Name: Kwantificering van de Immunosuppressieve tacrolimus op opgedroogd bloed Spots Met behulp van LC-MS / MS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Leer hoe u tacrolimus kwantificeert in gedroogde bloedvlekken met behulp van HPLC-MS/MS. Deze methode maakt minimaal invasieve monstername en therapeutische geneesmiddelenbewaking mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de United States Federal Drug Administration (FDA) contract HHSF223201310224C en de United States National Institutes of Health/FDA-subsidie 1U01FD004573-01.

De geïdentificeerde bloedmonsters van gezonde personen waren van de University of Colorado Hospital (Aurora, Colorado). Het gebruik van de geïdentificeerde bloedbank monsters voor de validatie studies, alsook voor de voorbereiding van kalibrators en kwaliteitscontrole monsters werd &quot;vrijgesteld&quot; beschouwd door de Colorado Multi-institutionele Review Board (COMIRB, Aurora, Colorado). 1. Voorbereiding van referenties en oplossingen <ol><li> Kopen van tacrolimus en de interne standaard D 2, 13 C-tacrolimus uit de in de materialen opgesomd leveranciers. <ol><li> Bereid voorraadoplossingen in zuivere methanol bij een concentratie van 1 mg / ml voor tacrolimus en een concentratie van 10 ug / ml voor D 2, 13 C-tacrolimus. Maak voorraad oplossingen van referentiematerialen gebaseerd op drie onafhankelijke wegingen. Aliquot voorraadoplossingen en bewaar bij -70 ° C of lager. </li></ol></li><li> Bereid oplossing eiwitten precipiterenen extract tacrolimus gebruik van methanol / 0,2 M ZnSO 4 in water (7: 3, v: v). Deze oplossing bevat ook de interne standaard D 2, 13 C-tacrolimus in een concentratie van 2,5 ng / ml en wordt gebruikt voor de extractie van alle monsters behalve voor de extractie van blanco monsters (zie 1.3.3). <ol><li> Bereid dit eiwit precipitatieoplossing vers op elke extractie dag en stel het verstrijken van de oplossing bij 12 uur. </li></ol></li><li> Bereiding van ijklijn en kwaliteitscontrole (QC) monsters <ol><li> Bereid voorraad oplossingen van tacrolimus door het uitvoeren van geschikte verdunningen van de voorraad oplossing met behulp van pure methanol. </li><li> Om ijk- en kwaliteitscontrolemonsters bereiden spike 20 pl geschikt verdund voorraadoplossing in EDTA volbloed, incubeer bij 37 ° C onder zacht schudden in een waterbad te zorgen voor homogene verdeling van tacrolimus in het cellulaire bloedproducten 20 min en aliquot in 1,5 ml poliepropylene buizen met conische bodem en snap-on deksels. Zorg ervoor dat de relatieve omvang van organische oplosmiddelen niet meer dan 5%. </li><li> Spot 50 ul van het verrijkte bloed in het midden van elke cirkel op de filterkaarten met een pipet. </li><li> Droog de bloedvlekken op filterkaarten bij kamertemperatuur gedurende 3 uur. </li><li> Bereid tacrolimus calibratiestandaarden in menselijk EDTA volbloed bij tacrolimus concentraties van 1, 2,5, 5, 10, 25 en 50 ng / ml. Bereid een blanco monster voor de extractie als de kalibratiestandaarden met het eiwit precipitatie met interne standaard D 2, 13 C-tacrolimus (&quot;zero sample&quot;). </li><li> Bereid QC monsters humaan volbloed EDTA in concentraties van 0, 2, 4, 20, 40 ng / ml. Bereid een blanco monster. In tegenstelling tot de QC-monsters die zijn geëxtraheerd met neerslag met interne standaard D 2, 13 C-tacrolimus, pakt deze lege monster met eiwitprecipitatie oplossing doetde interne standaard D 2, 13 C-tacrolimus (&quot;blanco monster&quot;) bevatten. </li></ol></li><li> Verzameling van klinische monsters <ol><li> Verzamel gedroogd bloed vlekken zoals beschreven in 43,44. </li></ol></li></ol> 2. Winning van tacrolimus opgedroogd bloed Spot Steekproeven <ol><li> Inspecteer de gedroogd bloed plek aanvaardbaar monster kwaliteit en volume 45 te waarborgen. </li><li> Punch centrum van het bloed vlek op het filter kaart met een 6-mm perforator. Opmerking: De kwaliteit van stempels kan worden gevolgd door weging. Een geperforeerd verzadigd filter schijf weegt gemiddeld 5,02 mg ± 0,09 mg (range: 4.83- 5.14 mg, n = 12). </li><li> Plaats schijven in 1,5 ml polypropyleen buizen met conische bodem en snap-on deksels. </li><li> Voeg 20-30 kogels aan elke buis. </li><li> Voeg 500 pi van het eiwit precipitatie-oplossing (methanol: 0,2 M ZnSO 4, 7: 3, v: v met 2,5 ng / ml interne standaard) in elke buis. Voor het extractie van blanco monsters, gebruiken eiwitprecipitatie oplossing zonder de interne standaard. </li><li> Homogeniseren van de schijven in de kogel blender gedurende 1 min (maximale snelheid, de instelling &quot;10&quot;). </li><li> Schud monsters bij RT op multi-tube vortex (maximale snelheid, de instelling &quot;10&quot;) gedurende 10 min. </li><li> Centrifugeer de monsters bij 16.000 xg en 4 ° C gedurende 10 min. </li><li> Breng de bovenstaande