Name: Directe visualisatie van het Muizen Dorsale Cochlear Nucleus voor optogenetische Stimulatie van de Auditieve Pathway (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Leer een chirurgische methode voor directe toegang tot het dorsale cochleaire kern (DCN) bij muizen. Deze techniek maakt optogenetische stimulatie en virus-gemedieerde gentransfer in het centrale auditieve systeem mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering: Dit werk werd ondersteund door een stichting Bertarelli subsidie ​​(DJL), een MED-EL-subsidie ​​(DJL), en een National Institutes of Health Subsidies DC01089 (MCB).

OPMERKING: Alle experimentele procedures worden uitgevoerd in overeenstemming met de Animal Care en gebruik Comite van het Massachusetts Eye en Ear Infirmary en de Harvard Medical School, die de nationale richtlijnen verzorging van dieren te volgen, waaronder GGD Beleid inzake Humane zorg en het gebruik van proefdieren, de ILAR Guide, en de Animal Welfare Act. Opgesomd experimentele procedures hieronder detail blootstelling van de linker DCN. Gebruik steriele instrumenten tijdens het uitvoeren van de overleving chirurgie. 1. Primaire Craniotomie en Dorsale Cochlear Nucleus Exposure <ol><li> Anesthesie <ol><li> Verdoven een muis, 8-12 weken, gewicht 18-24 g jaar, met xylazine 20 mg / kg ketamine en 100 mg / kg via de intraperitoneale toediening. Bevestig de juiste verdoving door bewaking hartslag, ademhaling, evenals teen knijpen terugtrekking reflex. Plaats dierenarts zalf op ogen droog terwijl onder narcose voorkomen. Zodra voldoende onder narcose, scheren haar bovenliggende tHij hoofdhuid onbelemmerde toegang tot de chirurgische site. </li></ol></li><li> Chirurgische positionering <ol><li> Plaats de muis stevig in een klein dier stereotaxisch houder, op zijn plaats gehouden door een snuit klem. </li><li> Zorg ervoor dat de snuit klem is los genoeg zodat er passende ademhaling, maar strak genoeg om volledig te immobiliseren het hoofd van de muis. Als de muis hoofd los is, het dier is waarschijnlijk uit de kop houder te vallen tijdens de craniotomie deel van de procedure. </li><li> Plaats auditieve hersenstam implantaat elektroden in standaard mode, die het mogelijk maakt voor hartslagmeting. Rate luchtwegen moet worden gecontroleerd door visualisatie. Merk op dat de normale hartslag en ademhaling zal variëren afhankelijk van de leeftijd van de muis. </li><li> Een thermometer wordt via plaatsing geplaatst en euthermia is verzekerd op een homeothermic verwarming deken. </li></ol></li><li> Huidincisie en de blootstelling van de interparietal en occipitale beenderen van de schedel <ol><li> Onder een Microscope, maak een verticale incisie door de huid vanaf de middellijn, rechtstreeks tussen de oorschelp, en zich uitstrekt tot het caudale gedeelte van de achterhoofdsknobbel. Volgende middellijn incisie in de huid, verdringen de huid lateraal. Visualiseer de spieren die het liet de achterste deel van de schedel. </li><li> Verwijder spier bovenop de linker pariëtale, interparietal en occipitale beenderen van de schedel door exarticulatie van spieraanhechtingen hun respectieve botten met een scalpel of iris schaar. Observeer een kleine mate van bloeding langs cut spier randen. Minimaliseer deze door lichte druk met een wattenstaafje voor 10-15 sec. </li></ol></li><li> Craniotomie bovenliggende Cochlear Nucleus <ol><li> Identificeer relevante hechtdraad lijnen, met inbegrip van sagittale en lambda hechtingen lijnen (figuur 1, linker paneel). </li><li> Met behulp van rongeurs, maak een craniotomie over de interparietal bot, links van de middellijn, ~ 2 mm caudaal van de lambda hechting. Deze regio ligt over de DCN. </li><li> Following craniotomie, observeren een dun laagje dura dat de kleine hersenen bedekt. Met behulp van een scalpel, verwijder de dura. (Figuur 1, Midden-Panel). LET OP: Het verwijderen van dura kan een kleine mate van bloeden veroorzaken. Dit proces van het gebruik van de scalpel de dura verwijderen beoogt de hoeveelheid bloedverlies te verminderen tijdens het cerebellum aspiratie, die pool op de hersenstam oppervlak obscure identificatie van het DCN. De totale bloedvolume van muis ~ 1,5 ml niet overschrijden&gt; dan 15%. Als bloeden dit bedrag overschrijdt, moet de muis worden voorzien met vocht suppletie. </li><li> Verwijder gestold bloed bedekken het cerebellum met de katoenen tip applicator. Optioneel zachtjes druppelen zoutoplossing met behulp van een tandheelkundige punt op de kleine hersenen om bloed bloed te ruimen. </li></ol></li><li> Cerebellaire Aspiration <ol><li> Met een 5 French zuiging, zuig het meest laterale deel van de linker cerebellum bovenop de DCN totdat het DCN is visUAL (figuur 1, rechter paneel). Verwijder ongeveer 1/4 tot 1/3 van de linker cerebellum. Het belangrijkste monument naast de DCN is de ampulla van de superieure halfronde gracht. OPMERKING: Aspiratie van het