Name: De veelzijdige voordelen van Protein Co-expressie in Escherichia coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Leer eiwitco-expressie in Escherichia coli voor de assemblage van eiwitcomplexen in vivo met behulp van compatibele plasmiden. Deze methode omzeilt oplosbaarheidsproblemen van vrije subunits en verhoogt de opbrengst van functionele complexen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De toestemming van Springer en Elsevier cijfers herdruk is sterk erkend.

1. Isolatie van E. coli Co-transformanten <ol><li> Bereid elektro-competente cellen van de geschikte E. coli-stam te transformeren. Transfer naar 1 ml LB-medium (trypton, gistextract, NaCl bij 10, 5 en 10 g / l respectievelijk) één enkele kolonie van de stam van keuze, en incubeer bij 37 ° C onder schudden omstandigheden van 180 rpm. Verdun de pre-kweek 1: 500 in 25 ml vers LB-medium en incubeer de kweek bij 37 ° C. </li><li> Bij log-fase (0.6 OD) Centrifugeer de celsuspensie bij 5000 xg gedurende 20 min) en resuspendeer de pellet in 10% v / v ijskoude steriele glycerol-water in de helft van het oorspronkelijke kweekvolume. Herhaal deze stap 4 keer, elke keer dat de resuspensie volume halveren. Tenslotte resuspendeer de pellet in glycerol / water en verdeel de cellen suspensie in 50 ul porties. Bewaar de monsters bij -80 ° C tot 6 maanden. </li><li> Los het gewenste plasmide in steriel water, aangevuld met 0,5 mM EDTA. Dooi op ice een hoeveelheid van elektro-competente cellen en mengen met een geschikte hoeveelheid (2,5-5 ng) vector. Breng het mengsel in een 0,1 cm cuvette geschikt voor elektroporatie en toepassen 1.8 kV. </li><li> Onmiddellijk over de geëlektroporeerde cellen in 1 ml SOC-medium (LB medium aangevuld met 0,2% w / v glucose, 10 mM MgCl2, 2,5 mM KCl), incubeer gedurende 1 uur onder schudden, en tenslotte overdracht 100 ul aliquots op platen met LB-agar met de juiste antibiotica. Incubeer O / N bij 37 ° C. </li><li> Zuiveren de transformanten door uitstrijken enkele kolonies op petrischaaltjes. </li><li> Bereid elektro-competente cellen van de primaire transformanten en herhaal stap 1,1 tot 1,5 te transformeren met verdere plasmiden. </li><li> Bereid glycerol voorraden van de co-transformanten. Breng een enkele kolonie in LB aangevuld met de juiste antibiotica, incuberen bij 37 ° C onder schudden, en log-fase (0.6 OD) centrifugeer de celsuspensie bij 5000 xg gedurende 20 min. Resuspend de pellet in LB-medium met antibiotica 15% v / v glycerol. Verdeel in porties en bewaar bij - 80 ° C. </li></ol> 2. Co-expressie van α en ε subeenheden van E. coli DNA Polymerase III <ol><li> Breng met een steriele lus een kleine hoeveelheid van de juiste stam glycerol voorraad (bv TOP10 / pGOOD-ε243 en TOP10 / pGOOD-ε243-θ / pBADα1160, zie figuur 1) in een petrischaal met LB-medium en antibiotica. Laat de cellen schorsing droog op de petrischaal, en streep de cellen druppeltje. Incubeer bij 37 ° CO / N. </li><li> Transfer, met een steriele tandenstoker, een enkele kolonie 1 ml LB-medium antibiotica. Incubeer 8 uur bij 37 ° C. Verdun de pre-kweek 1: 500 in vers medium en geïncubeerd bij 30 ° C gedurende 15 uur. </li><li> Voeg IPTG, arabinose of arabinose en IPTG, 1 mM elk. Incubeer bij 30 ° C gedurende 2,5 uur. Verzamel de cellen en bewaar de pellets bij -20 ° C. </li><li> Ontdooien pellets op ijs en resuspendeer in lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2,5 mM dithiothreitol, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), pH 8). Zachtjes homogeniseren van de cellen ophanging met een koud glas pottenbakker. </li><li> Ultrasone trillingen bij 15 W voor 15 sec, gevolgd door 15 sec koeling interval (4 cycli). </li><li> Centrifugeer de totale eiwitextracten bij 10.