vloeistoffen in glas HPLC-flesjes uitgerust met een 300 ul insert. Gebruik pre-split Teflon afdichtingen. Opmerking: De geëxtraheerde monsters worden bewaard bij -20 ° C of lager totdat LC-MS / MS analyse. </li></ol> 3. LC-MS / MS Analyse <ol><li> Belasting 100 pi van het supernatant van de geëxtraheerde monster in de extractiekolom C8 cartridge en wassen met een 7: 3 verhouding van 0,1% mierenzuur in water: acetonitril bij een stroomsnelheid van 5 ml / min gedurende 1 min. De aansluitingen van de schakelklep worden getoond in figuur 2 en het verloop gerund door de extractie pomp in Tabel 1 </strong&gt;. </li><li> Hierna activeert de schakelklep waardoor terugspoeling van de analyten uit de pre-kolom op de analytische kolom. </li><li> Stel de kolom thermostaat op 65 ° C. </li><li> Elueer de analyten uit de analytische kolom met de stroomsnelheden en verloop weergegeven in tabel 1. </li><li> Sluit de analytische kolom om een tandem massaspectrometer via de turbo elektrosprayionisatie bron. Pas de belangrijkste parameters van de massaspectrometer volgens tabel 2. </li><li> Detect positieve ionen ([M + Na] +) in de meervoudige reactiewijze (MRM). Gebruik de volgende ion transities voor de kwantificering: tacrolimus: m / z (massa / lading) = 826,6 → 616,2 en D 2, 13 C-tacrolimus: m / z = 829,6 → 619,2. Opmerking: De totale looptijd is 4,6 min. </li></ol> 4. kwantificering <ol><li> Voor elke run, het genereren van een ijkkromme gebaseerd op het bereid in 1.3.5 en kalibratorenomvatten in elke analytische run. <ol><li> Genereer een ijkcurve door nominale concentraties versus respons factor analyt (Peak Area [Analyte] / Peak Area [interne standaard]) met behulp van de massaspectrometer software. </li><li> Monteer de kalibratoren met een kwadratische fit in combinatie met 1 / X weging. </li></ol></li><li> De hoeveelheid tacrolimus in de gedroogde bloedvlekken integreren tacrolimus en de interne standaard in de uitgepakte MRM chromatogrammen. Bereken de responsfactor voor tacrolimus (Peak Area [Analyte] / Peak Area [interne standaard]) en vergelijken met de kalibratiecurve met behulp van de massaspectrometrie software. </li></ol> 5. Validatie Procedures <ol><li> Ondergrens van detectie (LLOD) en de ondergrens van kwantificering (LLOQ). <ol><li> Beschouw de laagste tacrolimus concentratie met een piek-tot-ruis verhouding van 4: 1 als de onderste detectielimiet (LLOD). Definieer de ondergrens van kwantificering (LLOQ) alslaagste concentratie van de kalibratiecurve met een nauwkeurigheid gelijk aan of beter dan ± 20% afwijking van de nominale concentratie en nauwkeurigheid gelijk aan of beter dan 20% (variatiecoëfficiënt). </li></ol></li><li> Intra- en inter-dag nauwkeurigheid en precisie. <ol><li> Test de nauwkeurigheid en de precisie op vier concentraties van 2 ng / ml (QC1), 4 ng / ml (QC2), 20 ng / ml (QC3) en 40 ng / ml (QC4). </li><li> Bereid de QC-monsters op elke dag validatie in menselijk EDTA volbloed droog filter cards, extract en geanalyseerd zoals hierboven beschreven. </li><li> Bepaal intra-day nauwkeurigheid en precisie met 6 monsters per QC concentratie. </li><li> Evalueren inter-dag nauwkeurigheid en precisie van meer dan 20 dagen. Meet elke QC-niveau met 4 monsters per dag. </li><li> Analyseer twee kalibratiecurves met de QC-monsters op elke dag. </li><li> Bereken intra-day nauwkeurigheid als% van de nominale concentratie (zes monsters per concentratie, zie 5.2.2). CalcUlate precisie als de coëfficiënt van variatie (CV%). </li><li> Overweeg intra-day nauwkeurigheid aanvaardbaar indien zij onder de acceptatiegrenzen 85% tot 115% van de nominale concentratie. Overweeg intra-day precisie aanvaardbaar als deze gelijk is aan of beter dan een CV (variatiecoëfficiënt) van 15%. </li><li> Bereken inter-dag nauwkeurigheid en precisie als het gemiddelde voor elke QC concentratieniveau boven de 20 validatie dagen geanalyseerd. </li><li> Beschouw gemiddelde nauwkeurigheid inter-dag aanvaardbaar indien zij onder de acceptatiegrenzen 85% tot 115% van de nominale concentratie. Overweeg inter-dag nauwkeurig aanvaardbaar als deze gelijk is aan of beter dan een CV (variatiecoëfficiënt) van 15%. </li></ol></li><li> Uitsluiting van matrix storingen. <ol><li> Voor de uitsluiting van storingen, veroorzaakt door de matrix signalen analyseren lege gedroogde bloedvlekken (8 verschillende individuen, bij voorkeur 4 mannetjes en 4 vrouwtjes). </li><li> Visueel te inspecteren ion chromatogrammen. Als pieken binnen de retentietijdraam van tacrolimus worden gedetecteerd, te integreren en hun gebieden te vergelijken onder de curve met die van tacrolimus pieken in blanco monsters verrijkt met tacrolimus op het LLOQ. Het gebied van pieken in de blanco monsters worden niet verondersteld om meer dan 15% van die van tacrolimus op de