweemaal wassen door en neer te pipetteren met 1x PBS. </li></ol></li><li> Houd PBS op de putjes totdat tumor klaar voor plating. Gebruik schuift op dezelfde dag. </li><li> Oogst een samenvloeiing kolf van het gewenste aanhangend tumorceltype. Count levensvatbare cellen met behulp van trypaanblauw kleurstofuitsluiting met lichtmicroscopie en resuspendeer in 5 x 10 6 cellen / ml in voldoende gebufferd groeimedium, bijvoorbeeld Dulbecco&#39;s minimaal essentieel medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS), L- glutamine en natrium- pyruvaat. </li><li> Als fluorescente beeldvorming van de hechtende celpopulatie gewenst, etiketteren de hechtende celpopulatie een vitale fluorescente kleurstof of celproliferatie kleurstof volgens de protocollen van de fabrikant. </li><li> Regelmatig Pipetteer 10 ul compleet medium in elk putje van de schuif zorg om te voorkomen dat luchtbellen in de wells, omdat deze uniform tumorcel hechting te voorkomen. </li><li> Voeg 2,5-5,0 x 10 4 cellen (5-10 pi celsuspensie) aan het medium in elk putje (figuur 1A). Stel het optimale aantal afhankelijk tumor celtype en het aantal dagen groei gewenst. Grotere tumorcellen of snelgroeiende cellen kunnen minder cellen aanvankelijk te eisen. Breng goed volume tot 40 pi door toevoeging medium en pipet op en neer een gelijkmatige verdeling van de cellen te waarborgen. </li><li> Immers putjes gezaaid, zodat de tumorcellen te hechten bij KT plaats het deksel op de 150 x 15 mm petrischaal en voorzichtig bewegen de schotel naar een 37 ° C / 5% CO2 bevochtigde incubator gedurende ten minste 24 uur. </li><li> Veranderen dagelijks het kweekmedium. Pipetteer voorzichtig een gedeelte van het verbruikte medium van de monolaag en vervangen door vers compleet medium. Opmerking: Door verdamping, meer volume moeten worden toegevoegd dan werd afgesloten. Wells zal klaar zijn voor de test zijn wanneer een gelijkmatige, confluent laag cellen aanwezig is. Dit is typisch 1-3 dagen na de eerste zaaien. </li><li> Was monolaag voorzichtig eenmaal met PBS zoals beschreven in stap 1.4 en ofwel verder naar stap 2 als monolagen gewenst of hieronder stap 1.13 ECM eiwitten extraheren van de monolaag. </li><li> Voeg een 0,5% Triton-X (v / v) oplossing in compleet medium en voeg 30 ul aan elk putje. Laat monolaag verteren kap 2 min, vervolgens tweemaal wassen met volledig medium gepipetteerd zoals hierboven beschreven. OPMERKING: De ECM laag kan zichtbaar door lichtmicroscopie (figuur 2) zijn. Gebruik dia&#39;s meteen, of in compleet medium te houden in de bevochtigde CO 2 incubator voor 1-2 dagen. Sta niet toe dat putten uit te drogen. </li></ol> 2. sedimentatie van niet-klevende T-cellen op Slide <ol><li> Als fluorescente beeldvorming van de niet-hechtende celpopulatie gewenst, etiketteren de niet-hechtende celpopulaties met een vitale fluorescerende kleurstof, zoals CFSE, Cell Tracker Rood CMPTX of eFluor670 volgens de protocollen van de fabrikant ten minste 1 uur vóór de test. Als alternatief, manipuleren cellen om fluorescerende eiwitten gecodeerd door virale vectoren te uiten. </li><li> Autoclaaf de cel sedimentatie spruitstuk in een autoclaaf zakje zoals beschreven in 1.2 hierboven. </li><li> Verwijder de vochtige kamer met Teflon gecoate glaasjes uit de incubator en plaats in bioveiligheidskast. </li><li> Was putjes met 1x PBS en neer te pipetteren, voeg 45 ul compleet medium dat ten minste 10% serum. </li><li> Verwijder het verdeelstuk uit de sterilisatie envelop en schuif in de putjes totdat het &quot;haak aan het einde van het verdeelstuk raakt de onderzijde van de slede (Figuur 1B). </li><li> Zorg ervoor dat het kweekmedium zichtbaar in elk van de kanalen. Als er geen wordt gezien, neem het spruitstuk en voeg meer medium om de corresponderende goed, dan is vervangen en opnieuw controleren. </li><li> Herhaal stap 2.5 per Channel van het spruitstuk, of voor zo vele putten zoals gewenst. </li><li> Graaf niet-hechtende cellen en resuspendeer in liefst 1,0-2,0 x 10 5 / ul. Opstellen van 1 pl van cellen en langzaam pipet ze in het kanaal (figuur 1C). Doe dit voor elke wel gewenst. </li><li> Laat de gehele cel geladen inrichting, namelijk, spruitstuk en schuif, in de bio-kap gedurende 20-30 minuten om de cellen in het kanaal te regelen. </li><li> Verwijder het verdeelstuk door op beide uiteinden en voorzichtig recht omhoog te tillen van de glijbaan om de cellen niet focaal uitgezaaid in het midden van de putjes (figuur 1D) verstoren. </li><li> Inspecteer elk putje zodat de niet-hechtende cellen zijn succesvol gezaaid in het midden van de put blijven binnen de omtrek van het verdeelstuk kanaal. De niet-hechtende cellen zal ideaal enigszins hechten aan de monolaag of ECM en elkaar derhalve voorzichtig bewegen van de slede rond zal niet leiden tot de cel Pellet om zich te verspreiden. Niet verdringen de dia. </li></ol> 3. fluorescentiemicroscopie <ol><li> Met de juiste experimentele apparatuur, voeren de beeldvorming na sedimentatie wordt bevestigd. Gebruik bij voorkeur een microscoop die is uitgerust met een CO2 en vochtige kamer. Afbeelding bij laag vermogen, bijvoorbeeld, 4X of 10X, om voor meerdere beelden te maken van een groter oppervlak, zodat het geheel van de put te zien. </li><li> Verwerven van digitale beelden met behulp van image capture software. Voeren helderveld en / of multi-channel fluorescentie beeldvorming. </li><li> Indien gewenst, het opzetten van een time-lapse beelden in verschillende kanalen op te nemen over een bepaald gebied, of houd de dia bevochtigde en in een 37 ° C / 5% CO 2 incubator en handmatig te nemen om het beeld op het moment dat de punten gewenste (Figuur 1E &amp; F, aanbevolen voor een langere tijd punten). </li></ol> 4. Analyse en Display <ol><li> Met behulp van software voor beeldbewerking, samenvoegen licht en fluorescerende afbeeldingen in één laag dus meerdere celtypes en merkers kan worden gezien in dezelfde afbeelding. Sleep de beeldbestanden voor elke individuele kleur in het programma en, als daarom wordt gevraagd, selecteert u de optie &#39;Layer Toevoegen&#39; om een ​​image-bestand met meerdere lagen te creëren. <ol><li> Bij hogere vergroting, nemen, uit te lijnen, en steek samen beelden over het goed digitaal. Bestanden uitlijnen door naar geconserveerde gebieden tussen twee beelden en een beeld bovenop de andere bedekken totdat een volledig beeld wordt gegenereerd. </li></ol></li><li> Voeg micron bars om beelden tijdens acquisitie met behulp van de capture software om afstand individuele cellen zijn gemigreerd te bepalen. </li><li> Om de cel migratie op verschillende tijdstippen te bepalen, maken oppervlak intensiteit fluorescentie kaarten met afbeelding software, dat