Name: Een Ex vivo Model naar Hormoon Actie studie in de menselijke borst (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Leer een ex vivo model voor hormoonactie in menselijk borstweefsel met behoud van architectuur en celinteracties. Deze methode ondersteunt onderzoek naar borstkanker en endocriene signalering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken M. Fiche van het Universitair Ziekenhuis van Lausanne voor het verstrekken van de mammoplasty foto, M. Wirth en A. Ayyanan van Zwitserse Instituut voor Experimenteel Kankeronderzoek, National Center of Competence in Research Moleculaire Oncologie, School of Life Sciences, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne voor technische bijstand en R. Clarke van de Universiteit van Manchester voor kritische opmerkingen. Het onderzoek leidde tot deze resultaten heeft de steun van SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531.817, en het Innovative Medicines Initiative gemeenschappelijke onderneming onder subsidieovereenkomst kreeg geen. 115.188, middelen van die zijn samengesteld uit financiële bijdrage van het zevende kaderprogramma van de Europese Unie (FP7 / 2007-2013) en de European Federation of Pharmaceutical Industries and Associations bedrijven &#39;in natura bijdrage. Het webadres van Innovative Medicines Initiative is <a href="http://www.imi.europa.eu/" target="_blank">http://www.imi.europa.eu/</a> . &lt;/ P&gt;

