Name: Detectie van exosomaal Biomarker door Electric Field-geïnduceerde Release and Measurement (Efirm) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Leer een efficiënte methode voor exosoomextractie uit biofluïda met behulp van magnetische micropartikelen en elektrische velden voor snelle biomarkeranalyse. Deze techniek maakt elektrochemische detectie van RNA en eiwitten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het National Center for Research Resources en het National Center for Translational Voortschrijdende Wetenschappen, National Institutes of Health, door Grant UL1TR000124 (naar FW); het Felix &amp; Mildred Yip Endowed hoogleraarschap en het Fonds Barnes gezin (tot DTWW), het National Institute of Dental &amp; Craniofacial Onderzoek van de National Institutes of Health onder Award Aantal T90DE022734 (MT). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.

1. Magnetische Bead-gebaseerde exosome Extraction <ol><li> Pipetteer een goed gemengde oplossing van 5 ul van Streptavidine-gecoate magnetische microdeeltjes in 495 ui met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer in een microcentrifugebuis om de kralen resuspenderen. Was en resuspendeer de kralen met 500 pl PBS driemaal met een magnetische rek. Het rek is een array van magneten op de zijkant van een wooneenheid dat het monster reactievaatjes kan houden. <ol><li> Voor elke wasbeurt, laten we eerst de buizen zitten op het rek voor 1 min, en vervolgens met een pipet tip om de bovenstaande buffer voorzichtig te verwijderen zonder verstoring van de kralen. </li><li> Plaats de buizen regelmatig rooster zonder magneten aan de zijkant. Voeg 500 ul PBS in de buizen, en gebruik de pipet om de oplossing en kralen mengen. Dan zet de buizen weer op de magnetische rek de korrels opnieuw scheiden van de oplossing. </li><li> Voer deze verwijdering van de buffer via magnetisatie en resuspensie in PBS eenin totaal drie keer. Deze voert een eerste wasbeurt van de magnetische deeltjes. </li></ol></li><li> Resuspendeer de kralen in 490 pl PBS-buffer, met de buis die op de niet-gemagnetiseerde gedeelte van de magnetische rek. Pipetteer 5 ul gebiotinyleerd muis-anti-humaan CD63 antilichaam bij 1,0 mg / ml stock-concentratie in het mengsel van korrels. Gebruik de pipet om de kralen en antilichaam mengen in oplossing. </li><li> Plaats de microcentrifugebuizen met kralen en gebiotinyleerd antilichaam mengsel op een steekproef rotator. Stel de rotator parameters voor het monster rotator wederzijdse rotatie bij 90 ° kantelen gedurende 5 seconden en trillen bij 5 ° gedurende 1 sec. Draai de sample-kraal mengsel buizen bij deze parameters gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder ongebonden antilichaam na conjugatie. <ol><li> Na 30 min rotatie bij kamertemperatuur, zet de buizen terug in de magnetische rek voor 5 min. </li><li> Voer drie wassingen kralen door het verwijderen van de vloeibare fase met behulp van een micropipet en wassen met 500 μ, L PBS. Na de drievoudige wassen, resuspendeer de kralen in 490 ul van caseïne-PBS en plaats op de unmagnetized deel van het rack. </li></ol></li><li> Exosoom extractie met antilichaam beklede parels. <ol><li> Label elke buis met gerichte monster ID. Pipetteer een 10 ul monster van serum of speeksel in de microcentrifugebuisje. Gebruik de pipet om het monster en magnetische korrels meng door herhaaldelijk pipetteren. </li><li> Plaats de buizen met het monster en anti-humaan CD63 antilichaam kralen op rotator en roteer gedurende 2 uur bij KT. Gebruik dezelfde rotator parameters zoals beschreven in stap 1.2. </li><li> Na 2 uur van het monster te draaien, het uitvoeren van een triple wassen door magnetiseren aparte kralen uit de oplossing, het verwijderen van de vloeibare fase met micropipet, en resuspenderen kralen in 500 pi van Tris-HCl-buffer. De resulterende kralen zijn nu gebonden aan de exosomen en zijn klaar voor het elektrische veld vrijlating en meting. </li></ol></li></ol> 2. Elektrisch veld Induced Uitgebracht eennd Meting van exosomaal Content <ol><li> Initiële voorcoating van elektrode met GADPH Primer <ol><li> Breng een plastic goed op een elektrode array om kruisbesmetting van de individuele elektroden te voorkomen. Voor dit experiment werd een 16-sensor elektrodenarray bij elke eenheid elektrode in de reeks bestaande uit een werkende, tegen en referentie-elektrode van kale goud. </li><li> Bereid een voorraad mengsel van 100 nM DNA probe, 0,3 M KCl en 10 mM pyrrool pipetteren