Detectie van exosomaal Biomarker door Electric Field-geïnduceerde Release and Measurement (Efirm)

Het algemene doel van deze procedure is om exosomen efficiënt uit biovloeistoffen te extraheren, de lading van de exosomen vrij te maken en deze lading snel te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst exosomen uit biovloeistoffen te extraheren met behulp van magnetische micropartikels met targetingsantistoffen voor exosoommarkers, om vervolgens de geëxtraheerde exosomen op een elektrode-oppervlak te laden. Daarna wordt het exosoom gelyseerd met behulp van een elektrisch veld en wordt de lading van het exosoom gehybridiseerd met probes op het oppervlak van de elektrode.

Er wordt ook een reportermolecuul gehybridiseerd aan het systeem. De laatste stap is het toevoegen van een substraatoplossing aan het elektrode-oppervlak, waarna de uitlezing wordt verkregen door de elektrische stroom te meten. Uiteindelijk wordt elektrochemische stroommeting gebruikt om de hoeveelheid nucleïnezuren of eiwitgehalte in de exosoommonster aan te tonen.

Het belangrijkste voordeel van deze technologie ten opzichte van bestaande methoden, zoals ultracentrifugatie en het gebruik van lysinebuffer, is dat het een eenvoudige en snelle methode is voor het extraheren en testen van exosoominhoud. We zijn zeer enthousiast over deze technologie omdat deze efim-technologie ons voor het eerst in staat stelt om gebruik te maken van de informatie die door organen wordt afgegeven bij ziekte of in gezonde toestand, welke via de vasculatuur wordt getransporteerd en in onze mondholte terechtkomt. Deze technologie stelt ons in staat om deze informatie op te vangen en de moleculaire inhoud vrij te maken, die we gelijktijdig en op flexibele wijze kunnen detecteren.

Deze ziekte-discriminerende informatie. Over het algemeen kunnen gebruikers die nieuw zijn aan deze methode problemen ervaren, aangezien het gebruik van magnetische microdeeltjes lastig kan zijn als men niet voorzichtig is. Bovendien kan het gebruik van elektrochemische methoden bij de analyse van biologische monsters voor sommigen een nieuw paradigma zijn. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de handelingen met magnetische microdeeltjes en het laden op de elektroden moeilijk aan te leren zijn. Er moet speciale zorg worden betracht bij het hanteren van magnetische microdeeltjes en het laden ervan op de elektroden.

Begin met het resuspenderen van een stockoplossing die 10 µg/ml streptavidine-gecoate magnetische microdeeltjes bevat en voeg vijf µL van deze oplossing toe aan een microcentrifugebuis met 495 µL PBS om de beads te wassen. Plaats de buis vervolgens gedurende één minuut in een magneethouder en verwijder voorzichtig de buffer zonder de beads te verstoren.

Plaats de buis vervolgens in een niet-magnetisch rek. Voeg 500 µL PBS toe en spoel de beads door middel van pipetteren. Herhaal dit in totaal drie keer; gebruik na de laatste wasbeurt een centrifuge.

Suspendeer de beads in 490 µL PBS en voeg vervolgens vijf µL gebiotineerd muis anti-human CD 63 antilichaam toe vanuit een voorraadoplossing van 1 mg/mL. Meng de oplossing door te pipetteren; programmeer een monsterrotator voor een reciproque rotatie van 90 graden gedurende vijf seconden en vibratie van vijf graden gedurende één seconde. Plaats de buisjes in de rotator en voer het programma 30 minuten lang uit bij kamertemperatuur.

Plaats vervolgens de buisjes gedurende vijf minuten in het magnetische rek. Was de beads drie keer met 500 µL PBS en resuspendeer ze daarna in 490 µL PBS waarin Caine is opgelost. Label een buisje met de monsteridentificatie en voeg vervolgens 10 µL van het monster toe; pipetteer dit meerdere keren om het monster met de antilichaam-geconjugeerde beads te mengen.

Breng vervolgens de buisjes over naar de monsterrotator en voer hetzelfde programma twee uur lang uit bij kamertemperatuur. Was de beads daarna drie keer met 500 µL van een 1 M tris-hydrochloridebuffer. Met behulp van het magnetische rek zijn de exosomen nu gebonden aan de magnetische beads om de elektrode voor te bereiden.

Verdun eerst de voorraadreagentia van de probe, kaliumchloride en de ole-monomeer in gedestilleerd water. De biotinylated DNA-probe van vijf primeren is specifiek voor GA DH mRNA. Meng de monomeer-probeprul door middel van vortexen.