Algemene beschouwingen: Vooruitlopend op tijd, het opzetten van een ethische protocol, bereiden vragenlijsten voor patiënten, en zie aan de opleiding van de klinische personeel. Voor het gebruik van materiaal uit vermindering mammoplasty chirurgie, schaffen vergunningen, en zorgen voor toestemming van de patiënt. Weefsel kan besmettelijk zijn en dienovereenkomstig moet worden behandeld. Dit protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van ISREC - Zwitserse Instituut voor Experimenteel Kankeronderzoek. 1. Tissue Recovery, Verwerking en Bio-banking Om een ​​optimale kwaliteit van het monster voor bio-banking te garanderen, zijn een aantal stappen uitgevoerd in het ziekenhuis voorafgaand aan het vervoer naar het laboratorium. In het ziekenhuis: <ol><li> Verkrijgen menselijke borst weefsel onder steriele condities van reductie mammoplasty chirurgie en bloedmonsters, indien nodig. Weefsel moet door patholoog die zullen genieten van de aanwezigheid van kwaadaardige laesies uitgesloten te worden onderzocht. </li><li> Plaats de borst tuitgifte van onder de motorkap op een steriele boord en een schaar, chirurgische scalpel en pincet die reeds gesteriliseerd met stoom sterilisator te bereiden. Maak diepe snee op verschillende plaatsen van het borstweefsel met behulp van een scalpel om het te openen. In menselijk borstweefsel kijken voor witte strengen bestaande uit leidingen en melkklieren, die zijn ingebed in het geel vetweefsel. OPMERKING: De verhouding van de witte parenchymale de gele vetweefsel verschilt bij vrouwen; meestal jongere vrouwen hebben meer epitheelweefsel. </li><li> Pick stukjes wit materiaal en houd ze met een pincet, dan scheiden ze voorzichtig uit het vetweefsel met een schaar. Vermijd het nemen van de bloedvaten. </li><li> Spoel stukjes weefsel in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,2 tot bloed te verwijderen. Breng het weefsel 250 ml plastic flessen met F12-medium (Medium F12 Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s) zonder fenol rood met 2% penicilline / streptomycine (inclusief 5.000 eenheden / ml penicilline en 5.000 g / ml streptomycine) en 1% eentibiotic / amfotericine B (waaronder 10.000 eenheden / ml penicilline, 10.000 ug / ml streptomycine en 25 ug / ml amfotericine B). Store weefsels in het medium voor transport naar het laboratorium. </li><li> Bereid stukken van 3-5 mm diameter voor RNA en eiwit-extractie en flash-vries ze in cryovials met koud (droogijs) isopentaan. Overbrengen naar droog ijs doos voor transport naar het laboratorium. </li><li> Zet stukken van 3-5 mm in de mal en bedek het met een laagje Optimal Cutting Temperatuur (oktober) en plaats dan de schimmel op de vlakke bodem van de doos gevuld met koude isopentaan. Na volledige bevriezing dragen de mal het droogijs box. </li><li> Fix 5 stukken van 3-5 mm diameter paraformaldehyde (PFA) 4% en een 5 stuks formaldehyde (FA) 4% in PBS bij kamertemperatuur histologische analyse later. Twee verschillende fixeermiddelen worden aanbevolen als sommige antilichamen beter met één of de andere van de twee werkt. </li></ol> In het laboratorium: <ol start="8"><li> Doencument alle informatie over de vermindering mammoplasty, na chirurgie en of de monsters zijn afkomstig van links versus rechter borst. </li><li> Plaats de bevroren monsters bij -80 ° C en breng de gefixeerde weefsels in histologie cassettes na 2 uur van fixatie. Dan zet ze ofwel PBS of 70% ethanol voor O / N opslag bij 4 ° C. Op de volgende dag, de overdracht van de histologie cassettes te histologie faciliteiten voor inbedden in paraffine. </li></ol> 2. Tissue Spijsvertering en hormoonstimulatie <ol><li> Breng de flessen met de weefselmonsters van een laminaire stroming kabinet in een P2 celcultuur kamer. Plaats weefsel stukken op steriele snijplank (29 x 19 