Directe visualisatie van het Muizen Dorsale Cochlear Nucleus voor optogenetische Stimulatie van de Auditieve Pathway

Het algemene doel van deze procedure is om chirurgisch toegang te krijgen tot de cochleaire nucleus in een muismodel om optogenetisch gebaseerde experimenten mogelijk te maken. Dit wordt bereikt door eerst de muis voor te bereiden op craniotomie en de huid en het zachte weefsel en de spieren die de hoofdhuid lateraal bedekken terug te trekken. Als tweede stap wordt een craniotomie gemaakt op het linker interpariëtale bot, ongeveer twee millimeter naast de lambda-naadlijn.

Deze regio bevindt zich boven de cochleaire nucleus. Vervolgens wordt met behulp van een vijf Franse zuigbuis de meest laterale porties van de linker cerebellum die de DCN bedekken, aangezogen. Het resultaat toont een onbelemmerd zicht op de DCN.

De belangrijkste voordelen van deze techniek ten opzichte van assisterende methoden zoals stereotactische gids zijn het behalen van directe visualisatie van de cochleaire nucleus en het plaatsen van een neurosimulator zoals een lichtbron of een elektrodenarray op het oppervlak van de hersenstam. Deze methode kan ons helpen om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van zowel optogenetica als auditief. Geen prothese, zoals genoverdracht, maakt het mogelijk om de auditieve hersenstam te stimuleren met licht met voldoende faciaal en temporaal bereik.

Nadat een muis is verdoofd met ketamine en xylazine via intraperitoneale toediening, controleer de teenkneepspierreflex en controleer de hartslag en ademhalingssnelheid om de juiste verdoving te bevestigen. Breng vervolgens vetzalf aan op beide ogen om uitdroging te voorkomen. Scheer vervolgens het haar dat de hoofdhuid bedekt om onbelemmerde toegang tot de operatieplaats te bieden.

Plaats de muis vervolgens in een stereotactische houder voor kleine dieren. Stel de snuitklem zo in dat deze los genoeg is om adequatie te laten doorgaan, maar strak genoeg om het hoofd van de muis volledig te immobiliseren. Maak onder een microscoop een verticale incisie door de huid, beginnend bij de middenlijn direct tussen de pinna en uitstrekkend tot het coddle-gedeelte van de occiput.

Verplaats vervolgens de huid lateraal. Verwijder de spieren die de linker pariëtale, interpariëtale en occipitale botten van de schedel bedekken met een scalpel of iris schaar. Minimeer ondertussen het bloeden door gedurende 10 tot 15 seconden zachte druk uit te oefenen met een wattenstaafje.

Identificeer vervolgens de sagittale en lambda-naadlijnen. Gebruik een paar Ron jewels. Maak een craniotomie op het linker interpariëtale bot ongeveer twee millimeter naast de lambda-naadlijn.

Deze regio bevindt zich na craniotomie boven de DCN. Een dunne laag dura die de cerebellum bedekt, moet zorgvuldig worden waargenomen en verwijderd met behulp van een scalpelblad. Verwijder het gecoaguleerde bloed met wattenstaafjes of druppel voorzichtig fysiologisch zout op de cerebellum om het bloed weg te wassen.

Gebruik vervolgens een vijf Franse zuigbuis om de meest laterale porties van de linker cerebellum, die de DCN bedekken, aan te zuigen om te assisteren. Zet bij aspiratie het brandpunt van de microscoop op de verwachte diepte van de cochleaire nucleus om de visualisatie te verbeteren en een scherp beeld te garanderen. Verwijder ongeveer een kwart tot een derde van de linker cerebellum.

Het belangrijkste oriëntatiepunt naast de DCN is de AM van de superieure halfcirkelvormige kanaal. Na aspiratie zullen verder bloeden, ophoping van hersenvocht en verplaatsing van de cerebellum op de DCN verschijnen; instilleer snel fysiologisch zout in de craniotomie om bloedstolling te voorkomen. Gebruik een combinatie van zachtjes dabbelen met een tandheelkundig punt en zuigen om een pad vrij te maken voor directe visualisatie van de DCN.

Nadat de DCN duidelijk zichtbaar en vrij is van bloed en CSF, maakt u een drukinspuiting van de vector erin met een vijf microliter gasdicht Hamilton-spuitje. Gebruik een 34 gauge naald met een ondiepe snijkant om stomp trauma te minimaliseren en de injectiehoeveelheid binnen de DCN te lokaliseren. Breng vervolgens langzaam de naald met een micro manipulator in totdat de punt niet meer zichtbaar is onder het oppervlak van de DCN.

Begin met het injecteren van 1,5 microliter van de vector. Nadat dit voltooid is, trek de naald langzaam terug, breng de huid vervolgens terug op zijn plaats en laat de muis herstellen volgens de standaard herstelprocedure. Na twee tot vier weken van genezing en incubatie van virusgemedieerde genoverdracht, verdoof de vector geïnjecteerde muis opnieuw en verwijder het littekenweefsel boven de craniotomie-site.

Identificeer vervolgens een combinatie van resterend cerebellum en littekenweefsel boven de DCN. Gebruik een vijf Franse zuigbuis om het overliggende cerebellum en littekenweefsel aan te zuigen. Na aspiratie.

Breng snel fysiologisch zout aan in de craniotomie. Om bloedvorming te voorkomen, gebruik een combinatie van zachtjes dabbelen met een tandheelkundig punt en zuigen om het pad voor directe visualisatie van de DCN vrij te maken. De DCN is nu toegankelijk voor de optogenetisch gebaseerde fysiologie-experimenten die hier worden getoond, namelijk het plaatsen van een laservezel direct op het oppervlak van de DCN, wat optische stimulatie van de opsine geïnfecteerde DCN mogelijk maakt; een reeks blauw lichtpulsen op het oppervlak van de geïnfecteerde DCN resulteert in een optisch aangedreven auditieve hersenstamrespons.

Met behulp van een micro manipulator wordt een optische vezel gekoppeld aan een blauw lichtlaser direct op het oppervlak van de cochleaire nucleus geplaatst en ingeschakeld. Hier kunnen we gepulseerd blauw licht op het oppervlak van de cochleaire nucleus identificeren. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals elektrisch stimuleren van de nucleus worden uitgevoerd, waardoor we niet alleen de akoestisch geëvoceerde, maar ook de elektrisch geëvoceerde neurale reacties kunnen vergelijken met die geëvoceerd door optische simulatie.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de craniotomie en cerebellair aspiratie voorbereidt en uitvoert met als uiteindelijk doel directe visualisatie en toegang tot de cochleaire nucleus.