Name: Opname Light-evoked Postsynaptische Reacties in Neuronen in Dark-aangepaste, Mouse retinale Slice Voorbereidingen Gebruik Patch Clamp technieken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Leer licht-geëvoceerde postsynaptische reacties opnemen in neuronen in donker-aangepaste muizenretina met patch clamp-technieken. Deze methode biedt hoge gevoeligheid voor elektrofysiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH R01 EY020533, WSU Startup Fund en RPB-subsidies.

Ethiek Verklaring: Procedures met dierlijke proefpersonen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Wayne State University. 1. Voorbereiding van de Experimentele Solution <ol><li> Bereid de dissectie oplossing 1 dag tot 1 week voor het eigenlijke experiment. Gebruik een HEPES bufferoplossing voor retinale dissectie vanwege zijn sterke bufferende vermogen bij lagere temperaturen 16. Meng alle chemicaliën als volgt (in mM): 115 NaCl, 2,5 KCI, 2,5 CaCl2, 1,0 MgCl2, 10 HEPES, 28 glucose. Stel de pH tot 7,4 met NaOH. Bewaar de oplossing in een koelkast tot 1 week. </li><li> De opname oplossing Ames medium, dat een kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) ontworpen voor retinale preparaten 17. Door de dag van het experiment, wegen uit Ames &#39;poeder (4,4 g voor 500 ml oplossing) in een buis. Ook afgewogen NaHCO3 (0,95 g 500 ml oplossing) en meng met de Ames &#39;poeder. </li><li> Bereid de intracellulaire pipet oplossing patch clamp de dag van het experiment. Meng alle chemicaliën als volgt (in mM): 111 K-gluconaat, 1,0 CaCl2, 10 HEPES, 1,1 EGTA, 10 NaCl, 1,0 MgCl2, 5 ATP-Mg en 1,0 GTP-Na. Stel de pH tot 7,2 met KOH. Filtreer de oplossing pipet met een conventionele injectiespuit filter. Maak ~ 500 ul porties en bewaar ze in de vriezer of een diepvriezer. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Dag van Experiment <ol><li> De nacht vóór het experiment plaats een muis in een kooi (C57BL / 6J of soortgelijke achtergrond, 4 - 8 weken oud, mannelijk) in een donkere ruimte voor O / N aanpassing aan het donker. </li><li> Voorbereiding voor dissectie: <ol><li> Vul ontleden oplossing (100-200 ml) in een bekerglas, plaats het op ijs en bel met zuurstof gedurende ten minste 10 minuten. </li><li> Start zuurstofvoorziening van het donkere vakje voor retinale voorbereiding opslag. </li><li> Bereid plastic dekglaasjes met vet rails voor hergebruiktinal slice voorbereidingen en leg elk van hen in een 35 mm plastic schaaltje. </li><li> Bevestig een nieuw scheermesje om een ​​chopper (weefsel snijmachine). </li><li> Snijd een filter membraan in twee helften. Dit is netvlies snijden. </li><li> Lijn de ontleden gereedschappen en overdracht pipetten in de buurt van de dissectiemicroscoop. Het werkgebied moet goed worden georganiseerd, zodat elk gereedschap gemakkelijk kunnen worden geopend in het donker. </li></ol></li><li> Voorbereiding voor patch clamp opnamen: <ol><li> Ontbinden Ames &#39;poeder en NaHCO3 in gedestilleerd water (Ames 4,4 g en NaHCO3 0,95 g / 500 ml DDH 2 O). Bubble de Ames-medium met gemengde zuurstof (95% O2 en 5% CO2) gedurende ten minste 30 minuten onder verwarmen tot een opname temperatuurniveau (~ 35 ° C). Breng de pH op 7,4 met NaHCO3 terwijl nog borrelen. </li><li> Ontdooi de interne pipet oplossing tijdens de dissectie. Nadat het ontdooid, voeg 0,01% sulforhodamine B intracellulaire kleuring. </li></ol></li></ol> 3. Retina Dissection <ol><li> In een donkere kamer, euthanaseren de muis met behulp van kooldioxide en bilaterale pneumothorax. Na 2 - 3 min met kooldioxide, zal de muis bewustzijn verliezen. </li><li> Wanneer de muis niet meer reageert op een staartknijptest snel ophelderen ogen en plaats ze in een koude dissectie oplossing in een plastic schaaltje. Voer de bilaterale pneumothorax dood van het dier te garanderen. Snel op te slaan in het oog in de schotel in het donker doos. Gebruik een infrarood kijker om de procedure uit te voeren in het donker. OPMERKING: U isofluraan, onthoofding of cervicale dislocatie kan voor euthanasie. De methode van euthanasie dient de richtlijnen van het National Institute of Health (NIH) en / of de Institutional Animal Care en gebruik Comite volgen. </li><li> In een donkere kamer, stel de dissectiemicroscoop en infrarood verlichting. Onder de microscoop overbrengen gaten van de schaal in een 10 cm plastic schaaltje wet de afgekoelde oplossing ontleden. Continu bubble zuurstof door buis op de bodem van de plastic schaaltje. Stel het debiet zodat het niet te laag, maar zorgen dat het niet hoog genoeg om de dissectie verstoren. </li><li> Hoornvlies en de lens te verwijderen: <ol><li> Een insnijding op de top van het hoornvlies met een micro-chirurgisch mes. Houd de oogzenuw aan het andere uiteinde van de oogbol verhindert het oog beweegt. Verleng de cut met behulp van een paar van chirurgische schaar. Knip de cornea met enkele sclera omheen. </li><li> Pak de lens met een fijn pincet en trek de lens uit. Als het glasvocht te kleverig lens te verwijderen, snijd het glaslichaam met een schaar. </li><li> Zodra de eye-beker is gemaakt, voorzichtig giet koude, zuurstofrijke ontleden oplossing in de oogschelp met een kleine transferpipet. OPMERKING: De oogbol leeglopen snel na een incisie in het hoornvlies. Het is belangrijk om de vorm van het oog handhaven vervormen het oog tijdens deze proprocedure zal het netvlies beschadigen en netvliesloslating. </li></ol></li><li> Het identificeren van de dorsale en ventrale zijden van het netvlies: Opmerking: Door ongelijke verdeling van de groene en ultraviolet (UV) kegels 18 identificeren van een specifiek netvliesgebied belangrijk voor lichte reactie opnames. <ol><li> Identificeer de lijn die dwars over het netvlies oog beker passeren in de buurt van de oogzenuw. Deze lijn loopt grotendeels over de ventrale zijde van de oogzenuw; de zijkant inclusief de oogzenuw is de dorsale zijde, terwijl de andere ventrale 19. Zie deze mijlpaal duidelijk onder infrarood kijkers. </li><li> Afhankelijk van het doel van het experiment maakt een snede aan onnodige zijde. Dit zal nuttig na het isoleren van de retina van het oog beker. </li></ol></li><li> Glasvocht