cm). Houd het materiaal met een pincet en schraap het achtergebleven vet en schepen uit de buurt van de borst parenchym (witte gedeelte) met een scalpel. Leg het witte materiaal in PBS in een 10 cm cultuur schotel. </li><li> Na het verwijderen van de vette materiaal van alle stukken en weggooien ze volgens de veiligheidsvoorschriften regels van het laboratorium, plaats de witte delen met de epitheliale weefsels terug op de snijplank. Met tegengestelde scalpels snijden het weefsel en hak het in stukken tot 2 mm diameter. </li><li> Plaats het gehakt materiaal in buizen van voldoende grootte: tot 1, 2,5 en 10 ml in een 5, 15 of 50 ml buizen, respectievelijk. Typisch een 5 ml buisje opbrengsten genoeg materiaal voor paraffine inbedding en hormonale stimulatie, en een buis van 15 ml levert genoeg materiaal voor Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS). Grotere buizen worden gebruikt voor het invriezen van monsters. </li><li> Bereid spijsvertering master mix bestaande uit (DMEM / F12 zonder fenol rood) met 1% penicilline / streptomycine / amfotericine B en collagenase A (Clostridiopeptidase A van Clostridium histolyticum). Dosis collagenase volgens de spijsvertering tijden. <ol><li> Bij 12, 24 en 36 uur incubatie gebruik eindconcentratie van collagenase van 1,5 mg / ml, 1,0 mg / ml en 0,5 mg / ml. Voeg spijsvertering master mix tot 4 keer van devolume van het gedigereerde materiaal voldoende roeren en beluchting te verzekeren. OPMERKING: Afhankelijk van de proefopzet en de duur van hormonale stimulatie, hormonen toe te voegen tijdens of na de enzymatische vertering stap en microstructuur herstel. </li></ol></li><li> Hormoon (s) toe te voegen op de gewenste concentratie van monsters en het voertuig aan de controle te testen. Bij stimulatie met 17 β-oestradiol en promegeston (R5020) gebruiken een eindconcentratie van 20 nM. OPMERKING: R5020 is een synthetisch progesteron receptor agonist, die stabieler dan natuurlijk progesteron in medium. <ol><li> Plaats de buisjes op de roller mixer in een incubator bij 37 ° C en 40 rpm O / N. Voordat de monsters aan de mixer, resuspendeer ze goed zodat alle materiaal verdeelt langs de centrifugebuizen. </li></ol></li><li> Zoals digestie duurt minimaal 12 uur (O / N) voor hormonale stimulering van minder dan 12 uur, voeg de hormonen na herstel van de microstructuren (detailed onder stap 3). Voeg de hormonen zoals u resuspendeer de microstructuren en plaats de schorsing op ultra-lage bevestigingsplaten. Weefsel microstructuren kunnen op ultra-lage bevestigingsplaten tot 7 dagen groei-factor vrij medium behoud ongeveer 70% houdbaarheid ervan. </li><li> Voor RNA en eiwitanalyse, verzamel weefsel microstructuren door centrifugatie bij 400 xg gedurende 5 minuten en flash bevriezing centrifugebuizen. </li></ol> 3. Herstel van Tissue Microstructuren <ol><li> Centrifugeer het buisje (s) bij 400 xg gedurende 5 minuten. Zuig het vet van de bovenkant van de centrifugebuis en breng het supernatans van de resterende waterige supernatant, dat is verrijkt in fibroblasten, een nieuwe centrifugebuis en centrifugeer bij 1250 xg gedurende 5 minuten. Opmerking: Als het borstweefsel microstructuren zeer kleverig, voor alle volgende stappen resuspendeer de pellet door voorzichtig schudden van de buis. Pipetteren wordt niet aanbevolen vanwege het risico van verlies van materiaal. </li&gt; <li> Resuspendeer de pellets verrijkt microstructuren en in fibroblasten afgeleid van waterige supernatant in PBS, 2% foetaal kalfsserum (FCS). Vervolgens draaien beide buizen bij 1250 xg gedurende 5 minuten en dan gooi de bovenstaande vloeistoffen. </li><li> Resuspendeer de pellets in 3-5 ml rode cel bloed lysebuffer en overbrengen naar buizen schoon te maken. Incubeer ze gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 2x