Name: EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in Water per cultuur en RT-qPCR. II. Totaal kweekbare Virus Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Leer het meten van infectieuze virussen in water volgens EPA-methode 1615 met behulp van Buffalo Green Monkey niercellen. Deze gestandaardiseerde aanpak kwantificeert virusdeeltjes via celkweek en MPN-berekening voor volksgezondheidsbeoordeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, voor het leveren van de Sabin poliovirus serotype 3 gebruikt in dit onderzoek; Mary Jean See, Nancy Schable en Jenifer Jones van Dynamac Corporation voor de bereiding van BGM-culturen; Nichole E. Brinkman, Shannon M. Griffin, Brian R. McMinn, Eric R. Rhodes, Eunice A. Varughese, Ann C. Grimm, Sandhya U. Parshionikar en Larry Wymer voor hun bijdragen aan de algehele evaluatie van USEPA-methode 1615; Gretchen Sullivan voor technische assistentie; en lokale privébroneigenaren en nutsbedrijven voor het toestaan van het verzamelen van watermonsters. Hoewel dit werk is beoordeeld door USEPA en goedgekeurd voor publicatie, betekent dit niet noodzakelijkerwijs dat het de officiële beleid van de instantie weerspiegelt. Vermelding van handelsnamen of commerciële producten vormt geen goedkeuring of aanbeveling voor gebruik.

