Name: Influenza Virus Voortplanting in bevruchte kippeneieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Leer hoe je grote hoeveelheden hooggetitreerd influenzavirus produceert in bevruchte kippeneieren. Deze methode is essentieel voor virologisch onderzoek en vaccinontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De huidige studie werd ondersteund door de NIH-subsidies HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.), en de American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)

OPMERKING: Algemene opmerkingen: Voer alle procedures waarbij manipulatie van het ei onder steriele omstandigheden, en steriele techniek moet dienovereenkomstig worden gebruikt. Pre-clean alle apparatuur met 70% ethanol voor gebruik. In het algemeen moeten influenza virus inoculatie en oogst worden uitgevoerd in een BSL-2 laboratorium. Echter, als dit protocol wordt gebruikt om zich te verspreiden veel meer pathogene influenza virussen (bv pandemie en pre-pandemische stammen, stammen die een gevaar voor pluimvee en vee, hoogpathogene aviaire influenza stammen, de 1918 H1N1-stam vormen), hogere bioveiligheid niveaus en in sommige gevallen, zijn biosecurity voorzorgsmaatregelen en vergunningen vereist. De lokale institutionele bioveiligheid comité moet al het onderzoek met het influenzavirus te keuren. 1. Voorbereiding van Eieren voor Inenting <ol><li> Verkrijgen serum-pathogeen vrij (SPF) vers bevruchte vogeleieren van een geschikte leverancier. Gewoonlijk worden kippeneieren gebruikt. Eieren moeten onsed direct na aankomst. </li><li> Bij aankomst plaats eieren in een bevochtigde ei incubator met een automatische ei turner om eieren regelmatig draaien. Als een automatische ei turner niet beschikbaar is, handmatig draaien eieren minstens 2-3 keer per dag (zorg ervoor om handschoenen te dragen en houden alles zo steriel mogelijk). </li><li> Incubeer eieren bij 37 ° C en 55-60% vochtigheid 10-11 dagen. </li></ol> 2. schouwinrichtingen <ol><li> Gebruik een ei candler het ei tegen een helder licht onderzoeken in een donkere kamer om eieren onvruchtbaarheid checken schouwen na ongeveer 7 of 8 dagen incubatie. <ol><li> Veeg het ei candler met 70% ethanol. Verander handschoenen vaak en desinfecteren met 70% ethanol om het risico op besmetting door ziekteverwekkers minimaliseren. </li><li> Haal de eieren uit de broedmachine en plaats ze in lege eierdozen. </li><li> Uitschakelen van de verlichting in de kamer. </li><li> Houd het brede uiteinde van elk ei een voor een tegen candler. </li><li> Observeer het ei te determine als het vruchtbaar of onvruchtbaar. OPMERKING: Dunne bloedvaten leidt tot een boonvormige embryo moet duidelijk zichtbaar zijn. Onbevruchte eieren zal verschijnen als een kleine bloedvlek met een zichtbare eigeel. </li></ol></li><li> Gooi eieren die onbevrucht zijn, en de terugkeer van de levensvatbare eieren naar de incubator. Eieren niet verlaten buiten de incubator gedurende meer dan 30 min. Als de status van een ei niet kan worden bevestigd, markeren, en observeer het later. </li></ol> 3. Bereiding van virusinoculum <ol><li> Verdun influenza virus stock tot 10 maart - 10 april pfu / ml in steriel PBS bevattende 10 mM HEPES (pH 7,4). Kritische stap: Verdun het virus voorraad direct voor gebruik en bewaar het verdunde virus op het ijs de hele tijd. </li></ol> 4. Influenza virusinoculatie via de allantoïs Route <ol><li> Op de dag van virus inoculatie (dag 10 of 11), kaars de eieren opnieuw en dode embryo