Opname Light-evoked Postsynaptische Reacties in Neuronen in Dark-aangepaste, Mouse retinale Slice Voorbereidingen Gebruik Patch Clamp technieken
11 februari 2015
We zullen demonstreren hoe retinale plakjes van het muizenoog worden bereid en lichtreacties in retinale neuronen worden opgenomen. De hele procedure wordt uitgevoerd in donker-aangepaste omstandigheden.
Het algemene doel van dit experiment is om lichtresponsopnamen te verkrijgen van in het donker aangepaste retinale neuronen. Dit wordt bereikt door eerst een muizenoog te verzamelen. De tweede stap is om de retina te isoleren en deze te snijden voor plakpreparaten.
Vervolgens wordt het retinale preparaat gemonteerd en bekeken op een microscoop om een doelcel te vinden voor patch clamp-opnamen. Na het vaststellen van een gehele cel patch clamp-configuratie, wordt een lichtstimulatie toegepast in de nabijheid van de cel. Ten slotte kan een gelijktijdige elektrofysiologische respons worden waargenomen via acquisitiesoftware.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals KRC-beeldvorming, is dat de opnamegevoeligheid hoog is en dat opnamecellen morfologisch kunnen worden geïdentificeerd. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode het moeilijk vinden omdat werken in totale duisternis moeilijk en desoriënterend kan zijn voor degenen die het niet gewend zijn. Om te beginnen, plaats de dissectietools en overdrachtspipetten bij de dissectiemicroscoop.
Het werkgebied zal goed georganiseerd zijn, zodat elk gereedschap gemakkelijk in het donker toegankelijk is. Wanneer u klaar bent, gebruikt u een infrarood kijker om de procedure in het donker uit te voeren. Na snel euthanasie in nucleaten, de ogen en plaats ze in een schaal met koud dissectieoplossing, bewaard in een donkere doos die onder een microscoop werkt.
Breng een oog over in een schaal met koude dissectieoplossing. Voortdurend geblazen met zuurstof. Om het hoornvlies en de lens te verwijderen, houdt u de oogzenuw aan het andere uiteinde van het oogbal vast om te voorkomen dat het beweegt en maakt u een incisie op de bovenkant van het hoornvlies met een microchirurgisch mes.
Verleng de snede met een paar chirurgische scharen en verwijder de hoornvlies, waarbij enige sclera eromheen wordt achtergelaten. Pak vervolgens de lens met fijne pincetten en trek deze langzaam eruit. Zodra de oogbeker is gemaakt, giet u voorzichtig koude geoxideerde dissectieoplossing in de oogbeker met een kleine overdrachtspipet.
Werk snel om de vorm van de retina te behouden en gebruik zachte druk om de dorsale en ventrale kanten van de retina te identificeren. Gebruik infrarood kijkers om de lijn te identificeren die de retinale oogbeker doorkruist, vlakbij de oogzenuwingang. Deze lijn loopt meestal over de ventrale kant van de oogzenuw en de kant, inclusief de oogzenuw, is de dorsale kant.
Afhankelijk van het experiment, maakt u een snede aan de ventrale of dorsale kant. Dit markeert de onnodige kant en is een nuttige marker voor verder werk. Vervolgens verwijdert u voorzichtig het glasvocht met extra fijne pincetten zonder de retina aan te raken.
Het glasvocht is voornamelijk bevestigd aan de bodem en de buitenrand van de oogbeker. Aangezien het glasvocht stevig aan de oogbeker kan zijn bevestigd, gaat u voorzichtig te werk om retinale loslating te verwijderen. Blijf trekken totdat er geen spanning meer wordt gevoeld.
Zodra de retina is geïsoleerd, pakt u de sclera en verwijdert u voorzichtig de retina. Gebruik de achterkant van de pincetten om de retina te trimmen en gooit u de onnodige helft in dezelfde plastic schaal weg. Snijd de resterende retina in twee stukken voor elk stuk.
Snijd de randen af om een retinale plak te maken en trim de vouwkanten. Gebruik vervolgens een grote overdrachtspipet om een retinale plak over te brengen naar een glazen plaat. Zuig het overtollige oplossing op met een kleine pipet en gebruik een stuk filterpapier om de plak plat te maken.