wil zeggen, ImageJ, om fluorescerende T-cel aggregatie of gespreid in de tijd te kwantificeren. <ol><li> Aan de oppervlakte percelen te genereren, neem een ​​gelaagde afbeelding gegenereerd in stap 4.1 en onder het venster Lagen,vinkje bij alle lagen behalve degenen die bij het kanaal gewenst. Bijvoorbeeld, als een oppervlakteplot gewenst EMD expressie visualiseren, alleen de groene lagen overeenkomt met de filter die voor deze marker zichtbaar. </li><li> Vlak de afbeelding en sla het op in een bestandsformaat erkend (bv .png) en laadt de afbeelding in het programma. Aan de oppervlakte perceel genereren, wijzigt het type afbeelding om 8-bit, de helderheid / contrast te wijzigen als dat nodig is om de achtergrond te verminderen, en selecteer de &#39;Analyze / Surface Plot&#39; optie. De beelden in Figuur 5 werden gegenereerd door het controleren van de &#39;Shade&#39;, &#39;Draw Axis&#39;, &#39;One Polygon Per Line&#39; en &#39;Smooth&#39; checkboxes. </li><li> Of neem metingen met de straal of diameter van de focale cel storting op tijdstip nul en vergelijken met de cellen op het buitenste punt op verschillende tijdstippen. De diameter van de Teflon putjes is 6.0 mm. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+fascin+in+the+migration+and+invasiveness+of+malignant+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells.</a> Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).</li>
<li>Valster, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cell migration and invasion assays.</a> Methods. 37 (2), 208-215 (2005).</li>
<li>Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+matrix+in+human+astrocytoma+migration+and+proliferation+studied+in+a+microliter+scale+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay.</a> Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).</li>
<li>Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+membrane+cytoskeleton+cross-linker+ezrin+in+medulloblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells.</a> Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).</li>
<li>Berens, M. E., Beaudry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+monolayer+cell+migration+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Radial monolayer cell migration assay.</a> Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).</li>
<li>Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+human+astrocytoma+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Determinants of human astrocytoma migration.</a> Cancer Res. 54 (14), 3897-3904 (1994).</li>
<li>Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cell+attachment+and+morphological+differentiation+in+a+pheochromocytoma+cell+line+and+embryonal+sensory+cells+by+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix.</a> Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).</li>
<li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).</li>
<li>Hickey, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+preclinical+study+findings+to+protocol+design%3A+translational+studies+with+alloreactive+CTL+for+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas.</a> Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).</li>
<li>Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-shot%2C+multicycle+suicide+gene+therapy+by+replication-competent+retrovirus+vectors+achieves+long-term+survival+benefit+in+experimental+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma.</a> Mol Ther. 12, 842-851 (2005).</li>
<li>Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+evolution+of+a+tagged+chimeric+gammaretrovirus%3A+identification+of+novel+cis-acting+elements+that+modulate+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing.</a> J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).</li>
<li>Koya, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+phases+of+distribution+and+tumor+targeting+by+T+cell+receptor+engineered+lymphocytes+inducing+robust+antitumor+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).</li>
<li>Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM-1-dependent+homotypic+aggregates+regulate+CD8+T+cell+effector+function+and+differentiation+during+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation.</a> J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).</li>
<li>Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+extracellular+matrix+from+sectioned+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protocol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">3-D extracellular matrix from sectioned human tissues.</a> Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).</li>
<li>Prevention, C. fD. C. a <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPrevention%2C+CfDCa+%22Biosafety+in+Microbiological+and+Biomedical+Laboratories+%28BMBL%29%22">Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL)</a>. , 5 edn, Health and Human Services. (2009).</li>
<li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).</li>
<li>Alstergren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+and+directed+migration+of+murine+neutrophils+is+dependent+on+cell+surface+expression+of+CD44%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44.</a> Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).</li>
<li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+under+agarose%3A+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).</li>
<li>Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metallothionein+mediates+leukocyte+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis.</a> BMC Immunol. 6 (12), 21(2005).</li>
<li>Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+real-time+measurement+of+chemotactic+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Automated real-time measurement of chemotactic cell motility.</a> Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).</li>
<li>Zhang, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+antigen+precursor+protein+profiles+of+adult+and+pediatric+brain+tumors+identify+potential+targets+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuro-oncol%22%5BJournal%5D)">Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy.</a> J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Tumorcellen in een enkele celsuspensie werd gepipetteerd in de putjes van een met teflon gemaskeerd slide. De cellen werden toegestaan ​​te hechten en vervolgens gevormd monolagen in een bevochtigde 5% CO2, 37 ° C incubator (figuur 1A). Gevestigde monolagen of ECM eiwitten van de monolaag kunnen worden geoogst voor deze testen (Figuur 1B). Effector T lymfocyten gelabeld met fluorescerende vitale kleurstoffen of getransduceerd met vectoren die coderen voor EMD werden gezaaid i...