elimineren. Onderscheiden levend embryo&#39;s doorzoekt beweging in het ei. </li><li> Verwijder drie eieren uit de incubator, en leg de eieren in een aparte houder met de luchtzak up. </li><li> Markeren het luchtruim van de eieren met een permanent marker. </li><li> Was de eierschaal boven het luchtruim met 70% ethanol. </li><li> Doe de eieren met de luchtruimte in een eierdoos en in een bioveiligheid kap (BSL-2). </li><li> Gebruik een steriele 18G naald om een ​​klein gaatje te slaan in de shell over de luchtzak van elk ei. Wees voorzichtig dat u de naald te diep in te voegen om te voorkomen steken het embryo of de dooier. </li><li> Het opstellen van de verdunde influenzavirus in een steriele 1 ml spuit en bevestig een 22G naald. </li><li> Vooraf zorgvuldig de spuit met naald in een hoek van 45 ° in de allantoïsholte. </li><li> Injecteer 0,2 ml van de verdunde influenzavirus. </li><li> Herhaal de injectie met de andere twee eieren, en vervolgens de spuit en naald weg te gooien. </li><li> Dicht het gat met een druppel lijm uit een lijmpistool (of gesmolten paraffine). Be oppassen dat de lijm niet in het ei lekt. </li><li> Leg de eieren terug in het ei incubator met de luchtruimte omhoog gericht. </li><li> Herhaal stap 4,2-4,12 totdat alle eieren geïnoculeerd. </li></ol> 5. incubatietijd <ol><li> Incubeer de besmette eieren zonder te draaien bij 37 ° C en ~ 60% vochtigheid. </li><li> Kies optimale incubatietijd afhankelijk van het influenzavirus. Incubeer influenza A gedurende 48 uur; incubeer influenza B en C voor 72 uur. </li></ol> 6. Influenza Virus Harvest <ol><li> Na incubatie, koel de eieren bij 4 ° C gedurende ten minste 4 uur (of O / N) om de embryo te doden en de bloedvaten vernauwen om het risico van besmetting van de geïnfecteerde allantoïsvloeistof met bloed. Doe dit om te voorkomen dat rode bloedcellen absorberen het virus, die de opbrengst vermindert. Alternatief chill eieren gedurende 30 minuten bij -20 ° C; maar dit verhoogt het risico op besmetting bloed. </li><li> Nadat de eieren voldoende gekoeld zijn geweest, de overdracht van de eieren naar een bioveiligheid kap. Leg het ei in een stevige houder met de luchtzak naar boven. Reinig het ei oppervlak met 70% ethanol. </li><li> Gebruik steriele schaar om de eierschaal boven de luchtzak te openen. Verwijder de schil rond de luchtzak terwijl dat evenwel niet tot de chorioallantoïsmembraan vernietigen. </li><li> Open de chorioallantoïsmembraan met steriele stompe pincet. Beweeg terzijde het embryo en de dooierzak met een kleine spatel of lepel. Verzorgen de dooier niet te scheuren. </li><li> Met behulp van een 1 ml Eppendorf pipet voorzichtig het verzamelen van de allantoïsvloeistof. Indien nodig, kantel het ei een beetje naar de zijkant om zo veel vocht als mogelijk te verzamelen. </li><li> Combineer de allantoïsvloeistof van de eieren in een 50 ml plastic conische buis. Houd buizen op ijs te allen tijde tijdens virus oogst. Een ei opbrengsten 5-10 ml van een licht geelachtige vloeistof. </li><li> Spin de virus bevattende allantoïsvloeistof bij 1000 xg gedurende 10 min bij 46, C vuil pelleteren. Breng de heldere vloeistof in een nieuwe 50 ml buis op ijs bewaard. Gooi de eieren in een BSL-2 afvalcontainer. </li></ol> 7. Opslag <ol><li> Onmiddellijk aliquot de geklaarde allantoïsvocht (bijvoorbeeld 50, 100 of 500 ul aliquots) en module bevriezen in vloeibare stikstof. Transfer bevroren virusvoorraden tot -80 ° C vriezer voor langdurige opslag. </li></ol>