volume van PBS, 2% FCS en centrifugeer ze bij 1250 xg gedurende 5 minuten. Was de pellets met PBS, 2% FCS en centrifugeer bij 1250 xg gedurende 5 minuten. Herhaal deze stap twee keer. </li></ol> 4. Monsters voor flowcytometrie <ol><li> Voeg 1-2 ml trypsine 0,25% de pellet en meng door en neer te pipetteren zachtjes gedurende 2 min met 1000 pi Pipetman cellen dissociëren. </li><li> Inhibit trypsine activiteit door toevoegen 9 ml PBS, 2% FCS. Centrifugeer bij 450 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer de pellet in 10 ml PBS, 2% FCS. </li><li> Breng de celsuspensie op een 40 um cel zeef geplaatst top een 50 ml centrifugebuis om enkele cellen te bereiden. Als een paar microliter celsuspensie blijft boven op de filter, helpt hen door het filter door te aspireren van de andere zijde van zeef met een pipet en deze toevoegen aan de gefilterde microstructuren. </li><li> Afzonderlijke immuuncellen, fibroblasten en endotheliale cellen van microstructuren met een cocktail van anti-CD45, anti-FAP en anti-CD31 antilichamen en vervolgens sorteren met FACS op basis van pan-epitheliale marker EpCAM en CD10 tot luminale en basale cellen respectievelijk 10 scheiden . </li></ol> 5. Monsters voor Histologie <ol><li> Na wassen van de mechanisch en enzymatisch gedigereerd materiaal zoals hierboven beschreven, vast pellets van 1.5 ml uitgangsmateriaal in 1 ml van 4% PFA in PBS bij kamertemperatuur gedurende 30 min. </li><li> Centrifuge bij 1250 xg gedurende 5 minuten en was met 1-2 ml PBS twee keer. </li><li> Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 10 min. Gedurende deze tijd bereiden 1% polyvalente agarose in tris-acetaat-EDTA (TAE) buffer en verwarm de oplossing in de magnetron tot de oplossing op kookpunt komt. <ol><li> Verwijder de oplossing uit de oven en schud de kolf zachtjes om de oplossing te mengen en resuspendeer de resterende agarose deeltjes. Koel agarose oplossing tot 50 ° C en giet 1 ml in paraffine basisvorm afmetingen 31 x 23 x 13,5 mm. </li></ol></li><li> Verwijder het supernatant en plaats de pellets bovenop de gestolde laag (1-3 mm) van agarose met een spatel met een plat uiteinde. Bedek ze allemaal met een extra laag agarose (40 ° C). </li><li> Na de agarose stolt, meestal binnen 5 minuten, zet de agarose blokken in de histologie cassettes voor paraffine inbedding. Samen met de agarose monsters plaatst een witte kantoor papier in de cassette met alle informatie over de vermindering mammoplasty nummer, experimentele conditie, en datum geschreven in kleine letters met potlood; dit schrijven is bestand tegen alle daaropvolgende behandeling stappen. </li><li> Plaats de cassettes inPBS O / N, of in 70% ethanol voor opslag in het weekend, bij 4 ° C. We hebben nog niet opgevallen geen verschil tussen de twee storage-oplossingen. Vervolgens transfer histologie cassettes te histologie faciliteiten voor inbedden in paraffine. </li></ol> 6. Freezing Microstructuren (Future kweken) <ol><li> Resuspendeer weefsel microstructuren in invriesmedium bestaande uit FCS met 10% dimethylsulfoxide (DMSO) en vries 1 ml porties in cryovials. Het aantal verkregen cryovials hangt af van de hoeveelheid primaire materiaal verkregen uit vermindering mammoplasty. </li><li> Bevries de cryoflesjes die weefsel microstructuren met een geregelde snelheid vriezer met het volgende programma: 5 min woning bij 4 ° C, daalt de temperatuur tot -7 ° C met een snelheid van 6 ° C / min, verlagen van de temperatuur tot -12 ° C van 6 ° C / min, 10 min woning, verlagen van de temperatuur tot -40 ° C met een snelheid van 6 ° C / min, verlagen van de temperatuur tot -80 ° Ctarief van 6 ° C / min. Daarna brengt de cryovials tot -80 ° C vriezer. </li><li> De volgende dag, breng de cryovials van -80 ° C vloeibare stikstof tank voor langdurige opslag. </li></ol>