De radiale monolaag celmigratie assay werd oorspronkelijk ontwikkeld om de infiltrative eigenschappen hechtende tumorcellen 1-4 meten op objectglaasjes bekleed met extracellulaire matrix (ECM) proteïnen 5-7 of afzonderlijke ECM componenten zoals fibronectine of laminine 1,2. De techniek betrokken zaaien een enkele celsuspensie van tumorcellen in het centrum van putjes met een roestvrij stalen cel sedimentatie verdeelstuk (CSM). Na sedimentatie, zou de tumorcellen hechten aan de bodem van de put en de verandering in de diameter van de initiële celpopulatie tijd werd gebruikt om een ​​hoeveelheid van horizontale motiliteit vast. De radiale monolaag celmigratie analyse leverde een visueel voordeel boven andere bestaande methodes die transwell platen om de in vitro migratie capaciteiten van cellen assay toegepast; Deze testen zijn niet bevorderlijk imaging 8. Als goed, zij ook een grote mate van vrijheid in het kiezen van het tijdstips wanneer de migratie wordt beoordeeld, met geen limiet op het aantal tijdstippen een onderzoeker kon kiezen om het beeld na sedimentatie. Omdat het vermogen om te migreren een belangrijke functionaliteit voor niet-hechtende cellen, vooral op het gebied van immunotherapie of wanneer deze kunnen worden gebruikt als afgiftevehikels voor virale vectoren, passen wij het gebruik van de CSM om de migratie van niet-hechtende cellen te evalueren types op tumorcel monolagen, naast ECM eiwitten. Het extra voordeel van microscopisch visualiseren migratie van niet-hechtende cellen op levensvatbare tumorcellen monolagen op complexe ECM geïsoleerd uit de tumor, of op afzonderlijke ECM componenten maakt deze assay veelzijdig. Testen die putten gecoat met een enkel extracellulair proteïne in dienst weerspiegelen niet nauwkeurig de ECM weefsel substraat of tumor van de cellen zou door migreren in vivo. Hier hebben we gebruikt alloreactieve cytotoxische T-lymfocyten (alloCTL), lichtgevoelig tot grote histocompatibility complex (MHC) eiwitten met een enkele gemengde lymfocyt tumorcel reactie (MLTR) of gemengde lymfocyt reactie (MLR) 9 onze representatieve niet-hechtende celtype. We testten cellen van zowel menselijke en murine oorsprong. Toen migratie werd gemeten tumor monolagen, de tumorcellen toegepast werden ofwel gedeeltelijk relevant targets, tonen enkele van dezelfde MHC-eiwitten op de celpopulatie gebruikt om de effectoren of volledig relevante doelen sensibiliseren met een volledige set van MHC moleculen die de effectoren werden gesensibiliseerd richting. In sommige experimenten gebruikten we fluorescerende CellTracker Rode CMPTX of celproliferatie kleurstof eFluor 670 om onderscheid te maken tussen effector en doelcellen. Wij gebruikten ook transductie met virale vectoren coderen voor fluorescerende eiwitten als een extra manier om de cellen te visualiseren. Voor bepaalde tests, we getransduceerde de alloCTL met retrovirale replicerende vectoren (RRV) codering voor Emerald Green (EMD) fluorescerend eiwit 10,11; voor others, tumorcellen getransduceerd met lentivirale vectoren die coderen voor mStrawberry. De alloCTL werden geënt door een kanaal van het verdeelstuk naar het centrum van beide tumorcel monolagen of ECM geoogst van tumorcellen monolagen. Hechtende en niet-hechtende cel interacties werden gevisualiseerd door licht en / of door fluorescentie microscopie tijd. Verstoring in de tumorcel monolaag bij laag vermogen, of tumorcellen met gefragmenteerde kernen op hoog vermogen waren indicatoren van celschade door lysis en apoptose, respectievelijk. We digitaal gemaakt oppervlak intensiteit fluorescerende kaarten die de migratie van niet-klevende fluorescerende T-cellen in de monolaag culturen. We hebben ook kennis genomen van de cytotoxiciteit veroorzaakt aan de aanhanger glioom celmonolaag na clustervorming van de overlay niet hechtende alloCTL. Als goed, horizontale transductie van RRV-EMD uit de alloCTL aan de glioom monolaag werd waargenomen.