LLOQ. </li></ol></li><li> Ion onderdrukking / ion toebehoren. <ol><li> Gebruik een infusie post-column protocol zoals beschreven 45 om mogelijke storing van ion onderdrukking / ion verbetering veroorzaakt door de co-eluerende matrixbestanddelen beoordelen. </li><li> Infuseren tacrolimus bij een concentratie van 10 ug / ml opgelost in 0,1% mierenzuur: methanol (30:70, v / v) na de kolom met een snelheid van 10 pl / min. <ol><li> Sluit een injectiepomp via T-stuk tussen de analytische kolom en de electrospray bron van de massaspectrometer. </li><li> Controleer de MS / MS signaalintensiteit van MRM-overgangen van tacrolimus en de interne standaard (m / z = 826,6 → 616,2 en m / z = 829,6 → 619,2) na injectie van winningted blanco monsters (n = 8 monsters van verschillende individuen). Opmerking: Bij afwezigheid van ion onderdrukking / ion enhancement het continu signaal veroorzaakt door infusie van de analyten niet worden beïnvloed door injectie van de lege matrix, terwijl ion onderdrukking veroorzaakt een daling van het signaal en een verbetering ion piek. </li></ol></li></ol></li><li> Overdragen. <ol><li> Evalueren mogelijke carry-over door het analyseren van gewonnen blanco monsters na de hoogste kalibratoren (50 ng / ml, n = 6). </li><li> Visueel te inspecteren ion chromatogrammen. Als pieken binnen de retentietijd raam van tacrolimus worden gedetecteerd, te integreren en hun gebieden te vergelijken onder de curve met die van tacrolimus pieken in blanco monsters verrijkt met tacrolimus op het LLOQ. Het gebied van pieken in de blanco monsters worden niet verondersteld om meer dan 15% van die van tacrolimus op de LLOQ. </li></ol></li><li> Extractie terugvorderingen. <ol><li> Bepaal herstel door vergelijking van de signalen van de analyten na extractie van QC samselen op alle vier concentraties (n = 6 per concentratie) met die van lege gedroogde bloedvlekken verrijkt met de overeenkomstige bedragen van tacrolimus na de extractie. </li><li> Bereid vier sets van KC (concentratie: 2, 4, 20, 40 ng / ml). </li><li> Bereid eens 4 sets van de overeenkomstige &quot;recovery proefmonsters&quot; door het spotten van 50 pi leeg EDTA volbloed op het filter papieren kaarten en drogen gedurende 2 uur. </li><li> Hierna, zowel voor de QC en blanco &quot;recovery proefmonsters&quot;, knip de hele bloed vlek op het filter kaart met een schaar en plaats de resulterende schijven in een polypropyleen buis met conische bodem en snap-on deksel. </li><li> Extract alle monsters. </li><li> Breng de supernatanten (400 pi) in glas HPLC-flesjes. </li><li> Voeg tacrolimus voorraadoplossing naar de lege &quot;recovery geëxtraheerde monsters&quot; concentraties van 2, 4, 20 en 40 ng / ml (4 pl 200, 400, 2000, 4000 ng / ml tacrolimus stock sol bereikenutions tot 400 pl supernatant). </li><li> Na LC-MS / MS analyse, vergelijk de signalen in zowel QC samples en &quot;recovery proefmonsters&quot; van de desbetreffende concentratie (recovery% = signaalmonsters spiked voordat extractie / signaalmonsters spiked na extractie x 100). </li></ol></li><li> Verdunning integriteit. <ol><li> Vaststellen verdunning integriteit behulp monsters verrijkt met de analyten 500, 250 en 100 ng / ml. </li><li> Na extractie, verdunnen monsters met behulp eiwitprecipitatie oplossing (01:10, n = 3 per concentratie). </li><li> Bereken afwijkingen van de nominale concentratie. Overweeg resultaten die binnen 85% -115% van de nominale aanvaardbare vallen. </li></ol></li><li> Stabiliteiten. <ol><li> Onderzoek stabiliteiten met de QC-monsters bij vier concentraties (n = 4 per concentratie) geanalyseerd op verschillende tijdstippen en onder verschillende opslagomstandigheden. </li><li> Vergelijk resultaten na opslag van de nominale waarden. Overweeg resultaten dat binnen 85% -115% van de nominale aanvaardbare vallen. </li><li> Vaststellen monsterstabiliteit gedurende 1 week bij kamertemperatuur, 1 week bij 4 ° C, 1 maand bij -20 ° C en 1 maand bij -80 ° C. </li><li> Test vries-dooi-stabiliteit via drie cycli (-20 ° C). Test geëxtraheerde monster en autosampler stabiliteit door het plaatsen van monsters in de autosampler thermostatisch ingesteld op 4 ° C. Injecteren monsters na 72 uur. </li></ol></li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hoewel, zoals hierboven vermeld, het begrip therapeutische geneesmiddel en hechting monitoring van tacrolimus basis van gedroogde bloedvlekken aantrekkelijk, er analytische uitdagingen die verder gaan dan die kenmerkend zijn voor de LC-MS / MS analyse van tacrolimus in veneus EDTA volbloedmonsters. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot, het feit dat de matrix capillair volbloed gedrenkt in de katoenlinters materiaal van het filter kaartmateriaal hier gebruikt en de lage bloedvolume (20 ui). Niettemin high-throughput...