cerebellum is de belangrijkste stap van het protocol. Gericht aspiratie van het cerebellum is het meest succesvol uitgevoerd als het zich voordoet in één poging en niet met meerdere passages van de zuiging, omdat dit zal leiden tot bloeden. Om te helpen bij aspiratie, stelt het brandvlak van de microscoop op de verwachte diepte van de GN, die enigszins distaal van het oppervlak van het cerebellum is. De focal plane instellen op de GN zal visualisatie te verbeteren en te zorgen voor een scherp beeld. </li><li> Als gevolg van aspiratie, verder bloeden, cerebrospinale vloeistof (CSF) te bouwen-up, en het cerebellum verdringing op de DCN worden verwacht. Inboezemen 0,5 cc steriele zoutoplossing snel in de craniotomie om bloedstolling te voorkomen. Een combinatie van zacht deppen met een tandheelkundige punt en zuigkracht kan dangebruikt te ruimen een pad voor directe visualisatie van het DCN. Niet direct contact op met de oppervlakte van de DCN. </li></ol></li></ol> 2. Druk Micro-injectie voor-Virus gemedieerde Gene Transfer en Chirurgische Recovery <ol><li> Na de DCN is vrij van bovenliggende bloed en CSF en is duidelijk zichtbaar, maken druk micro-injecties in de DCN met behulp van een 10 ul Hamilton spuit over een 2 min periode. </li><li> Breng de naald met een micromanipulator totdat de tip niet meer zichtbaar onder het oppervlak van het DCN. </li><li> Voor optimale prestaties gebruikt een 33 of 34 gauge naald (gebruik een gasdichte injectiespuit met 34 gauge naald) met ondiepe afschuining, zoals 45 °, stompe trauma te minimaliseren en het injectievolume binnen het DCN, dat een dun lokaliseren en ondiepe hersenstam structuur (&lt;300 micrometer dik). OPMERKING: Andere micro-injectie instrumenten kunnen worden gebruikt gebaseerd. Idealiter zou de injectie instrument flexibel waardoor enige lichte bend, indien nodig direct richten op de DCN. Verder, zoals de muis zich verplaatst gedurende de procedure door ademhaling, het instrument moet robuust genoeg zijn om kleine hoeveelheden beweging weerstaan. </li></ol> 3. Chirurgische Recovery <ol><li> Onmiddellijk na de injectie, opnieuw benaderen van de huid en laat de muis om te herstellen per standaard invorderingsprocedure. Resterende cerebellum en littekenweefsel zal in de holte, veroorzaakt door aspiratie van het cerebellum te vullen. Voortdurend te controleren dieren totdat voldoende bewustzijn is hersteld om borstligging behouden. Monitor hartslag, ademhaling, alsmede het vermogen om te voeden. OPMERKING: Geen enkel dier dat een operatie heeft ondergaan is teruggekeerd naar een kooi met andere dieren tot ze volledig hersteld. </li><li> Als een muis begint te lopen in cirkels na operatie (&lt;5% van de gevallen), meestal 2-4 uur na sluiting van de incisie in de huid, onmiddellijk te offeren de muis, omdat het waarschijnlijk zou hebben een moeilijke tijd het voeden. Tzijn zijde effect is waarschijnlijk te wijten aan aspiratie van het cerebellum. Het dier moeten worden gecontroleerd op de pijn na de operatie, en passende verdovende middelen moet worden besteed aan het comfort van dieren te verzekeren op basis van de institutionele normen. Antibiotica kan nodig zijn, als bewijs van de infectie. </li></ol> 4. Secundaire Craniotomie en Cochlear Nucleus Exposure <ol><li> Na 2-4 weken van genezing en virus-gemedieerde genoverdracht incubatie opnieuw verdoven een eerder geïnjecteerde muis en herhaal stap 1,1-1,5 Optimale incubatietijd varieert met het type van gen overgedragen. </li><li> Verwijder littekenweefsel over de craniotomie plaats door een combinatie van een pincet, scalpel, en rongeurs. </li><li> Na het visualiseren van de craniotomie, identificeren van een combinatie van de resterende cerebellum en littekenweefsel bovenop de DCN. Gebruik een 5 Franse afzuigen bovenliggende cerebellum / littekenweefsel (vergelijkbaar met de vorige cerebellaire aspiratie) te zuigen. </li><li> Als gevolg van aspiratie, verwachten een verdere bloeden, CSF build-up, en de overige bits van het cerebellum. Snel introduceren zoutoplossing in de craniotomie om bloedstolling te voorkomen. Gebruik een combinatie van zachte tandheelkundige punt deppen en zuigkracht om het pad voor de directe visualisatie van de DCN wissen. </li><li> Let op de oppervlakte van de DCN. Uitvoeren-optogenetics basis fysiologie experimenten als DCN is nu toegankelijk. Introductie van een licht stimulus, bijvoorbeeld een optische vezel (Figuur 2), om een optogenetics experiment brengt drijven. </li></ol> 5. Histologie <ol><li> Na afloop van experimenten euthanaseren de muis met een overdosis ketamine. Perfuse de muis met een fysiologische zoutoplossing, gevolgd door 4% paraformaldehyde. </li><li> Pak de hersenstam van de schedel en de post-fix voor 2 uur. Cryoprotect de hersenstam in 30% sucrose gedurende 24-48 uur. Deel van de hersenstam met een standaard cryostaat met behulp van 60 micrometer secties. </li></ol>