<table><tbody><tr><td>Teflon-masked microscope slides</td><td>Creative Scientific Methods</td><td>CSM002</td><td></td></tr><tr><td>Cell Sedimentation Manifold</td><td>Creative Scientific Methods</td><td>CSM001</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish, 150mm</td><td>Corning</td><td>430597</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish, 35mm</td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Mediatech</td><td>21-040</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu;l Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;l Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;l pipette tips</td><td>VWR</td><td>89003-060</td><td></td></tr><tr><td>Gedistilleerde, gedeïoniseerde water (steriele)</td><td>Mediatech</td><td>25-055</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Mediatech</td><td>25-054-CL</td><td></td></tr><tr><td>Celltracker Red CMPTX</td><td>Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (optioneel)</td><td>Gibco</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>Tumor celkweekmedia (bv. DMEM)</td><td>Mediatech</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>AIM-V serum-vrij media</td><td>Invitrogen</td><td>12055-083</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>Inverteerde microscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPOT Advanced</td><td>Diagnostic Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>BD</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>31/2 x 51/4 Autoclaafzakken</td><td>Crosstex</td><td>SCXS2</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Mediatech</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Cell Proliferation eFluor 670</td><td>eBioscience</td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

radial mobiliteit en cytotoxische functie van retrovirale replicerende vector getransduceerde, niet-klevende alloresponsive t-lymfocyten

Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

Wij rapporteren een nieuwe aanpassing van de radiale monolaag celmigratie analyse, voor het eerst bij de radiale migratie van hechtende tumorcellen op extracellulaire matrixeiwitten maat voor meting van de motiliteit van fluorescent-gelabelde, niet-hechtende menselijke of murine effector immuuncellen. Deze techniek maakt gebruik van een roestvrij stalen spruitstuk en 10 putjes Teflon dia focaal niet-hechtende T-cellen storten putjes bereid met ofwel confluente monolagen tumorcellen of extracellulaire matrixeiwitten. Licht en / of multi-channel fluorescentie microscopie gebruikt om de bewegingen en het gedrag van de effector cellen te volgen in de tijd. Fluorescente kleurstoffen en / of virale vectoren die coderen voor fluorescerende transgenen worden gebruikt om differentieel labelen celtypen voor beeldvorming. Deze methode onderscheidt zich van soortgelijke type in vitro testen die horizontale of verticale migratie / invasie gebruik te maken van dia kamers, agar of transwell borden volgen. De test maakt het mogelijk gedetailleerde beeldvorming gegevens naar be verzameld verschillende celtypen onderscheiden door specifieke fluorescente merkers; zelfs specifieke subpopulaties van cellen (dat wil zeggen getransduceerd / nontransduced) kan worden gecontroleerd. Oppervlakte fluorescentie intensiteit plots worden gegenereerd middels fluorescentie kanalen die overeenkomen met het type migrerende cel. Dit zorgt voor een betere visualisatie van de niet-hechtende immune mobiliteit cel op specifieke tijden. Het is mogelijk om het bewijs van andere effector celfuncties, zoals cytotoxiciteit of overdracht van virale vectoren van effectorcellen verzamelen aan doelcellen, ook. Zo is de methode stelt onderzoekers microscopisch document cel-cel interacties van differentieel gelabelde, niet-hechtende met hechtende cellen van verschillende soorten. Dergelijke informatie kan met name relevant voor de beoordeling van biologisch-gemanipuleerd of geactiveerde immuunsysteem celtypen, waar visueel bewijs van functionaliteit gewenst is met tumordoelcellen cellen vóór het gebruik ervan voor de behandeling van kanker zijn.

Virale vectoren die coderen voor fluorescerende eiwitten kunnen worden gebruikt naast, of in plaats van fluorescente kleurstof. Virale transductie moet worden uitgevoerd vóór de motiliteit assay. Zowel hechtende en niet-hechtende celtypen kunnen verschillend gemerkt. Het protocol voor transductie zal afhangen van het type vector toegepast. Hier hebben we getransduceerd de alloCTL in figuren 3, 5 en 6 met RRV-EMD ten minste twee dagen voor de test met het protocol beschreven 12.</su...

We beschrijven een protocol om de radiale mobiliteit van niet-aderente immuuncellen in vitro te monitoren met behulp van een celsedimentatie manifold/slide apparaat. Celmigratie wordt gevolgd op monolagen van tumorcellen of op extracellulaire matrix-eiwitten. Onderzoek door licht- en fluorescentiemicroscopie maakt observatie van celmobiliteit en cytotoxische functionaliteit mogelijk.

Radial Mobiliteit en cytotoxische functie van retrovirale replicerende vector getransduceerde, niet-klevende Alloresponsive T-lymfocyten