Tacrolimus is een krachtige immonosuppressant 1-7 die een macrolide structuur 8 (figuur 1) heeft. Vanwege cis - trans isomerie GN bindingen vormt twee rotameren in oplossing 9 die kunnen worden gescheiden door omgekeerde fase hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) Tacrolimus lipofiel en oplosbaar in alcoholen (methanol: 653 g / L, ethanol: 355 g / l), gehalogeneerde koolwaterstoffen (chloroform: 573 g / l) en ether. Het is slecht oplosbaar in alifatische koolwaterstoffen (hexaan: 0,1 g / l en water (pH 3. 0,0047 g / L) 9 Het molecuul bevat geen chromofoor en UV-absorptiemaximum bevat is 192 nm Tacrolimus werkt via inhibitie van calcineurine. . Het werkingsmechanisme is beoordeeld in de referenties 10,11. Het wordt momenteel gebruikt in meer dan 80% van de vaste-orgaantransplantatie patiënten in de Verenigde Staten 12. De therapeutische index van tacrolimus is gezioend te zijn smalle 13. Bovendien is de correlatie tussen tacrolimus en bloedconcentraties is slecht en farmacokinetiek variabel 14,15. Therapeutische drug monitoring tacrolimus dosering bij transplantatie patiënten is daarom de algemene klinische praktijk 16-20. Het doel is om de tacrolimus bloedconcentraties binnen een vooraf bepaalde therapeutische bereik te houden. Tacrolimus bloed concentraties beneden het therapeutisch bereik kan leiden tot verhoogde activiteit van chronische of acute allo-immuunreactie, terwijl concentraties boven het therapeutisch verhogen het risico van over- immunosuppressie, kanker en toxiciteit, bijvoorbeeld nefrotoxiciteit, neurotoxiciteit, hypertensie en diabetes. Hoge farmacokinetische intra-individuele variabiliteit van tacrolimus kan schadelijk zijn voor zowel de transplantatie van organen en overleving van patiënten 21,22 zijn. Terwijl de inter-individuele variabiliteit van tacrolimus farmacokinetiek wordt vooral veroorzaakt door CYP3A5 polymorfismen, redenen voor intra-individuelevariabiliteit omvatten, maar zijn niet beperkt tot, drug-drug, ziekte-geneesmiddel en food-geneesmiddelinteracties 14,15. Ook gebrek aan naleving van de immunosuppressieve therapeutische drug regime is een bijdragende factor en een belangrijke reden voor transplantaat verlies 23,24. Deze overwegingen suggereren dat frequent thuis therapeutische geneesmiddelen en therapietrouw monitoring van tacrolimus volbloed-concentraties nuttig om ervoor te zorgen dat patiënten de blootstelling tacrolimus binnen de gewenste therapeutische raam te allen tijde kan worden. Echter, de logistiek en de kosten van frequentere therapeutic drug monitoring als het huidige klinische praktijk 15 is onbetaalbaar. Een van de redenen is dat de patiënt om te zien een phlebotomist de vereiste veneus bloedmonster getrokken hebben. Gedroogd bloed vlekken zijn onlangs naar voren gekomen als een aantrekkelijk concept van 25-28. Na een eenvoudige vinger stick de patiënt verzamelt een druppel bloed op een speciaal filter papier kaart en na het bloed spot heeft dried kan worden verzonden naar een centraal laboratorium voor analyse van tacrolimus en andere immunosuppressieve dat de patiënt nog kan nemen. Dit is mogelijk geworden door de ontwikkeling van zeer gevoelige en specifieke LC-MS / MS assays voor het kwantificeren van tacrolimus en andere immunosuppressiva in zeer kleine hoeveelheden bloed zoals gedroogde bloedvlekken (gewoonlijk 20 pl bloed) 25,29-43. Een ander voordeel is dat minimaal invasieve, een laag volume monstername strategieën zoals gedroogde bloedvlekken sterk therapeutische controle van geneesmiddelen en farmacokinetische studies bij kleine kinderen 28 vergemakkelijken. Tacrolimus wordt meestal gemeten bij veneuze EDTA volbloed 15. Redenen zijn dat tacrolimus uitgebreid distribueert in bloedcellen en dat de klinische studies hebben gemeld betere correlatie tussen tacrolimus dalspiegels in het bloed dan in het plasma met klinische gebeurtenissen 15,18. In vergelijking, de analyse van tacrolimus in gedroogde bloedvlekken op basis van capillair bloed dat wordt gemengd met het filterpapier matrix. Dit biedt uitdagingen op het gebied van de solubilisatie van tacrolimus en mogelijke interferenties met de LC-MS / MS analyse. Hier presenteren we een gevestigde en gevalideerde test gebaseerd op homogenisering van de gedroogde bloedvlek met een kogel blender in combinatie met high-flow online column steekproef schoonmaak procedures en LC-MS / MS analyse. Met ingang van vandaag, heeft deze test met succes gebruikt voor de kwantificering van meer dan vijfduizend tacrolimus gedroogd bloed spot monsters voor de naleving bewaking in klinische studies.