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C aan de oplosbare fractie herstellen. </li><li> Analyseer door SDS-PAGE (12,5% acrylamide) hoeveelheden van elk oplosbaar eiwit extract. Hiertoe overdracht 20 ul van elk oplosbaar eiwit extract Eppendorf buizen die 60 pi H2O en 20 gl laadbuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-mercaptoethanol, 10% (w / v) SDS, 50% (v / v) glycerol, 0,25% (w / v) broomfenol blauw) en koken gedurende 5 min. Plaats 18 gl van elk monster en voer de elektroforese bij 140 V gedurende 1,5 uur. </li></ol> 3. Co-expressie van α subunit van Deinococcus radiodurans DNA Polymerase III en ε subeenheid van E. coli DNA Polymerase III <ol><li> Bereid een voorkweek van E. coli stam TOP10 / pBAD-α Dr / pGOOD-ε243 in 1 ml LB-ampicilline-tetracycline medium en incuberen 8 uur bij 37 ° C. Verdun 1: 1.000 in vers medium en geïncubeerd O / N bij 37 ° C. </li><li> Verdun 1: 100 in 200 ml vers medium, incuberen bij 37 ° C gedurende 3 uur, daarna induceren 3 uur met arabinose en IPTG, 1 mM elk. Oogst de cellen en bewaar de pellet bij -20 ° C. </li><li> Resuspendeer de pellet in 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF. Homogeniseren en verstoren de cellen zoals beschreven in 2.4 en 2.5. </li><li> Onmiddellijk Centrifugeer de cellen lysaat bij 10.000 xg gedurende 20 min. Gooi de pellet. Filtreer de bovenstaande vloeistof met een Büchner trechter uitgerust met 3 lagen papier filter. Pas lichte vacuüm. Om overmatige schuimvorming te voorkomen, moet het vacuüm Erlenmeyer op ijs tijdens filtratie. </li><li> Bepaal eiwitconcentratie volgens Bradford 14. </li></ol> 4. gelfiltratiechromatografie <ol><li> Equilibreer een watermantel 16x70 (200) gelfiltratie kolom met 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8. Plaats op de kolom het oplosbare eiwit extract. Voor optimale resolutie, gebruik dan een 1 ml sample loop. Voer de chromatografie met 0,6 ml / min. Houd kolom temperatuur op 4 ° C in. </li><li> Verzamel 0,9 ml fracties en analyseren door SDS-PAGE. Breng 20 pl van de genoemde fractie Eppendorf buizen die 60 pi H2O en 20 gl laadbuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-mercaptoethanol, 10% (w / v) SDS, 50% ( v / v) glycerol, 0,25% (w / v) broomfenol blauw) en koken gedurende 5 min. Plaats 18 gl van elk monster en voer de elektroforese bij 140 V gedurende 1,5 uur. </li><li> Bepaal de 3&#39;-5 &#39;exonuclease en DNA polymerase activiteit van elke fractie met 96 well microplaten. Assay de exonuclease activiteit met thymidine 5&#39;-monofosfaat p-nitrofenyl ester (p NP-TMP) als substraat 15. Schatting DNA polymerase activiteit met de PPX (pyrofosfatase, purine nucleoside fosforylase, xanthine oxidase) enzym-gekoppelde assay 16 en 2- (4-joodfenyl) -3- (4-nitrofenyl) -5-fenyl-2H-tetrazoliumchloride (s) als elektronenacceptor 16. </li></ol> 5. Mutatie analyse van populaties Co-expressie het wildtype ε subeenheid van E. coli DNA polymerase III en het mutagene εD12A Variant <ol><li> Transfer een enkele kolonie van E. coli TOP10 die het pBAD-ε en pGOOD1-εD12A 11 vectoren om 1 ml LB-medium antibiotica. Incubeer O / N bij 37 ° C. </li><li> Verdun de pre-kweek 1: 250 tot 3 flessen met vers medium (10 ml), voeg de juiste inductoren (arabinose, IPTG, of arabinose en IPTG, 1 mM elk) en incubeer bij 37 ° C8 uur. Bereid parallel niet-geïnduceerde kweken. </li><li> Verzamel fracties van 1 ml, vervolgens verdund 1: 500 in nieuwe flessen met vers medium (10 ml), aangevuld of niet met de juiste inductoren. Incubeer O / N bij 37 ° C. </li><li> Herhaal de stappen 5.2 en 5.3 en verzamel aliquots van 1 ml. </li><li> Bepaal het aantal generaties deed zich voor in elke cultuur. Breng op LB-platen werd 100 ui van geschikte seriële verdunningen van inoculum en cultuur. Incubeer O / N bij 37 ° C. De kolonies op de LB-platen, en bereken de log van het aantal cellen aanwezig in het inoculum (log I) en in de cultuur eind groei (log C). Om het aantal generaties te bepalen, gebruikt u de volgende formule: (log C - log I) /0.301. </li><li> Centrifugeer bij 5000 xg gedurende 20 min en resuspendeer de cellen in 1 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM NaCl. Om de cellen permeabel, voeg 2-3 druppels chloroform en vortex gedurende 20 seconden. </li><li> Bepaal de β-glucosidase activiteit van elk monster in een 96-well microplaat, met p-nitrofenyl-β-D-glucopyranoside (PNPGluc) als substraat. Voeg aan elk putje 100 pl gepermeabiliseerde cellen en 100 pl substraat (16 mg / ml voorraadoplossing in H2O). Zorg luchtbellen in de putjes te voorkomen. Lees de absorptie bij 420 nm met behulp van een microplaat reader en het juiste filter. </li></ol>

