Influenza Virus Voortplanting in bevruchte kippeneieren
19 maart 2015
Bevruchte kippeneieren worden veel gebruikt om grote hoeveelheden humaan influenza A-virus te produceren, omdat ze een handig en kosteneffectief systeem bieden om hoge opbrengsten van het virus te bewijzen.
Het algemene doel van deze procedure is om grote hoeveelheden van een influenzavirus met een hoog titer te produceren, in een kosteneffectief systeem. Dit wordt bereikt door eerst serumpathogenvrije, vers bevruchte kippeneieren te verkrijgen. In de tweede stap worden de eieren via de Alan Toic-wortel geïnfecteerd met influenzavirus.
Gedurende 48 uur wordt vervolgens het Alan Toic-vocht, dat het virus bevat, geoogst en het virus wordt direct ingeslagen in vloeibare stikstof. Uiteindelijk kunnen plaque- en hemagglutinine-assays worden uitgevoerd om de invloed van het virustiter van het verzamelde Alan Toic-vocht te bepalen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de oogststappen zeer gevoelig zijn en een zorgvuldige behandeling van de eieren en een goede kennis van hun anatomie vereisen.
Voordat u met de procedure begint, verkrijgt u serumpathogenvrije, vers bevruchte davian-eieren van een geschikte leverancier. Plaats de eieren onmiddellijk na aankomst in een gehumidificeerde eierincubator met een automatische eierdraaier om de eieren regelmatig te draaien bij 37 graden Celsius en 55 tot 60% luchtvochtigheid gedurende 10 tot 11 dagen. Na zeven tot acht dagen incubatie, draag gedesinfecteerde handschoenen met 70% ethanol.
Wis een eierkandeler af met de ethanol en breng de eieren over van de incubator naar de lege eierdozen. Schakel vervolgens de lichten uit en houd de grote kant van de eieren, een voor een, tegen de kandeler. Als een ei bevrucht is, moeten dunne bloedvaten die naar een boonvormig embryo leiden duidelijk zichtbaar zijn.
Als het ei onbevrucht is, zal een kleine bloedvlek met een zichtbare eidooier worden waargenomen. Gooi dan de onbevruchte eieren weg en breng de levensvatbare ei terug naar de incubator. Als de status van een ei niet kan worden bevestigd, markeer het voor latere observatie op dag 10 of 11 na de bevruchting en verdun direct voor gebruik een influenza A-virusstock tot eenmaal 10 tot de derde tot 10 tot de vierde PFU per milliliter in steriel PBS gesupplementeerd met hippies en plaats het op ijs.
Kandel vervolgens elk ei opnieuw en elimineer eventuele dode, onbeweeglijke embryo's. Verwijder vervolgens drie eieren uit de incubator en rangschik ze in een aparte houder. Met de luchtzakken omhoog, markeer de luchtruimen van de eieren met een permanente stift.
Was vervolgens het gebied boven de luchtruimen met 70% ethanol en breng de luchtruimen van de eieren omhoog in een eierdoos binnen een BSL twee bioveiligheidskast. Gebruik nu een steriele 18-gauge naald om een klein gaatje in de schaal boven de luchtzak van elk ei te prikken. Zorg ervoor dat de naald niet te diep wordt ingebracht om het embryo of de dooier te prikken.
Zuig vervolgens het verdunde influenzavirus op in een steriele één milliliter spuit. Bevestig een 22-gauge naald en steek de naald voorzichtig onder een hoek van 45 graden in de Alan Toic-holte van het eerste ei. Injecteer 0,2 milliliter van het verdunde virus in het ei en verwijder na het injecteren van de andere twee eieren de spuit en de naald en verzegel elk gaatje met een druppel lijm uit een lijmpistool.
Zorg ervoor dat de lijm niet in het ei lekt en plaats vervolgens de eieren terug in de incubator. Nadat alle eieren zijn geïnoculeerd, bebroed de geïnfecteerde eieren bij 37 graden Celsius en 60% luchtvochtigheid zonder te draaien gedurende de optimale bebroedingstijd. Afhankelijk van het type influenzavirus.
Aan het einde van de bebroedingsperiode, koel de eieren gedurende minimaal vier uur bij vier graden Celsius om het embryo te doden en de bloedvaten te samentrekken. Wanneer de eieren voldoende zijn afgekoeld, breng ze dan over naar een bioveiligheidskast en een stevige houder en reinig de eieroppervlakken met 70% ethanol.