<table><tbody><tr><td>Tacrolimus</td><td>U.S. Pharmacopeial Convention</td><td>1642802</td><td></td></tr><tr><td>D2,13C-Tacrolimus</td><td>Toronto Research Chemicals Inc.</td><td>F370002</td><td></td></tr><tr><td>Rode bloedcellen</td><td>University of Colorado Hospital</td><td>W20091305500 V</td><td></td></tr><tr><td>Plasma</td><td>University of Colorado Hospital</td><td>W2017130556300Q</td><td></td></tr><tr><td>Aceton CHROMASOLV, HPLC, &ge;99,9%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>439126-4 L</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril Optima LC/MS, UHPLC-UV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol 99.9%, HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2632-4</td><td></td></tr><tr><td>Methanol Optima LC/MS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Water Optima LC/MS, UHPLC-UV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>Mierenzuur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A118P-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferd zout (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Zinksulfaat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Z68-500</td><td></td></tr><tr><td>0,5 &ndash; 10 &micro;l pijp, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008649</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorf tube</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>10 &ndash; 100 &micro;l pijp, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008651</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu;l pijptips met filter, steriel</td><td>Neptune</td><td>BT 10XLS3</td><td></td></tr><tr><td>100 &ndash; 1.000 &micro;l pijp, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008653</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu;l pijptips met filter, steriel</td><td>Neptune</td><td>BT 100</td><td></td></tr><tr><td>1.000 &mu;l pijptips met filter, steriel</td><td>Multimax</td><td>2940</td><td></td></tr><tr><td>2 &ndash; 20 &micro;l pijp, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008650</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Eppendorf tube</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-681-258</td><td></td></tr><tr><td>20 &ndash; 200 &micro;l pijp, VoluMate LIQUISYSTEMS</td><td>Mettler Toledo</td><td>17008652</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu;l pijptips met filter, steriel</td><td>GeneMate</td><td>P-1237-20</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;l pijptips met filter</td><td>Multimax</td><td>2938T</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;l pijptips met filter, steriel</td><td>Multimax</td><td>2936J</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon tube</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>300 &mu;l inzetstukken voor HPLC-violen</td><td>Phenomenex</td><td>ARO-9973-13</td><td></td></tr><tr><td>Balance PR2002</td><td>Mettler Toledo</td><td>1117050723</td><td></td></tr><tr><td>Balances AX205 Delta Range</td><td>Mettler Toledo</td><td>1119343379</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender Homogenizer</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Biofuge Fresco</td><td>Heraeus</td><td>290395</td><td></td></tr><tr><td>wegwerp doekjes</td><td>PDI</td><td>Q55172</td><td></td></tr><tr><td>Glasbuisjes, 4 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-955-334</td><td></td></tr><tr><td>Glasbuisjes, 20 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B7800-20</td><td></td></tr><tr><td>Handschoenen, nitril</td><td>Titan Brand Gloves</td><td>44-100S</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-buisjes, 9 mm, 2 ml, helder</td><td>Phenomenex</td><td>ARO- 9921-13</td><td></td></tr><tr><td>Doppen voor HPLC-violen</td><td>Phenomenex</td><td>ARO- 8952-13-B</td><td></td></tr><tr><td>Naald, 18 G 1,5</td><td>Precision Glide</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Rack voor Eppendorfbuisjes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-448-11</td><td></td></tr><tr><td>Rack voor HPLC-violen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-541-29</td><td></td></tr><tr><td>Stalen bolletjes 0,9 &ndash; 2 mm</td><td>Next Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>Opslagdozen voor diepvriezers / koelkasten</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>03-395-464</td><td></td></tr><tr><td>Standaard multi-buis vortexer</td><td>VWR Scientific Products</td><td>658816-115</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK</td><td>GE Whatman&nbsp;</td><td>2016-05</td><td></td></tr><tr><td>Autosampler</td><td>CTC PAL&nbsp;</td><td>PAL.HTCABIx1</td><td></td></tr><tr><td>Binaire pomp, Agilent 1260 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 G1312B</td><td></td></tr><tr><td>Binaire pomp, Agilent 1290 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G4220A</td><td></td></tr><tr><td>Microvacuümdegasser, Agilent 1260</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 G13798</td><td></td></tr><tr><td>Kolom oven,&nbsp; Agilent 1290 met 2 posities&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G1216C</td><td></td></tr><tr><td>Gethermostaseerde kolomcompartiment met geïntegreerde 6-poorts schakelklep</td><td>Agilent Technologies</td><td>1290 G1316C</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-voorkolomcartridge, Zorbax XDB C8 (5 &micro;m deeltjesgrootte), 4,6 &middot; 12,5 mm</td><td>Phenomenex</td><td>820950-926</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-analytische kolom, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 &micro;m deeltjesgrootte), 4,6 &middot; 150 mm</td><td>Phenomenex</td><td>993967-906</td><td></td></tr><tr><td>Tandem-massaspectrometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>API5000 MS/MS met TurboIonspray-bron</td><td>AB Sciex</td><td>4364257</td><td></td></tr><tr><td>Massaspectrometriesoftware</td><td>AB Sciex</td><td>Analyst 1.5.1</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificering van de immunosuppressieve tacrolimus op opgedroogd bloed spots met behulp van lc-ms / ms