<ol><li>Durani, V., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplifying+protein+expression+with+ligation-free%2C+traceless+and+tag-switching+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Simplifying protein expression with ligation-free, traceless and tag-switching plasmids.</a> Protein Expr. Purif. 85 (1), 9-17 (2012).</li>
<li>Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+landscape+of+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Expanding the landscape of recombinant protein production in Escherichia coli.</a> Biotechnol. Lett. 35 (12), 1971-1981 (2013).</li>
<li>Geisse, S., Gram, H., Kleuser, B., Kocher, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+expression+systems%3A+a+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic expression systems: a comparison.</a> Protein Expr. Purif. 8 (3), 271-282 (1996).</li>
<li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli%3A+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J. Mol. Biol. 260 (3), 289-298 (1996).</li>
<li>Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+expression+of+the+PBAD+promoter+in+Escherichia+coli+by+constitutive+expression+of+the+low-affinity+high-capacity+AraE+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Homogeneous expression of the PBAD promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter.</a> Microbiology. 147 (12), 3241-3247 (2001).</li>
<li>Morgan-Kiss, R. M., Wadler, C., Cronan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+and+homogeneous+regulation+of+the+Escherichia+coliaraBAD+promoter+by+use+of+a+lactose+transporter+of+relaxed+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coliaraBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxed specificity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (11), 7373-7377 (2002).</li>
<li>Tabita, F. R., Small, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+assembly+of+active+cyanobacterial+ribulose-1%2C5-bisphosphate+carboxylase%2Foxygenase+in+Escherichia+coli+containing+stoichiometric+amounts+of+large+and+small+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Expression and assembly of active cyanobacterial ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in Escherichia coli containing stoichiometric amounts of large and small subunits.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 (18), 6100-6103 (1985).</li>
<li>Van der Vies, S. M., Bradley, D., Gatenby, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+cyanobacterial+and+higher+plant+ribulose+bisphosphate+carboxylase+subunits+into+functional+homologous+and+heterologous+enzyme+molecules+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Assembly of cyanobacterial and higher plant ribulose bisphosphate carboxylase subunits into functional homologous and heterologous enzyme molecules in Escherichia coli.</a> EMBO J. 5 (10), 2439-2444 (1986).</li>
<li>Amann, E., Brosius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATG+vectors+for+regulated+high-level+expression+of+cloned+genes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">ATG vectors for regulated high-level expression of cloned genes in Escherichia coli.</a> Gene. 40 (2-3), 183-190 (1985).</li>
<li>Scheich, C., Kümmel, D., Soumailakakis, D., Heinemann, U., Büssow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vectors+for+co-expression+of+an+unrestricted+number+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Vectors for co-expression of an unrestricted number of proteins.</a> Nucleic Acids Res. 35 (6), e43(2007).</li>
<li>Conte, E., Landolfi, G., Vincelli, G., Stefan, A., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pGOODs%3A+new+plasmids+for+the+co-expression+of+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">pGOODs: new plasmids for the co-expression of proteins in Escherichia coli.</a> Biotechnol. Lett. 33 (9), 1815-1821 (2011).</li>
<li>Guzman, L., Belin, D., Carson, M., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+regulation%2C+modulation%2C+and+high-level+expression+by+vectors+containing+the+arabinose+PBAD+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter.</a> J. Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).</li>
<li>McHenry, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replicases+from+a+bacterial+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">DNA replicases from a bacterial perspective.</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 403-436 (2011).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Hamdan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolysis+of+the+5%E2%80%99-p-nitrophenyl+ester+of+TMP+by+the+proofreading+exonuclease+%28%CE%B5%29+subunit+of+Escherichia+coli+DNA+polymerase+III%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Hydrolysis of the 5’-p-nitrophenyl ester of TMP by the proofreading exonuclease (ε) subunit of Escherichia coli DNA polymerase III.</a> Biochemistry. 41 (16), 5266-5275 (2002).</li>
<li>Guillén Suárez, A. S., Stefan, A., Lemma, S., Conte, E., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+enzyme-coupled+assay+of+phosphate-+or+pyrophosphate-releasing+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A continuous enzyme-coupled assay of phosphate- or pyrophosphate-releasing enzymes.</a> BioTechniques. 53 (2), 99-103 (2012).</li>
<li>DeRose, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+for+the+catalytic+domain+of+the+proofreading+%CE%B5+subunit+of+Escherichia+coli+DNA+polymerase+III+based+on+NMR+structural+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Model for the catalytic domain of the proofreading ε subunit of Escherichia coli DNA polymerase III based on NMR structural data.</a> Biochemistry. 41 (1), 94-110 (2002).</li>