<ol><li>Beral, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+and+hormone-replacement+therapy+in+the+Million+Women+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study.</a> Lancet. 362 (9382), 419-427 (2003).</li>
<li>MacMahon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+at+first+birth+and+breast+cancer+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Age at first birth and breast cancer risk.</a> Bull World Health Organ. 43 (2), 209-221 (1970).</li>
<li>Pike, M. C., Krailo, M. D., Henderson, B. E., Casagrande, J. T., Hoel, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Hormonal%27+risk+factors%2C+%27breast+tissue+age%27+and+the+age-incidence+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">'Hormonal' risk factors, 'breast tissue age' and the age-incidence of breast cancer.</a> Nature. 303 (5920), 767-770 (1983).</li>
<li>Brisken, C., O'Malley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone+action+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Hormone action in the mammary gland.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (12), a003178(2011).</li>
<li>Levenson, A. S., Jordan, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCF-7%3A+the+first+hormone-responsive+breast+cancer+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line.</a> Cancer Res. 57 (15), 3071-3078 (1997).</li>
<li>Tanos, T., Rojo, L. J., Echeverria, P., Brisken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+and+PR+signaling+nodes+during+mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">ER and PR signaling nodes during mammary gland development.</a> Breast Cancer Res. 14 (4), 210(2012).</li>
<li>Roskelley, C., Desprez, P., Bissell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix-dependent+tissue-specific+gene+expression+in+mammary+epithelial+cells+requires+both+physical+and+biochemical+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12378-12382 (1994).</li>
<li>Kass, L., Erler, J. T., Dembo, M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+epithelial+cell%3A+influence+of+extracellular+matrix+composition+and+organization+during+development+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mammary epithelial cell: influence of extracellular matrix composition and organization during development and tumorigenesis.</a> Int J Biochem Cell Biol. 39 (11), 1987-1994 (2007).</li>
<li>Graham, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+licensing+and+progenitor+numbers+are+increased+by+progesterone+in+normal+human+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">DNA replication licensing and progenitor numbers are increased by progesterone in normal human breast.</a> Endocrinology. 150 (7), 3318-3326 (2009).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comment+on+%22Progesterone%2FRANKL+is+a+major+regulatory+axis+in+the+human+breast%22%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Comment on "Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast".</a> Sci Transl Med. 5 (215), 215le214(2013).</li>
<li>Brisken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+signalling+in+breast+cancer%3A+a+neglected+hormone+coming+into+the+limelight%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Progesterone signalling in breast cancer: a neglected hormone coming into the limelight.</a> Nat Rev Cancer. 13 (6), 385-396 (2013).</li>
<li>Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+architecture+and+function%3A+dynamic+reciprocity+via+extra-+and+intra-cellular+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices.</a> Cancer Metastasis Rev. 28 (1-2), 167-176 (2009).</li>
<li>Tanos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone%2FRANKL+is+a+major+regulatory+axis+in+the+human+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast.</a> Sci Transl Med. 5 (182), 182ra155(2013).</li>
<li>Yalcin-Ozuysal, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+roles+of+Notch+and+p63+in+controlling+mammary+epithelial+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate.</a> Cell Death Differ. 17 (10), 1600-1610 (2010).</li>
<li>Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+out+the+FACS%3A+a+devil+in+the+details%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Sorting out the FACS: a devil in the details.</a> Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De ex vivo kweken hier beschreven is borstweefsel microstructuren die intact leidingen en melkklieren, samen met andere celtypen die normaal in het menselijke vrouwelijke borst. Bij de verwerking van de menselijke borst weefsel gewoonlijk verkregen door reductie mammoplasties, verwijdering van vetweefsel, mechanische en enzymatische digestie van de stromale matrix en lysis van rode bloedcellen verrijkt melk duct fragmenten en terminale ductale lobulaire eenheden. Gentle enzymatische digestie op de juiste concen...