OPMERKING: Zie aanvullende materialen sectie S1 voor een lijst met definities. De QA-procedures in verband met USEPA Method 1615 worden beschreven in de aanvullende materialen sectie S2. 1. Filter Elutie Procedure <ol><li> eerste Elutie <ol><li> Plaats 500 ml gebufferde 1,5% vleesextract, pH 9,0, verwarmd tot kamertemperatuur in een maatcilinder. Open de filterpatroon behuizing en voeg een voldoende hoeveelheid vleesextract de elektropositieve filter volledig omsluit. Vervang het filterhuis deksel en giet de resterende vlees extract in een steriele beker. </li><li> Na 1 min van contacttijd, voorbij het rundvlees extract oplossing in de behuizing samen met dat nog in de steriele beker langzaam door het filter met behulp van een druk container of een peristaltische pomp. Vang het eluaat op in een 2 L glazen beker. </li></ol></li><li> tweede elutie <ol><li> Herhaal stap 1.1 met behulp van een extra 500 ml gebufferde 1,5% rundvlees extract, Maar verhogen de contacttijd bij stap 1.1.2 tot 15 minuten. </li><li> Voeg het vlees extract van de tweede elutie om de 2 L beker met dat van de eerste elutie. Voeg een steriele roerstaafje aan de beker. </li></ol></li></ol> 2. Organische Flocculatie Concentratie Procedure <ol><li> Steriliseren een combinatiepreparaat pH elektrode met 0,525% natriumhypochloriet gedurende tenminste 5 min. Spoel de elektrode met steriele dH 2 O en vervolgens dechlorinate met 0,05 M natriumthiosulfaat. Kalibreer de pH meter behulp pH 4 en 7 normen. </li><li> Plaats het bekerglas met het eluaat op een roer plaat. Zet de plaat en verhoog de roersnelheid tot een vortex wordt gevormd. </li><li> De pH van het eluaat tot 3,5 ± 0,1 door langzaam druppelsgewijs toevoegen van 1,2 M HCl aan het eluaat. Voeg het HCl druppelsgewijs omdat snelle toevoeging virus inactiveren. Gedurende deze tijd wordt het eluaat troebel worden als een neerslag begint zich te vormen. </li><li> Verminder het mengen speed een langzame en roer daarna blijven volgen en handhaven van de pH van het eluaat op 3,5 ± 0,1 bij kamertemperatuur gedurende 30 min. </li><li> Giet het neergeslagen vleesextract suspensie in één of meer centrifuge flessen en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 2500 xg bij 4 ° C. Verwijder de flessen uit de centrifuge en ofwel zuig of langzaam decanteer de bovenstaande vloeistof om verlies van het precipitaat gepelleteerd voorkomen. Verwijder het supernatant. OPMERKING: Er kan een aanzienlijke variatie tussen rundvlees extract kavels in de kwantiteit en kwaliteit van de neerslag zijn. Het neerslag geproduceerd uit een aantal percelen zal snel op te lossen, terwijl dat van andere partijen lost met moeite. </li><li> Voeg 30 ml 0,15 M natriumfosfaat de centrifuge fles met het precipitaat. <ol><li> Gebruik 0,15 M natriumfosfaat, pH 9,0 om een ​​neerslag ontstaat vleesextract partijen die oplossen in 5 min. Roer gedurende 10 minuten na het neerslag volledig is opgelost, en ga dan meteen naar stap 2.7. </li><li> Gebruik 0,15 M natriumfosfaat, pH 7,0-7,5 voor alle andere neerslagen. Roer gedurende 10-15 min op te lossen, of moeilijker precipitaten, breken ze met een steriele spatel, door herhaaldelijk de oplossing op en neer trekken tijdens het roeren met een pipet, door schudden van de neerslag bij 160 rpm op een ronddraaiende schudder, of door een combinatie van deze procedures. OPMERKING: Bij gebruik van meerdere centrifugefles, combineer het precipitaat met minder dan 30 ml natriumfosfaat en vervolgens het resterende deel van de 30 ml om de flessen te spoelen na het combineren van de neerslag in een fles of beker. </li><li> Indien de gecombineerde neerslag in een vlakke bodem centrifugefles, voeg een roerstaaf om de fles. Ga naar stap 2.6.5. </li><li> Indien de gecombineerde neerslag in een centrifuge fles met een conische bodem, deze hoeveelheid in een kleine glazen beker en voeg een roerstaaf in het bekerglas. </li><li> Plaats de fles of beker op een magneetroerder en roer tot de precipitate volledig opgelost. </li><li> Opnieuw steriliseren type combinatie pH-elektrode met 0,525% natriumhypochloriet en dechlorinate met 0,05 M natriumthiosulfaat zoals beschreven in stap 2.1. Kalibreer de pH meter behulp pH 7 en 10 standaarden. Langzaam de pH van het volledig opgelost precipitaat 9,0 met 1 M NaOH en vervolgens 10 min geroerd. </li></ol></li><li> Verwijder de roerstaaf en centrifugeer de opgeloste precipitaat gedurende 10 min bij 4,000-10,000 xg en 4 ° C. </li><li> Giet het supernatans in een glazen beker zonder de pellet te verstoren. Voeg een roerstaafje aan de beker en gooi de pellet. </li><li> Plaats de beker op een magnetische roerder en roer de oplossing. Voeg 1,2 M HCl druppelsgewijs aan de pH op 7,0-7,5. </li><li> Filter steriliseren het supernatant door het door een steriliserend filter met voorfilter dat was voorbehandeld met 15 ml 1,5% vleesextract, 0,05 M glycine, pH 7,0-7,5. </li><li> Assay Sample Volume (S) berekeningen: <ol><li> Gebruik vergelijking 1 tot S te berekenen voor alle monsters met uitzondering van het Lab Versterkt Blank en het reagens Lab Blank, <img alt="vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq1.jpg" width="100" /> vergelijking 1 waarbij D (volume van Original Water Sample getest) is 500 L voor het grondwater, TSV (Total Sample Volume) is het volume van veldmonster doorgegeven via de 5-inch elektronpositieve cartridge filter door het laboratorium ontvangen en FCSV (Final Concentrated Sample Volume) is het volume na filtratie in stap 2.10. Een voorbeeld is te zien in aanvullende materialen Sectie S4.1. </li><li> Bereken S voor het Lab Versterkte Blank (LFB, dat wil zeggen, een positieve kwaliteitscontrole met behulp van geënte reagenskwaliteit water) en de reagens Lab Blank (LRB, dat wil zeggen, een negatieve kwaliteitscontrole met zuivere water) door de FCSV te vermenigvuldigen met 0,3. </li></ol></li><li> Verdeel de FCSV in three deelmonsters. <ol><li> Bereid deelmonsters 1 en 2 met een volume dat gelijk is aan 1,04 maal de Assay Sample Volume. Freeze deze submonsters op of onder -70 ° C als ze niet met de totale kweekbare virustest (subgroep 1, stap 4) kunnen worden geanalyseerd of bewerkt voor het moleculaire assays (niet getoond) binnen 24 uur; anders, houden op 4 ° C. </li><li> Bevriezen overblijvende volume (deelsteekproef 3) bij of beneden -70 ° C. </li></ol></li><li> Bereken de Inoculum Volume door de S delen door 10. </li></ol> 3. Totaal kweekbare Virus quantal Assay NB: Voor alle stappen zorgvuldig altijd oplossingen toe te voegen om te voorkomen dat het verstoren van de cel monolaag. <ol><li> Giet of aspireren media uit testvaten met een monolaag van BGM cellen bij 3-6 dagen na de splitsing en voeg dan een volume van gebalanceerde zoutoplossing gelijk aan de media verwijderd. </li><li> Giet of zuig het gebalanceerde zoutoplossing uit de celkweek test schepen wordt gebruikt en vervolgens het enten van de celkweek testvaten <ol><li> Inoculeer 10 testbakken voor elk proefmonster met een volume van subgroep 1 gelijk is aan de Inoculum Volume, samen met de totale kweekbare virus quantale assay controles (aanvullende materialen sectie S2.4). </li><li> Voor de LFB en het Lab Versterkte monstermatrix (LFSM, dwz geënt watermatrix monster) Bereid 5-, 25- en 125-voudige verdunningen gebruikt subgroep 3 en 0,15 M natriumfosfaat, pH 7,0-7,5 als verdunningsmiddel. Een voorbeeld van een procedure voor het maken van verdunningen wordt gegeven in aanvullende materialen sectie S3. Inoculeer 10 gewassen celkweek testvaten elk verdunningsreeks met een Inoculum Volume op een bak naast de vaten geïnoculeerd met onverdunde deelsteekproef 1 in stap 3.2.1. </li><li> Voor elk monster uit stap 3.2.1 (andere dan die geënt in stap 3.2.2), die CPE heeft in alle 10 replica&#39;s na 14 dagen incubatie (zie stap 3.3), prepare 5-, 25- en 125- en 625-voudige verdunningen van subgroep 3. Inoculatie 10 gewassen celkweek testvaten voor elke verdunning serie met behulp van een Inoculum Volume op elk testvat samen met een nieuwe reeks van de totale kweekbare virus quantal assay controles (aanvullende materialen sectie S2.4). </li><li> Verdeel het inoculum over het oppervlak van de cel monolagen door heen en weer te kantelen de vaten. Incubeer de testvaten bij kamertemperatuur gedurende 80-120 min op een mechanisch schudapparaat 1-5 oscillaties / min of schommelen van de vaten om de 15-20 minuten om eventueel aanwezig virus adsorberen aan cellen. </li><li> Voeg voorverwarmde onderhoud medium, en vervolgens incubeer de test schepen op 36,5 ± 1 ° C. </li></ol></li><li> Kijk voor het verschijnen van CPE in elk testvat behulp van een microscoop per dag gedurende de eerste 3 d en vervolgens onderzoeken ze elke 2-3 dagen tot dag 14. Transfer even welke test vaten, die ≥75% CPE te tonen aan een vriezer ingesteld op ofonder -70 ° C. Freeze alle resterende culturen en de totale kweekbare virus quantale assay controles op of onder -70 ° C na onderzoek van de schepen op de laatste dag. </li><li> Ontdooi alle culturen en filteren ≥15% van het medium van alle CPE-positieve test vat door een 0,2 um steriliseren filter. Als het voorgeschreven volume niet door het filter kan worden geleid door verstopping, gecentrifugeerd medium gedurende 10 min bij 1,500-18,000 xg en 4 ° C voorafgaand aan filtratie. </li><li> Voer een tweede passage van 1 ste passage testvaten met behulp van gewassen BGM testbakken. <ol><li> Inoculeer de nieuwe test schepen met een inenting volume dat 10% van de ontdooide medium uit alle negatieve test schepen en van de gefilterde medium van positief schepen vertegenwoordigt. </li><li> Herhaal de stappen 3.2.4-3.4.3, maar bevriezen elk testvat die negatief op de 1 ste passage en positief op de 2e was zoals beschreven in stap 3.3. Voer een 3 e pasleeftijd als beschreven voor de 2de passage met alleen negatieve controles en test celkweken die negatief