Radial Mobiliteit en cytotoxische functie van retrovirale replicerende vector getransduceerde, niet-klevende Alloresponsive T-lymfocyten

Het algemene doel van het volgende experiment is om de migratie van niet-adherente effector T-lymfocyten over een monolaag van adherente tumorcellen aan te tonen. Dit wordt bereikt door eerst een monolaag van adherente tumorcellen aan te brengen in de wells van met poly-D-lysine gecoate Teflon-gemaskeerde slides; als tweede stap worden fluorescentie-gelabelde effector T-lymfocyten met behulp van een cel-sedimentatie manifold in het centrum van de monolaag gesedimenteerd. Vervolgens worden licht- en fluorescentiemicroscopie gebruikt om de migratie van de niet-adherente cellen over de monolaag te visualiseren.

De resultaten tonen aan dat de migratie en effectorfuncties van niet-adherente T-lymfocyten in co-cultuur met een adherente tumorcelmonolaag behouden blijven nadat de lymfocyten zijn getransduceerd met een retrovirale vector. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat de radiale migratie van niet-adherente effector T-lymfocyten kan worden gemeten in co-cultuur met adherente tumorcellen. Dit heeft verstrekkende implicaties voor patiënten met primaire of metastatische hersentumoren, omdat allogene cytotoxische T-lymfocyten die zijn gemodificeerd om een pro-drug-activatorgen tot expressie te brengen, zoals cytosine deaminase, worden getest als een multimodale benadering voor het elimineren van tumoren in de hersenen.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met het vestigen van adherente tumorcelmonolagen vanwege de heterogeniteit van de tumorcelgroei in adherentiekenmerken. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor het genereren van een gelijkmatige tumormonolaag en een effectieve sedimentatie van niet-adherente L-O-C-T-L een ervaren begrip vereisen van de kenmerken van beide celtypen. Begin met het plaatsen van maximaal vier gesteriliseerde.

10 met Teflon gecoate slides met putjes in een steriele Petrischaal van 150 millimeter bij 15 millimeter. Plaats een Petrischaal van 35 millimeter bij 10 millimeter met twee tot drie milliliters steriel water naast de slides om voor vochtigheid te zorgen. Precoat vervolgens de slides door elk putje te bedekken met een oplossing van 100 micrograms per milliliter poly-D-lysin of poly-L-lysin.

Incubeer de objectglazen gedurende één uur bij kamertemperatuur, aspireer vervolgens de oplossing en spoel het oppervlak van de well tweemaal met PBS, zodra de monsterwells zijn voorbereid. Oogst een confluence fles met adherente tumorcellen. Tel het aantal levensvatbare cellen met behulp van lichtmicroscopie en suspendeer de cellen vervolgens op een concentratie van 5 × 10⁶ cellen per milliliter.

Voeg in gebufferd groeimedium vijf tot 10 µL van de celsuspensie toe aan elke put, afhankelijk van het type tumorcel; vul het volume van de put aan tot 40 µL met medium en pipetteer langzaam op en neer om de cellen gelijkmatig te verspreiden. Laat de tumorcellen na het uitplaten 30 minuten bezinken bij kamertemperatuur. Plaats vervolgens het deksel op de Petrischaal en breng deze voorzichtig over naar een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2; incubeer gedurende ten minste 24 uur.

Vervang dagelijks het kweekmedium in de wells door voorzichtig een deel van het medium van de monolaag te verwijderen en dit te vervangen door een groter volume vers volledig T-celmedium. De cellen zullen gewoonlijk binnen één tot drie dagen confluent zijn om de cellen voor te bereiden op sedimentatie op de tumorcelmonolaag. Oogst de niet-adherente T-cellen en label deze met een celproliferatiekleurstof volgens het protocol van de fabrikant ten minste één uur vóór de assay.

Plaats vervolgens de bevochtigingskamer met de tumorcelglaasjes in de biologische veiligheidskabinet. Was de putjes met PBS door middel van pipetteren en voeg daarna 45 µL compleet medium met 10% serum toe aan de putjes. Schuif een gesteriliseerd sedimentatiemanifold voor cellen over de putjes tot de haak aan het uiteinde van het manifold de onderkant van het glaasje raakt.

Zorg ervoor dat het medium zichtbaar is in de kanalen van het manifold. Tel vervolgens de niet-adherente cellen en suspendeer deze in het medium op een concentratie van 1 tot 2 × 10⁵ cellen per µL.

Resuspendeer de cellen voorzichtig om celclusters te elimineren die de celsedimentatie zouden kunnen belemmeren. Pipetteer langzaam één microliter van de celsuspensie in het kanaal van de manifold voor elke well. Incubeer het apparaat vervolgens gedurende 20 tot 30 minuten bij kamertemperatuur om de cellen in het kanaal op de monolayer te laten bezinken.