<ol><li>Centers for Disease Control and Prevention (CDC). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates+of+deaths+associated+with+seasonal+influenza+---+United+States%2C+1976-2007%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR.+Morbidity+and+mortality+weekly+report%22%5BJournal%5D)">Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007.</a> MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).</li>
<li>Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+and+pandemic+potential+of+swine-origin+H1N1+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus.</a> Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).</li>
<li>Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+Influenza+Viruses+with+Genes+from+the+1918+Pandemic+Virus%3A+Functional+Roles+of+Alveolar+Macrophages+and+Neutrophils+in+Limiting+Virus+Replication+and+Mortality+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice.</a> J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).</li>
<li>Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+and+the+challenge+for+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immu%22%5BJournal%5D)">Influenza and the challenge for immunology.</a> Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).</li>
<li>Webster, R. G., Govorkova, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuing+challenges+in+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Continuing challenges in influenza.</a> Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).</li>
<li>Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSzretter%2C+KJ+%22Current+protocols+in+microbiology%22">Current protocols in microbiology</a>. , Wiley. (2006).</li>
<li>Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+influenza-induced+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome.</a> Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).</li>
<li>Ito, T., Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+sialic+acid-galactose+linkages+in+the+chicken+egg+amnion+and+allantois+influence+human+influenza+virus+receptor+specificity+and+variant+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection.</a> J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).</li>
<li>Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+amniotic+passage+in+the+egg-adaptation+of+human+influenza+virus+is+revealed+by+haemagglutinin+sequence+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses.</a> J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).</li>
<li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells).</a> Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Influenza veroorzaakt een grote wereldwijde ziektelast, en werk gaat in het begrijpen van de pathogenese van longbeschadiging 7. Om vergemakkelijkt onderzoek op dit dodelijke ziekte, zijn verschillende methoden ontwikkeld om het influenzavirus 6 propageren. Hier beschrijven we een techniek om influenzavirus produceren kippeneieren. Het voordeel van deze methode is dat het zeer reproduceerbaar en resulteert in grote hoeveelheden hoge titer influenzavirus bestanden, die vaak nodig is voor in vitr...

Influenza A blijft een belangrijke bedreiging voor de menselijke gezondheid. Het is een potentieel verwoestende ziekte van de luchtwegen met een grote globale last veroorzaken tot 500.000 doden wereldwijd per jaar 1. Influenza virussen zijn in de familie Orthomyxoviridae en uitvoeren 8 negatieve-sense enkelstrengs RNA in hun genoom 1,2. De hoge veranderlijkheid (dwz antigene &quot;drift&quot;) van het virale genoom voorkomt langdurige immuniteit. Bovendien influenza steeds resistent tegen antivirale geneesmiddelen 3. De 2009 H1N1-grieppandemie gemarkeerd alle uitdagende kwesties in verband met influenza ziekte (pandemische stam, anti-virale resistentie, vertraagde de productie van vaccins). De formulering vaccin wordt jaarlijks vastgesteld door de World Health Organization voor de meest waarschijnlijke pathogene influenza stammen (een voor elk van H1N1, H3N2 en influenza B) 4. Omdat deze methode is gebaseerd op de voorspelde influenzastams, pathogene stammen worden soms ten onrechte geïdentificeerd en effectiviteit van het vaccin daalt dramatisch. Bovendien kan de verschijning van nieuwe influenzastammen deze preventieve programma&#39;s veroorzaken pandemische ziekte 2 te omzeilen. De creatie van een universeel griepvaccin is ongrijpbaar 5 geweest. Daarom moet het onderzoek voort te zetten naar het begrijpen van de pathogenese van longschade. Om faciliteit laboratoriumonderzoek zijn verscheidene werkwijzen ontwikkeld voor virale isolatie en vermeerdering 6. Menselijke influenzavirussen kan worden geamplificeerd in verschillende zoogdiercel substraten. Echter, zijn het genereren van hoge titer virussen in grote hoeveelheden best bereikt in bebroede eieren. Het volgende protocol beschrijft een techniek voor influenza A virus verspreiding en opslag van bestaand virus voorraden.