in het 1 ste passage positief op 2de passage was. </li></ol></li><li> Identiteit van afzonderlijke testvaten als viruspositieve wanneer zij CPE in zowel de 1 e en 2e kanalen of tonen, in het geval dat CPE niet tot de 2de passage, in zowel de 2 en 3 de passages optreedt. </li><li> Gebruik USEPA Meest Waarschijnlijke Aantal Calculator met het standaardprogramma instellingen zoals weergegeven in Tabel S2 het virus titers van alle monsters berekend. <ol><li> Voer het aantal virus positieve testmonster schepen uit stap 3.6 voor elke test monster in de rekenmachine om de MPN / ml waarde (M ml) en de bovenste (CL UML) en lager (CL LML) 95% -betrouwbaarheidsgrenzen / ml waarden te bepalen . </li><li> Obtain de MPN / L-waarde (M L) van de desbetreffende test monster met behulp van Vergelijking 2. <img alt="vergelijking 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq2.jpg" width="100" /> vergelijking 2 M mL is de MPN / ml waarde in stap 3.7, S is de Assay Sample Volume, en D is het volume van Original Water Sample getest. </li><li> Bereken de bovenste betrouwbaarheidsinterval / L door het vervangen van de CL UML waarde voor de M mL waarde. Bereken de benedengrens / L door het vervangen van de CL LML waarde voor de M mL waarde. Een rekenvoorbeeld wordt getoond in aanvullende materialen Sectie S4.2. </li><li> Rapport M mL waarden van 0 als ≤ 1 / D. Bijvoorbeeld, ≤ 0,002 MPN / L (≤ 1/500 L) voor monsters grondwater. </li><li> Bereken de MPN en 95% betrouwbaarheidsinterval grenswaarden voor elk Lab Versterkte Blank en Lab Re-agent Blank door eerst de waarden / ml verkregen in de rekenmachine door S te vermenigvuldigen en vervolgens het resultaat te delen door 0,3. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Bradbury, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source+and+transport+of+human+enteric+viruses+in+deep+municipal+water+supply+wells%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Source and transport of human enteric viruses in deep municipal water supply wells.</a> Environ. Sci. Technol. 47 (9), 4096-4103 (2013).</li>
<li>Aslan, A., Xagoraraki, I., Simmons, F. J., Rose, J. B., Dorevitch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+adenovirus+and+other+enteric+viruses+in+limited-contact+freshwater+recreational+areas+and+bathing+waters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Occurrence of adenovirus and other enteric viruses in limited-contact freshwater recreational areas and bathing waters.</a> J. Appl. Microbiol. 111 (5), 1250-1261 (2011).</li>
<li>Begier, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+outbreak+of+concurrent+echovirus+30+and+coxsackievirus+A1+infections+associated+with+sea+swimming+among+a+group+of+travelers+to+Mexico%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">An outbreak of concurrent echovirus 30 and coxsackievirus A1 infections associated with sea swimming among a group of travelers to Mexico.</a> Clin. Infect. Dis. 47 (5), 616-623 (2008).</li>
<li>Anderson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+waterborne+outbreak+of+Norwalk-like+virus+among+snowmobilers-Wyoming%2C+2001%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001.</a> J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).</li>
<li>Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. Norovirus gastroenteritis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGlass%2C+RI+%22N.Engl.J.+Med%22">N.Engl.J. Med</a>. 361 (18), 1776-1785 (2009).</li>
<li>Khetsuriani, N., Lamonte-Fowlkes, A., Oberst, S., Pallansch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterovirus+surveillance--United+States%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Surveill.+Summ%22%5BJournal%5D)">Enterovirus surveillance--United States.</a> MMWR Surveill. Summ. 55 (8), 1-20 (2006).</li>
<li>Sawyer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterovirus+infections%3A+diagnosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Pediatr.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Enterovirus infections: diagnosis and treatment.</a> Semin. Pediatr. Infect. Dis. 13 (1), 40-47 (2002).</li>
<li>Abzug, M. J. The enteroviruses: an emerging infectious disease? The real, the speculative and the really speculative. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbzug%2C+MJ+%22Hot+Topics+in+Infection+and+Immunity+in+Children%22">Hot Topics in Infection and Immunity in Children</a>. Finn, A., Pollard, A. J. , Springer. (2008).</li>
<li>Harris, J. P., Edmunds, W. J., Pebody, R., Brown, D. W., Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deaths+from+norovirus+among+the+elderly%2C+England+and+Wales%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Deaths from norovirus among the elderly, England and Wales.</a> Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1546-1552 (2008).</li>
<li>Ho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Epidemic+of+Enterovirus+71+Infection+in+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+J.+Med%22%5BJournal%5D)">An Epidemic of Enterovirus 71 Infection in Taiwan.</a> New England J. Med. 341 (13), 929-935 (1999).</li>
<li>Bae, J., Schwab, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+murine+norovirus%2C+feline+calicivirus%2C+poliovirus%2C+and+MS2+as+surrogates+for+human+norovirus+in+a+model+of+viral+persistence+in+surface+water+and+groundwater%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of murine norovirus, feline calicivirus, poliovirus, and MS2 as surrogates for human norovirus in a model of viral persistence in surface water and groundwater.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74 (2), 477-484 (2008).</li>
<li>Ward, R. L., Knowlton, D. R., Winston, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+inactivation+of+enteric+viruses+in+fresh+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of inactivation of enteric viruses in fresh water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 52 (3), 450-459 (1986).</li>
<li>Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Source+Water+Quality+on+Chlorine+Inactivation+of+Adenovirus%2C+Coxsackievirus%2C+Echovirus%2C+and+Murine+Norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effects of Source Water Quality on Chlorine Inactivation of Adenovirus, Coxsackievirus, Echovirus, and Murine Norovirus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (15), 5159-5164 (2010).</li>
<li>Dahling, D. R., Wright, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+BGM+cell+line+culture+and+viral+assay+procedures+for+monitoring+viruses+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimization of the BGM cell line culture and viral assay procedures for monitoring viruses in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 51 (4), 790-812 (1986).</li>
<li>Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W. 3rd, Dahling, D. R., Stetler, R. E. EPA/600/R-95/178. ICR Microbial Laboratory Manual. , U.S. Environmental Protection Agency, I. (1996).</li>
<li>Cashdollar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Evaluation+of+EPA+Method+1615+for+Detection+of+Enterovirus+and+Norovirus+in+Water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).</li>
<li>USEPA. 40 CFR Parts 141 and 142 Revisions to the Unregulated Contaminant Monitoring Regulation (UCMR3) for Public Water Systems Final Rule. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Federal+Register%22">Federal Register</a>. 77 (85), 26072-26101 (2012).</li>
<li>USEPA. 40 CFR Part 141 National Primary Drinking Water Regulations: Monitoring Requirements for Public Drinking Water Supplies; Final Rule. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Federal+Register%22">Federal Register</a>. 61 (94), 24353-24388 (1996).</li>
<li>Shaw, S., Regli, S., Chen, J. Virus occurrence and health risks in drinking water . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShaw%2C+S+%22Information+Collection+Rule+Data+Analysis%22">Information Collection Rule Data Analysis</a>. McGuire, M. J., McLain, J. L., Obolensky, A. , AWWA Research Foundation and American Water Works Association. 437-462 (2002).</li>
<li>Lieberman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLieberman%2C+RJ+%22Microbial+monitoring+of+vulnerable+public+groundwater+supplies%22">Microbial monitoring of vulnerable public groundwater supplies</a>. , American Water Works Association. Denver, CO. (2002).</li>
<li>Lukasik, J., Scott, T. M., Andryshak, D., Farrah, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+salts+on+virus+adsorption+to+microporous+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of salts on virus adsorption to microporous filters.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66 (7), 2914-2920 (2000).</li>
<li>Sedmak, G., Bina, D., MacDonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+an+enterovirus+sewage+surveillance+system+by+comparison+of+clinical+isolates+with+sewage+isolates+from+milwaukee%2C+wisconsin%2C+collected+august+1994%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of an enterovirus sewage surveillance system by comparison of clinical isolates with sewage isolates from milwaukee, wisconsin, collected august 1994.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (12), 7181-7187 (2003).</li>
<li>Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+using+a+positively+charged+microporous+filter+and+ultrafiltration+for+concentration+of+viruses+from+tap+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77 (10), 3500-3506 (2011).</li>
<li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li>
<li>Cashdollar, J. L., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+primary+concentration+of+viruses+from+water+samples%3A+a+review+and+meta-analysis+of+recent+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.</a> J Appl Microbiol. 115 (1), 1-11 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