Plaats voorzichtig een stuk filtermembraan op het weefsel met behulp van een kleine overdrachtspipet. Plaats een druppel dissectieoplossing op het filtermembraan. Wacht ongeveer 15 seconden terwijl de oplossing zich verspreidt en het retinale weefsel aan het filtermembraan plakt.
Eenmaal vast, giet u meer koude dissectieoplossing onder en rond het filter tot het membraan drijft. Plaats vervolgens het filtermembraan in de snijkamer en bedek het met dissectieoplossing. Werk snel om ervoor te zorgen dat het membraan niet uitdroogt, gebruik de chopper om het retinale weefsel in plakjes te snijden.
Plaats een plastic dekglas met vetrails in de snijkamer. Breng een retinale plak over op de vetrails en draai de plak 90 graden zodat de dwarssectie zichtbaar is. Druk het filtermembraan neer op het dekglas voordat u de zijden van het filterpapier bedekt met vet.
Nadat de plakken op een plastic dekglas zijn geïmmobiliseerd, brengt u het over naar een plastic schaal van 33 millimeter. Dompel de voorbereiding onder met kolen dissectieoplossing en bewaar elke schaal in een donkere doos die continu wordt geoxygeneerd. Voor patch clamp-opnamen.
Pomp de profusiebuizen met aims medium en laat alle luchtbellen uit de buizen ontsnappen. Nadat u opnamepijpen hebt gemaakt met een glazen pool, vult u de punt met pijptoplossing. Gebruik vervolgens een micropipetvuller om ongeveer een derde van de pipet te vullen. Zodra deze is gevuld, bewaar elke pipet in een vochtige pipetbox.
Schakel vervolgens de apparatuur voor patch plant-opnamen in, inclusief de computerversterker, CCD-camera en microscoop die in donkere omstandigheden werken. Plaats een retinale plakvoorbereiding op de microscooptafel met behulp van een infrarood kijker. Nadat deze geïmmobiliseerd is, begint u met continue perfusie.
Stel de perfusietemperatuur in op 33 tot 37 graden Celsius. Bekijk het plakoppervlak met een CCD-camera. Focus op de doellocatie.
Met de doelceltypen, selecteert u een gezond uitziende cel voor een patch clat-opname. Zodra een gezonde cel is geïdentificeerd, plaatst u een opnamepipet in een pipethouder en brengt u de pipet naar de plakvoorbereiding. Wanneer het dicht bij de plakvoorbereiding is, vindt u de punt van de pipet met een microscoop.
Zodra de punt van de pipet onder de microscoop zichtbaar is, bewee
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel demonstreert de preparatie van retinale coupes uit muizenogen en het registreren van lichtresponsen in retinale neuronen. De procedure wordt uitgevoerd onder donker-geadapteerde condities om nauwkeurige metingen te garanderen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Retinale biologie
Achtergrond
- Het begrijpen van lichtreacties in retina-neuronen is cruciaal voor neurowetenschappelijk onderzoek.
- Patchclamp-technieken maken gedetailleerde elektrofysiologische registraties mogelijk.
- Donkeradaptatie is essentieel voor nauwkeurige metingen van de lichtrespons.
- Preparaten van retina-sneden bieden een gecontroleerde omgeving voor het bestuderen van neuronale activiteit.
Doel van de studie
- Om lichtresponsopnames te verkrijgen van donker-geadapteerde retinale neuronen.
- Om de methodologie voor het prepareren van retinale coupes te demonstreren.
- Om het gebruik van patchclamp-technieken in retinaal onderzoek te illustreren.
Gebruikte methoden
- Oogwinning bij muizen voor isolatie van het netvlies.
- Voorbereiding van netvliessneden voor elektrofysiologische analyse.
- Het gebruik van een microscoop om doelcellen voor registraties te lokaliseren.
- Toepassing van lichtstimuli om neuronale responsen te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie en preparatie van retina-slices.
- Vestiging van de whole-cell patchclamp-configuratie.
- Observatie van licht-geïnduceerde elektrofysiologische responsen.
- Demonstratie van de effectiviteit van de methodologie.