Gebruik vervolgens steriele schaar om de eierschaal boven de luchtzak van het eerste ei te openen. Verwijder de schaal rond de luchtzak. Zorg ervoor dat u de chorio Alan Toic-membraan niet beschadigt.
Gebruik vervolgens steriele stompe pincetten om de chorio Alan Toic-membraan te openen en verplaats voorzichtig het embryo en de dooierzak met een kleine spatel of lepel, zorg ervoor dat u de dooier niet scheurt. Verzamel vervolgens met behulp van een een milliliter einor-pipet voorzichtig het Alan Toic-vocht, kantel het ei opzij om zoveel mogelijk vocht te verzamelen als dat nodig is. Elke ei zou tussen de vijf tot tien milliliter licht gele vloeistof moeten opleveren, aangezien elke ei wordt geoogst.
Verzamel het Alan Toic-vocht in 50 milliliter plastic conische buisjes op ijs. Wanneer al het vocht is verzameld, centrifugeer het virus en breng het heldere vocht over in een nieuwe 50 milliliter buis op ijs. Gooi ten slotte de eieren in een BSL twee afvalcontainer en Eloqua onmiddellijk naar geklaard LAN toic-vocht.
Bevriest vervolgens het virus in vloeibare stikstof en plaats de bevroren stengels in een negatieve 80 graden Celsius vriezer. Voor langdurige opslag veroorzaakt influenzavirusinfectie een cytopathisch effect dat resulteert in cirkelvormige zones van gelaagde cellen of plaques die zich vormen op een monolaag van cellen. In dit experiment werden de plaques zichtbaar gemaakt door de cellen te kleuren met kristalviolet en werden 65 plaques geteld in de put met de eenmaal 10 tot de negatieve 12 verdunning van het virus, omdat 500 microliters verdunde virusstock op de cellen werd gekweekt.
In dit experiment was het eindtitreer 1,3 keer 10 tot de 14e PFU per milliliter. De Hemagglutinine-nation-assay is een methode voor het titreren van influenzavirus op basis van het vermogen van het virus om zich te hechten aan het oppervlak van rode bloedcellen. Zoals waargenomen, coaguleert de virale suspensie de rode bloedcellen en voorkomt dat de rode bloedcellen uit de suspensie neerslaan.
Een duidelijk negatief resultaat werd waargenomen met een twee tot de min 10e verdunning van het virus in 50 microliter. Daarom is het eindtitreer 2,1 keer 1
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het produceren van grote hoeveelheden influenza A-virus met een hoge titer met behulp van bevruchte kippeneieren. Het proces omvat het infecteren van de eieren met het virus en het oogsten van de resulterende vloeistof voor verdere analyse.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Virologie
- Infectieziekten
- Vaccinontwikkeling
Achtergrond
- Vruchtbare kippeneieren zijn een kosteneffectief systeem voor virusproductie.
- Hoge opbrengsten van het influenzavirus zijn essentieel voor onderzoek en vaccinontwikkeling.
- Kennis van de anatomie van de eieren is cruciaal voor een succesvolle oogst.
- Tijdens het oogstproces is zorgvuldige behandeling vereist.
Doel van de studie
- Het produceren van grote hoeveelheden influenzavirus A.
- Het vaststellen van een betrouwbare methode voor het oogsten van het virus.
- Het faciliteren van verder onderzoek en analyses van het virus.
Gebruikte methoden
- Het verkrijgen van serumpathogeen-vrije, vers bevruchte kippeneieren.
- Het infecteren van de eieren met influenzavirus via de allantoïsche route.
- Het oogsten van de allantoïsche vloeistof na 48 uur.
- Het snap-invriezen van het geoogste virus in vloeibare stikstof.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle infectie van kippeneieren met het influenzavirus.
- Hoge virustiter verkregen uit het geoogste vloeistof.
- Haalbaarheid van de methode aangetoond via assays.
- Visuele demonstratie van de methode als cruciaal gemarkeerd.
Conclusies
- De methode biedt een betrouwbare manier om influenzavirus A te produceren.
- Zorgvuldige hantering en kennis van de anatomie van het ei zijn essentieel.