USEPA Methode 1615 is ontwikkeld voor gebruik tijdens de niet-gereglementeerde Monitoring verordening Verontreinigende derde controle cyclus (UCMR3) 17 en de eerste plaats bedoeld voor het meten van het virus voorkomen in het grondwater. Het deelt een aantal gemeenschappelijke stappen bij de methode Information Collection Rule (ICR), 15,18 maar heeft twee kleine verschillen. Beiden maken gebruik van quantale assays om virus dat CPE te produceren op BGM celmonolagen met kwantificatie is gebaseerd op het meest waarschijnlijke aantal (MPN) berekeningen te meten. Werkwijze 1615 maakt het gebruik van een nieuwere elektropositieve filter voor het concentreren van virus uit diverse matrices water en vermindert het aantal celkweek testvat replicaten per verdunning van 20 tot 10. Zowel geringe veranderingen algemene werkwijze verlagen. De vermindering van het aantal herhalingen minder arbeid, maar resulteert in een iets lagere detectiegrens. Hoewel grondwater wordt verwacht dat lagere concentraties van het virus dan het oppervlaktewater hebben, 19,20 the hoeveelheid monster geanalyseerd is vijf keer die van het oppervlaktewater, compensatie voor een deel voor de verschillen. Het gebruik van minder herhalingen zal geschikt voor de meeste oppervlaktewateren zijn, maar zal monster verdund worden. Methode 1615 heeft een aantal kritische stappen en beperkingen. Rundvlees extracten variëren van partij tot partij. Elke partij moeten worden getest op doeltreffendheid van de elutie virus en het vermogen tot virusconcentratie via de secundaire concentratiestappen zoals beschreven is aanvullend materiaal sectie S2.3. De methode maakt gebruik van exacte formules voor de berekening van het bedrag van het monster voor het enten op BGM celculturen en virustiters bepalen. Onnauwkeurige resultaten gegenereerd als deze formules zijn niet strikt gevolgd. Adequate steriele technieken worden gebruikt voor het handhaven van celculturen. Ongeïnfecteerde BGM celcultuur controles die leed tijdens de 14-daagse incubatieperiode tonen waarschijnlijk wijzen op problemen met celkweek onderhoud. Grote zorg moet ook ta zijnken tijdens pipetteren stappen die betrokken zijn bij inenting van middelgrote en naast celkweek kolven om kruisbesmetting te voorkomen. De in aanvullende materialen Sectie S2 beschreven kwaliteitscontroles moeten strikt worden opgevolgd. Sectie S2 biedt ook oplossingen voor problemen voor aspecten van kwaliteit. Het primaire mechanisme van virusadsorptie filters elektropositieve een lading interactie met betrekking tot de sterkte van de positieve lading op het filter en de sterkte van het virus negatieve lading gerelateerd aan het iso-elektrische punt en de pH van het water getest 21. Elutie van filters wordt ook beïnvloed door de kracht van deze interacties. Omdat ze bij virustypen en zelfs onder stammen binnen dezelfde soort variëren elutie van de filters is niet uniform. Dit betekent dat geen resultaat op het huidige niveau van het virus aanwezig is in het milieu wateren mogen onderschatten. Het gebruik van de enkele BGM cellijn onderschat ook virus voorkomen. Het bereikenterische virus dat CPE kan produceren in deze cellijn voornamelijk beperkt tot poliovirussen en enterovirus serotypen B species en enkele reovirussen 14,15,22. Andere besmettelijke virus types zullen niet worden gedetecteerd. Poliovirus herstel van bodem en reagenskwaliteit water met het US EPA Method 1615 prestaties acceptatiecriteria voor zowel Spelevaluatie (PE, dwz geënt reagenskwaliteit watermonsters met titers onbekende analist die worden gebruikt om de prestaties van de analist voor aanvang evalueren van een studie) en LFB monsters (aanvullende materialen Tabel S1). De 58% herstel van grondwater met de kweekmethode procedure vergelijkbaar met die van andere gebruikers kraanwater 23,24 gerapporteerd. De gemiddelde herstel van de LFB monsters van 111% met een coëfficiënt van variatie (CV) van 100% ook een ontmoeting van de methode prestaties acceptatiecriteria ook al zijn ze hoger dan die waargenomen voor PE monsters during de ICR. ICR betekenen interlaboratoriumonderzoeken herstel was 56% met een coëfficiënt van variatie (CV) van 92%, terwijl de gemiddelde intralaboratorium terugvorderingen varieerde 36-85% (CV 58-131%; niet-gepubliceerde gegevens van de ICR PE database). Hogere terugvorderingen werden waargenomen in deze studie voor lage zaad LFB monsters dan voor een hogere zaadmonsters (122 versus 42%). Op het moment dat de ICR was gepland, werd verwacht dat PE-monsters ontvangen lage zaad waarden lager herstel zou hebben dat degenen die hoge zaden. Vergelijkbaar met die hier waargenomen voor de monsters LFB, poliovirus herstel ICR PE monsters waren 71% (CV 100%), 54% (CV 69%) en 44% (71% CV) voor zaadwaarden ≤300 MPN, 300- 1500 MPN en&gt; 1500 MPN, respectievelijk. Er zijn vele methoden voor het meten van infectieus virus in watermonsters 25. Deze werkwijze is significant ten opzichte van andere werkwijzen in de mate van standaardisatie. De standaardisatie omvat niet alleen de kwaliteit en de prestaties van de controles,maar maakt ook gebruik van bepaalde volumes en formules om ervoor te zorgen dat alle analytische laboratoria voeren de methode identiek. Zonder standaardisatie, is het moeilijk om resultaten te vergelijken over laboratoria, en daarom standaardisatie is van essentieel belang bij het uitvoeren van grootschalige studies in meerdere analytische laboratoria. Met de ingebouwde in de normalisatie van deze methode kan worden uitgebreid in de toekomst tot andere soorten virus en cellijnen omvatten. Onderzoek is gaande om gegevens voor opname van adenovirus in de werkwijze.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.
The penultimate sentence of the last paragraph of the Representative Results section was changed from:
 These controls performed similarly with a mean recovery of 111% and a coefficient of variation of 100% (Figure 2), 
 