Conclusies
- De methode maakt nauwkeurige registraties van lichtresponsen in retinale neuronen mogelijk.
- Donkeradaptatie is essentieel voor accurate experimentele resultaten.
- Deze aanpak kan worden toegepast in verdere studies naar de retinale fysiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Het begrijpen van de functionele rollen van subtypes van retina-neuronen is cruciaal voor targetvalidatie bij de ontdekking van oogheelkundige geneesmiddelen. Deze methode maakt een nauwkeurige elektrofysiologische karakterisering van licht-evoqueerde synaptische responsen mogelijk, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie van targets in de visuele route. De aanpak levert kwantitatieve, reproduceerbare gegevens die het voorspellende vertrouwen bij de selectie van targets in een vroeg stadium vergroten.
Strategische Toepassingen in Biofarma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door neuronale morfologie te koppelen aan door licht opgewekte postsynaptische responsen.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe meting van de synaptische functie in gedefinieerde subtypen van retinale neuronen.
- Voorspellende waarde: Genereert kwantitatieve elektrofysiologische read-outs die bijdragen aan de betrouwbaarheid van targets en de validatie van pathways.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Produceert gestandaardiseerde, donkergeadapteerde retinale plakpreparaten die geschikt zijn voor consistente elektrofysiologische screening.
- Kwantitatieve output: Levert meetbare lichtopgewekte postsynaptische stromen of voltages met een gedefinieerde piekamplitude en vervalkinetiek.
- Reproduceerbaarheid: Maakt betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk via stabiele whole-cell patch clamp-registraties in visueel geïdentificeerde cellen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Faciliteert de studie van retinaal neurale netwerken die betrokken zijn bij de codering van visuele kenmerken zoals beweging en kleur.
- Translationele Continuïteit: Slaat een brug tussen functionele validatie in de ontdekkingsfase en preklinische beoordeling van synaptische mechanismen in visuele signalering.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Ondersteunt go/no-go beslissingen door de functionele bijdrage van specifieke neuronale subtypen aan visuele verwerking te verduidelijken.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van target-hypothesen tot lead-identificatie, en levert functionele gegevens die bijdragen aan vroege target-prioritisering.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden door het registreren van door licht opgewekte reacties in morfologisch geïdentificeerde retinale neuronen.
- Screening: Maakt standaardisatie van assays mogelijk via donker-geadapteerde slice-preparatie en consistente protocollen voor lichtstimulatie.
- Analytica: Genereert elektrofysiologische read-outs, waaronder stroomamplitude en vervaltijd, waardoor vergelijking tussen celtypen en condities mogelijk wordt.
- Translationeel onderzoek: Verbindt de ontdekking van synaptische mechanismen met modellen van retinale ziekten via subtype-specifieke functionele profilering.
- Hergebruik in de sector: Vestigt een herbruikbaar platform voor het evalueren van genetische, farmacologische of ziektegerelateerde wijzigingen in de retinale neuronale functie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door celmorfologie te koppelen aan synaptische functie in het retinaal netwerk.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door donker-geadapteerde condities en infraroodgestuurde preparatie, waardoor variabiliteit in lichtresponsmetingen wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verhoogt de betrouwbaarheid van targetselectie door direct elektrofysiologisch bewijs te leveren voor neuronale betrokkenheid bij visuele signaalverwerking.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van gevalideerde functionele rollen in verschillende retinaal paden.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in elektrofysiologie, retina-dissectie en infraroodmicroscopie voor de hantering van donkergeadapteerd weefsel.
- Afhankelijkheid van patchclamp-versterkers, perfusiesystemen en CCD-camera's voor stabiele opnames en visualisatie.
- Noodzaak van gestandaardiseerde donkerekamerprotocollen en zuurstofrijke dissectie-oplossingen om de levensvatbaarheid van het weefsel te behouden.
- Aanpassing aan verschillende modelsystemen kan correcties vereisen in de snijhoeken en perfusieparameters, afhankelijk van de retinadikte en celdichtheid.
- Praktische beperkingen omvatten de technische uitdaging om donkergeadapteerde condities te handhaven en de behoefte aan ervaren operators voor het behalen van een betrouwbare giga-seal vorming.