- Deze aanpak kan verdere virologische onderzoek en vaccineproductie ondersteunen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
De propagatie van het influenzavirus in geembryonneerde kippeneieren biedt een kosteneffectief systeem met een hoog rendement voor het genereren van virale stocks die essentieel zijn voor antivirale screening en de productie van vaccinsedlots. Deze methode ondersteunt vroege targetvalidatie door een consistente productie van infecteus virus mogelijk te maken voor mechanistische studies en de ontwikkeling van assays. De schaalbaarheid en reproduceerbaarheid maken het een fundamenteel instrument in pipelines voor de ontdekking van antivirale middelen en immunogenen tegen influenza.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt de productie van influenza-virus met een hoge titer mogelijk voor het evalueren van antivirale verbindingen en de efficiëntie van antilichamen in vitro.
- Operationele waarde: Levert 5-10 mL virusbevattende allantoïsvloeistof per ei op, wat grootschalige screeningcampagnes ondersteunt.
- Voorspellende waarde: Levert biologisch relevante virusvoorraden die de antigenische integriteit behouden voor functionele risicoreductie van targets.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Geoogst allantoïsvloeistof is geschikt voor plaque- en hemagglutinine-assays om infectieuze eenheden en antigenische activiteit te kwantificeren.
- Operationele waarde: Centrifugatie klaart de virale vloeistof op door debris te verwijderen, waardoor de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de assay worden gewaarborgd.
- Schaalbaarheid: Het protocol ondersteunt batchverwerking van meerdere eieren, waardoor consistente generatie van reagentia voor HTS-platforms mogelijk is.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Produceert virusvoorraden die natuurlijke infectiefenotypes nabootsen, wat studies naar pathogenese en immuunrespons ondersteunt.
- Translationele continuïteit: Het gegenereerde virusmateriaal sluit aan bij de preklinische challenge-modellen die worden gebruikt bij de evaluatie van vaccins en therapieën.
- Risicobeperking: Hoog-titer, goed gekarakteriseerde voorraden verminderen de variabiliteit bij downstream-beoordelingen van werkzaamheid en veiligheid.
Integratie van pipeline en workflow
Deze methode past binnen het vroege stadium van het ontdekkingsproces en levert virusreagentia voor targetvalidatie, assay-kwalificatie en het screenen van leadverbindingen voorafgaand aan de preklinische ontwikkeling.
- Discovery Biology: Levert infectieus virus voor studies naar het werkingsmechanisme en de analyse van signaalpaden in gastcelmodellen.
- Screening: Genereert gestandaardiseerde virusvoorraden die reproduceerbare kwantificering mogelijk maken in plaque-reductie- en hemagglutinatie-inhibitie-assays.
- Analytics: Output die compatibel is met titerbepaling via PFU/mL en HAU/mL, wat kwantitatieve benchmarks biedt voor de potentie van verbindingen.
- Translationeel Onderzoek: De geproduceerde virusvoorraden zijn geschikt voor gebruik in challenge-modellen bij fretten of muizen, waardoor in vitro bevindingen worden overbrugd naar in vivo effectiviteit.
- Bedrijfsmatige Hergebruik: De gevestigde ei-gebaseerde propagatie dient als een herbruikbaar platform voor de preparatie van seizoensgebonden en pandemische influenzastammen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: De productie van virussen met een hoge titer maakt robuuste dosis-responsmodellering mogelijk en vermindert het aantal fout-negatieven bij antivirale screening.
- Operationele waarde: Gedefinieerde incubatie-, koel- en oogststappen garanderen een consistente virale opbrengst en zuiverheid per lot.
- Strategische waarde: Een kosteneffectief systeem met een hoge output verbetert de kapitaalefficiëntie bij campagnes voor de identificatie van antivirale lead-verbindingen.
- Impact op portfolio: Een betrouwbare virusvoorraad ondersteunt go/no-go-beslissingen op basis van reproduceerbare antivirale activiteit over meerdere stammen heen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de hantering van gebemmeerde eieren en virologische technieken om schade aan het embryo tijdens de inoculatie te voorkomen.
- Afhankelijk van toegang tot SPF-eieren, incubatoren met nauwkeurige temperatuur- en vochtigheidsregeling en BSL-2-faciliteiten voor veilige virusmanipulatie.
- Noodzaak van gestandaardiseerde training voor het doorschijnen van eieren, het penetreren van de schaal en het verzamelen van allantoïsvloeistof om procedurele consistentie te waarborgen.
- Aanpassing aan verschillende influenzastammen kan optimalisatie van de titer van het inoculum en de incubatieduur vereisen op basis van de replicatiekinetiek van het virus.
- Het succes van de oogst hangt af van het behoud van de integriteit van het chorioallantoïs-membraan en het vermijden van besmetting met dooier tijdens het verzamelen van de vloeistof.