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de migratie van niet-adherente effector T-lymfocyten over een monolaag van adherente tumorcellen aan te tonen. Dit wordt bereikt door eerst een monolaag van adherente tumorcellen aan te brengen in de wells van met poly-D-lysine gecoate Teflon-gemaskeerde slides; als tweede stap worden fluorescentie-gelabelde effector T-lymfocyten met behulp van een cel-sedimentatie manifold in het centrum van de monolaag gesedimenteerd. Vervolgens worden licht- en fluorescentiemicroscopie gebruikt om de migratie van de niet-adherente cellen over de monolaag te visualiseren.De resultaten tonen aan dat de migratie en effectorfuncties van niet-adherente T-lymfocyten in co-cultuur met een adherente tumorcelmonolaag behouden blijven nadat de lymfocyten zijn getransduceerd met een retrovirale vector. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat de radiale migratie van niet-adherente effector T-lymfocyten kan worden gemeten in co-cultuur met adherente tumorcellen. Dit heeft verstrekkende implicaties voor patiënten met primaire of metastatische hersentumoren, omdat allogene cytotoxische T-lymfocyten die zijn gemodificeerd om een pro-drug-activatorgen tot expressie te brengen, zoals cytosine deaminase, worden getest als een multimodale benadering voor het elimineren van tumoren in de hersenen.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met het vestigen van adherente tumorcelmonolagen vanwege de heterogeniteit van de tumorcelgroei in adherentiekenmerken. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor het genereren van een gelijkmatige tumormonolaag en een effectieve sedimentatie van niet-adherente L-O-C-T-L een ervaren begrip vereisen van de kenmerken van beide celtypen. Begin met het plaatsen van maximaal vier gesteriliseerde.10 met Teflon gecoate slides met putjes in een steriele Petrischaal van 150 millimeter bij 15 millimeter. Plaats een Petrischaal van 35 millimeter bij 10 millimeter met twee tot drie milliliters steriel water naast de slides om voor vochtigheid te zorgen. Precoat vervolgens de slides door elk putje te bedekken met een oplossing van 100 micrograms per milliliter poly-D-lysin of poly-L-lysin.Incubeer de objectglazen gedurende één uur bij kamertemperatuur, aspireer vervolgens de oplossing en spoel het oppervlak van de well tweemaal met PBS, zodra de monsterwells zijn voorbereid. Oogst een confluence fles met adherente tumorcellen. Tel het aantal levensvatbare cellen met behulp van lichtmicroscopie en suspendeer de cellen vervolgens op een concentratie van 5 × 10⁶ cellen per milliliter.Voeg in gebufferd groeimedium vijf tot 10 µL van de celsuspensie toe aan elke put, afhankelijk van het type tumorcel; vul het volume van de put aan tot 40 µL met medium en pipetteer langzaam op en neer om de cellen gelijkmatig te verspreiden. Laat de tumorcellen na het uitplaten 30 minuten bezinken bij kamertemperatuur. Plaats vervolgens het deksel op de Petrischaal en breng deze voorzichtig over naar een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2; incubeer gedurende ten minste 24 uur.Vervang dagelijks het kweekmedium in de wells door voorzichtig een deel van het medium van de monolaag te verwijderen en dit te vervangen door een groter volume vers volledig T-celmedium. De cellen zullen gewoonlijk binnen één tot drie dagen confluent zijn om de cellen voor te bereiden op sedimentatie op de tumorcelmonolaag. Oogst de niet-adherente T-cellen en label deze met een celproliferatiekleurstof volgens het protocol van de fabrikant ten minste één uur vóór de assay.Plaats vervolgens de bevochtigingskamer met de tumorcelglaasjes in de biologische veiligheidskabinet. Was de putjes met PBS door middel van pipetteren en voeg daarna 45 µL compleet medium met 10% serum toe aan de putjes. Schuif een gesteriliseerd sedimentatiemanifold voor cellen over de putjes tot de haak aan het uiteinde van het manifold de onderkant van het glaasje raakt.Zorg ervoor dat het medium zichtbaar is in de kanalen van het manifold. Tel vervolgens de niet-adherente cellen en suspendeer deze in het medium op een concentratie van 1 tot 2 × 10⁵ cellen per µL.Resuspendeer de cellen voorzichtig om celclusters te elimineren die de celsedimentatie zouden kunnen belemmeren. Pipetteer langzaam één microliter van de