<ol><li>Lalwani, A., Mhatre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ear+Hear%22%5BJournal%5D)">Cochlear gene therapy.</a> Ear Hear. 24 (4), 342-348 (2003).</li>
<li>Lalwani, A., Jero, J., Mhatre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+issues+in+cochlear+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol+Neurootol%22%5BJournal%5D)">Current issues in cochlear gene transfer.</a> Audiol Neurootol. 7 (3), 146-151 (2002).</li>
<li>Jero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+gene+delivery+through+an+intact+round+window+membrane+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse.</a> Hum Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).</li>
<li>Koh, S., Pettis, R., Mhatre, A., Lalwani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+microinjection+and+its+effects+upon+auditory+function+in+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Arch+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Cochlear microinjection and its effects upon auditory function in the guinea pig.</a> Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).</li>
<li>Lalwani, A., Walsh, B., Reilly, P., Muzyczka, N., Mhatre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+in+vivo+gene+therapy+for+hearing+disorders%3A+introduction+of+adeno-associated+virus+into+the+cochlea+of+the+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig.</a> Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).</li>
<li>Wareing, M., Lalwani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+gene+therapy%3A+current+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pediatr+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Cochlear gene therapy: current perspectives.</a> Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 5 Suppl 1. (49), 27-30 (1999).</li>
<li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgene+expression+in+the+guinea+pig+cochlea+mediated+by+a+lentivirus-derived+gene+transfer+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector.</a> Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).</li>
<li>Akil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+hearing+in+the+VGLUT3+knockout+mouse+using+virally+mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy.</a> Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).</li>
<li>Hernandez, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li>
<li>Adamantidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogation+of+dopaminergic+modulation+of+the+multiple+phases+of+reward-seeking+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogation of dopaminergic modulation of the multiple phases of reward-seeking behavior.</a> J Neurosci. 30 (31), 10829-10835 (2011).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+mimicry+of+the+transient+activation+of+dopamine+neurons+by+natural+reward+is+sufficient+for+operant+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement.</a> PloS One. 7 (4), e33612(2012).</li>
<li>Britt, J., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogations+of+the+neural+circuits+underlying+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogations of the neural circuits underlying addiction.</a> Curr Opin Neurobiol. 23 (4), 539-545 (2013).</li>
<li>Abbott, S., Coates, M., Stornetta, R., Guyenet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+c1+and+retrotrapezoid+nucleus+neurons+causes+sleep+state-dependent+cardiorespiratory+stimulation+and+arousal+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of c1 and retrotrapezoid nucleus neurons causes sleep state-dependent cardiorespiratory stimulation and arousal in rats.</a> Hypertension. 61 (4), 835-841 (2013).</li>
<li>Carter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+arousal+with+optogenetic+modulation+of+locus+coeruleus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons.</a> Nat Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).</li>
<li>Darrow, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+central+auditory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Assoc.+Res.+Otolaryngol.+Abstr%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of central auditory neurons.</a> Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. (695), (2012).</li>
<li>Shimano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+AAV-mediated+expression+of+channelrhodopsin-2+and+halorhodopsin+in+brainstem+neurons+mediating+auditory+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Assessment of the AAV-mediated expression of channelrhodopsin-2 and halorhodopsin in brainstem neurons mediating auditory signaling.</a> Brain Res. 1511, 138-152 (2013).</li>
<li>Doucet, J., Ryugo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+from+the+ventral+cochlear+nucleus+to+the+dorsal+cochlear+nucleus+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats.</a> J Comp Neurol. 385, 245-264 (1997).</li>
<li>Brown, M., Drottar, M., Benson, T., Darrow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commissural+axons+of+the+mouse+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Commissural axons of the mouse cochlear nucleus.</a> J Comp Neurol. 521, 1683-1696 (2013).</li>
<li>Verma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+responses+to+electric+and+infrared+neural+stimulation+of+the+rat+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus.</a> Hear Res. 310, 69-75 (2014).</li>
<li>Taberner, A. M., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+properties+of+single+auditory+nerve+fibers+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse.</a> J Neurophysiol. 93 (1), 557-569 (2005).</li>
<li>Rolls, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+disruption+of+sleep+continuity+impairs+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic disruption of sleep continuity impairs memory consolidation.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (32), 13305-13310 (2011).</li>
<li>Huff, M., Miller, R., Deisseroth, K., Moorman, D., LaLumiere, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttraining+optogenetic+manipulations+of+basolateral+amygdala+activity+modulate+consolidation+of+inhibitory+avoidance+memory+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Posttraining optogenetic manipulations of basolateral amygdala activity modulate consolidation of inhibitory avoidance memory in rats.</a> Proc Natl Acad Sci. 110 (9), 3597-3602 (2013).</li>
<li>Stortkuhl, K., Fiala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Smell+of+Blue+Light%3A+A+New+Approach+toward+Understanding+an+Olfactory+Neuronal+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Smell of Blue Light: A New Approach toward Understanding an Olfactory Neuronal Network.</a> Front Neurosci. 5 (72), (2011).</li>
<li>Hira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+optogenetic+stimulation+for+functional+mapping+of+the+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Transcranial optogenetic stimulation for functional mapping of the motor cortex.</a> J Neurosci Methods. 179 (2), 258-263 (2009).</li>
<li>Ayling, O., Harrison, T., Boyd, J., Foroshkov, A., Murphy, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+light-based+mapping+of+motor+cortex+by+photoactivation+of+channelrhodopsin-2+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated light-based mapping of motor cortex by photoactivation of channelrhodopsin-2 transgenic mice.</a> Nat Methods. 6 (3), 219-224 (2009).</li>
<li>Boyden, E., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit artikel beschrijft de techniek van directe visualisatie van het DCN in het muismodel manipulatie van het centrale auditieve systeem. De geschetste aanpak van directe visualisatie biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van de belangrijkste alternatief, dat stereotaxisch benaderingen zijn. In de eerste plaats, directe visualisatie van de DCN zorgt voor directe bevestiging van de site van de hersenstam, terwijl stereotaxisch benaderingen niet veroorloven directe visualisatie. In experimenten die incubatietijd noodza...