Nadat de cellen zijn neergeslagen, tilt u het manifold voorzichtig recht omhoog zonder het objectglas aan te raken. Controleer of de celpellets zich binnen de omtrek van het manifoldkanaal bevinden. Bij observatie onder een microscoop moeten de neergeslagen cellen licht aan de monolaag hechten, zodat het voorzichtig verschuiven van het objectglas de pellet niet zal verspreiden.

Nadat is bevestigd dat de cellen zijn bezonken, wordt het preparaat overgebracht naar een omgekeerde microscoop die is uitgerust met een koolstofdioxide- en vochtigheidskamer. Gebruik het 4x objectief voor brightfield- en multichannel fluorescentiebeeldvorming van de cellen. Leg beelden vast van een bepaald gebied in de brightfield- en fluorescentiekanalen en voeg vervolgens micronbalken toe met behulp van de software voor beeldvastlegging.

Bewaar het preparaat in een bevochtigde incubator tussen de tijdspunten door, zodra alle tijdspunten zijn vastgelegd. Sleep de afbeeldingsbestanden naar het beeldbewerkingsprogramma en selecteer de optie 'laag toevoegen' om een afbeeldingsbestand met meerdere lagen te maken. Voeg de licht- en fluorescentiebeelden samen in één laag.

Gebruik de acquisitiesoftware om foto's te maken van een gebied van acht millimeter bij acht millimeter. De software moet zo worden ingesteld dat de vastgelegde beelden automatisch worden samengevoegd (gesticht) met gebruik van het kanaal dat over de gehele put het beste is vertegenwoordigd. Als er alleen fluorescentiekanalen worden gefotografeerd, moet dit het kanaal zijn voor de beeldvorming van de adherente cellen.

Als alternatief kunnen de afbeeldingen worden samengevoegd met behulp van beeldbewerkingssoftware. Dit gebeurt door regio's van de afbeeldingen die in de verschillende beelden behouden blijven op elkaar uit te lijnen en de afbeeldingen over elkaar heen te leggen totdat er een compleet beeld is gegenereerd. Voeg de afbeeldingen samen met de beeldbewerkingssoftware.

Gebruik de gecombineerde afbeeldingen om met Image J-software fluorescentiekaarten van de oppervlakte-intensiteit te maken om de aggregatie of verspreiding van fluorescerende T-cellen in de loop van de tijd te visualiseren. Humane allo-reactieve cytotoxische T-lymfocyten, bekend als Allo CTL, die waren getransduceerd met een replicatiecompetente retrovirale vector die een expressiegen voor emeraldfoutloos groen fluorescerend eiwit codeert, werden in het centrum van een monolaag glioomcellen geplaatst. Na vier uur hadden de Allo CTL zichtbare aggregaten gevormd tegen de tijd van 24 uur.

Er verschenen lege plekken in de adherente cellaag, wat wees op lysis van de tumorcellen, en sommige allo CTL waren voorbij de voorkant gemigreerd. Fluorescerend gelabelde murine Allo CTL werden in het centrum van een laag fluorescent gelabelde gliomacellen geplaatst; na één uur waren de Allo CTL nauw geassocieerd met de gliomacellen en na 48 uur waren de Allo CTL weggemigreerd vanuit het centrum van de cellaag. Op basis van deze beelden werden met ImageJ-software fluorescentiekaarten van de oppervlakte-intensiteit gegenereerd, die een aanzienlijke migratie weg van het centrum na 48 uur laten zien.

Het is belangrijk om het kweekmedium van de tumorcelmonolaag dagelijks te verversen om gezonde kweekcondities te behouden. Daarnaast zou, zodra de techniek onder de knie is, de sedimentatie van niet-adherente cellen na deze procedure ongeveer 20 minuten in beslag nemen. Andere methoden, zoals celpad-tracing, kunnen worden gebruikt om vragen te beantwoorden over de snelheid waarmee allo CTL's door de monolaag migreren of de tijd dat zij in contact staan met tumorcellen om hun cytotoxische functies uit te voeren.

Dit protocol helpt onderzoekers op het gebied van immuno-gentherapie bij het bestuderen van de migratie van genetisch gemodificeerde T-lymfocyten in co-cultuur met tumorcellen. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u niet-adherente en adherente cellen voor co-cultuur prepareert en hoe u het cel-sedimentatieverdeelstuk gebruikt om de horizontale radiale migratie van niet-adherente cellen over een monolaag van tumorcellen te bestuderen.