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs&nbsp;</td><td>VALO BioMedia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>humidified egg incubator&nbsp;</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Model 2100</td><td></td></tr><tr><td>automatic egg turner</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Model 3200</td><td></td></tr><tr><td>egg candler</td><td>FARM iNNOVATORS</td><td>Model 3300&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>18G needle</td><td>BD Bioscience</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>20G / 22G needle</td><td>BD Bioscience</td><td>305176 / 305156</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol>99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td>verdund tot 70% met water</td></tr><tr><td>glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro"</td><td>Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.</td><td>Model 1105</td><td></td></tr><tr><td>glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp"</td><td>Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.</td><td>220-34ZIP30</td><td></td></tr><tr><td>MDCK cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2935</td><td></td></tr><tr><td>Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10%</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>724908</td><td></td></tr></tbody></table>

influenza virus voortplanting in bevruchte kippeneieren

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infectie is geassocieerd met ongeveer 36.000 doden en meer dan 200.000 ziekenhuisopnames per jaar in de Verenigde Staten. De continue opkomst van nieuwe influenzavirusstammen door mutatie en recombinatie bemoeilijkt de controle van het virus en vereist de permanente ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen en vaccins. Het laboratoriumonderzoek van influenza is een betrouwbare en kosteneffectieve werkwijze voor de vermeerdering van het virus. Hier wordt een uitgebreid protocol waarin influenza A virus propagatie in vruchtbare kippeneieren, die consequent levert hoge titer virale voorraden. Kortom, zijn serum pathogeenvrije (SPF) bevruchte kippeneieren geïncubeerd bij 37 ° C en 55-60% luchtvochtigheid gedurende 10 - 11 dagen. Gedurende deze periode, kan ontwikkeling van het embryo gemakkelijk worden gecontroleerd met behulp van een ei candler. Virusinoculatie wordt uitgevoerd door injectie van het virus voorraad verricht naar de allantoïsholte behulp van een naald. Na 2 dagen incubatie bij 37 ° C, de eierengekoeld gedurende ten minste 4 uur bij 4 ° C. De eierschaal boven de luchtzak en het chorioallantoïsmembraan worden vervolgens voorzichtig geopend en de allantoïsvloeistof met het virus geoogst. De vloeistof wordt uit afval door centrifugatie geklaard porties verdeeld en overgebracht naar -80 ° C voor langdurige opslag. De grote hoeveelheid (5-10 ml virus bevattende vloeistof per ei) en hoge virustiter die meestal bereikt met dit protocol is het gebruik van eieren voor viruspreparaat voordelige wijze gemaakt, met name voor in vitro studies die grote hoeveelheden nodig virus waarbij hoge doseringen van hetzelfde virus voorraad nodig.

Meerdere methoden ontwikkeld om influenzavirus titreren. Een overweging bij het ​​kiezen van een geschikte methode is dat sommige bepalen totale deeltjes onafhankelijk van de levensvatbaarheid (bijv hemagglutinine-test), terwijl anderen zijn gebaseerd op de besmettelijkheid, die levensvatbaar virusdeeltjes zal beoordelen (bijvoorbeeld plaque assay) 6. Hier, de virale titer van allantoïsvloeistof vanuit kippeneieren geënt met een muis-aangepaste influenzavirus (A / PR / 8/34) werd bepaald doo...

Bevruchte kippeneieren worden veel gebruikt om grote hoeveelheden humaan influenza A-virus te produceren, omdat ze een handig en kosteneffectief systeem bieden om hoge opbrengsten van het virus te bewijzen.