Virus-gemedieerde genoverdracht om gehoorverlies te keren, is grotendeels gericht op het perifere gehoorsysteem.1 Met als doelwit de cochlea, hebben onderzoekers een reeks toedieningsroutes onderzocht, waaronder osmotische minipomp-infusie2, vector-transgeencomplex-gedrenkte Gelfoam®2 of gelatinespons3, directe micro-injectie4; talrijke genoverdrachtsvectoren, waaronder adeno-geassocieerde virale vectoren5,6, lentivirale vectoren7 en cationische liposomen2; en de verspreiding van genoverdrachtsvectoren buiten het doelweefsel2. Meest recent is adeno-geassocieerd virus (AAV)-1 geïntroduceerd in de cochlea om doofheid bij muizen te behandelen als gevolg van verlies van vesticulair glutamaattransporter-3.8 Verder is de toepassing van optogenetica in het perifere gehoorsysteem recent beschreven.9
Er zijn echter maar weinig studies die genoverdracht naar het centrale gehoorsysteem hebben onderzocht. De dorsale cochleaire kern (DCN) van de hersenstam bevat tweede orde neuronen van de gehoorbaan. Hoewel genoverdrachtstechnieken in de cochleaire kern (CN) kunnen worden gebruikt voor een groot aantal onderzoeken, kan genoverdracht van opsines, lichtgevoelige eiwitten, naar de DCN ook worden gebruikt om optogenetica-gebaseerde experimentele technieken mogelijk te maken. Na virus-gemedieerde genoverdracht van een opsine, zoals channelrhodopsine-2 (ChR2), worden de neuronen van de DCN gevoelig voor lichtstimuli. Optogenetische genoverdracht is eerder geprobeerd in verschillende hersenstamgebieden, waaronder de retrotrapezoïde kern van de rat, de locus coeruleus van de muis, de superieure colliculus van de aap en het ventrale tegmentale gebied van de muis.10-14
Onlangs hebben onderzoekers het gebruik van optogenetica in de DCN onderzocht.15,16 De DCN is de locatie voor het plaatsen van auditieve hersenstamimplantaten bij mensen, waardoor het een aantrekkelijk deel van het gehoorsysteem is om te bestuderen voor translationele studies over auditieve neuroprothesen. Gezien de locatie van de DCN is chirurgische expositie echter een uitdaging. De hier beschreven techniek biedt een protocol voor maximale blootstelling van de DCN via de posterior fossa-aanpak om virale vectorgenoverdracht en optogenetische experimenten mogelijk te maken in een muismodel. Eerdere studies gebruikten stereotactische micro-injectie in de DCN met channelrhodopsine-2.16 Stereotactische injecties zijn echter mogelijk minder nauwkeurig dan injecties gemaakt door directe visualisatie, vooral in een kern die zo klein en diep langs de hersenstam is als de DCN. Transgene muizen die weefselspecifieke eiwitten in de CN tot expressie brengen, zijn ook een aantrekkelijke optie en zouden de noodzaak van genoverdracht overbodig maken. Ons protocol voor blootstelling van de DCN zou ook werken bij transgene muizen, aangezien de DCN rechtstreeks blootgesteld zou moeten worden voor optische stimulatie. Deze techniek voor chirurgische blootstelling van de DCN is aangepast van eerdere protocollen die betrekking hebben op opnames van de auditieve zenuw en de cochleaire kern bij muis- en ratmodellen.15,17-20
Het algemene doel van het protocol is om directe blootstelling aan de CN mogelijk te maken voor genoverdrachtstechnieken. Meer specifiek is de aanpak compatibel met zowel acute als overlevingschirurgie en de voorbereiding kan worden herhaald bij hetzelfde dier voor verdere neurofysiologische tests. De directe blootstelling van het DCN-protocol heeft implicaties voor optogenetische- en virus-gemedieerde genoverdracht-gebaseerde experimenten in andere kernen van de hersenstam.