 to: 
 
 These controls had a mean recovery of 82% and a coefficient of variation of 110% (Figure 2).
 
The third sentence of the fourth paragraph of the Discussion section was changed from:
 The mean recovery from the LFB samples of 111% with a coefficient of variation (CV) of 100% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR, 
 
 to: 
 
 The mean recovery from the LFB samples of 82% with a coefficient of variation (CV) of 110% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.

Erratum: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Enterische virussen zijn een diverse groep van virussen die het menselijk darmkanaal infecteren en die via de fecaal-orale route worden verzonden. Deze virussen in het oppervlaktewater en grondwater door de zuiveringsinstallatie en septische tank afvalwater, verkeerd ontworpen of gebroken septic tanks, kapotte rioolleidingen, overstorten en ander punt en diffuse bronnen 1-4. Human infecties en ziekten van watergedragen virussen optreden via de consumptie van besmet of onvoldoende gedesinfecteerd water of via recreatiewater contact. Ziekteverschijnselen kunnen lichte tot ernstige gastro-enteritis te betrekken; conjunctivitis; koorts; bovenste luchtwegen nood; de hand, mond- en klauwzeer; myocarditis; aseptische meningitis; encefalitis; verlamming; sepsis 5-8, en de dood 9,10. USEPA Methode 1615 voorziet in een procedure om besmettelijke enterische virusdeeltjes in het milieu en het drinken van water te meten. Deze wateren kunnen bevattenmengsel van infectieuze en niet-infectieuze virions, maar alleen de infectieuze deeltjes vormen een gevaar voor de gezondheid. Besmettelijke virusdeeltjes verliezen besmettelijkheid de loop der tijd in het milieu en het drinken van water uit het verlies van eiwit capside integriteit, schade aan nucleïnezuren als gevolg van UV-straling uit zonlicht en schade als gevolg van enige ontsmettingsmiddelen die aanwezig 11-13 kunnen zijn. De totale kweekbare virus procedure van de werkwijze is gebaseerd op de productie van cytopathische effecten (CPE) in de Buffalo Green Monkey nier (BGM) cellijn. Deze cellijn werd gekozen vanwege het wijdverbreide gebruik in de virologie milieugebied 14,15, terwijl het traject van infectueuze virus types gedetecteerd voornamelijk beperkt tot bepaalde enterovirussen 15. Het doel van dit document is om Method 1615 de procedures beschrijven voor uitwassen van vijf-inch elektronpositieve cartridge filters, secundaire concentratie, en het meten van de totale kweekbare virussen. Een evaluatie van dealgemene werkwijze beschreven in Cashdollar et al. 16.

<table><tbody><tr><td>Beef extract, desiccated powder</td><td>BD Bacto</td><td>211520</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic tubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>3775/945373</td><td></td></tr><tr><td>Hank&rsquo;s balanced salt solution</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Mechanical rocking platform</td><td>Daigger</td><td>EF4907G</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-285-729</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizing filter with prefilter</td><td>VWR</td><td>28143-295</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizing syringe filter</td><td>Corning</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>pH Standards</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33643, 33646, 33648</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1018 or M4642</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4386</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate, 7.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Invitrogen</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr></tbody></table>

epa method 1615. meting van enterovirus en norovirus voorkomen in water per cultuur en rt-qpcr. ii. totaal kweekbare virus assay

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Een gestandaardiseerde methode is vereist wanneer nationale studies over het voorkomen van virussen in milieu- en drinkwater gebruikmaken van meerdere analytische laboratoria. De Method 1615 van de Amerikaanse Environmental Protection Agency (USEPA) werd ontwikkeld met als doel een dergelijke standaard te bieden voor het meten van Enterovirus en Norovirus in deze wateren. Het virus wordt uit het water geconcentreerd met behulp van een elektropositief filter, elueert van het filteroppervlak met runderextract en wordt vervolgens verder geconcentreerd met behulp van organische flocculatie. Hierin presenteren we het protocol van Method 1615 voor filterelutie, secundaire concentratie en meting van het totale aantal cultiveerbare virussen. Een deel van het geconcentreerde eluaat van elk monster wordt geïnoculeerd in tien replicaatkolven met nieren van Buffalo Green Monkey. Het aantal kolven dat cytopathische effecten vertoont, wordt gebruikt om het meest waarschijnlijke aantal (MPN) van besmettelijke eenheden per liter te kwantificeren. De methode gebruikt een aantal kwaliteitscontroles om de gegevenskwaliteit te verhogen en de variatie tussen laboratoria en binnen laboratoria te verminderen. Laboratoria moeten aan gedefinieerde prestatiestandaarden voldoen. Method 1615 werd geëvalueerd door het herstel van virussen te onderzoeken uit reagent-grade en grondwater die waren gezaaid met Sabin poliovirus type 3. De gemiddelde poliovirusherstelverhoudingen met de totale cultiveerbare assay waren 111% in reagent-grade water en 58% in grondwater.