Influenza Virus Voortplanting in bevruchte kippeneieren

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Het algemene doel van deze procedure is het produceren van grote hoeveelheden influenzavirus met een hoge titer in een kostenefficiënt systeem. Dit wordt bereikt door eerst serum-pathogeenvrije, vers bevruchte kippeneieren te verkrijgen. In de tweede stap worden de eieren geïnfecteerd met influenzavirus via de allantoïsche route.Gedurende 48 uur wordt vervolgens het Alan Toic-vloeistof, waarin het virus zich bevindt, geoogst en wordt het virus snel ingevroren in vloeibare stikstof. Uiteindelijk kunnen plaque- en hemagglutinine-assays worden uitgevoerd om de invloed van de virustiter van de verzamelde Alan Toic-vloeistof te bepalen. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de oogststappen zeer gevoelig zijn en een zorgvuldige behandeling van de eieren en een goede kennis van hun anatomie vereisen.Verkrijg vóór aanvang van de procedure serumvrije, vers bevruchte kweekeieren van een geschikte leverancier. Plaats de eieren direct na ontvangst in een bevochtigde eierbroeder met een automatische eieromdraaier om de eieren regelmatig te roteren bij 37 °C en een vochtigheid van 55 tot 60% gedurende 10 tot 11 dagen. Draag na zeven tot acht dagen incubatie handschoenen die zijn gedesinfecteerd met 70% ethanol.Veeg een eierkijker af met ethanol en verplaats de eieren van de incubator naar lege eierdozen. Schakel vervolgens de lichten uit en houd de eieren één voor één bij het brede uiteinde tegen de kijker. Als een ei vruchtbaar is, moeten dunne bloedvaten die naar een boonvormige embryo leiden duidelijk zichtbaar zijn.Als het ei onbevrucht is, zal een kleine bloedvlek met een zichtbare eidooier worden waargenomen. Gooi vervolgens de onbevruchte eieren weg en plaats het levensvatbare ei terug in de incubator. Als de status van een ei niet kan worden bevestigd, markeer dit dan voor latere observatie op dag 10 of 11 na bevruchting en verdun, direct voor gebruik, een influenza A-virusvoorraad tot 1 × 10³ tot 10⁴ PFU per milliliter in steriele PBS aangevuld met hippies en plaats dit op ijs.Voer vervolgens opnieuw een eikaarscontrole uit en verwijder alle dode, immobile embryo's. Neem daarna drie eieren uit de incubator en plaats deze in een aparte houder. Markeer de luchtkamer van de eieren met een watervaste stift, terwijl de luchtzakken naar boven zijn gericht.Was vervolgens het gebied boven de luchtkamer met 70% ethanol en breng de eieren met de luchtkamer naar boven over naar een eierdoos binnen een BSL-2 biosafety cabinet. Gebruik nu een steriele 18 gauge naald om een klein gaatje in de schaal boven de luchtkamer van elk ei te prikken. Let er hierbij op de naald niet te diep in te brengen om te voorkomen dat het embryo of de dooier wordt geraakt.Trek vervolgens het verdunde influenzavirus op in een steriele spuit van één milliliter. Bevestig een naald van 22 gauge en voer de naald voorzichtig onder een hoek van 45 graden in de allantoïsche holte van het eerste ei. Injecteer 0,2 milliliters van het verdunde virus in het ei. Nadat de andere twee eieren zijn geïnjecteerd, gooit u de