<li>Ozawa, K., Jergic, S., Park, A. Y., Dixon, N. E., Otting, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proofreading+exonuclease+subunit+%CE%B5+of+Escherichia+coli+DNA+polymerase+III+is+tethered+to+the+polymerase+subunit+%CE%B1+via+a+flexible+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The proofreading exonuclease subunit ε of Escherichia coli DNA polymerase III is tethered to the polymerase subunit α via a flexible linker.</a> Nucleic Acids Res. 36 (15), 5074-5082 (2008).</li>
<li>Bressanin, D., Stefan, A., Dal Piaz, F., Cianchetta, S., Reggiani, L., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+of+the+proofreading+subunit+controls+the+assembly+of+Escherichia+coli+DNA+polymerase+III+catalytic+core%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Proteolysis of the proofreading subunit controls the assembly of Escherichia coli DNA polymerase III catalytic core.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1794 (11), 1606-1615 (2009).</li>
<li>Schaaper, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base+selection%2C+proofreading%2C+and+mismatch+repair+during+DNA+replication+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Base selection, proofreading, and mismatch repair during DNA replication in Escherichia coli.</a> J. Biol. Chem. 268 (32), 23762-23765 (1993).</li>
<li>Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+evolution+of+novel+traits+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid evolution of novel traits in microorganisms.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).</li>
<li>Reynolds, A. E., Felton, J., Wright, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+DNA+activates+the+cryptic+bgl+operon+in+E.+coli+K12%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insertion of DNA activates the cryptic bgl operon in E. coli K12.</a> Nature. 293, 625-629 (1981).</li>
<li>Schaeffer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+system+for+the+utilization+of+%CE%B2-glucosides+in+Escherichia+coli.+I.+Active+transport+and+utilization+of+%CE%B2-glucosides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inducible system for the utilization of β-glucosides in Escherichia coli. I. Active transport and utilization of β-glucosides.</a> J. Bacteriol. 93 (1), 254-263 (1967).</li>
<li>Miller, J. H., Suthar, A., Tai, J., Yeung, A., Truong, C., Stewart, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+selection+for+mutators+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Direct selection for mutators in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 181 (5), 1576-1584 (1999).</li>
<li>Dunker, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unfoldomics+decade%3A+an+update+of+intrinsically+disordered+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The unfoldomics decade: an update of intrinsically disordered proteins.</a> BMC Genomics. 9, Suppl 2. (2008).</li>
<li>Taft-Benz, S. A., Schaaper, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C-terminal+domain+of+DnaQ+contains+the+polymerase+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The C-terminal domain of DnaQ contains the polymerase binding site.</a> J. Bacteriol. 181 (9), 2693-2695 (1999).</li>
<li>Perrino, F. W., Harvey, S., McNeill, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+functional+domains+of+the+%CE%B5+subunit+of+DNA+polymerase+III%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Two functional domains of the ε subunit of DNA polymerase III.</a> Biochemistry. 38 (48), 16001-16009 (1999).</li>
<li>Kim, D. R., McHenry, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assembly+of+overproduced+DNA+polymerase+III.+Overproduction%2C+purification%2C+and+characterization+of+the+%CE%B1%2C+%CE%B1-%CE%B5%2C+and+%CE%B1-%CE%B5-%CE%B8+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo assembly of overproduced DNA polymerase III. Overproduction, purification, and characterization of the α, α-ε, and α-ε-θ subunits.</a> J. Biol. Chem. 271 (34), 20681-20689 (1996).</li>
<li>Maul, R. W., Ponticelli, S. K. S., Duzen, J. M., Sutton, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+Escherichia+coli+DNA+polymerase+to+the+%CE%B2-sliding+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differential binding of Escherichia coli DNA polymerase to the β-sliding clamp.</a> Mol. Microbiol. 65 (3), 811-827 (2007).</li>
<li>Greener, A., Callahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XL1-red%3A+highly+efficient+random+mutagenesis+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Strategies%22%5BJournal%5D)">XL1-red: highly efficient random mutagenesis strain.</a> Strategies. 7, 32-34 (1994).</li>
<li>Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+ligation-independent+expression+vectors+for+co-expression+of+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli.</a> Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).</li>
<li>Sun, J., Hopkins, R. C., Jenney, F. E. Jr, McTernan, P. M., Adams, M. W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+and+maturation+of+an+NADP-dependent+%5BNiFe%5D-hydrogenase%3A+a+key+enzyme+in+biofuel+production%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production.</a> PloS One. 5 (5), (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Eiwitten kunnen intrinsiek ontvouwen, die gebieden waarvan de tertiaire structuur is niet beperkt tot een beperkt aantal conformaties 25. Deze ontvouwen eiwitten zijn meestal gevoelig voor aggregatie 25, en hun isolatie en karakterisering misschien een moeilijke taak te vertegenwoordigen. De ε subeenheid van E. coli DNA polymerase III is voorzien van twee verschillende domeinen 26,27, te weten: i) de N-ter-domein met het 3&#39;-5 &#39;exonucleaseactiviteit, en die bevoegd zijn o...