te verwijderen: <ol><li> Eventueel incubeer de oogschelp met hyaluronidase (0,5 mg / ml) gedurende 15 min. </li><li> Verwijder het glasvocht met extra-fijne pincet. Het glasachtige voornamelijknaar de bodem en de buitenrand van de oogschelp bevestigd. Verwijder het voorzichtig, zonder te raken of te porren het netvlies. Als het glasvocht stevig kan worden bevestigd aan de oogschelp voorzichtig verwijderen retinale onthechting van de oogschelp vermijden. Blijven trekken tot er geen spanning wordt gevoeld. Opmerking: Deze stap is bijzonder belangrijk voor het ontleden van de muis netvlies; het is echter geen probleem voor de netvliezen van andere soorten, zoals de rat of salamander. </li></ol></li><li> Isoleer het netvlies van het oog-cup. Pak de sclera en voorzichtig trek het netvlies met de achterkant van een tang. OPMERKING: Whole-mount netvlies preparaten kunnen worden van de geïsoleerde netvlies. Maak 03:57 bezuinigingen aan de randen en plat het netvlies, of snijd het netvlies in verschillende stukken. </li><li> Trim het netvlies en de onnodige helft van het netvlies weggooien (stap 3.5). In dezelfde plastic schaaltje, snijd de resterende netvlies in twee stukken. Voor elk stuk van het netvlies, afgesneden van de randen om een ​​te makennetvlies plakken, en trim de vouwen randen. </li><li> Breng een retinale plaat op een glasplaat met een grote transferpipet (~ 2 ml). Zuig de overmaat oplossing met een kleine pipet, gebruik een stuk filtreerpapier de plaat plat, en wordt snel een stuk van het filtermembraan bovenop het weefsel. <ol><li> Met behulp van een kleine transferpipet, plaats een druppel ontleden oplossing op het filter membraan. Wacht ~ 15 seconden totdat de oplossing verspreidt zich over het membraan. Gedurende deze tijd zal het retinale weefsel vasthouden aan het filtermembraan. </li><li> Pour meer koude ontleden oplossing onder en rondom het filter. De retinale weefsel met het filtermembraan drijven. Pak het filter membraan met een pincet en plaats deze in de slicing kamer. Giet ontleden oplossing over het weefsel, en bewaar de voorbereiding in de donkere doos. OPMERKING: De hier beschreven procedure is van cruciaal belang. Het is belangrijk deze stappen snel uit te voeren opdat het retinale weefsel kleeft aan de filter membraan en droogt niet uit. </li></ol></li><li> Met behulp van een helikopter, snijd de netvliesweefsel in plakjes. Rond 200 micrometer dik haalbaar is voor patch clamp studies. </li><li> Plaats een plastic dekglaasje met vet rails in de slicing kamer. Breng een netvlies slice op de top van het vet rails op een plastic dekglaasje. Draai het segment van 90 ° zodat de dwarsdoorsnede zichtbaar. Druk het filtermembraan beneden op het dekglaasje dan betrekking op de zijkanten van het filtreerpapier met vet. <ol><li> Nadat het segment wordt geïmmobiliseerd op een plastic dekglaasje, pak het dekglaasje en overbrengen naar een 35 mm plastic schaaltje. Giet koud ontleden oplossing op het netvlies voorbereiding en dompel de voorbereiding. Bewaar elk gerecht in het donker doos, die continu moet worden zuurstofrijk. OPMERKING: De gehele procedure moet zorgvuldig gebeuren zodat het filtermembraan niet vervormd. Anders, de retinale plak gemakkelijk scheidt van het filtermembraan. </li></ol></li></ol><ol><li> Het opnemen van het preparaat: <ol><li> Prime de perfusie buizen met Ames &#39;medium. Laat alle bellen door te laten bij het vullen van de slang. </li><li> Maak patch clamp opname pipetten met een trekker. Om een ​​pipet met de pipet oplossing, duik in de achterkant van een pipet te vullen voor 1 min tot het pipet wordt opgevuld. Vervolgens vult ~ 1/3 van de pipet met een micro-pipetvuller. Bewaar elke pipet in een vochtige pipet doos. </li><li> Draai aan de apparatuur voor patch clamp opnamen; waaronder de computer, versterker, CCD camera en microscoop. </li></ol></li><li> Schakel het licht in de kamer. Plaats een netvlies slice voorbereiding op de microscoop fasekamer behulp van een infrarood kijker. Nadat het is geïmmobiliseerd, beginnen continue perfusie. Stel de perfusie temperatuur op 33-37 ° C. </li><li> Bekijk de slice oppervlak met de CCD-camera. Focus op de doellocatie waar de doelgroep cell soorten verblijven. Selecteer een gezond uitziende cel voor patch clamp opname (dat wil zeggen, moet het glad uitziende oppervlak en een goede mobiele vorm hebben). </li><li> Plaats een opname pipet in een pipet houder. Vooraf de pipet om de slice voorbereiding. Wanneer het dichtbij de slice preparaat (~ 2 mm boven), vindt de punt van de pipet met de microscoop. Zodra de pipet tip is zichtbaar onder de microscoop, beweeg de punt naar beneden in de richting van de doelcel. </li><li> Stel de versterker. Pas de pipet op 0 mV / 0 Pa (nul stellen) en start een continue elektrische puls van ~ 5 mV bij ~ 10 Hz. Controleer de pipet weerstand; ideaal weerstand tussen 5 en 10 MQ meeste retinale neuronen. </li><li> Begin uitblazen van de tip. Gebruik een mondstuk, of gebruik een spuit, om positieve druk uit te oefenen wanneer de pipet dips in het bad oplossing. Continu blaas de interne oplossing totdat de punt op het oppervlak van de doelcel. <ol><li> Wanneer de positieve druk maakt een klein kuiltje op the celoppervlak, vooraf de tip lichtjes en stop uitblazen. Controleer de pipet weerstand, die moet toenemen. Alsof deze gestaag toe, laat het en controleren de weerstand totdat het&gt; 1 GQ (gigaseal) bereikt. Als de weerstand niet spontaan te verhogen, zachtjes toe te passen negatieve druk tot het een gigaseal. </li></ol></li><li> Na de gigaseal wordt bereikt, verandert de holding potentieel om -70 mV. Vervolgens intermitterend toepassen negatieve druk op het membraan in de pipetpunt scheuren. Wanneer de whole-cell configuratie is gemaakt, kan de pipet weerstand tussen 500 MQ en 1 GQ, en de capacitieve stroom wordt gezien. Soms spontane postsynaptische stromingen waar te nemen. </li><li> Noteer de IV relatie van -80 tot +40 mV. Verschillende types van spanningsafhankelijke kanalen worden geactiveerd afhankelijk van het celtype. </li><li> Record licht opgewekte synaptische stromen of spanningen. </li></ol>