spuit en naald weg en dicht u elk gat af met een druppel lijm uit een lijmpistool.Zorg ervoor dat de lijm niet in het ei lekt en plaats de eieren vervolgens terug in de incubator. Nadat alle eieren zijn geïnoculeerd, worden de geïnfecteerde eieren gedurende de optimale incubatietijd bij 37 °C en 60% luchtvochtigheid geïncubeerd zonder te keren, afhankelijk van het type influenzavirus.Aan het einde van de incubatieperiode worden de eieren minimaal vier uur gekoeld bij vier graden Celsius om het embryo te doden en de bloedvaten te vernauwen. Wanneer de eieren voldoende zijn afgekoeld, worden ze overgebracht naar een biosafety-kabinet en een stevige houder, waarna de oppervlakken van de eieren worden gereinigd met 70% ethanol.Gebruik vervolgens een steriele schaar om de eierschaal boven de luchtkamer van het eerste ei te openen. Verwijder de schaal rondom de luchtkamer. Doe dit zorgvuldig om te voorkomen dat het chorio-allantoïse membraan beschadigd raakt.Gebruik vervolgens steriele stompe pincetten om het chorio-allantoïse vlies te openen en schuif het embryo en de dooierzak voorzichtig opzij met een kleine spatel of lepel, waarbij u er goed op let dat de dooier niet scheurt. Verzamel vervolgens, met behulp van een pipet van één milliliter, voorzichtig de allantoïse vloeistof; kantel het ei indien nodig opzij om zoveel mogelijk vloeistof op te vangen. Elk ei zou tussen de vijf en 10 milliliter lichtgele vloeistof moeten opleveren bij het oogsten.Verzamel het allantoïsche vocht in plastic conische buizen van 50 milliliter op ijs. Wanneer al het vocht is verzameld, centrifugeer het virus en breng het heldere vocht over in een nieuwe buis van 50 milliliter op ijs. Gooi ten slotte de eieren in een afvalcontainer voor BSL-2 en vries het gezuiverde allantoïsche vocht onmiddellijk in.Bevries het virus vervolgens snel in vloeibare stikstof en plaats de bevroren buisjes in een vriezer van -80 °C. Voor langdurige bewaring: influenza-virusinfectie veroorzaakt een cytopathisch effect dat resulteert in cirkelvormige zones van geperforeerde cellen of plaques die zich vormen op een monoclaag van cellen. In dit experiment werden de plaques gevisualiseerd door de cellen te kleuren met kristalviolet en werden er 65 plaques geteld in de well met de 1 × 10⁻¹² verdunning van het virus, aangezien 500 µL van de verdunde virusstam op de cellen was gekweekt.In dit experiment was de uiteindelijke titer 1,3 × 10¹⁴ PFU per milliliter. De hemagglutinatie-assay is een methode voor het bepalen van de titer van het influenzavirus, gebaseerd op het vermogen van het virus om zich te hechten aan het oppervlak van rode bloedcellen. Zoals waargenomen, aggregeert de virale suspensie de rode bloedcellen, waardoor wordt voorkomen dat de rode bloedcellen uit de suspensie bezinken.Een duidelijk negatief resultaat werd waargenomen bij een verdunning van 2⁻¹⁰ van het virus in 50 µL. Daarom is de uiteindelijke titer 2,1 × 10⁴ HAU per milliliter. Na het bekijken van deze video heeft u een goed begrip van hoe het influenzavirus kan worden gepropageerd door kippeneieren te inoculeren en het allantoïsvloeistof die het virus bevat te oogsten.