voorraad reagentia in een buis met ultrazuiver gedestilleerd water. Meng goed door vortexen. OPMERKING: Bij dit onderzoek werd de DNA probe gekozen overeenkomt met de GAPDH referentie gen, waarvan bekend is dat er in exosomes. De probe sequentie gebruikt: 5&#39;-biotine-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3 &#39;. Met dit mengsel op de elektroden. </li><li> Pipetteer 60 ul van de monomere DNA-probe mengsel op het oppervlak van elke goudelektrode. Onderzoek de elektroden om ervoor te zorgen dat er voldoende dekking van de arbeidersklasse, counter en referentie-elektroden door het vloeibare mengsel. </li><li> Electropolymerize monomeer-probe mengsel een geleidende polymeerlaag op het elektrodeoppervlak creëren door een cyclisch blokgolf (CSW) elektrisch veld profiel naar het elektrodeoppervlak. Deze elektrische veld omvat de toepassing +350 mV 9 seconden en onmiddellijk omschakelen naar 950 mV gedurende 1 sec. Breng deze cyclische blokgolf profiel de elektrode 10 cycli in totaal 100 sec aangelegd elektrisch veld. </li><li> Spoel sensoroppervlak 3 keer met gedestilleerd water en droog stikstofgas om vloeistof van het oppervlak van de elektrode te verwijderen. Zorg ervoor dat vloeistof goed is verwijderd uit de elektrode. </li></ol></li><li> Exosome lading lossen <ol><li> Laad 5 gl 1 uM van een detector sonde in 495 ul van de hiel-Exosoom mengsel en gebruik een pipet te mengen. OPMERKING: De detector probe een DNA primer sequentie geconjugeerd met fluoresceïne molecuul aan het 3 &#39;uiteinde. De detector probe sequentie die wordt gebruikt voor deze studie komt overeen met de GAPDH mRNA binnen exosomen. De sequentie van het fluoresceïne geconjugeerde detector probe: 5&#39;-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-fluoresceïne-3 &#39;. </li><li> Pipetteer 60 ul van de probe en bead-Exosoom mengsel op een gouden elektrode oppervlak met een magneetreeks eronder. Deze magneet array bestaat uit zestien 2.54 mm neodymium magneten afgestemd overeenkomt met de elektrodes van de sensor. Figuur 2A illustreert de plaatsing van de magneten en bead-exosome oplossing. </li><li> Eenmaal monster op het elektrodeoppervlak wordt geladen toepassen 20 cycli van het elektrisch veld CSW met 9 sec bij -300 mV en 1 s bij 200 mV (200 sec totaal). De exosomaal lading die vrijkomt zal hybridiseren met de primers op het oppervlak van de elektrode. Indien het oppervlak van markers van de exosome zijn onderwerp van onderzoek, sla dit gedeelte van het experiment. Figuur 2B illustreert dit proces. </li> &lt;li&gt; afspoelen ongebonden analyten op het elektrodeoppervlak door drievoudig spoelen het elektrodeoppervlak met gedestilleerd water. Droog de elektrode met stikstofgas. </li></ol></li><li> Reporter antilichaam en uitlezing <ol><li> Voeg 60 ul van 150 eenheden / ml anti-fluoresceïne antilichaam geconjugeerd aan mierikswortel peroxidase (HRP in 1: 1000 verdunning) verdund in caseïne / PBS. </li><li> Gebruik een elektrisch veld gedreven conjugatie complexe anti-fluoresceïne HRP aan de probe sandwich. Solliciteer -200 mV voor 1 sec en 500 mV voor 1 sec voor 5 cycli aan het oppervlak van de elektrode. Figuur 2A toont de vangst en de detector sonde complexen voor zowel een eiwit en nucleïnezuur systeem. </li><li> Triple wassen sensor oppervlak met behulp van gedestilleerd water en droog met stikstofgas. </li><li> Na het wassen-off van ongebonden overtollige anti-fluoresceïne antilichaam, voeg 60 ul van 3,3 &#39;, 5,5&#39;-Tetramethylbenzidine (TMB) substraat. Plaats dit substraat aan elke sensoroppervlak met een multichannel pipet. </li><li> Voer amperometrische aflezing van de stroom door meting van de elektrode stroom bij -200 mV gedurende 60 sec met een elektrochemische potentiostaat geschikt voor het gelijktijdig meten van 16 kanalen. Figuur 2C is een voorbeeld van stroomprofiel tijdens uitlezing. </li></ol></li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig2highres.jpg" /> Figuur 2. Componenten van Efirm methode. (A) Werkwijze voor het extraheren van exosomes Biofluid behulp van anti-humaan CD63 beklede magnetische microdeeltjes en vervolgens lossen exosome lading van cyclische vierkante golven aangebracht op het deeltje-Exosoom. (B) Regeling van de elektrode biosensor gebruikt voor het opsporen van RNA / DNA / eiwit targets uit de vrijgegeven exosome. (C) Representatief voorbeeld van ampèrometrische uitlezing van de Efirm methodiek, waar grotere stroom magnitude komt overeen to hogere niveaus van een biomolecuul. Dit cijfer komt uit Wei et al. 14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52439/52439fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