<ol><li>Werblin, F. S., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+retina+of+the+mudpuppy%2C+Necturus+maculosus+II.+Intracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Organization of the retina of the mudpuppy, Necturus maculosus II. Intracellular recording.</a> J Neurophysiol. 32 (3), 339-355 (1969).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Lukasiewicz, P., Werblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+slowly+inactivating+potassium+current+truncates+spike+activity+in+ganglion+cells+of+the+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A slowly inactivating potassium current truncates spike activity in ganglion cells of the tiger salamander retina.</a> J Neurosci. 8 (12), 4470-4481 (1988).</li>
<li>Kaneko, A., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+L-glutamate+on+the+anomalous+rectifier+potassium+current+in+horizontal+cells+of+Carassius+auratus+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of L-glutamate on the anomalous rectifier potassium current in horizontal cells of Carassius auratus retina.</a> J Physiol. 358, 169-182 (1985).</li>
<li>Kamermans, M., Werblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA-mediated+positive+autofeedback+loop+controls+horizontal+cell+kinetics+in+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA-mediated positive autofeedback loop controls horizontal cell kinetics in tiger salamander retina.</a> J Neurosci. 12 (7), 2451-2463 (1992).</li>
<li>Cook, P. B., McReynolds, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+inhibition+in+the+inner+retina+is+important+for+spatial+tuning+of+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lateral inhibition in the inner retina is important for spatial tuning of ganglion cells.</a> Nat Neurosci. 1 (8), 714-719 (1998).</li>
<li>Pang, J. J., Gao, F., Wu , J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+current+responses+in+rod+bipolar+cells%2C+cone+depolarizing+bipolar+cells+and+AII+amacrine+cells+in+dark-adapted+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol.+558+%28Pt%22%5BJournal%5D)">Light-evoked current responses in rod bipolar cells, cone depolarizing bipolar cells and AII amacrine cells in dark-adapted mouse retina.</a> J Physiol. 558 (Pt. 558 (Pt 3), 897-912 (2004).</li>
<li>Euler, T., Masland , R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+responses+of+bipolar+cells+in+a+mammalian+retina%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Light-evoked responses of bipolar cells in a mammalian retina).</a> J Neurophysiol. 83 (4), 1817-1829 (2000).</li>
<li>Berntson, A., Taylor , W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+characteristics+and+receptive+field+widths+of+on-bipolar+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol.+524+Pt%22%5BJournal%5D)">Response characteristics and receptive field widths of on-bipolar cells in the mouse retina.</a> J Physiol. 524 Pt. 524 (Pt 3), 879-889 (2000).</li>
<li>Sterling, P., Smith, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+for+a+binary+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Design for a binary synapse.</a> Neuron. 41 (3), 313-315 (2004).</li>
<li>Borghuis, B. G., Marvin, J. S., Looger, L. L., Demb, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+nonlinear+glutamate+release+dynamics+at+bipolar+cell+synapses+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of nonlinear glutamate release dynamics at bipolar cell synapses in the mouse retina.</a> J Neurosci. 33 (27), 10972-10985 (2013).</li>
<li>Dowling, J. E., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+retinal+dystrophy+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Inherited retinal dystrophy in the rat.</a> J Cell Biol. 14, 73-109 (1962).</li>
<li>Eggers, E. D., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28A%29%2C+GABA%28C%29+and+glycine+receptor-mediated+inhibition+differentially+affects+light-evoked+signalling+from+mouse+retinal+rod+bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">GABA(A), GABA(C) and glycine receptor-mediated inhibition differentially affects light-evoked signalling from mouse retinal rod bipolar cells.</a> J Physiol. 572 (Pt 1), 215-225 (2006).</li>
<li>Ichinose, T., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mode+of+retinal+presynaptic+inhibition+switches+with+light+intensity%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mode of retinal presynaptic inhibition switches with light intensity).</a> J Neurosci. 32 (13), 4360-4371 (2012).</li>
<li>Ichinose, T., Fyk-Kolodziej, B., Cohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+ON+cone+bipolar+cell+subtypes+in+temporal+coding+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Roles of ON cone bipolar cell subtypes in temporal coding in the mouse retina.</a> J Neurosci. 34 (26), 8761-8771 (2014).</li>
<li>Baicu, S. C., Taylor, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-base+buffering+in+organ+preservation+solutions+as+a+function+of+temperature%3A+new+parameters+for+comparing+buffer+capacity+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency.</a> Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).</li>
<li>Ames, A. 3rd, Nesbett, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+retina+as+an+experimental+model+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">In vitro retina as an experimental model of the central nervous system.</a> J Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).</li>
<li>Haverkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primordial%2C+blue-cone+color+system+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The primordial, blue-cone color system of the mouse retina.</a> J Neurosci. 25 (22), 5438-5445 (2005).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li>
<li>Farre, C. G., M Bruggemann, A., Fertig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channel+screening+-+automated+patch+clamp+on+the+rise%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+discovery+today.+Technologies%22%5BJournal%5D)">Ion channel screening - automated patch clamp on the rise.</a> Drug discovery today. Technologies. 5 (1), e1-e34 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Goede opnames kunnen alleen worden bereikt met goede retinale preparaten en goed ontworpen patch clamp-opstellingen. Hoewel alle hierboven beschreven stappen belangrijk zijn, benadrukt de discussie enkele cruciale stappen zowel voor de dissectie als de opnames.
Voor de dissectie zijn twee dingen bijzonder belangrijk: koeling en oxygenatie. Nadat het oog is geënucleeerd, verwijdert u snel het voorste deel van het oog in een dissectiekamer met zuurstofgebeurbelde, gekoelde dissectieoplossing, en...