influenza-virus-propagation-in-embryonated-chicken-eggs

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Redding van influenza A-virussen uit het plasmide DNA is een fundamentele en essentiële experimentele techniek die het mogelijk maakt influenza onderzoekers recombinante virussen te genereren om meerdere aspecten in de biologie van influenza virus te bestuderen en om te worden gebruikt als potentiële vectoren of vaccins.

Generatie van recombinant griepvirus uit plasmide-DNA

Een gelijktijdige infectie met influenza A-virus is een van de factoren betrokken bij de inductie van invasieve pneumokokkeninfecties bij...

Met behulp van Bioluminescent Imaging naar Synergie Onderzoek Between Streptococcus pneumoniae En influenza A-virus bij jonge muizen

Source: Brauer, R. et al., Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the synthesis and harvest of the influenza virus in fertilized chicken eggs. The virus is inoculated into the allantoic cavity, where it replicates in epithelial cells and buds into the allantoic fluid, which is then collected and stored for downstream applications.

Propagation and Harvest of Influenza Virus from a Fertilized Chicken Egg

This video demonstrates a technique for generating escape variants of neutralizing influenza virus monoclonal antibodies. Antibody-neutralized virus suspension is injected into embryonated chicken eggs to propagate escape variants selectively. This results in a virus population predominantly of escape variants, confirmed via a Hemagglutination assay.

Generation of Influenza Virus Escape Variants against Neutralizing Antibodies

The video showcases a method to create cold-adapted recombinant influenza viruses. It involves transfecting human cells with bi-directional plasmids, followed by incubation at lower temperature incubation to yield viruses suitable for vaccine production, characterized by reduced replication in warmer conditions.

Generating  Recombinant Live-Attenuated Influenza Viruses for Vaccines

Newcastle Disease Virus (NDV) is uitgebreid bestudeerd in de afgelopen jaren om nieuwe vectoren te ontwikkelen voor vaccinatie en therapie, onder anderen. Deze studies zijn mogelijk gemaakt door technieken om recombinant virus te redden van cDNA, zoals hier beschreven.

Redding van recombinant Newcastle Disease Virus uit cDNA

Systemische en lokale infectiemodellen met zebravissen voor humaan influenza A-virus worden gedemonstreerd. Met behulp van een systemisch infectiemodel kunnen zebravissen worden gebruikt om antivirale geneesmiddelen te screenen. Met behulp van een lokaal infectiemodel kunnen zebravissen worden gebruikt om reacties van gastheer immuuncellen te karakteriseren.

Met behulp van zebravis modellen van menselijke influenza A-virus infecties op Bleken antivirale middelen en karakteriseren Host Immune Cell Responses

Hier hebben we een methode om stabiele transfection van kip Eimeria parasieten te bereiken door nucleofecting sporozoites of tweede generatie merozoiten. Genetisch gemodificeerde eimerian parasieten die heterologe antigene genen uitdrukken, kunnen worden gebruikt als vaccinleveringsvoertuigen.

Nucleofection en in Vivo propagatie van kippeneimeria parasieten

Het algemene doel van dit artikel is om te beschrijven hoe te presteren in ovo intracellulaire injectie van exogene materialen in kippenembryo's. Deze aanpak is zeer nuttig om de ontwikkelingsbiologie van kippenembryo's te bestuderen.

In Ovo Intravasculaire injectie in kippenembryo's

Hier bieden we een gedetailleerde procedure voor de productie, zuivering en kwantificering van high-titer recombinant Newcastle disease virus. Dit protocol levert consequent &gt; 6 × 109 plaquevormende eenheden/ml op, wat virushoeveelheden oplevert die geschikt zijn voor in vivo dierstudies. Aanvullende kwaliteitscontroletests om de veiligheid in vivo te waarborgen, worden beschreven.

Productie van High-titer Recombinant Newcastle Disease Virus uit Allantoic Fluid

Deze methode toont het kippenembryo als een eenvoudig en kosteneffectief in vivo model om de bacteriële ziekteverwekker L. monocytogenes te doen herleven uit een levensvatbare maar niet-kweekbare (VBNC) toestand en met mogelijke verdere toepassingen bij het begrijpen van bacteriële kiemwerkingsmechanismen.

Kippenembryo als een in vivo model om levensvatbare maar niet-kweekbare pathogenen te doen herleven

Leer hoe je grote hoeveelheden hooggetitreerd influenzavirus produceert in bevruchte kippeneieren. Deze methode is essentieel voor virologisch onderzoek en vaccinontwikkeling.

Influenza Virus Voortplanting in bevruchte kippeneieren

Meer video's verkennen