<ol><li>Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+MicroRNA%3A+A+Diagnostic+Marker+for+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomal MicroRNA: A Diagnostic Marker for Lung Cancer.</a> Clinical Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).</li>
<li>Thakur, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+DNA+in+exosomes%3A+a+novel+biomarker+in+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection.</a> Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).</li>
<li>Lau, C. S., Wong, D. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer+Exosome-like+Microvesicles+and+Salivary+Gland+Cells+Interplay+Alters+Salivary+Gland+Cell-Derived+Exosome-like+Microvesicles+In%5BTitle%5D)+AND+%22Vitro.+PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer Exosome-like Microvesicles and Salivary Gland Cells Interplay Alters Salivary Gland Cell-Derived Exosome-like Microvesicles In.</a> Vitro. PLoS ONE. 7 (3), e33037(2012).</li>
<li>Bala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+exosomes+indicate+hepatocyte+injury+and+inflammation+in+alcoholic%2C+drug-induced%2C+and+inflammatory+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatolog%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases.</a> Hepatolog. 56 (5), 1946-1957 (2012).</li>
<li>Dear, J. W., Street, J. M., Bailey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+exosomes%3A+A+reservoir+for+biomarker+discovery+and+potential+mediators+of+intrarenal+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Urinary exosomes: A reservoir for biomarker discovery and potential mediators of intrarenal signalling.</a> Proteomics. 13 (10-11), 1572-1580 (2013).</li>
<li>Lässer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+saliva%2C+plasma+and+breast+milk+exosomes+contain+RNA%3A+uptake+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages.</a> Journal of Translational Medicine. 9 (1), 9(2011).</li>
<li>Palanisamy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanostructural+and+Transcriptomic+Analyses+of+Human+Saliva+Derived+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes.</a> PLoS ONE. 5 (1), e8577(2010).</li>
<li>Camussi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%2Fmicrovesicles+as+a+mechanism+of+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication.</a> Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).</li>
<li>Lau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pancreatic+cancer-derived+exosomes+in+salivary+biomarker+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Role of pancreatic cancer-derived exosomes in salivary biomarker development.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26888-26897 (2013).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Exosomes+from+Cell+Culture+Supernatants+and+Biological+Fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 3 (22), (2001).</li>
<li>Park, N. J., Li, Y., Yu, T., Brinkman, B. M. N., Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+RNA+in+Saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of RNA in Saliva.</a> Clinical Chemistry. 52 (6), 988-994 (2006).</li>
<li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio%2FAbiotic+Interface+Constructed+from+Nanoscale+DNA+Dendrimer+and+Conducting+Polymer+for+Ultrasensitive+Biomolecular+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Bio/Abiotic Interface Constructed from Nanoscale DNA Dendrimer and Conducting Polymer for Ultrasensitive Biomolecular Diagnosis.</a> Small. 5 (15), 1784-1790 (2009).</li>
<li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+Sensor+for+Multiplex+Biomarkers+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Electrochemical Sensor for Multiplex Biomarkers Detection.</a> Clinical Cancer Research. 15 (13), 4446-4452 (2009).</li>
<li>Wei, F., Yang, J., Wong, D. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+exosomal+biomarker+by+electric+field-induced+release+and+measurement+%28EFIRM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (EFIRM).</a> Biosensors and Bioelectronics. 44, 115-121 (2013).</li>
</ol>

David Wong is mede-oprichter van RNAmeTRIX Inc., een moleculair diagnostisch bedrijf. PeriRx LLC sublicentie intellectuele eigendommen met betrekking tot de moleculaire diagnostiek van RNAmeTRIX. David Wong is een consultant te PeriRx.