De retina is een van de unieke delen van het zenuwstelsel. Als een toegankelijk deel van de hersenen is de synaptische architectuur ervan goed gekarakteriseerd. Bovendien kunnen de functies van dit neurale netwerk worden onderzocht met een fysiologische stimulus: licht. Als het retinale weefsel wordt geïsoleerd in een donkere kamer met geschikte procedures, zullen neuronen in het weefsel op licht reageren. Deze voorbereiding is gebruikt om visuele signaalverwerking te bestuderen en verschillende synaptische mechanismen en neurale netwerkfuncties te verduidelijken, evenals ziektemechanismen. 
Lichtreacties in retinale neuronen worden al decennia lang geregistreerd. Vroege studies gebruikten scherpe elektroden om intracellulaire opnames te maken van mudpuppy retinale neuronen1. In de jaren tachtig werd de patch clamp-techniek uitgevonden2, en werd al snel een populaire methode onder onderzoekers op het gebied van visie3,4. Enkele celopnames van lagere gewervelden, inclusief mudpuppy en visretinale neuronen, waren populaire methoden die bijdroegen tot de verduidelijking van visuele signaalverwerkingsmechanismen5,6. 
Nadat genetische mutatietechnieken waren ontwikkeld, werd de muisretina een populairder model voor onderzoekers op het gebied van visie7-9. Het zoogdierretina is aantrekkelijker dan dat van lagere gewervelden omdat het evolutionair dichter bij de menselijke retina staat, en er is een mogelijkheid om ziektemodellen te gebruiken. Echter, muisretinale cellen zijn klein en kwetsbaar10, en het maken van retinale preparaten en het uitvoeren van patch clamp-opnames in een donkere kamer is een uitdaging. Naarmate de technologie is verbeterd, zijn er diverse benaderingen beschikbaar gekomen om visuele signaalmechanismen te bestuderen, zoals beeldvormingsstudies11 en het elektroretinogram (ERG)12. Desalniettemin is enkelcelregistratie met de patch clamp-methode nog steeds belangrijk omdat deze zeer tijdelijk en ruimtelijk gevoelig is in vergelijking met andere methoden. Daarom hebben we continu patch clamp-opnames uitgevoerd en onze methoden verbeterd om visuele signaalverwerking in muisretinale plaaspreparaten te onderzoeken13-15.
In deze video-tutorial worden de protocollen gepresenteerd met belangrijke tips. Goede opnames kunnen alleen worden bereikt met goede voorbereiding. Het oefenen van dierdissocatie en het bouwen van een stevige patch clamp-installatie zal de meeste onderzoekers in staat stellen om succesvolle opnames te bereiken.