De invoering van overexpressie technologieën gestimuleerd ofwel de biochemische studies van laag kopie-aantal enzymen en de industriële productie van farmacologisch werkzame eiwitten (bijvoorbeeld insuline). Sinds de komst van deze technologieën, aanzienlijke vooruitgang geboekt om de opbrengst en kwaliteit van recombinante eiwitten verhogen. Daarnaast werden prokaryotische 1,2 en eukaryotische 3 overexpressie systemen ontwikkeld door de jaren heen, het aanbieden van bruikbare alternatieven voor het &quot;werkpaard&quot; van eiwitten biotechnologie, dat wil zeggen, Escherichia coli. Vooral de beschikbaarheid van alternatieve platforms E. coli leidde tot de productie van recombinante peptiden of proteïnen dragen post-translationele modificaties. Er moet echter worden opgemerkt dat E. coli is nog het organisme gekozen voor recombinante eiwitproductie. Dit komt door verschillende factoren, waaronder de meest relevant kan zijnbeschouwd: i) de beschikbaarheid van een groot aantal overexpressie systemen (expressievectoren en stammen) voor E. coli 1,2; ii) de korte generatietijden en hoge opbrengsten biomassa, E. coli in een verscheidenheid van rijke en synthetische media; iii) de gemakkelijke manipulatie hetzij op biochemisch en op genetisch niveau van dit micro-organisme; iv) het isoleren van stammen in staat de productie van toxische eiwitten 4; v) de bouw van de stammen met homogene inductie bij de bevolking niveau 5,6. Bovendien is recent aangetoond dat expressie die geschikt zijn voor de productie in E. coli van post-translationeel gemodificeerde eiwitten kunnen worden bedacht en gebouwd 2. Momenteel wordt eiwitoverexpressie vooral gebruikt om monomere of homo-oligomere eiwitten waarvan hypersynthesis kan worden uitgevoerd met een enkel gen gekloneerd in een geschikte plasmide te verkrijgen. Echter, aandacht werd onlangsbesteed aan de bouw van E. coli eiwit co-expressiesystemen, tegen de productie, in vivo, van hetero-oligomere complexen 2. Interessant is dat vroege experimenten van eiwit co-expressie gericht de inter-species assemblage van grote en kleine subeenheden van cyanobacteriën ribulose-1,5-bisfosfaatcarboxylase / oxygenase 7,8, en de vereniging van afgeknotte en full-length vormen van HIV-1 reverse transcriptase 9. Deze baanbrekende studies aangetoond dat eiwit co-expressie is een krachtig alternatief voor traditionele in vitro reconstitutie. Bovendien eiwit co-expressie in E. coli werd gebruikt om verschillende eiwitten dragen posttranslationele modificaties 2 produceren, eiwitten bevattende natuurlijke aminozuren 2 verkrijgen, en om de opbrengst van overexpressie membraaneiwitten 2 verhogen. Bovendien is het potentieel van proteïne co-expressie als een middel te verlenen aan E. coli concurrerennvu in eiwituitscheiding is onder actieve onderzoek 2. Twee belangrijke strategieën van eiwit co-expressie in E. coli kan worden nagestreefd: i) het gebruik van een enkel plasmide op de verschillende genen gastheer voor overexpressie; ii) het gebruik van meerdere plasmiden in enkele cellen co-expressie van de doelwit eiwitten. In het eerste geval zijn de criteria voor de keuze van plasmide niet van die van conventionele enkelvoudige eiwitoverexpressie experimenten, hoewel name plasmiden die tandem promoter / operator elementen zijn geconstrueerd voor co-expressie 10. Deze eerste benadering is derhalve vrij eenvoudig. Er moet echter worden opgemerkt dat het gebruik van een enkel plasmide co-expressie verschillende eiwitten voor twee belangrijke problemen: i) de molecuulmassa van de vector toeneemt met het aantal gastheer genen, waardoor het aantal co-expressie gebrachte eiwitten; ii) wanneer meerdere genen worden gekloneerd onder de controle van een enkele promoter, polariteit decrease de expressie van de genen distaal van de promoter. Het gebruik