celsuspensie in het kanaal van de manifold voor elke well. Incubeer het apparaat vervolgens gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur om de cellen in het kanaal op de monolayer te laten bezinken.Nadat de cellen zijn neergeslagen, tilt u het manifold voorzichtig recht omhoog zonder het objectglas aan te raken. Controleer of de celpellets zich binnen de omtrek van het manifoldkanaal bevinden. Bij observatie onder een microscoop moeten de neergeslagen cellen licht aan de monolaag hechten, zodat het voorzichtig verschuiven van het objectglas de pellet niet zal verspreiden.Nadat is bevestigd dat de cellen zijn bezonken, wordt het preparaat overgebracht naar een omgekeerde microscoop die is uitgerust met een koolstofdioxide- en vochtigheidskamer. Gebruik het 4x objectief voor brightfield- en multichannel fluorescentiebeeldvorming van de cellen. Leg beelden vast van een bepaald gebied in de brightfield- en fluorescentiekanalen en voeg vervolgens micronbalken toe met behulp van de software voor beeldvastlegging.Bewaar het preparaat in een bevochtigde incubator tussen de tijdspunten door, zodra alle tijdspunten zijn vastgelegd. Sleep de afbeeldingsbestanden naar het beeldbewerkingsprogramma en selecteer de optie 'laag toevoegen' om een afbeeldingsbestand met meerdere lagen te maken. Voeg de licht- en fluorescentiebeelden samen in één laag.Gebruik de acquisitiesoftware om foto's te maken van een gebied van acht millimeter bij acht millimeter. De software moet zo worden ingesteld dat de vastgelegde beelden automatisch worden samengevoegd (gesticht) met gebruik van het kanaal dat over de gehele put het beste is vertegenwoordigd. Als er alleen fluorescentiekanalen worden gefotografeerd, moet dit het kanaal zijn voor de beeldvorming van de adherente cellen.Als alternatief kunnen de afbeeldingen worden samengevoegd met behulp van beeldbewerkingssoftware. Dit gebeurt door regio's van de afbeeldingen die in de verschillende beelden behouden blijven op elkaar uit te lijnen en de afbeeldingen over elkaar heen te leggen totdat er een compleet beeld is gegenereerd. Voeg de afbeeldingen samen met de beeldbewerkingssoftware.Gebruik de gecombineerde afbeeldingen om met Image J-software fluorescentiekaarten van de oppervlakte-intensiteit te maken om de aggregatie of verspreiding van fluorescerende T-cellen in de loop van de tijd te visualiseren. Humane allo-reactieve cytotoxische T-lymfocyten, bekend als Allo CTL, die waren getransduceerd met een replicatiecompetente retrovirale vector die een expressiegen voor emeraldfoutloos groen fluorescerend eiwit codeert, werden in het centrum van een monolaag glioomcellen geplaatst. Na vier uur hadden de Allo CTL zichtbare aggregaten gevormd tegen de tijd van 24 uur.Er verschenen lege plekken in de adherente cellaag, wat wees op lysis van de tumorcellen, en sommige allo CTL waren voorbij de voorkant gemigreerd. Fluorescerend gelabelde murine Allo CTL werden in het centrum van een laag fluorescent gelabelde gliomacellen geplaatst; na één uur waren de Allo CTL nauw geassocieerd met de gliomacellen en na 48 uur waren de Allo CTL weggemigreerd vanuit het centrum van de cellaag. Op basis van deze beelden werden met ImageJ-software fluorescentiekaarten van de oppervlakte-intensiteit gegenereerd, die een aanzienlijke migratie weg van het centrum na 48 uur laten zien.Het is belangrijk om het kweekmedium van de tumorcelmonolaag dagelijks te verversen om gezonde kweekcondities te behouden. Daarnaast zou, zodra de techniek onder de knie is, de sedimentatie van niet-adherente cellen na deze procedure ongeveer 20 minuten in beslag nemen. Andere methoden, zoals celpad-tracing, kunnen worden gebruikt om vragen te beantwoorden over de snelheid waarmee allo CTL's door de monolaag migreren of de tijd dat zij in contact staan met tumorcellen om hun cytotoxische functies uit te voeren.Dit protocol helpt onderzoekers op het gebied van immuno-gentherapie bij het bestuderen van de migratie van genetisch gemodificeerde T-lymfocyten in co-cultuur met tumorcellen. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u niet-adherente en adherente cellen voor co-cultuur prepareert en hoe u het cel-sedimentatieverdeelstuk gebruikt om de horizontale radiale migratie van niet-adherente cellen over een monolaag van tumorcellen te bestuderen.