<table><tbody><tr><td>Muizen (28-60 dagen oud, mannelijk)</td><td>Jackson laboratory</td><td>C57BL/6J-stam</td><td></td></tr><tr><td>Ames' medium poeder</td><td>Sigma</td><td>A1420</td><td>uitstekend</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>uitstekend</td></tr><tr><td>Dissectie-instrument: pincet</td><td>Dumont</td><td>#4, #5, #55</td><td>uitstekend</td></tr><tr><td>Dissectie-instrument: schaar</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td>uitstekend</td></tr><tr><td>Dissectie-instrument: operatiemes</td><td>Surgistar</td><td>7514</td><td>uitstekend</td></tr><tr><td> Scheermesje (voor chopper)</td><td>EMS</td><td>71970</td><td>uitstekend</td></tr><tr><td>Chopper</td><td>handgemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infrarood viewer</td><td>Night Owl Optics</td><td>NOBG1</td><td>Het toont een helder beeld. Het scherpstellen van kleine objecten is een probleem.</td></tr><tr><td>Puller</td><td>Sutter</td><td>P-1000</td><td>uitstekend; maakt consistente grootte pipetten.</td></tr><tr><td>Donkere doos</td><td>Pelican</td><td>donkere doos</td><td>uitstekend</td></tr><tr><td>Patch clamp systeem</td><td>Scientifica</td><td>slice scope 2000</td><td>Uitstekende setup. De meeste belangrijke componenten zijn inbegrepen in één pakket. Micromanipulatoren zijn uitstekend.</td></tr><tr><td>Versterker</td><td>Molecular Devices</td><td>multiclamp 700B</td><td>Uitstekend en eenvoudig te bedienen.</td></tr><tr><td>Software voor acquisitie</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp software</td><td>Uitstekend en eenvoudig te bedienen.</td></tr><tr><td>Lichtbron (LED)</td><td>Cool LED</td><td>pE-2 4-kanaals systeem</td><td>Uitstekend</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Q-imaging</td><td>Retiga 2000</td><td>Uitstekend</td></tr><tr><td>Faraday kooi</td><td>handgemaakt</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

opname light-evoked postsynaptische reacties in neuronen in dark-aangepaste, mouse retinale slice voorbereidingen gebruik patch clamp technieken

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

Het netvlies is de toegangspoort tot het visuele systeem. Om visuele signaalverwerking mechanismen te begrijpen, onderzoeken we het netvlies neuraal netwerk functies. Retinale neuronen in het netwerk omvatten van talrijke subtypes. Meer dan 10 subtypen van bipolaire cellen ganglioncellen en amacrine cellen zijn door morfologische studies. Meerdere subtypes van retinale neuronen worden gedacht aan duidelijke kenmerken van zichtbare signalen, zoals beweging en kleur te coderen, en vormen meerdere zenuwbanen. Echter, de functionele rol van elk neuron in de visuele signaalverwerking niet volledig begrepen. De patch clamp methode is nuttig om deze fundamentele vraag te beantwoorden. Hier, een protocol aan het licht opgewekte synaptische responsen in de muis retinale neuronen met behulp van patch clamp opnamen in donker aangepaste voorwaarden op te nemen wordt verstrekt. De muis ogen zijn donker aangepaste O / N, en het netvlies slice bereidingen worden ontleed in een donkere kamer met behulp van infrarood verlichting en kijkers. Infrarood licht nietactiveren muis fotoreceptoren en behoudt daarmee hun licht responsiviteit. Patch clamp wordt gebruikt om het licht-reacties van de consument in retinale neuronen opnemen. Een fluorescerende kleurstof wordt geïnjecteerd tijdens opnames neuronale subtypes morfologische kenmerken. Deze procedure maakt het mogelijk om de fysiologische functies van elk neuron te bepalen in de muis netvlies.