Virus werd geconcentreerd uit de bron grondwater van drie drinkwater zuiveringsinstallaties en een eigen goed gebruik elektropositieve filters. Twee sample sets, bestaande uit een veld monster en LFSM controle werden verzameld uit de zuiveringsinstallaties bij verschillende gelegenheden, en één monster set werd verzameld uit de eigen bron. Gemiddelde viruswinning werd bepaald met LFSM monsters van twee van de planten en de eigen bron (twee monsters van een vaste één monster uit elkaar werden van de berekening uitgesloten omdat de MPN waarde van het gebruikte zaad met elk monster niet nauwkeurig gevolg kon worden bepaald CPE om abnormale resultaten bij herhaalde kolven). Gemiddelde poliovirus herstel van grondwaterstalen gemiddeld 58% met een variatiecoëfficiënt van 79% (figuur 2) 16. Geen kweekbare virus werd ontdekt in een van de dubbele water veldmonsters ongeplaatste grond. Resultaten van de methode ook werd gemeten met behulp van LFB samples gemodificeerd door twee verschillende niveaus zaad. A &quot;low&quot; titer van 300 MPN poliovirus werd gebruikt om de prestaties in concentraties lager dan de &quot;standaard&quot; 500 MPN LFB niveau dat in USEPA Method 1615. Een &quot;high&quot; titer evalueren van 1000 MPN poliovirus werd gebruikt om de prestaties te testen met een niveau van de LFSM controle. Deze controles eveneens met een gemiddelde terugwinning van 111% en een variatiecoëfficiënt van 100% (figuur 2). Alle LRB monsters waren negatief en al LFB monsters uitgevoerd binnen de acceptatiegrens (aanvullende materialen Tabel S1). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig1.jpg" /> Figuur 1. Filter elutie. Een schema voor het gebruik van een drukhouder voor patroonfilter elutie weergegeven. Positieve luchtdruk wordt gebruikt om vleesextract oplossing in de drukhouder duwen door de cassettebehuizing conTaining de elektropositieve cartridge filter. Een peristaltische pomp kan worden vervangen door de drukhouder met de inlaat van de pomp in de houder die de vleesextract oplossing geproduceerd. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig2.jpg" /> Figuur 2. Gemiddelde poliovirus Recovery (%) van de grond en reagens-Grade Water. Het gemiddelde percentage herstel wordt getoond voor poliovirus vanaf de grond ( <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig3.jpg" /> ; n = 4) en reagenskwaliteit water ( <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig4.jpg" /> ; n = 12) monsters. De twaalf reagenskwaliteit watermonsters omvatte zes bezaaid met 300 MPN en zes geënt met 1.000 MPN van poliovirus. Fout balken geven standaard fout.

Hier presenteren we een procedure om totale cultiveerbare virussen te meten met behulp van de Buffalo Green Monkey niercel lijn. De procedure biedt een gestandaardiseerd hulpmiddel voor het meten van het voorkomen van infectieuze virussen in milieu- en drinkwater.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in Water per cultuur en RT-qPCR. II. Totaal kweekbare Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