A correction was made to <a href="/video/52436">An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast</a>. There was an error with the author, Marie Shamsheddin&#39;s, name. The author&#39;s name has been corrected to:
Marie Shamseddin
instead of:
Marie Shamsheddin

A correction to the author list has been made for the article <a href="/video/52436">An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast</a>.

Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Informatie over de mutatie-landschap bij borstkanker is steeds meer in snel tempo. Minder aandacht is besteed aan systemische factoren die de ontwikkeling van borstkanker beïnvloeden. Blootstelling aan reproductieve hormonen heeft een grote invloed op het ziekteverloop 1-3. Toch zijn de mechanismen die de reproductieve hormonen van invloed zijn op de menselijke borst slecht begrepen. Werken met genetisch gemanipuleerde muis modellen is gebleken dat er sprake is cel intrinsieke en paracrienen via verschillende downstream effectoren 4. De beperkte kennis hormoonwerking in de menselijke borst is grotendeels toe te schrijven aan een gebrek aan geschikte modellen. De meeste werken op de mechanismen van oestrogeenreceptor (ER) en progesteron receptor (PR) signalering uitgevoerd met hormoonreceptorpositieve borstkanker cellijnen, zoals MCF-7 en T47D. Deze waren afkomstig van pleuravocht van patiënten met gevorderde borstkanker bij wie alrea gehaddy ontving meerdere behandelingen 5. De biologische relevantie van de bevindingen in zulke eenvoudige in vitro modellen van de menselijke borst twijfelachtig en doelgenen die in deze in vitro modellen verschillen van doelgenen die zijn geïdentificeerd in diermodellen 6. Als primaire menselijke borst epitheliale cellen worden gekweekt in vitro ze de neiging om hormoon-receptor expressie en dus hormoon respons 7,8 verliezen. Dit probleem kan worden circumventd door geavanceerde 3D-aanpak met behulp van matrigel. Zo C. Clarke en collega&#39;s in geslaagd borst epitheelcellen die hormoonreceptor expressie onderhouden en vertoonden een proliferatieve reactie op progesteron stimulatie 9. Maar twee belangrijke in vivo progesteronreceptor doelwitgenen, Wnt-4 en RANKL, werden niet geïnduceerd na progesteron stimulatie in dit systeem 9. Deze aanpak werd onlangs genomen over verdere met in vitro </em&gt; hormoon voorbehandeling en RANKL inductie werd bereikt 10. Een nadeel blijft dat matrigel heeft activiteiten die batch-afhankelijke, is duur, en eist een experimenteel ontwerp dat geschikt is voor slechts kleine cel aantallen. Op basis van de bevinding dat in vivo ER en PR signalering worden grotendeels veroorzaakt door paracrine interacties 11, we betoogd dat intercellulaire interacties moeten worden gehandhaafd. Een andere belangrijke factor die verloren weefsels gedissocieerd tot afzonderlijke cellen in vitro cultuur zijn de interacties van de epitheelcellen van de extracellulaire matrix; maar deze zijn van cruciaal belang voor epitheliale differentiatie en hun verstoring is belangrijk bij het ​​ontstaan ​​van tumoren 12. Met dit in het achterhoofd, hebben we een methode om borstweefsel microstructuren te isoleren van verse chirurgische discard materiaal 13. De borst parenchym, bestaande uit twee lagen epitheel met inwendige luminale en uitwendige myoepithelial cellen, wordt verwijderd ontleed uit vetweefsel en onderworpen aan mechanische en enzymatische dissociatie. Na wassen en centrifugeren, worden fragmenten van melkkanalen verkregen die nauwe interactie met vele stromale cellen behouden. Deze weefsel microstructuren blijven hormoon reageren. Het model werd gevalideerd in klinische monsters 13. Als zodanig kan de onderhavige procedure helpen hormoonwerking in de borst bestuderen een biologisch en klinisch relevante context.

<table><tbody><tr><td>Microlitre Centrifuge</td><td>Heraeus Biofuge Fresco</td><td>75005521</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5810 000.327</td><td></td></tr><tr><td>Cryobox</td><td>Nalgene&nbsp;&nbsp;</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Controlled Rate Freezer EF600 Grant</td><td>Asymptote&nbsp;</td><td>EF600</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Hera Cell Heraeus</td><td>51022391</td><td></td></tr><tr><td>Roller Mixer SRT9D</td><td>Sturt</td><td>SRT9D</td><td></td></tr><tr><td>Histology Cassettes</td><td>Medizintechnik</td><td>81-0021-00</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Surgical Blade&nbsp;</td><td>Aesculap</td><td>BB536&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Aesculap</td><td>BB084R</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Aesculap</td><td>BD047R</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Aesculap</td><td>BC374R</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin base mold</td><td>SAKURA</td><td>4166</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix</td><td>Thermoscientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic/Antimycotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F/12</td><td>Life Technologies</td><td>11039-021</td><td>Voorbereiden (37 &deg;C)</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Roche</td><td>11 088 793 001</td><td>Voorbereiden (37 &deg;C)</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10270</td><td>Kan vervangen worden door Fetal Calf Serum</td></tr><tr><td>Cell Blood Lysis Buffer</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Roth</td><td>335</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1009831000</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic vials (5.0 ml)</td><td>VWR, International</td><td>479-0820</td><td></td></tr><tr><td>Ultra low attachment culture dish</td><td>Corning, NY 14831</td><td>3471</td><td></td></tr></tbody></table>

een<em&gt; ex vivo</em&gt; model naar hormoon actie studie in de menselijke borst