radial-mobility-cytotoxic-function-retroviral-replicating-vector

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze techniek laat een efficiënte manier om replicatie-defecte retrovirale aandelen dat codeert voor een menselijk oncogen voor te bereiden, en vervolgens gebruikt voor de inductie van myeloproliferatieve ziekte in de muis model.

De productie van replicatie-defecte Retrovirus door transiënte transfectie van 293T-cellen

We presenteren een protocol om antigeen-specifieke muis T-cellen te produceren met behulp van retrovirale...

Retrovirale Transductie van T-cel-receptoren in Mouse T-cellen

Een snelle, eenvoudige en kosteneffectieve protocol voor het genereren van donor-afgeleide multivirus-specifieke CTL (rCTL) voor infusie aan allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) ontvangers risico op het ontwikkelen CMV, Adv of EBV infecties. Dit productieproces is GMP-compliant en moet zorgen voor de bredere implementatie van T-cel-immunotherapie voorbij gespecialiseerde centra.

Genereren van Multivirus-specifieke T-cellen te voorkomen / virale infecties te behandelen na allogene hematopoietische stamceltransplantatie

Adenovirale genoverdracht in naïeve CD4 T-cellen met transgene expressie van de Coxsackie adenovirus receptor kan de moleculaire analyse van regulatoire T...

Adenovirale transductie van Naïeve CD4 T-cellen aan Treg Differentiatie Studie

We presenteren een snel en flexibel protocol voor een enkelvoudig T-celreceptor (TCR) retroviraal-gebaseerd in vivo expressiesysteem.  Retrovirale vectoren worden gebruikt om beenmerg-progenitorchellen te transduceren om T-celontwikkeling en functie van een enkele TCR in vivo te bestuderen als een alternatief voor TCR-transgene muizen.

Retrovirale Transductie van beenmerg stamcellen voor het genereren van T-cel Receptor Retrogenic Muizen

Vele experimentele systemen zijn gebruikt om de mechanismen reguleren T cel ontwikkeling en functie van een immuunrespons begrijpen. Hier een genetische benadering met behulp van retrovirale transductie wordt beschreven, dat is economisch, tijd efficiënt, en nog belangrijker, zeer informatieve bij het identificeren van de regelgeving paden.

Retrovirale Transductie van helper T-cellen als een genetische benadering om te studeren mechanismen die hun differentiatie en functie

De huidige protocol combineert eencellige gekoppeld menselijke TCR alpha en beta keten sequencing met gestroomlijnd generatie van retrovirale vectoren compatibel met in vitro en in vivo TCR expressie.

Gestroomlijnd eencellige TCR isolatie en generatie van retrovirale vectoren voor In Vitro en In Vivo expressie van menselijke TCRs

Hier beschrijven we een protocol voor de genoom-brede mapping van de integratie-sites van Moloney-muizen-leukemie-virus-gebaseerde retrovirale vectoren in menselijke cellen.

Retrovirale Scanning: Mapping MLV Integration Sites om de specifieke codespecifieke regio&#39;s te definiëren

Hier beschrijven we een methode voor retrovirale overexpressie en adoptieoverdracht van murine B-1a cellen om in vivo B-1a celmigratie en lokalisatie te onderzoeken. Dit protocol kan worden uitgebreid voor diverse downstream functionele tests, waaronder kwantificering van donor B-1a cellokalisatie of analyse van donorcel-afgeleide gedesinteveneerde factoren na adoptieve overdracht.

Retrovirale overexpressie van CXCR4 op Murine B-1a Cellen en adoptieve overdracht voor gerichte B-1a celmigratie naar het beenmerg en igm productie

De huidige studie toont protocollen voor het beoordelen van de vroege lotsverbintenis van virusspecifieke TFH-cellen en het manipuleren van genexpressie in deze cellen.

Toegang tot vroege differentiatie van virusspecifieke folliculaire helper CD4+ T-cel in acute LCMV-geïnfecteerde muizen

We presenteren verbeterde protocollen voor retrovirale transductie van transportreceptoren en competitieve homing om receptor-gemedieerde orgaan- en micro-omgevingsspecifieke lymfocytenpositionering te bestuderen. Deze methode biedt waardevolle inzichten in mechanismen voor het transport van immuuncellen en heeft potentiële toepassingen in toekomstig fundamenteel en therapeutisch onderzoek.

Efficiënte retrovirale transductie en competitieve homing voor het onderzoeken van GPCR-gemedieerde T-cellokalisatie in diverse weefselmicro-omgevingen

Leer de radiale migratie van niet-hechtende effector T-lymfocyten over tumorcellagen met behulp van een celbezinkingsmanifold en fluorescentiemicroscopie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar immuunresponsen in tumoromgevingen.

Radial Mobiliteit en cytotoxische functie van retrovirale replicerende vector getransduceerde, niet-klevende Alloresponsive T-lymfocyten (Video) | JoVE Journal

Radial Mobiliteit en cytotoxische functie van retrovirale replicerende vector getransduceerde, niet-klevende Alloresponsive T-lymfocyten

Meer video's verkennen