<table><tbody><tr><td>Stereotaxic holder</td><td>Stoelting</td><td>51500</td><td></td></tr><tr><td>Homeothermic blanket</td><td>Harvard</td><td>507214</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade #11</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Iris scissor</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>5 French suction</td><td>Symmetry Surgical</td><td>2777914</td><td></td></tr><tr><td>Dental Points</td><td>Henry Schein</td><td>100-8170</td><td></td></tr><tr><td>Bone rongeur</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>16020-14</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro;l Hamilton syringe</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>34 gauge, needle</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td>207434</td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr></tbody></table>

directe visualisatie van het muizen dorsale cochlear nucleus voor optogenetische stimulatie van de auditieve pathway

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Onderzoek naar het gebruik van virus-gemedieerde genoverdracht te arresteren of achteruit gehoorverlies is grotendeels verbannen naar de perifere auditieve systeem. Enkele studies hebben genoverdracht naar het centrale auditieve systeem onderzocht. De dorsale cochleaire nucleus (DCN) van de hersenstam, die tweede orde neuronen van het auditieve pad bevat, is een potentiële site voor genoverdracht. In dit protocol is een techniek voor het direct en maximale blootstelling van de muizen DCN via een fossa posterior aanpak is. Deze aanpak maakt het voor zowel acute of overleving chirurgie. Na directe visualisatie van het DCN, een reeks experimenten mogelijk, zoals injectie van opsins in de cochleaire kern en daaropvolgende stimulatie door een optische vezel gekoppeld met een blauw laserlicht. Andere neurofysiologie experimenten, zoals elektrische stimulatie en neurale injector traces zijn ook mogelijk. Het niveau van visualizatie en de duur van de stimulatie stand te brengen is deze benadering voor diverse experimenten.