Het algemene doel van het volgende protocol is om het niveau van infectieuze virusdeeltjes in een watermonster te meten. Dit wordt bereikt door een alkalische extractieoplossing te gebruiken om negatief geladen virusdeeltjes te elueren van een elektropositief filter waarin virussen uit drinkwater of oppervlaktewater zijn geconcentreerd. Het opvangen van virussen op een elektropositieve cartridgefilter wordt behandeld in deel één van deze serie.Als tweede stap wordt de pH van het eluaat langzaam verlaagd, wat resulteert in de vorming van een vlok van deze extracteiwitten en het in het monster aanwezige virus. Vervolgens wordt de vlok verzameld door centrifugatie, opgelost in een natriumfosfaatbuffer en steriel gefiltreerd om bacteriën en schimmels te verwijderen. Daarna wordt het uiteindelijke geconcentreerde eluaat geïnoculeerd op niercellen van de groene buffelaap, en worden de cellen gedurende 14 dagen geobserveerd op cytopathisch effect, of CPE, om virusreplicatie aan te tonen.Om alle celgebonden viruspartikels vrij te laten, worden alle flessen met cellen na 14 dagen bevroren, of wanneer de CPE in een fles 75% of hoger is. Na een tweede en derde passage om te bevestigen dat de CPE het gevolg is van virusreplicatie, wordt een Most Probable Number-programma, of MPN-calculator, gebruikt om het meest waarschijnlijke aantal per liter van elk geanalyseerd monster te bepalen. Uiteindelijk biedt de totale kweekbare viruszuurcomponent van EPA-methode 1615 een maat voor het niveau van infectieuze viruspartikels in het watermonster.Deze assay voor het totale virusgehalte is slechts één onderdeel van EPA-methode 1615. De volledige methode meet de aanwezigheid van enterovirus en norovirus in drink- en oppervlaktewater. Eventuele virusbevindingen kunnen vervolgens worden gebruikt als inputgegevens om het risico van blootstelling aan deze virussen in drinkwater en recreatiewater te bepalen.Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het een enkele gestandaardiseerde aanpak biedt voor het meten van virussen in water. De aanpak is feitelijk gebaseerd op de Information Collection Rule-methode die in 1996 is gepubliceerd. Het belangrijkste probleem waar nieuwe gebruikers tegenaan lopen bij deze methode, is het vrijhouden van de BGM-cellijn van contaminatie en het interpreteren van CPE, oftewel cytopathische effecten.Shay Fout en ik zullen de elutie- en organische flocculatieprocedures demonstreren, gevolgd door de celkweektechniek. Om de eerste elutie uit te voeren, plaatst u 500 milliliters gebufferd 1,5% rund-extract op kamertemperatuur, pH 9.0, in een maatcilinder. Open vervolgens de behuizing van de filtercartridge en voeg voldoende rund-extract toe om het elektropositieve filter volledig te bedekken.Giet de rest van het rundersextract in een bekerglas. Plaats het deksel van de filterhouder terug. Na een contacttijd van één minuut wordt een peristaltische pomp en steriele slangen gebruikt om het rundersextract-oplossing in de houder, samen met het restant in het bekerglas, langzaam door het filter te leiden.Verzamel het eluaat in een steriel glazen bekerglas van 2 liter. Herhaal deze stappen met nog eens 500 milliliters gebufferd 1,5% rundvleesextract, maar gebruik nu een contacttijd van 15 minuten. Voeg het rundvleesextract van de tweede elutie toe aan het 2-liter bekerglas met het extract van de eerste elutie en voeg een steriele roerstaaf toe aan het bekerglas.Plaats het bekerglas met het eluaat op een roerplaat. Zet de plaat aan en verhoog de roersnelheid tot er een vortex wordt gevormd. Stel de pH van het eluaat langzaam in op 3,5 plus of min 0,1 door druppelgewijze toevoeging van 1,2 M zoutzuur, of HCl.Voeg het zuur druppelgewijs toe, aangezien een snelle toevoeging het virus zal inactiveren. Gedurende deze tijd zal het eluaat troebel worden, naarmate er een neerslag begint te vormen. Verlaag de mengsnelheid naar een langzame roerbeweging en blijf de pH van het eluaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur monitoren en handhaven op 3,5 plus of minus 0,1.Giet vervolgens de neergeslagen rundextractsuspensie in één of meer centrifugebuizen en centrifugeer 15 minuten bij 2.500 ×g bij vier graden Celsius. Haal de buizen uit de centrifuge en schenk het supernatant langzaam af om verlies van het gepelletteerde precipitaat te voorkomen. Het supernatant kan worden weggegooid.Voeg voor batches rundvleestract die binnen 5 minuten oplossen 30 milliliters 0,15 molair natriumfosfaat, pH 9,0, toe aan de centrifugebuis met het neerslag. Raadpleeg het tekstprotocol voor instructies over het oplossen van neerslagen die niet binnen vijf minuten oplossen. Roer 10 minuten nadat het neerslag volledig is opgelost.Verwijder vervolgens de roerstaf en centrifugeer het opgeloste precipitant gedurende 10 minuten bij 4.000 tot 10.000 ×g en vier °C. Giet het supernatant voorzichtig in een glazen bekerglas zonder de pellet te verstoren. Voeg een roerstaf toe aan het bekerglas en gooi de pellet weg.Plaats het bekerglas op een magnetische roerder en roer de oplossing. Voeg 1,2 molair HCl druppelsgewijs toe om de pH aan te passen naar een waarde tussen 7,0 en 7,5. Filtersteriliseer het supernatant door het te laten passeren door een steriliserend filter met een voorfilter dat is voorbehandeld met 15 milliliter gebufferd 1,5% beef extract, pH 7,0 tot 7,5.Raadpleeg het tekstprotocol om het analysemonstervolume, of S, voor alle testmonsters te berekenen. Bereken vervolgens het inoculumpolume door S door 10 te delen. Verdeel op basis van deze berekeningen het uiteindelijke geconcentreerde monstervolume, oftewel het monster dat na filtersterilisatie is verkregen, in drie submonsters, zoals beschreven in het tekstprotocol.Inoculeer voor elk testmonster 10 testvaten met een monolaag BGM-cellen met het volume van submonster één, gelijk aan het Inoculum Volume, samen met de controles van de assay voor de totale kweekbare virushoeveelheid. Bereid voor de Lab Fortified Blank en de Lab Fortified Sample Matrix verdunningen van 5, 25 en 125 keer met behulp van submonster drie en 0,15 molair natriumfosfaat, pH 7,0 tot 7,5, als verdunningsmiddel. Inoculeer, naast de vaten die zijn geïnoculeerd met onverdund submonster één, 10 gewassen celcultuur-testvaten voor elke verdunningsreeks, waarbij een Inoculum Volume per testvat wordt gebruikt.Verdeel het inoculum over het oppervlak van de celmonolagen door de vaten heen en weer te kantelen. Incubeer de testvaten gedurende 80-120 minuten bij kamertemperatuur op een mechanisch schudplatform met één tot vijf oscillaties per minuut, of door de vaten elke 15 tot 20 minuten te kantelen om elk aanwezig virus te laten adsorberen aan de cellen. Voeg vervolgens voorverwarmd onderhoudsmedium toe aan de testvaten, alvorens deze te incuberen bij 36,5 plus of min één graad Celsius.Controleer gedurende de eerste drie dagen elk testvat onder een microscoop op de verschijning van cytopathische effecten, en onderzoek ze daarna elke twee tot drie dagen tot dag 14. Plaats alle testvaten die meer dan 75% cytopathische effecten vertonen in een vriezer die is ingesteld op of onder -70 °C. Bevries na het onderzoek van de vaten op de laatste dag alle resterende culturen en de controles van de totale kweekbare viruskwantiteitsassay op of onder -70 °C.Ontdooi vervolgens alle culturen en filtreer meer dan 15% van het medium uit elk CPE-positief testvat door een steriliserend filter van 0,2 micron. De volgende stap is het uitvoeren van een tweede passage van alle eerste passage testvaten met behulp van gewassen BGM-nierceltestvaten. Doe dit door de nieuwe testvaten te inoculeren met een inoculatievolume dat 10% vertegenwoordigt van het ontdooide medium uit alle negatieve testvaten, alsook van het gefiltreerde medium van de positieve vaten.Herhaal de stappen die voor de eerste passage zijn uitgevoerd; vries elk testvat in dat negatief was bij de eerste passage en positief bij de tweede. Voer vervolgens een derde passage uit zoals beschreven voor de tweede passage, met uitsluitend de negatieve assay-controles en celculturen die negatief waren tijdens de eerste passage en positief in de tweede passage. Identificeer individuele testvaten als viruspositief wanneer ze cytopathische effecten vertonen in zowel de eerste als de tweede passage, of, in het geval waarin het cytopathische effect pas optreedt bij de tweede passage, in zowel de tweede als de derde passage.Gebruik de Most Probable Number Calculator van de U.S. Environmental Protection Agency met de standaardprogramma-instellingen zoals beschreven in het tekstprotocol om de virustiters van alle testmonsters te berekenen. Gebruik vervolgens de verkregen waarden voor het meest waarschijnlijke aantal infectieuze eenheden per milliliter, samen met de bovenste en onderste betrouwbaarheidsgrenzen per milliliter, om het meest waarschijnlijke aantal infectieuze eenheden per liter en de bijbehorende betrouwbaarheidsgrenzen te berekenen, zoals beschreven in het tekstprotocol. Het gemiddelde percentage terugwinning wordt weergegeven voor Poliovirus uit grond- en reagentiegrade watermonsters.De gemiddelde terugwinning van Poliovirus uit grondwatermonsters bedroeg gemiddeld 58% met een variatiecoëfficiënt van 79%. Er werd geen kweekbaar virus gedetecteerd in een van de dubbele, niet-geënt grondwatermonster-veldmonsters. De prestaties van de methode werden ook gemeten met behulp van Lab Fortified Blank-monsters, aangepast door twee verschillende entingsniveaus te gebruiken. De twaalf monsters van water van reagenskwaliteit bestonden uit zes monsters geënt met 300 MPN aan infectieuze eenheden en zes monsters geënt met 1.000 MPN aan infectieuze eenheden Poliovirus.Deze controles vertoonden een vergelijkbare prestatie, met een gemiddeld terugwinningspercentage van 111% en een variatiecoëfficiënt van 100%. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om aseptische technieken en goede laboratoriumpraktijken toe te passen om contaminatie van de monsters te voorkomen. Het is daarnaast belangrijk om te onthouden dat u bij het werken met virale pathogenen voorzorgsmaatregelen moet nemen, zoals het gebruik van handschoenen, telkens wanneer u deze procedure uitvoert. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het verdunnen van virussen en elektropositieve filters, en in het uitvoeren van organische flocculatie en celkweekassays.Naast deze procedure kunt u ook moleculaire assays uitvoeren om aanvullende virustypen te identificeren en te detecteren.