Een representatieve slice preparaat wordt getoond in figuur 1. De slice preparaat in een rechte stand, met fotoreceptoren te ganglion cellen in een plat vlak en geen onthechting van het filterpapier. Wanneer een segment wordt gekanteld, slechts een deel van het preparaat in focus, waardoor het moeilijk een geschikte cel identificeren patchklemmen. Voor opnamen is het belangrijk om een ​​goede soma, die meestal een glanzend oppervlak, een gelijkmatige ronde vorm, en geen zichtbare donkere plaques te sele...

We zullen demonstreren hoe retinale plakjes van het muizenoog worden bereid en lichtreacties in retinale neuronen worden opgenomen. De hele procedure wordt uitgevoerd in donker-aangepaste omstandigheden.

Opname Light-evoked Postsynaptische Reacties in Neuronen in Dark-aangepaste, Mouse retinale Slice Voorbereidingen Gebruik Patch Clamp technieken

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Het algemene doel van dit experiment is om registraties van de lichtrespons van donkergeadapteerde retinale neuronen te verkrijgen. Dit wordt bereikt door eerst een muizenoog te oogsten. De tweede stap is het isoleren van de retina en deze te snijden voor slice-preparaten.Vervolgens wordt het retina-preparaat gemonteerd en bekeken onder een microscoop om een doelcel voor patchclamp-metingen te vinden. Na het vestigen van een whole-cell patchclamp-configuratie wordt er een lichtstimulus aangebracht in de nabijheid van de cel. Ten slotte kan de gelijktijdige elektrofysiologische respons worden waargenomen via de acquisitiesoftware.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals KRC-beeldvorming is dat de registratiegevoeligheid hoog is en dat de registrerende cellen morfologisch geïdentificeerd kunnen worden. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat werken in volledige duisternis lastig en desoriënterend kan zijn voor wie dit niet gewend is. Om te beginnen, plaats de dissectie-instrumenten en transferpipetten in de buurt van de dissectiemicroscoop.De werkruimte wordt goed georganiseerd zodat elk instrument in het donker gemakkelijk bereikbaar is. Gebruik, zodra u klaar bent, een infraroodkijker om de procedure in het donker uit te voeren. Enucleer na euthanasie snel de ogen en plaats deze in een schaal met koude dissectie-oplossing, bewaard in een donkere box terwijl u onder een microscoop werkt.Verplaats een oog naar een schaaltje met koele dissectie-oplossing. Belucht dit continu met zuurstof. Om het hoornvlies en de lens te verwijderen, houdt u de oogzenuw aan de andere zijde van de oogbol vast om beweging te voorkomen en maakt u met een microsurgisch mes een incisie aan de bovenzijde van het hoornvlies.Verleng de incisie met een chirurgische schaar en verwijder het hoornvlies, waarbij een deel van het sclera eromheen behouden blijft. Pak vervolgens de lens vast met een fijne pincet en trek deze langzaam naar buiten. Zodra de oogcup is gevormd, giet u voorzichtig koude, zuurstofrijke dissectie-oplossing in de oogcup met een kleine transferpipet.Werk snel om de vorm van het netvlies te behouden en oefen zachte druk uit om de dorsale en ventrale zijden van het netvlies te identificeren. Gebruik infraroodkijkers om de lijn te identificeren die over de retinal eye cup loopt en vlak langs de kop van de oogzenuw gaat. Deze lijn loopt hoofdzakelijk over de ventrale zijde van de oogzenuw; de zijde waar de oogzenuw zich bevindt, is de dorsale zijde.Afhankelijk van het experiment maakt u een inkeping aan wezenlijk de ventrale of dorsale zijde. Dit markeert de overbodige zijde en dient als een nuttig referentiepunt voor het verdere verloop. Verwijder vervolgens voorzichtig het glasachtig lichaam met extra fijne pincetten zonder de retina aan te raken.Het glasachtig lichaam is hoofdzakelijk gehecht aan de bodem en de buitenrand van de oogcup. Omdat het glasachtig lichaam strak aan de oogcup gehecht kan zijn, dient men voorzichtig te werk te gaan om retinal detachment te verwijderen. Blijf trekken totdat er geen spanning meer wordt gevoeld.Zodra het netvlies is geïsoleerd, pakt u de sclera vast en pelt u het netvlies voorzichtig los. Trim het netvlies met de achterkant van de pincet en gooi het onnodige deel weg in hetzelfde plastic schaaltje. Snijd het resterende netvlies in twee stukken per deel.Snijd de randen af om een retina-plakje te maken en trim de vouwranden. Gebruik vervolgens een grote transferpipet om een retina-plakje over te brengen naar een glasplaat. Zuig de overtollige oplossing op met een kleine pipet en gebruik een stukje filterpapier om het plakje plat te maken.Plaats voorzichtig met een kleine transferpipet een stukje filtermembraan bovenop het weefsel. Breng een druppel dissectie-oplossing aan op het filtermembraan. Wacht ongeveer 15 seconden terwijl de oplossing zich verspreidt en het retinaweefsel aan het