Gedeeltelijke Cerebellar Aspiration toegang verschaft tot de Cochlear Nucleus Nadat de huid en spieren die over de schedel verwijderd, schedeloppervlak monumenten, zoals de coronale en Lamda hechtdraad lijnen tonen de benaderde lokalisatie van de craniotomie. Na craniotomie met rongeurs, wordt het cerebellum gevisualiseerd. Zorgvuldig aspireren van het kleine deel van het cerebellum toont visualisatie van de GN, die vervolgens kan worden geïnjecteerd (Figuur 1). </p...

Het doel van dit protocol is om een chirurgische benadering te schetsen om directe toegang te bieden tot de dorsale cochleare nucleus in een muismodel.

Directe visualisatie van het Muizen Dorsale Cochlear Nucleus voor optogenetische Stimulatie van de Auditieve Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Het algemene doel van deze procedure is om chirurgische toegang te verkrijgen tot de cochleaire kern in een muismodel om optogenetica-gebaseerde experimenten mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door de muis eerst voor te bereiden op een craniotomie en het zachte weefsel van de huid en de spieren boven de hoofdhuid lateraal terug te trekken. In een tweede stap wordt een craniotomie uitgevoerd op het linker interpariëtaal bot, ongeveer twee millimeter caudaal van de lambdanaad.Dit gebied ligt boven de cochleaire nucleus. Aspireer vervolgens, met behulp van een vijf French zuigbuisje, het meest laterale gedeelte van het linker cerebellum dat boven de DCN ligt. Het resultaat is een ongehinderd zicht op de DCN.De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van ondersteunende methoden zoals stereotactische begeleiding, zijn het verkrijgen van directe visualisatie van de cochleaire nucleus en het plaatsen van een neurostimulator, zoals een lichtbron of een elektrode-array, op het oppervlak van de hersenstam. Deze methode kan ons helpen cruciale vragen te beantwoorden in zowel de optogenetica als de auditieve neurowetenschap. Geen enkele prothese, zoals genoverdracht, kan de auditieve hersenstam in staat stellen om door licht te worden gestimuleerd met voldoende spatiale en temporele resolutie.Nadat een muis via intraperitoneale toediening is geanestheseerd met ketamine en xylazine, dient de terugtrekkingsreflex bij een knijptest van de teen te worden gecontroleerd en de hartslag en ademhalingsfrequentie te worden gemonitord om een adequate anesthesie te bevestigen. Breng vervolgens veterinaire zalf aan in beide ogen om uitdroging te voorkomen. Scheer daarna het haar op de hoofdhuid weg om een ongehinderde toegang tot de chirurgische plaats te verkrijgen.Plaats de muis daarna in een stereotaxische houder voor kleine dieren. Stel de snuitklem zo in dat deze los genoeg is om een adequate ademhaling toe te staan, maar strak genoeg om de kop van de muis volledig te immobiliseren. Maak onder een microscoop een verticale incisie door de huid, beginnend bij de middellijn direct tussen de oorschelpen en uitlopend tot het condaal gedeelte van het occiput.Verschuif vervolgens de huid lateraal. Verwijder de spieren boven het linker pariëtaalbeen, het interpariëtaalbeen en het occipitaalbeen van de schedel met een scalpel of irisschaar. Minimaliseer ondertussen de bloeding door gedurende 10 tot 15 seconden zachte druk uit te oefenen met een wattenstaafje.Identificeer vervolgens de sagittale en lambda-hechtnaden. Maak met een Rongeur een craniotomie in het linker pariëtaal bot, ongeveer twee millimeter caudaal van de lambda-hechtnaad.Deze regio ligt boven de DCN na de craniotomie. Een dunne laag dura over het cerebellum moet zorgvuldig worden waargenomen; verwijder deze met een scalpelblad. Verwijder het gestolde bloed met wattenstaafjes of druppel voorzichtig saline op het cerebellum om het bloed weg te spoelen.Gebruik vervolgens een zuigbuisje van vijf French om het meest laterale gedeelte van het linker cerebellum, dat boven de DCN ligt, te aspireren ter ondersteuning. Stel bij de aspiratie het brandvlak van de microscoop in op de verwachte diepte van