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

EPA-methode 1615 gebruikt een elektropositieve filter om enterovirussen en norovirusessen te concentreren in milieu- en drinkwater. Dit manuscript beschrijft de procedure voor het verzamelen van monsters voor analyse volgens Methode 1615.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. I. Het verzamelen van Virus Samples

Hier presenteren we een procedure om enterovirus en norovirus in milieu- en drinkwater te kwantificeren met behulp van reverse transcriptie-kwantitatieve PCR. De gemiddelde virusterugwinning uit grondwater met deze gestandaardiseerde procedure van EPA-methode 1615 was 20% voor poliovirus en 30% voor muur-norovirus.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. Deel III. Virus Detectie door RT-qPCR

Een op macrofoam gebaseerde bemonsteringsmethodologie werd ontwikkeld en geëvalueerd voor de detectie en kwantificering van norovirus op harde oppervlakken in het milieu.

Swab Sampling Methode voor de detectie van humane Norovirus op oppervlakken

Er werd een benadering ontwikkeld voor het identificeren van optimale virale concentratiecondities voor kleine watermonsters met behulp van spikes van humaan adenovirus. De hier beschreven technieken worden gebruikt om concentratieparameters voor andere virale doelen te identificeren en worden toegepast op grootschalige virale concentratie-experimenten.

Een klein volume Procedure voor Virale Concentratie van het Water

Dit manuscript beschrijft een duplex digitale PCR test die kan worden gebruikt om tegelijkertijd kwantificeren Enterococcus spp. En HF183 genetische merkers als indicatoren van algemene en menselijke-geassocieerde fecale besmetting in recreatiewater.

Een duplex digitale PCR test voor gelijktijdige kwantificering van de<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; En de Human Fecal-geassocieerde HF183 Marker in Waters

We introduceren de VacuSIP, een eenvoudige, niet-invasieve en betrouwbare methode voor schoon en nauwkeurig puntsampling van water. Het systeem werd ontwikkeld en geëvalueerd voor de gelijktijdige verzameling van het water dat wordt ingeademd en uitgeademd door benthische suspensie-voeders in situ, om de verwijdering en uitscheiding van deeltjes en opgeloste verbindingen schoon op te meten.

VacuSIP, een verbeterde INEX Methode voor het<em&gt; In Situ</em&gt; Meten van Particulate en opgeloste componenten verwerkt door Active Suspension Voeders

Deze paper meldt het protocol voor een snelle identificatie assay voor Bemisia tabaci gebaseerd op lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) technologie. Het protocol vereist minimale laboratorium opleiding en kan, daarom, ter plaatse op de punten van binnenkomst voor de plant invoer zoals zeehavens en luchthavens worden uitgevoerd.

Een lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) Assay voor snelle identificatie van Bemisia tabaci

Dit protocol diagnose Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia weefsels met behulp van de RT-PCR methodes. De hele methode is beschreven van weefsel dissectie totaal RNA extractie, gevolgd door de cDNA synthese en opsporing van TiLV door conventionele PCR of kwantitatieve PCR dsDNA bindend een bindende fluorescerende kleurstof gebruiken.

Detectie van Tilapia Lake Virus met behulp van conventionele rechts-PCR en SYBR groene RT-qPCR

Een microplot ontwerp voor 15N tracer onderzoek wordt beschreven om meerdere in-season plant en bodem bemonstering gebeurtenissen tegemoet te komen. Voor de analyse van 15 N worden bodem- en verwerkingsprocedures voor monsters, met inbegrip van slijp- en weegprotocollen, voor 15N-analyse naar voren gebracht.

Microplot Ontwerp en Plant en Bodem Monster Voorbereiding voor 15Stikstof Analyse

Leer het meten van infectieuze virussen in water volgens EPA-methode 1615 met behulp van Buffalo Green Monkey niercellen. Deze gestandaardiseerde aanpak kwantificeert virusdeeltjes via celkweek en MPN-berekening voor volksgezondheidsbeoordeling.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in Water per cultuur en RT-qPCR. II. Totaal kweekbare Virus Assay (Video) | JoVE Journal

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in Water per cultuur en RT-qPCR. II. Totaal kweekbare Virus Assay

Meer video's verkennen