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

De studie van het hormoon actie in de menselijke borst is belemmerd door een gebrek aan adequate modelsystemen. Bij in vitro cultuur, primaire mamma-epitheliale cellen hebben de neiging om hormoon-receptor expressie te verliezen. Veel gebruikte hormoon-receptor positieve borstkanker cellijnen van beperkte relevantie voor de in vivo situatie. We beschrijven hier een ex vivo model om de werking van hormonen in de menselijke borst te bestuderen. Verse menselijke specimens borstweefsel van chirurgische discard materiaal zoals vermindering mammoplasties of mammectomies worden mechanisch en enzymatisch verteerd om weefsel fragmenten die leidingen en melkklieren en meerdere stromale celtypen te verkrijgen. Deze weefsel microstructuren in basaal medium bewaard zonder groeifactoren behouden hun intercellulaire contacten, het weefsel architectuur, en blijven hormoon responsieve voor meerdere dagen. Ze worden gemakkelijk verwerkt voor RNA en eiwit-extractie, histologische analyse of opgeslagen in invriesmedium. Fluorescentiegeactiveerde celsortering (FACS) kan worden gebruikt om te verrijken voor specifieke celpopulaties. Dit protocol voorziet in een eenvoudige, standaard aanpak voor translationeel onderzoek met zeer complexe, gevarieerde menselijke specimens.

Om de rol van oestrogenen en progesteron te bestuderen en om hun moleculaire functies in het menselijk borst beter te begrijpen, verzamelen wij verse menselijke specimens borstweefsel van patiënten die een vermindering mammoplasties (figuur 1) na het behalen van hun geïnformeerde toestemming. We krijgen ook medische en reproductieve voorgeschiedenis van de patiënt, evenals een bloedmonster serum progesteron bij de operatie bepalen. Weefsel van verse vermindering mammoplasties is mechanisch en enzymatisc...

We hebben een nieuwe ex vivo model om de werking van hormonen in de menselijke borst bestuderen ontwikkeld. Het is gebaseerd op microstructuren weefsel geïsoleerd uit chirurgische borstweefsel monsters die weefselarchitectuur, intercellulaire interacties en paracrienen behouden.

Een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Model naar Hormoon Actie studie in de menselijke borst

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Het algemene doel van deze procedure is om een ex vivo model van de menselijke borst te verkrijgen dat de weefselarchitectuur, intercellulaire interacties en hormonale responsiviteit behoudt om de werking van hormonen te bestuderen. Het model is gebaseerd op menselijke weefselmicrostructuren die worden geprepareerd door eerst het borstparenchym, bestaande uit gangen en lobuli, te dissekeren uit het vette mammaire stroma. Naast adipocyten bevat het stroma fibroblasten, immuuncellen en endotheelcellen.Zodra het parenchymale weefsel is bevrijd van het vet, wordt het mechanisch gedissocieerd in stukjes ter grootte van een speldenknop met behulp van tegenover elkaar geplaatste scalpels. Vervolgens wordt de weefselmassa onderworpen aan enzymatische digestie met collagenase; indien gewenst kan hormonale stimulatie aan deze stap worden toegevoegd. De weefselmicrostructuren worden daarna teruggewonnen door centrifugatie, gevolgd door het verwijderen van het resterende vetweefsel, de fibroblast-verrijkte fractie en rode bloedcellen.Na een herstelprocedure wordt de suspensie van het resterende verteerde borstweefsel verrijkt met weefselmicrostructuren die luminale en myoepitheliale cellen bev

an-ex-vivo-model-to-study-hormone-action-in-the-human-breast

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Kanker is een complexe ziekte die wordt beïnvloed door het weefsel rondom de tumor en lokale pro- en anti-inflammatoire mediatoren. Daarom kan orthotroop injectie modellen plaats subcutane modellen nuttig om de progressie van kanker te bestuderen op een wijze die beter nabootst humane pathologie.

Orthotopische Injectie van borstkankercellen in de uiervet Pad van Muizen tumorgroei te bestuderen.