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

De calcineurineremmer tacrolimus is de hoeksteen van de meeste immunosuppressieve behandelprotocollen na solide orgaantransplantatie in de Verenigde Staten. Tacrolimus is een smalle therapeutische index geneesmiddel en als zodanig vereist therapeutische controle van geneesmiddelen en aanpassing van de dosis op basis van haar volbloed dalconcentraties. Naar huis therapeutische geneesmiddelen en therapietrouw monitoring te vergemakkelijken, de verzameling van gedroogde bloedvlekken is een aantrekkelijk concept. Na een vingerprik, de patiënt verzamelt een druppel bloed op filterpapier thuis. Nadat het bloed is gedroogd, wordt deze verzonden naar het analytische laboratorium waar tacrolimus wordt gekwantificeerd met behulp van high-performance vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (HPLC-MS / MS) in combinatie met een eenvoudige handmatige eiwitten neerslaan en online extractiekolom. Voor tacrolimus analyse is een 6-mm schijf gestanst uit de verzadigde centrum van het bloed ter plaatse. Het bloed spot wordt gehomogeniseerd met behulp van een kogel een blendernd dan eiwitten worden geprecipiteerd met methanol / 0,2 M ZnSO 4 met interne standaard D 2, 13 C-tacrolimus. Na vortexen en centrifugeren, wordt 100 ul supernatant geïnjecteerd in een online extractiekolom en gewassen met 5 ml / min van 0,1 mierenzuur / acetonitril (7: 3, v: v) gedurende 1 min. Hierna wordt de schakelklep geactiveerd en de analyten worden teruggespoeld op de analytische kolom (en gescheiden met een 0,1% mierenzuur / acetonitril gradiënt). Tacrolimus wordt gekwantificeerd in de positieve meerdere reactiewijze (MRM) met een tandem massaspectrometer. De assay is lineair 1-50 ng / ml. Inter-assay variabiliteit (3,6% -6,1%) en de nauwkeurigheid (91,7% -101,6%) zoals bepaald meer dan 20 dagen te voldoen acceptatiecriteria. Gemiddelde extractie herstel is 95,5%. Er zijn geen relevante carry-over, matrix storingen en matrixeffecten. Tacrolimus is stabiel in gedroogde bloedvlekken bij kamertemperatuur en bij 4 ° C gedurende 1 week. Onttrokken monsters in deautosampler stabiel bij 4 ° C gedurende ten minste 72 uur.

Representatieve ion chromatogrammen van een blanco monster een monster op de ondergrens van kwantificering en een patiëntmonster spiked zijn weergegeven in figuur 3. Kalibratie Curves De onderste detectiegrens was 0,5 ng / ml en de onderste bepalingsgrens was 1,0 ng / ml. Vijftig ng / ml werd gekozen als de kalibrator hoogste hogere concentraties onwaarschijnlijk onder normale omstandigheden in de kliniek te bereiken. <p clas...

Hier beschrijven we een hoogwaardige vloeistofchromatografie-gekoppelde massaspectrometrie (HPLC-MS/MS) test om het immunosuppressivum tacrolimus in gedroogde bloedvlekken te kwantificeren met behulp van een eenvoudige handmatige eiwitprecipitatiestap en online kolomextractie.