filtermembraan hecht.Zodra ze aan elkaar kleven, giet u meer koude dissectie-oplossing onder en rond het filter totdat het membraan gaat drijven. Plaats vervolgens het filtermembraan in de snijkamer en bedek dit met dissectie-oplossing. Werk snel om te voorkomen dat het membraan uitdroogt en gebruik de chopper om het retinaweefsel in plakjes te snijden.Plaats een plastic dekglas met vetrails in de snijkamer. Breng een retina-snede over op de vetrails en roteer de snede 90 graden zodat de transversale sectie zichtbaar is. Druk het filtermembraan op het dekglas voordat de zijkanten van het filterpapier met vet worden afgedicht.Nadat de coupes op een plastic dekglas zijn gefixeerd, brengt u dit over naar een plastic schaaltje van 33 millimeter. Dompel het preparaat onder in een dissectie-oplossing voor coal en bewaar elk schaaltje in een donkere box die continu wordt voorzien van zuurstof. Voor patchclamp-metingen.Spoel de profusiebuizen voor met AIMS-medium en zorg dat alle luchtbellen uit de slang verdwijnen. Nadat de registratiepipetten met een glaspolair zijn gemaakt, wordt de punt gevuld met pipetoplossing. Vul vervolgens ongeveer een derde van de pipet met een micropipetvulleur; zodra deze gevuld is, wordt elke pipet bewaard in een vochtige pipetdoos.Zet vervolgens de apparatuur voor patch-clampmetingen aan, inclusief de computer, versterker, CCD-camera en microscoop, waarbij gewerkt wordt in het donker. Plaats een retina-snede preparaat met behulp van een infraroodkijker op de objecttafel van de microscoop. Nadat het preparaat is geïmmobiliseerd, wordt gestart met de continue perfusie.Stel de perfusietemperatuur in op 33 tot 37 graden Celsius. Bekijk het oppervlak van de slice met een CCD-camera. Focus op de doellocatie.Zodra de doelceltypen zijn gelokaliseerd, selecteert u een gezond uitziende cel voor een patch-clamp opname. Wanneer een gezonde cel is geïdentificeerd, plaatst u een opnamepipet in een pipethouder en brengt u de pipet naar de slice-preparaat. Wanneer deze zich dicht bij het slice-preparaat bevindt, lokaliseert u de punt van de pipet met een microscoop.Zodra de pipetpunt zichtbaar is onder de microscoop, beweegt u de punt naar beneden richting de doelcel. Stel vervolgens de versterker in en pas de pipet aan bij pika amp. Vijf volt per Nana amp.Start een continue elektrische puls van ongeveer vijf millivolt en ongeveer 10 hertz en controleer de pipetweerstand. Een ideale weerstand ligt tussen vijf en 12 mega ohm voor de meeste retina-neuronen.Wanneer u klaar bent, gebruikt u een mondstuk of spuit om de interne oplossing uit te blazen totdat de punt van de pipet zich op het oppervlak van de doelcel bevindt. Wanneer de positieve druk een kleine kuiltje op het celoppervlak veroorzaakt, schuift u de punt iets verder naar voren en stopt u met uitblazen. Als de pipetweerstand continu toeneemt, laat u deze dan ongemoeid en bewaakt u de weerstand totdat deze groter is dan één giga ohm.Indien de weerstand niet spontaan toeneemt, breng dan voorzichtig negatieve druk aan totdat er een giga-seal ontstaat. Nadat de giga-seal is bereikt, wordt het houdpotentiaal gewijzigd naar negatief 70 millivolt, waarna er intermitterend negatieve druk wordt aangebracht om het membraan in de pipetpunt te ruptureren. Wanneer de whole-cell configuratie is gerealiseerd, kan de pipetweerstand tussen 500 mega ohm en één giga ohm liggen en is de capacitieve stroom waarneembaar.Registreer de IV-relatie van min 80 tot 40 millivolt. Afhankelijk van het celtype zullen verschillende typen voltage-afhankelijke kanalen worden geactiveerd. Registreer tot slot de door licht opgewekte synaptische stromingen of voltages.Deze plakpreparaat, bekeken bij 10 x, toont zowel fotoreceptoren als ganglioncellen zonder loslating van het filterpapier. Wanneer dit preparaat met een 60 x objectief wordt bekeken, is elke cellaag duidelijk waarneembaar. Licht-evoceerde excitatoire postsynaptische potentialen van retinaire neuronen werden opgewekt in reactie op een stapsgewijze lichtimpuls.De piekamplitude en de vervaltijd variëren afhankelijk van het celtype en het subtype. Het celtype en het morfologische subtype werden onthuld door zwavelmarkering na de fysiologische opnames na de ontwikkeling ervan. Deze techniek maakte de weg vrij voor wetenschappers in het vakgebied van retina-onderzoek om de functies van natuurlijke visuele signalering te bestuderen, evenals de bijdragen van synaptische mechanismen.

recording-light-evoked-postsynaptic-responses-neurons-dark-adapted

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video toont het proces van het whole-cell voltage clamp opnamen in de retinale deel van de in het water levende tijger salamander. Tonen we de voorbereiding van het stuk, alsook hoe de patch clamp opnames uit te voeren tijdens visuele stimulatie van het netvlies.