Gebruik een elektrode-array met 16 sensoren, waarbij elke enkelvoudige elektrode bestaat uit werk-, tegen- en referentie-elektroden van puur goud. Plaats een plastic well op de elektrode-array om kruiscontaminatie van de elektroden te voorkomen. Breng 60 µL van de monomeer-probetoplossing aan op het oppervlak van een gouden elektrode, zodat de werk-, tegen- en referentie-elektroden door de vloeistof worden bedekt.

Pas een cyclisch vierkante golf elektrisch veldprofiel toe, bekend als het A-C-S-W-E-veld, om een monomeer-sonde elektropolymerisatie te ondergaan. Dit creëert een geleidende polymeerlaag op het elektrode-oppervlak. Spoel de sensor drie keer af met gedestilleerd water en droog deze vervolgens met stikstofgas om vloeistof van het elektrode-oppervlak te verwijderen.

Nadat de elektrode is gefunctionaliseerd met de capture-probe, worden vijf µL van een 1 µM oplossing van de detector-probe toegevoegd aan 495 µL van de bead-exosoomcomplex-oplossing, waarna het mengsel door pipetteren wordt gemengd. De probe is een 3'-fluoresceïne-geconjugeerde DNA-primer die specifiek is voor GA dh. Plaats een gefunctionaliseerde elektrode-array over een magneet-array bestaande uit 16 magneten die zijn uitgelijnd met de werkelektroden van de sensor.

Breng vervolgens 60 µL van de exosoom-beadoplossing over naar het elektrode-oppervlak. Pas een A-C-S-W-E-veld toe gedurende 20 cycli. De vrijgekomen exosomale lading zal hybridiseren met de probe op het elektrode-oppervlak.

Spoel het elektrode-oppervlak drie keer af met gedestilleerd water om eventuele ongebonden analyten te verwijderen en droog de elektrode vervolgens met stikstofgas. Maak daarna een verdunning van 1:1000 van anti-fluoresceïne HRP-geconjugeerd antilichaam in PBS met Caseïne. Voeg vervolgens 60 µL van de antilichaamverdunning toe aan het elektrode-oppervlak.

Breng een A-C-S-W-E-veld aan op het elektrode-oppervlak om het anti-fluoresceïne HRP-antilichaam aan de detectorsonde te conjugeren. Spoel het sensoroppervlak drie keer met gedestilleerd water om overtollig antilichaam te verwijderen en droog de elektrode vervolgens met stikstofgas. Breng vervolgens met een multikanalenpipet 60 µL TMB-substraat aan op elk sensoroppervlak en meet met een elektrochemische potentiostaat de elektrodecurrent bij -200 mV gedurende 60 seconden.

Om de tric-uitlezing te verkrijgen, werd transmissie-elektronenmicroscopie gebruikt om te bepalen of exosomen gebonden waren aan de magnetische kraaltjes. De korrels met een grootte van 70 tot 100 nanometer die aan de kraaltjes vastzitten, zijn consistent met de bekende grootte van exosomen na lysis door het elektrische veld of detergent. Er zijn geen exosomen zichtbaar in de nabijheid van de kraaltjes.

GA DH mRNA in exosomen werd gedetecteerd via atric readout. De hoeveelheid aanwezige GA DH neemt na verloop van tijd af, zoals verwacht bij exosoomlyse door zowel het elektrische veld als detergent, wat wijst op blootstelling aan de extravesiculaire omgeving van het speeksel. Efim werd gebruikt om de exosomale inhoud van het serum en het speeksel te meten van muizen die waren geïnjecteerd met humane longkankercellen die een humane CD 63 GFP exosomale marker produceren.

Na 20 dagen werden hogere concentraties CD 63 GFP aangetroffen in zowel het serum als het speeksel van de muizen die waren geïnjecteerd met de kankercellen, maar niet bij de muizen die waren geïnjecteerd met zoutoplossing. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de kralen niet aangeraakt mogen worden bij het extraheren van een adequate hoeveelheid vloeistof tijdens het wassen van de kralen, om het elektrode-oppervlak uniform te reinigen en de regio's op de elektrode correct te laden. Deze technologie, deze efim-technologie, bood de cruciale, nog niet vervulde mogelijkheid om te bepalen hoe een systemische ziekte in een distaal orgaan informatie kan afscheiden en deze kan kwantificeren in deze entiteiten die exosomen worden genoemd.

Hoe ze in het speeksel, in onze mondholte terechtkomen en hoe het mogelijk is om exosomen op te vangen, deze moleculaire targets vrij te laten en hiermee gelijktijdig levensbedreigende ziekten, zoals diabetes, pancreascarcinoom of andere levensbedreigende aandoeningen, te detecteren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe exosomen snel uit een biofluid kunnen worden geëxtraheerd, hoe de cargo van de exosomen kan worden vrijgemaakt en hoe de inhoud van de exosomen snel kan worden geanalyseerd met behulp van een geïntegreerd electrodesysteem.