van dubbele of meervoudige plasmiden in enkele E. coli-cellen heeft om de verenigbaarheid van de vectoren van keuze te bereiken, dus het opleggen van beperkingen aan de in aanmerking komende combinaties van plasmiden. Echter, deze tweede co-expressie strategie biedt het voordeel dat met de molecuulmassa van vectoren, en beperkt polariteit. We hebben onlangs gebouwde een eiwit co-expressie systeem ontworpen om het pendelen van genen tussen de co-expressie plasmiden 11 te vergemakkelijken. In het bijzonder hebben we de pGOOD vectoren serie geconstrueerd, de relevante eigenschappen daarvan zijn: i) een p15A oorsprong van replicatie, de verenigbaarheid van de pGOOD plasmiden met de commerciële vectoren die de ColE1 oorsprong (bijvoorbeeld de pBAD serie 12) te verschaffen; ii) een tetracycline-resistentie cassette; iii) de aanwezigheid van lac -afgeleide regulerende elementen, dat wil zeggen, de promotor-Operator (O 1) paar en het lad </em&gt; q-gen. Met behulp van een geschikte pBAD-pGOOD echtpaar, waren we in staat om de katalytische kern van E. overexpressie coli DNA polymerase III, samengesteld uit drie verschillende subeenheden, namelijk α (de 5&#39;-3 &#39;polymerase), ε (de 3&#39;-5&#39; exonuclease) en θ (stabiliserende ε) 13. In het bijzonder hebben we aangetoond dat de co-expressie van het αεθ complex strikt afhankelijk van de toevoeging aan de E. coli kweekmedium van zowel IPTG en arabinose, wat leidde tot overexpressie van pGOOD en pBAD respectievelijk (Figuur 1A). In dit rapport, illustreren we hoe eiwit co-expressie efficiënt kunnen oplossen problemen in verband met de slechte oplosbaarheid van een eiwitcomplex subunit. Verder tonen we hoe in vivo eiwit complementatie tests kunnen worden uitgevoerd, en tenslotte beschrijven we het gebruik van eiwit co-expressie afstemmen mutatiefrequentie in E. coli. Om dit doel, gebruikten we pGOOD-pBAD koppels geschikt om relevante voorbeelden van elke casus illustreren.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>INT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8377</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>PNP-gluc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7006</td><td></td></tr><tr><td>pNP-TMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0251</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87128</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95039</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Fluka</td><td>70161</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide solution 30%</td><td>BioRad</td><td>161-0158</td><td>Voor gelelektroforese</td></tr><tr><td>Ammonium persolphate</td><td>BioRad</td><td>161-0700</td><td>Voor gelelektroforese</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>BioRad</td><td>161-0718</td><td>Voor gelelektroforese</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad</td><td>161-0302</td><td>Voor gelelektroforese</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BioRad</td><td>161-0800</td><td>Voor gelelektroforese</td></tr><tr><td>Tris</td><td>BioRad</td><td>161-0719</td><td>Voor gelelektroforese</td></tr><tr><td>Cuvettes 0.1 cm</td><td>BioRad</td><td>1652089</td><td>Voor elektroporatie</td></tr><tr><td>Centrifuge 5415R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Allegra 21R</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chromatography apparatus GradiFrac</td><td>Pharmacia Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser II electroporation</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader 550</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniProtean 3 cell</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Power Supply</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator 3000</td><td>Misonix</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