Whole-cell Opnames van Licht prikkelende synaptische Stromingen opgeroepen in het netvlies Slice

Hier beschrijven we een procedure voor het genereren van donker aangepaste plakjes van de muis netvlies voor elektrofysiologische opnames.

Patch Clamp Opnamen van Mouse Retinal Neuronen in een donker aangepaste Slice Voorbereiding

Dit artikel geeft een beschrijving van hoe te ontleden en op te nemen van de geïsoleerde netvlies voorbereiding in de muis. In het bijzonder beschrijven we hoe de reacties aan het licht opnemen van een fluorescent gelabelde ganglion cel populatie en vervolgens te identificeren en analyseren van de morfologie.

Een geïsoleerde Retinale Voorbereiding op Light Response Opnemen van genetisch Labeled retinale ganglioncellen

We beschrijven een relatief eenvoudige methode van transretinal electroretinogram (ERG) opnamen voor het verkrijgen van staafjes en kegeltjes photoresponses uit intacte muis netvlies. Deze aanpak maakt gebruik van het blok van synaptische transmissie van fotoreceptoren hun lichte reacties te isoleren en hen te registreren met behulp van elektroden veld geplaatst over de geïsoleerde platte gemonteerde netvlies.

Transretinal ERG Opnames van Mouse Retina: staafjes en kegeltjes Photoresponses

This video demonstrates a whole-cell patch-clamp technique for electrophysiological recording from a flat-mount mouse retina. A thin glass pipette with an electrode is used to approach starburst amacrine cells (SACs) within the retina. After forming a seal, suction is applied to rupture the membrane and form the whole-cell patch-clamp configuration. Finally, the flow of ions through the SAC synaptic receptors is measured using the configuration.

Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from a Flat-Mount Mouse Retina

The video demonstrates a protocol to study synaptic interactions and neuronal responses in a transfected mouse hippocampal brain slice. It involves illuminating long-range sensory neurons to trigger action potentials and recording the resulting excitatory post-synaptic potentials in the recorded neuron using the whole-cell patch-clamp technique.

Photostimulation and Whole-Cell Patch Clamp Recordings of Neurons in Mouse Hippocampal Slices

This video demonstrates the recording of light-evoked post-synaptic responses in a dark-adapted mouse retinal tissue slice preparation. The retinal slice is placed in a recording chamber, and a recording pipette is used to establish electrical continuity with a retinal ganglion cell. Light pulses are applied to generate excitatory post-synaptic potentials in the ganglion cells, which are recorded by the pipette.

Light-Evoked Postsynaptic Responses in Neurons of Mouse Retinal Slices

We beschrijven de bereiding van dunne netvlies plakken uit het water levende tijger salamanders...

Gelijktijdige Whole-cell Opnames van Photoreceptors en Tweede-orde neuronen In amfibievliegtuig netvlies Slice Voorbereiding

Dit protocol laat zien hoe whole-cell patch clamp opname uit te voeren op het netvlies neuronen uit een flat-mount voorbereiding.

Patch Clamp Registratie van Starburst amacrine Cellen in een flat-mount voorbereiding van Deafferentated Mouse Retina

We ontwikkelden een horizontale slice voorbereiding van de zoogdierretina volwassene met het vlak van snijden parallel aan het netvliesoppervlak. Dendritische gebied van nonradially georiënteerde retinale neuronen werden niet afgekapt, waardoor de studie van de signaalverwerking met patch-klem en beeldvormende technieken.

Voorbereiding van de Horizontale Schijfjes van Adult Mouse Retina voor elektrofysiologisch onderzoek

In dit artikel bespreken we drie hersenen preparaten die worden gebruikt voor het opnemen van de klem van het flard van hele cel om te studeren het retinotectal circuit van Xenopus laevis kikkervisjes. Elk preparaat, met zijn eigen specifieke voordelen, draagt bij aan de experimentele werkwillig van de Xenopus tadpole als een model om te studeren van neurale functie.

Preparaten en protocollen voor de hele cel Patch klem opname van Xenopus laevis Tectal neuronen

Leer licht-geëvoceerde postsynaptische reacties opnemen in neuronen in donker-aangepaste muizenretina met patch clamp-technieken. Deze methode biedt hoge gevoeligheid voor elektrofysiologisch onderzoek.

Opname Light-evoked Postsynaptische Reacties in Neuronen in Dark-aangepaste, Mouse retinale Slice Voorbereidingen Gebruik Patch Clamp technieken (Video) | JoVE Journal

Opname Light-evoked Postsynaptische Reacties in Neuronen in Dark-aangepaste, Mouse retinale Slice Voorbereidingen Gebruik Patch Clamp technieken

Meer video's verkennen