Radial Mobiliteit en cytotoxische functie van retrovirale replicerende vector getransduceerde, niet-klevende Alloresponsive T-lymfocyten

Het algemene doel van het volgende experiment is om de migratie van niet-adherente effector T-lymfocyten over een monolaag van adherante tumorcellen te laten zien. Dit wordt bereikt door eerst een monolaag van adherante tumorcellen in de putjes van poly D-lysine gecoate Teflon-gemaskerde slides te vestigen als tweede stap worden fluorescerend gelabelde effector T-lymfocyten gesedimeerd in het centrum van de monolaag met behulp van een celsedimentatie-manifold. Vervolgens worden licht- en fluorescentiemicroscopie gebruikt om de migratie van de niet-adherente cellen over de monolaag te visualiseren.

De resultaten laten zien dat de migratie en effectorfuncties van niet-adherente T-lymfocyten in co-cultuur met een adherante tumorcelmonolaag worden gehandhaafd nadat de lymfocyten zijn getransduceerd met een retroviraal vector. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat radiale migratie van niet-adherente effector T-lymfocyten kan worden gemeten in coal-cultuur met adherante tumorcellen. Dit heeft verstrekkende implicaties voor patiënten met primaire of gemetastaseerde hersentumoren omdat allogene cytotoxische T-lymfocyten die zijn gemodificeerd om een pro-drug-activatorgen, zoals cytosine deaminase, tot expressie te brengen, worden getest als een multimodale aanpak voor het elimineren van tumoren in de hersenen.

Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode moeite hebben met het vestigen van monolagen van adherante tumorcellen vanwege de heterogeniteit van tumorcelgroei in adherentiekarakteristieken. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, aangezien de stappen voor het genereren van een gelijkmatige tumormonolaag en een effectieve sedimentatie van niet-adherente L-O-C-T-L een ervaren begrip van de kenmerken van beide celtypen vereisen. Om te beginnen plaatst u maximaal vier gesteriliseerde.

10-well Teflon gecoate slides in een steriele 150 millimeter bij 15 millimeter petrischaal. Plaats een 35 millimeter bij 10 millimeter petrischaal met twee tot drie milliliter sterieel water naast de slides om vocht te bieden. Bedek vervolgens de slides door elk putje te bedekken met een oplossing van 100 microgram per milliliter van poly D-lycine of poly L-lycine.

Incubeer de slides gedurende één uur bij kamertemperatuur, zuig vervolgens de oplossing op en spoel het oppervlak van de putjes twee keer met PBS met de monsterputjes. Verzamel een confluente flacon met adherante tumorcellen. Tel het aantal levensvatbare cellen door lichtmicroscopie en suspendeer vervolgens de cellen in een concentratie van vijf keer 10 tot de zesde cellen per milliliter.

Voeg in gebufferd groeimedium vijf tot 10 microliter van de celsuspensie toe aan elke put, afhankelijk van het tumorceltype, breng het volume van de put op tot 40 microliter met medium en pipet langzaam op en neer om de cellen gelijkmatig te verdelen. Laat de tumorcellen na het zaaien van de putjes 30 minuten op kamertemperatuur bezinken. Plaats vervolgens het deksel op de petrischaal en draag het voorzichtig over naar een gehumidificeerde incubator van 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide en incubeer gedurende ten minste 24 uur.

Ververs dagelijks het kweekmedium op de putjes door voorzichtig een deel van het medium van de monolaag te verwijderen en het te vervangen door een groter volume vers compleet T-celmedium. De cellen zijn doorgaans confluent binnen één tot drie dagen om cellen voor te bereiden op sedimentatie op de tumorcelmonolaag. Verzamel de niet-adherente T-cellen en label ze met een celproliferatiekleurstof volgens het protocol van de fabrikant ten minste één uur voorafgaand aan de test.

Plaats vervolgens de gehumidificeerde kamer met de tumorcelslides in de biologische veiligheidskast. Was de putjes met PBS door te pipetten en voeg vervolgens 45 microliter compleet medium met 10% serum toe aan de putjes. Schuif een gesteriliseerde celsedimentatie-manifold over de putjes totdat de haak aan het uiteinde van de manifold de bodem van de slide raakt.

Zorg ervoor dat het medium zichtbaar is in de kanalen van de manifold. Tel vervolgens de niet-adherente cellen en suspendeer ze in een concentratie van een tot twee keer 10 tot de vijfde cellen per microliter in het medium.

Verstoor de cellen voorzichtig om eventuele celclusters te elimineren die de celsedimentatie zouden kunnen verstoren. Pipet langzaam één microliter van de celsuspensie in het kanaal van de manifold voor elke put en incubeer vervolgens het apparaat gedurende 20 tot 30 minuten op kamertemperatuur om de cellen in het kanaal op de monolaag te laten bezinken.

Nadat de cellen zijn bezonken, tilt u de manifold recht omhoog zonder de slide aan te raken. Zorg ervoor dat de celpellets binnen de omtrek van het manifoldkanaal zijn gezet. Met behulp van een microscoop zouden de gezette cellen lichtjes aan de monolaag moeten hechten, zodat het voorzichtig bewegen van de slide de pellet niet zal verspreiden.

Na te hebben bevestigd dat de cellen zijn gesedimeerd, brengt u de slide over naar een omgekeerde microscoop uitgerust met een koolstofdioxide- en vochtigheidskamer. Gebruik de viervoudige objectief voor helderveld en meerkanaals fluorescentiebeeldvorming van de cellen. Verzamel beelden van een bepaald gebied in helderveld- en fluorescentiekanalen en voeg vervolgens micronbalken toe met beeldopnamesoftware.

Bewaar de slide in een gehumidificeerde incubator tussen de tijdstippen, zodra alle tijdstippen zijn verkregen. Sleep en plaats de beeldbestanden in het beeldbewerkingsprogramma en selecteer de optie laag toevoegen om een ​​beeldbestand met meerdere lagen te maken. Voeg de licht- en fluorescentiebeelden samen in één laag.

Gebruik de acquisitiesoftware om foto's te maken van een gebied van acht millimeter bij acht millimeter. De software moet zijn ingesteld om vastgelegde beelden automatisch samen te voegen met behulp van het kanaal dat het beste wordt weergegeven over de hele put. Als alleen fluorescentiekanalen worden afgebeeld, zou dit het kanaal moeten zijn voor het beeldvormen van de adherante cellen.

Alternatief kunnen de beelden worden samengevoegd met beeldbewerkingssoftware. Dit gebeurt door gebieden van de beelden uit te lijnen die behouden blijven van het ene beeld naar het andere en de beelden op elkaar te plaatsen