de veelzijdige voordelen van protein co-expressie in<em&gt; escherichia coli</em

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We rapporteren hier dat de expressie van eiwitcomplexen in vivo in Escherichia coli handiger kan zijn dan traditionele reconstitutie-experimenten in vitro. In het bijzonder laten we zien dat de slechte oplosbaarheid van de ε-subeenheid van Escherichia coli DNA-polymerase III (met 3’-5’ exonuclease-activiteit) sterk verbetert wanneer hetzelfde eiwit wordt geco-exprimeerd met de α- en θ-subeenheden (met respectievelijk DNA-polymerase-activiteit en stabilisering van ε). We tonen ook aan dat eiwitco-expressie in E. coli kan worden gebruikt om de competentie van subeenheden van verschillende bacteriesoorten om zich te associëren in een functioneel eiwitcomplex efficiënt te testen. We laten inderdaad zien dat de α-subeenheid van Deinococcus radiodurans DNA-polymerase III kan worden geco-exprimeerd in vivo met de ε-subeenheid van E. coli. Bovendien rapporteren we over het gebruik van eiwitco-expressie om de mutatiefrequentie in E. coli te moduleren. Door de wildtype ε-subeenheid onder controle van de araBAD-promotor (arabinose-induceerbaar) te exprimeren, en de mutagene D12A-variant van hetzelfde eiwit, onder controle van de lac-promotor (induceerbaar door isopropyl-thio-β-D-galactopyranosid, IPTG), waren we in staat de mutatiefrequentie van E. coli te veranderen door gebruik te maken van geschikte concentraties van de inducers arabinose en IPTG. Ten slotte bespreken we recente vorderingen en toekomstige uitdagingen van eiwitco-expressie in E. coli.

De ε subeenheid van E. coli DNA polymerase III bestaat uit 243 aminozuren en heeft een slechte oplosbaarheid 17,18, tenzij de residuen 187-243 geschrapt 17. Wij hebben echter eerder aangetoond 11 dat de co-expressie van volledige lengte α, ε en θ subeenheden levert oplosbaar DNA polymerase III katalytische kern (figuur 1). Vooral met de pBAD-pGOOD co-expressiesysteem, we aangetoond dat: i) kan de overexpressie van α en ε subeenheden afzonderlijk worden ingesteld...

Eiwit co-expressie is een krachtige alternatief voor de reconstitutie in vitro van eiwitcomplexen, en helpt bij het uitvoeren van biochemische en genetische tests in vivo. Hier rapporteren we over het gebruik van eiwit co-expressie in Escherichia coli om eiwitcomplexen te verkrijgen en om de mutatiefrequentie van cellen af te stemmen.

De veelzijdige voordelen van Protein Co-expressie in<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om verschillende eiwitten gelijktijdig tot expressie te brengen in Escherichia coli en hun assemblage in vivo te beoordelen. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van de twee compatibele plasmiden, P bad en P good, om e. coli TOP10 co-te transformeren. Als tweede stap wordt de co-getransformeerde stam gekweekt bij 30 °C en vervolgens geïnduceerd om de eiwitten over te expresseren.Vervolgens worden de oplosbare eiwitten geëxtraheerd en onderworpen aan gelfiltratie om de associatie van de overgeëxprimeerde eiwitten te analyseren. De resultaten tonen aan dat co-expressie in E. coli een efficiënt instrument is voor de productie van in vivo geassembleerde eiwitcomplexen en een handige manier is om de slechte oplosbaarheid van vrije eiwitsubunits te omzeilen. Co-expressie is een krachtig instrument in de biochemie, waardoor de gelijktijdige overexpressie van verschillende eiwitten in enkelvoudige cellen mogelijk wordt.Er kan worden vastgesteld dat de overexpressie van enkelvoudige genen essentieel was voor de studie van Lopi-getal-eiwitten. Wanneer de uitdaging echter bestond uit het bestuderen van eiwitcomplexen, moesten individuele eiw

the-multifaceted-benefits-of-protein-co-expression-in-escherichia-coli

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Systematische, grootschalige synthetische genetische (gen-gen of epistase) interactie schermen kunnen worden gebruikt om genetische redundantie en route overspraak verkennen. Hier hebben we een high-throughput kwantitatieve synthetische genetische scala screening technologie te beschrijven, genoemd eSGA door ons ontwikkelde voor het ophelderen van epistatisch relaties en het verkennen van genetische interactie netwerken...