Opgericht kanker cellijnen en xenograften hebben de steunpilaar van het onderzoek naar kanker in de afgelopen paar decennia. Echter, recente gegevens blijkt dat de therapeutische respons sterk wordt beïnvloed door de tumorcel micromilieu. Daarom hebben wij een ex vivo analyse van de primaire tumor specimens geneesmiddelontwikkeling doeleinden ontwikkeld.

Ex vivo behandeling Reactie van primaire tumoren en / of geassocieerde Metastasen voor preklinische en klinische ontwikkeling van Therapeutics

Protocollen worden beschreven voor het bestuderen van borstkanker celmigratie, proliferatie en kolonisatie in een menselijk botweefsel explantaatmodel systeem.

Methoden voor het kweken van menselijke dijbeen weefselexplantaten naar Breast Cancer Cell Kolonisatie van het gemetastaseerde Niche Bestudeer

We ontwikkelden een in vitro model van dormantie in het beenmerg voor oestrogengevoelige borstkankercellen. Het doel van dit protocol is om het gebruik van het model aan te tonen voor de studie van de moleculaire en cellulaire biologie van dormantie en voor het genereren van hypothesen voor verder testen in vivo.

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Kiemrust Model van oestrogeen-gevoelige Borstkanker in het beenmerg: A Tool for Molecular Mechanism Studies en Hypothese Generation

We beschrijven een 3D-kweekmodel van het menselijk borstpijtheel dat geschikt is om hormoonwerking te bestuderen.

Een hormoon-responsieve 3D Cultuur Model van de Human borstklier epitheel

Hier presenteren we een protocol om het implantaat van borstkankercellen in de borstklier vet pad in een eenvoudige, minder invasief, en gemakkelijk te bedienen manier, en deze orthotopic borst kanker muismodel met een juiste borstklier vet pad omgeving kan worden gebruikt voor het onderzoeken van verschillende aspecten van kanker.

Orthotopic injectie van borstkankercellen in de borstklier vet Pad muizen

Patient-derived xenograft (PDX) modellen en transplanteerbare genetisch gemanipuleerde muismodellen getrouw de menselijke ziekte samenvatten en zijn voorkeursmodellen voor fundamenteel en translationeel borstkankeronderzoek. Hier wordt een methode beschreven om borsttumorfragmenten orthotopisch in het borstvetkussen te transplanteren om tumorbiologie te bestuderen en de respons van geneesmiddelen te evalueren.

Orthotopische transplantatie van borsttumoren als preklinische modellen voor borstkanker

Dit protocol beschrijft de constructie van een in vitro microfysiologisch systeem voor het bestuderen van borstkanker met behulp van primair menselijk borstweefsel met kant-en-klare materialen.

Borstkanker modelleren in menselijk borstweefsel met behulp van een microfysiologisch systeem

We introduceren een protocol voor het meten van real-time medicijn- en stralingsrespons van borstkanker hersenmetaster gemetastaseerde cellen in een organotypisch hersenplakmodel. De methoden bieden een kwantitatieve test om de therapeutische effecten van verschillende behandelingen op hersenmetastasen van borstkanker op een ex vivo manier binnen de micro-omgevingsinterface van de hersenen te onderzoeken.

Een ex vivo hersenschijfmodel om borstkanker te bestuderen en te targeten Hersen gemetastaseerde tumorgroei

Kruisverwijzing tussen borstepitheelcellen en endotheelcellen draagt belangrijk bij aan de progressie van borstkanker, tumorgroei en metastase. In deze studie zijn sferoïden gemaakt van borstkankercellen samen met vasculaire en / of lymfatische endotheelcellen en tonen hun toepasbaarheid aan als een in vitro systeem voor borstkankeronderzoek.

Mammary Epitheliale en Endotheelcel Sferoïden als een potentieel functioneel in vitro model voor borstkankeronderzoek

Leer een ex vivo model voor hormoonactie in menselijk borstweefsel met behoud van architectuur en celinteracties. Deze methode ondersteunt onderzoek naar borstkanker en endocriene signalering.

Een

Meer video's verkennen