de cochleaire kern om de visualisatie te verbeteren en een scherp beeld te garanderen. Verwijder ongeveer een kwart tot een derde van het linker cerebellum.Het belangrijkste referentiepunt naast de DCN is de AM van het superieure halve cirkelvormige kanaal. Na aspiratie zullen verdere bloedingen, ophoping van cerebrospinaal vocht en verplaatsing van het cerebellum over de DCN optreden; breng snel saline aan in de craniotomie om bloedstolling te voorkomen. Gebruik een combinatie van voorzichtig drogdeppen met een dental point en zuiging om een pad vrij te maken voor directe visualisatie van de DCN.Zodra de DCN duidelijk zichtbaar is en vrij is van bovenliggend bloed en CSF, wordt de vector via een druk-microinjectie met een gasdichte Hamilton-spuit van vijf microliter in de DCN geïnjecteerd. Gebruik een naald van 34 gauge met een flauwe schuinte om stomp trauma te minimaliseren en het injectievolume binnen de DCN te lokaliseren. Voer de naald vervolgens langzaam in met een micromanipulator totdat de punt niet langer zichtbaar is onder het oppervlak van de DCN.Begin met het injecteren van 1,5 µL van de vector. Trek na voltoering de naald langzaam terug, breng vervolgens de huid weer bij elkaar en laat de muis herstellen volgens de standaardherstelprocedure. Na twee tot vier weken genezing en incubatie voor virus-gemedieerde gentransfer wordt de muis die de vector heeft ontvangen opnieuw geanestheseerd, waarna het littekenweefsel boven de craniotomieplaats wordt verwijderd.Identificeer daarna een combinatie van het resterende cerebellum en littekenweefsel dat over de DCN ligt. Gebruik een vijf French zuiger om het bovenliggende cerebellum en littekenweefsel te aspireren. Na de aspiratie.Breng snel zoutoplossing aan in de craniotomie. Om bloedophoping te voorkomen, wordt een combinatie van voorzichtig deptappen met een dental point en zuiging gebruikt om het pad vrij te maken voor directe visualisatie van de DCN. De DCN is nu toegankelijk voor de op optogenetica gebaseerde fysiologische experimenten; hier is de plaatsing van een laservezel direct op het oppervlak van de DCN te zien, wat optische stimulatie van de opsine-geïnfecteerde DCNA mogelijk maakt. Een reeks blauwe lichtpulsen aan het oppervlak van de geïnfecteerde DCN resulteert in een optisch aangestuurde auditieve hersenstamrespons.Met behulp van een micromanipulator wordt een optische vezel, gekoppeld aan een blauwe laser, direct op het oppervlak van de cochleaire nucleus geplaatst en ingeschakeld. Hier kunnen we gepulst blauw licht op het oppervlak van de cochleaire nucleus waarnemen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals elektrische stimulatie van de nucleus, worden uitgevoerd, waardoor we niet alleen de akoestisch opgewekte, maar ook de elektrisch opgewekte neurale responsen direct kunnen vergelijken met die welke door optische stimulatie worden opgewekt.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van het voorbereiden en uitvoeren van de craniotomie en cerebellaire aspiratie, met als uiteindelijk doel de directe visualisatie van en toegang tot de cochleaire kern.

direct-visualization-murine-dorsal-cochlear-nucleus-for-optogenetic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Volwassen geboren neuronen van de bulbus olfactorius kan optogenetically worden gecontroleerd met behulp van Channelrhodopsin2 expressie lentivirale injectie in de rostrale migratie stroom en chronische fotostimulering met een geïmplanteerd miniatuur LED.

Selectieve Viral Transductie van Adult geboren Olfactorische Neuronen voor chronische In vivo Optogenetic Stimulatie

Source: Kozin, E. D., et.al. Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates virus-mediated gene transfer into the mouse dorsal cochlear nucleus (DCN) to enable light-induced auditory stimulation. A viral vector encoding opsin, a light-sensitive ion channel, is injected into the DCN following a craniotomy and cerebellar aspiration for direct access. The expressed opsins allow neurons to be...