Het in kaart brengen Bacteriële Functionele Netwerken en Wegen in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Gebruik van synthetische Genetische Arrays

Affiniteitszuivering van gemerkte eiwitten in combinatie met massaspectrometrie (APM) is een krachtige methode voor systematische mapping van eiwit interactie netwerken en het onderzoeken van de mechanistische basis van biologische processen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde sequentiële peptide affiniteit (SPA) APM procedure ontwikkeld voor de...

Identificatie van eiwit complexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Met Sequential Peptide Affinity Purification in combinatie met tandem massaspectrometrie

Eiwitcomplexen katalyseren belangrijke cellulaire functies. Gedetailleerde functionele en structurele karakterisering van vele essentiële complexen vereist recombinante productie. MultiBac is een baculovirus / insectencelsysteem vooral afgestemd voor het uitdrukken van eukaryote eiwitten en hun complexen. MultiBac werd geïmplementeerd als een open-access platform en standaard operationele procedures ontwikkeld om het nut te maximaliseren.

De MultiBac Protein Complex Production Platform in het EMBL

Deze vijfdaagse protocol beschrijft alle stappen, apparatuur en aanvullende software voor het maken en uitvoeren van een efficiënte endogene Escherichia coli op basis TX-TL-cel-vrije expressie systeem vanaf nul. Met reagentia, het protocol duurt 8 uur of minder voor het inrichten van een reactie, verzamelen en verwerken van gegevens.

Protocollen voor implementatie van een Escherichia coli Op basis TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Een gestroomlijnde benadering screening op de expressie van recombinant membraaneiwitten in Escherichia coli gebaseerd op fusie met groen fluorescent proteïne gepresenteerd.

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

Deze studie beschrijft methoden voor de T7-gemedieerde co-expressie van meerdere genen uit een enkel plasmide in Escherichia coli met behulp van het pMGX plasmide systeem.

Induceerbaar T7 RNA Polymerase-gemedieerde Multigene Expression System, pMGX

Synthetische biologie waardoor de engineering van eiwitten met ongekende eigenschappen met behulp van het co-translational inbrengen van niet-canonieke aminozuren. Hier, presenteerden we hoe een spectraal rood-verschoven variant van een GFP-type fluorophore met roman fluorescentie spectroscopische eigenschappen, genoemd "goud" fluorescent proteïne (GdFP), wordt geproduceerd in E. coli via selectieve druk opneming (SPI).

Engineering 'Golden' fluorescentie door selectieve druk opneming van niet-canonieke aminozuren en eiwit analyse door massaspectrometrie en fluorescentie

We hebben een nieuwe methode voor het uitdrukken van mede meerdere chimeer fluorescerende fusie-eiwitten in planten te overwinnen van de moeilijkheden van conventionele methoden ontwikkeld. Duurt het voordeel van het gebruik van een enkele uitdrukking plasmide waarin meerdere functioneel onafhankelijk eiwit uiting van cassettes om eiwituitdrukking mede.

Co expressie van meerdere chimeer fluorescerende Fusion eiwitten op een efficiënte manier in planten

Dit protocol detailleert de stappen, kosten, en apparatuur die nodig is voor het genereren van E. coli-op basis van cel extracten en uit te voeren in vitro eiwit synthese reacties binnen 4 dagen of minder. Om de invloed van de flexibele aard van dit platform voor brede toepassingen, bespreken we reactie voorwaarden die kunnen worden aangepast en geoptimaliseerd.

Escherichia coli-cel-Free eiwitsynthese gebaseerd: protocollen voor een robuuste, flexibele en toegankelijk platformtechnologie

We beschrijven een methode voor de karakterisering van protonen-gedreven membraan transporteurs in membraan vesikel preparaten geproduceerd door heterologeuze expressie in E. coli en Lysis van cellen met behulp van een Franse pers.

Karakterisering van membraan transporters door Heterologeuze expressie in E. coli en productie van membraan blaasjes

Hier beschrijven we een methode voor de bacteriële co-expressie van differentieel gelabelde eiwitten met behulp van een reeks compatibele vectoren, gevolgd door de conventionele pulldown-technieken om eiwitcomplexen te bestuderen die niet in vitro kunnen worden samengevoegd.

Pulldown-test in combinatie met co-expressie in bacteriecellen als een tijdefficiënt hulpmiddel voor het testen van uitdagende eiwit-eiwitinteracties

Leer eiwitco-expressie in Escherichia coli voor de assemblage van eiwitcomplexen in vivo met behulp van compatibele plasmiden. Deze methode omzeilt oplosbaarheidsproblemen van vrije subunits en verhoogt de opbrengst van functionele complexen.

De veelzijdige voordelen van Protein Co-expressie in

Meer video's verkennen