Kwantificering van de Immunosuppressieve tacrolimus op opgedroogd bloed Spots Met behulp van LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om tacrolimus in drooggedroogde bloedvlekken te kwantificeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven kwantificering van tacrolimus in bloedmonsters na intraveneuze bloedafname is dat patiënten monsters zelf kunnen verzamelen. Minimaal invasieve, laagvolume monsterverzamelingstrategieën zoals drooggedroogde bloedvlekken vergemakkelijken ook het bewaken van therapeutische geneesmiddelen en farmacokinetische onderzoeken bij kleine kinderen. Na een eenvoudige vingerprikken verzamelt de patiënt een bloeddruppel op een speciale filterpapierkaart en nadat de bloedvlek is gedroogd, kan deze worden verzonden naar een centraal laboratorium voor analyse van tacrolimus en eventuele andere immunosuppressiva die de patiënt mogelijk gebruikt.Kwantificering van geneesmiddelen op drooggedroogde bloedvlekken is mogelijk geworden door de ontwikkeling van zeer gevoelige en specifieke LCM SM S-assays voor de kwantificering van tacrolimus en andere immunosuppressiva in zeer kleine bloedvolumes zoals drooggedroogde bloedvlekken. Bereid eerst stamoplossingen in zuiver methanol met een concentratie van één milligram per milliliter voor tacrolimus en een concentratie van 10 microgram per milliliter. Voor D twee 13 C aliquot stamoplossingen en bewaar op elke extractiedag bij negatief 70 graden Celsius of lager, bereid een zeven op drie verhouding van methanol en 0,2 molair zinksulfaat in water om eiwitten te precipiteren en tacrolimus te extraheren.De interne standaardstamoplossing wordt in de precipitatieoplossing gespoeld. Stel de vervaldatum van de oplossing in op 12 uur. Bereid vervolgens stamoplossingen van tacrolimus door de stamoplossing geschikt te verdunnen met zuiver methanol om kalibratoren en kwaliteitscontrolemonsters te bereiden.Spuit 20 microliter van de geschikt verdunde stamoplossing in EDT. Incubeer een vol bloed bij 37 graden Celsius onder zacht schudden in een waterbad gedurende 20 minuten om een homogene verdeling van tacrolimus in de cellulaire bloedcomponenten mogelijk te maken. Om een grotere hoeveelheid kalibratoren en kwaliteitscontrolemonsters te bereiden, spuit 2000 microliter van de geschikt verdunde stamoplossing in EDT.Een vol bloed incuberen bij 37 graden Celsius onder zacht schudden in een waterbad gedurende 20 minuten om een homogene verdeling van tacrolimus in de cellulaire bloedcomponenten mogelijk te maken. Verdeel vervolgens de monsters in 1,5 milliliter polypropyleenbuisjes met conische bodems en klikopdeksels. Spuit 50 microliter van het gespikte vol bloed in het midden van elke cirkel op filterkaarten met behulp van een pipet nadat de bloedvlekken gedurende drie uur op kamertemperatuur zijn gedroogd, bereid tacrolimus kalibratiestandaarden in menselijk EDTA-volbloed bij tacrolimusconcentraties van één 2,5 5, 10 25 en 50 nanogram per milliliter.Bereid een blanco monster voor extractie zoals de kalibratiestandaarden met de eiwitprecipitatieoplossing, zonder de interne standaard D twee 13 C tacrolimus. Bereid vervolgens kwaliteitscontrolemonsters in menselijk EDTA-volbloed bij concentraties van 0 2 4 20 en 40 nanogram per milliliter. Bereid ook een blanco monster voor. Nadat de drooggedroogde bloedvlekken zijn verzameld, inspecteer elk visueel om de acceptabele monsterkwaliteit en -volume te waarborgen.Puns vervolgens het midden van de bloedvlek op de filterkaart met een zes millimeter pons. Plaats de schijven in 1,5 milliliter polypropyleenbuisjes met conische bodems en klikopdeksels. Voeg 20 tot 30 kogels toe aan elke buis.Voeg vervolgens 500 microliter van de eiwitprecipitatieoplossing toe aan elke buis. Homogeniseer de schijven gedurende één minuut op maximale snelheid in een kogelmixer. Wanneer u klaar bent, schudt u de monsters bij kamertemperatuur op een multi-buisvortex met maximale snelheid gedurende 10 minuten.Vervolgens centrifugeren de monsters bij 16.000 GS en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Na centrifugatie brengt u de SNAT over in glazen HPLC-vialtje voorzien van een 300 microliter inzet. Laad op dit punt 100 microliter van het supernat van het geëxtraheerde monster op de C acht cartridge extractiekolom, was met een zeven op drie verhouding van 0,1% formijnzuur in water en zuur nitril bij een stroomsnelheid van vijf milliliter per minuut.Verbind de analytische kolom via de turbo elektrospray ionisatiebron met een tandemmassaspectrometer. Pas de belangrijkste parameters van de massaspectrometer aan volgens de volgende tabel. Detecteer vervolgens positieve ionen in de meervoudige reactiemodus.Om tacrolimus in de drooggedroogde bloedvlekken te kwantificeren, vergelijkt u deze met de kalibratiecurve met behulp van de massaspectrometriesoftware representatieve ionenchromatogrammen van een blanco monster. Een monster gespikt op de onderste limiet van de kwantificering en een patiëntenmonster worden hier getoond. Een typische kalibratiecurve wordt hier getoond.De gemiddelde correlatiecoëfficiënt is 0,9994. De nauwkeurigheid en precisieresultaten worden hier gedetailleerd weergegeven. Er werden geen aanwijzingen van significante ionisonderdrukking of ionisverbetering waargenomen en er werd geen relevante carry-over gedetecteerd die resulteerde in pieken die hoger waren dan.15%van het signaal bij de onderste kwantificeringsgrens. De verdunningsintegriteit werd onderzocht door monsters te analyseren die werden bereid bij concentraties boven de hoogste kalibrator en verdund in eiwitprecipitatieoplossing na extractie om de doelconcentraties te bereiken. Alle verdunningen voldeden aan de acceptatiecriteria.Er werden geen verliezen waargenomen na een week opslag bij kamertemperatuur na een week opslag bij vier graden Celsius en na een maand opslag bij negatief 20 graden Celsius. Bovendien werden er geen verliezen waargenomen na een maand opslag bij negatief 80 graden Celsius na drie vries-doodcycli en na 72 uur van geëxtraheerde monsters in de autosampler bij vier graden Celsius. Eenmaal onder de knie, kunnen 20 monsters in minder dan een uur worden geëxtraheerd.Wanneer u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden dat de sleutel tot betrouw

quantification-immunosuppressant-tacrolimus-on-dried-blood-spots

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Tregs zijn krachtige onderdrukkers van het immuunsysteem. Er is een gebrek van unieke oppervlakte markers om ze te definiëren, dus, de definities van Tregs zijn vooral functioneel. Hier beschrijven we een...