Virus-Mediated Gene Transfer Into the Mouse Dorsal Cochlear Nucleus for Light-Induced Auditory Stimulation

This video demonstrates the process of preparing wedge-shaped brain slices in a laboratory setting. Using a vibratome, a wedge-shaped slice from a mouse's brain is crafted with varying thickness. This slice contains the auditory nerve root positioned on the thicker end, while the hearing-related neurons are located on the thinner end.

Preparing Wedge Brain Slices to Visualize Auditory Neurons

This video demonstrates a protocol for stimulating the auditory nerve root and recording postsynaptic currents in medial olivocochlear neurons in mouse brain wedge slices.

Auditory Nerve Root Stimulation and Postsynaptic Current Recordings in a Mouse Brain Wedge Slice

We beschrijven een methode voor het karakteriseren van de functionele topografie en synaptische eigenschappen van voorhersenencircuits met behulp van een optogenetische aanpak om neuronale populaties in vitro te fotostimuleren.

Laser-scanning fotostimulatie van optogenetisch gerichte voorhersenencircuits

Optogenetica is een krachtig hulpmiddel geworden voor gebruik in gedragsneurowetenschappelijke experimenten. Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor het ontwerp en de installatie van lasersystemen en biedt een volledig protocol voor het uitvoeren van meerdere en gelijktijdige in vivo optogenetische stimulaties die compatibel zijn met de meeste gedragstestparadigma's bij knaagdieren.

In vivo optogenetische Stimulatie van de knaagdieren centrale zenuwstelsel

Hier beschrijven we onze strategie voor het verkrijgen van stabiele, goed geïsoleerde single-unit opnamen van geïdentificeerde remmende interneuronen in de geanesthetiseerde muiscortex. Neuronen die ChR2 tot expressie brengen, worden geïdentificeerd door hun reactie op blauw licht. De methode maakt gebruik van standaard extracellulair opname-apparatuur en dient als een goedkope alternatief voor calcium-beeldvorming of visueel geleid patchen.

Een gids voor In vivo Single-unit Opnemen van Optogenetically Identified Cortical Remmende Interneurons

Cochleair implantaat (CI) in staat stellen het horen door directe elektrische stimulatie van de gehoorzenuw. Echter, slechte frequentie en intensiteit resolutie beperkt de kwaliteit van het gehoor met CI. Hier beschrijven we optogenetische stimulatie van de gehoorzenuw in muizen als een alternatieve strategie voor auditieve research en ontwikkeling van toekomstige CI's.

Optogenetische stimulatie van de gehoorzenuw

Integratie van diverse synaptische ingangen naar neuronen wordt het best gemeten in een preparaat dat alle pre-synaptische kernen voor natuurlijke timing en circuit plasticiteit behoudt, maar hersenen plakjes meestal verbreken veel verbindingen. We ontwikkelden een gemodificeerde hersenen slice na te bootsen in vivo circuit activiteit met behoud van in vitro experimentatie vermogen.

In Vitro Wedge Slice Voorbereiding voor het nabootsen van in Vivo Neuronal Circuit Connectiviteit

Het huidige protocol beschrijft hoe draadloze optogenetica in combinatie met high-speed videografie kan worden gebruikt in een enkele pellet reach-to-grab-taak om de neurale circuits te karakteriseren die betrokken zijn bij de uitvoering van bekwaam motorisch gedrag bij vrij bewegende muizen.

In vivo Draadloze optogenetische controle van bekwaam motorisch gedrag

Hier presenteren we twee protocollen voor de registratie van micro-elektrocorticografie met hoge dichtheid (μEcoG) bij ratten en muizen, inclusief chirurgische, implantatie- en registratiemethoden. μECoG-opnames worden uitgevoerd in combinatie met laminaire polytrode-opname in de auditieve cortex van de rat of met optogenetische manipulatie van neurale activiteit in de somatosensorische cortex van de muis.

Multischaalonderzoek van corticale verwerking door integratie van laminaire polytrodes en optogenetica met micro-elektrocorticografie bij knaagdieren

Leer een chirurgische methode voor directe toegang tot het dorsale cochleaire kern (DCN) bij muizen. Deze techniek maakt optogenetische stimulatie en virus-gemedieerde gentransfer in het centrale auditieve systeem mogelijk.

Directe visualisatie van het Muizen Dorsale Cochlear Nucleus voor optogenetische Stimulatie van de Auditieve Pathway

Meer video's verkennen