Menselijk In Vitro Onderdrukking als Screening Tool voor de erkenning van een vroege staat van Immune Imbalance

Wij rapporteren een methode voor het geneesmiddel sorptie evaluatie met behulp van een pomp en model drugs (diazepam en tacrolimus). Na drug analyse met behulp van high-performance vloeistofchromatografie, geneesmiddelconcentraties en sorptie niveaus in de buizen van toedieningssystemen worden berekend.

Evaluatie van de Drug Sorptie aan PVC- en Non-PVC-gebaseerde Tubes in Administration Stelt Met behulp van een pomp

Hier beschrijven we een chromatografische test in combinatie met de ion mobiliteit scheiding van peptide precursoren gevolgd door de hoge resolutie (~ 30.000) MS-detectie van peptide fragmenten voor de kwantificering van puntige peptide normen in een monoclonal antilichaam Digest.

Een HS-MRM Assay voor de kwantificering van de gastheercel eiwitten in Protein biofarmaceutica door vloeistofchromatografie Ion mobiliteit QTOF massaspectrometrie

Combinatie van Ivacaftor en ivacaftor-lumacaftor zijn twee nieuwe CF-drugs. Er is echter nog steeds een gebrek aan overeenstemming inzake hun PK/PD en farmacologie. We presenteren een geoptimaliseerde HPLC-MS-techniek voor de gelijktijdige analyse van ivacaftor en de belangrijkste metabolieten daarvan, en lumacaftor.

Geoptimaliseerde LC-MS/MS methode voor de analyse van de High-throughput van klinische monsters van Ivacaftor, de belangrijkste metabolieten daarvan en Lumacaftor in biologische vloeistoffen van Cystic Fibrosis patiënten

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en handige methode voor het opslaan van perifeer bloed en serum/plasma voor downstream analyses uitgevoerd, zoals single nucleotide polymorphism (SNP) evaluatie en analyse ELISA.

Gedroogd bloed en Serum vlekken als een nuttig instrument voor Sample opslag om te evalueren van kanker, Biomarkers

Hier beschrijven we een protocol met behulp van laser vangt microdissection LC/MS-analyse wordt gekoppeld aan het ruimtelijk-kwantificeren drug distributies binnen longtuberculose granulomas. De aanpak heeft brede toepasbaarheid te kwantificeren van de drug concentraties in weefsels bij hoge ruimtelijke detail.

Ruimtelijke kwantificering van Drugs in longtuberculose laesies door Laser vangen Microdissection vloeistof chromatografie massaspectrometrie (LCM-LC/MS)

Hier beschrijven we een eencellige proteomic aanpak om te evalueren van immuun fenotypische en functionele (intracellulaire cytokine inductie) veranderingen in het perifere bloedmonsters geanalyseerd via massale cytometry.

Eencellige analyse van Immunophenotype en Cytokine productie in perifere bloed via massale Cytometry

De huidige methoden voor het analyseren van de therapietrouw van patiënten aan complexe resistente tuberculose (DR-TB) regimes kunnen onjuist en resource-intensief zijn. Onze methode analyseert haar, een gemakkelijk verzamelde en opgeslagen matrix, voor concentraties van 11 DR-TB medicijnen. Met behulp van LC-MS / MS, kunnen we bepalen sub-nanogram drug niveaus die kunnen worden gebruikt om beter te begrijpen drug therapietrouw.

Gevalideerd LC-MS/MS Panel voor het kwantificeren van 11 resistente tb-medicijnen in small hair samples

Een betrouwbare en herhaalbare manier om een ​​eenzijdige cervicale dwarslaesie het gebruik van de oneindige horizon botslichaam te produceren wordt beschreven. De methode maakt gebruik van een speciaal ontworpen frame en vast te klemmen aan de wervelkolom te stabiliseren. De gestandaardiseerde procedure en biomechanische letsel parameters resulteren in een toereikende en duurzame verwondingen.

Een Contusive model van eenzijdige cervicale ruggenmerg letsel met behulp van de Oneindige Horizon Impactor

Te ontrafelen de vroegste moleculaire mechanismen prostaatkanker initiatie, nieuw en innovatief model van de mens systemen en benaderingen zijn hard nodig. Het potentieel van de pre-prostaat urogenitale sinus mesenchym (UGSM) naar pluripotente stamcel populatie bewegen om menselijke prostaat epitheel vormen is een krachtig experimenteel hulpmiddel in prostate onderzoek.

Vorming van menselijke prostaat epitheel behulp Tissue recombinatie van knaagdieren Urogenital Sinus Mesenchym en menselijke stamcellen

Leer hoe u tacrolimus kwantificeert in gedroogde bloedvlekken met behulp van HPLC-MS/MS. Deze methode maakt minimaal invasieve monstername en therapeutische geneesmiddelenbewaking mogelijk.

Kwantificering van de Immunosuppressieve tacrolimus op opgedroogd bloed Spots Met behulp van LC-MS / MS

Meer video's verkennen