Als resultaat geven, anti-humaan CD63 beklede magnetische nanodeeltjes kunnen bijzonder kleine deeltjes die een grootte variërend 70-100 nm vangen. Deze gevangen deeltjes is in overeenstemming met de eerder waargenomen profiel van exosomes. Bovendien wordt het gebruik van de laagspannings-CSW na het vangen van de deeltjes aangetoond dat ze van de kraal oppervlak te verwijderen en veroorzaken DNA degradatie dat overeenstemt met dat van een traditionele lysisbuffer methode voor lading release. Deze gegevens duiden erop da...

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>. The disclosures were updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>.

Errata: Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosome onderzoek is een opkomende gebied van onderzoek dat lipide microvesicles dat RNA 1, DNA 2, en eiwit 3 lading te vervoeren onderzoekt. Eerdere onderzoeken van exosome biologie hebben geleid tot de identificatie van exosomen in biovloeistoffen zoals bloed 4, 5 urine, moedermelk 6, en speeksel 7. Studies hebben aangetoond dat exosomes spelen een rol in verschillende cellulaire responsen op afstand mediteren communicatie tussen verschillende systemen van het lichaam 8. Vanwege de rol exosomes spelen bij intercellulaire communicatie, wordt verondersteld dat ze biomolecule targets (eiwit, RNA en DNA) gecorreleerd met ziektetoestanden kunnen verpakken. In vitro 3 en diermodel 9 studies lijken deze hypothese te bevestigen. Bij het onderzoek exosomaal inhoud ontwikkeling van biomerkers, moet een methode voor selectieve isolatie van exosome biovloeistoffen ontwikkelen geïnduceerde expulsiop van de lading van exosomen, en kwantificatie van exosome biomoleculen. In de omvang van deze werkzaamheden zal exosomes gedefinieerd als een structuur met een diameter van ongeveer 70-100 nm en bezitten oppervlaktemarker CD63. Onderzoekers normaliter eerst zuiveren exosomen door ultracentrifugeren 10 en dan verwerken exosomaal inhoud door het gebruik van lysebuffer kits. Gebruik lysisbuffer methoden vereist incubatietijden variëren van minuten tot uren. Dit proces kan in potentie schadelijk exosome lading en leiden tot degradatie proeven. Bijvoorbeeld, speeksel exosome RNA vrijkomt door lysis buffer in de omringende extracellulaire omgeving bezit een halfwaardetijd van minder dan 1 minuut, de meting van exosomaal RNA na lysis buffer bijzonder moeilijk zonder toevoeging van stabilisatie reagentia 11. De samengestelde effect van het toevoegen van verschillende reagentia voor lysis en stabilisatie kunnen middelen die compliceren voeren en interfereren met de analysis van exosomaal inhoud. Een alternatieve benadering kan nuttig zijn voor het snel lossen exosomaal inhoud en veilig bewaren van de lading voor het karakteriseren zijn. In dit werk, stellen wij het gebruik van een niet-uniform elektrisch veld voor de vrijlating van exosomaal inhoud. Elektrische velden is bekend dat het vermogen tot polariseren en verstoren de lipide dubbellaag die celmembranen vormt dragen. Onze experimentele werk onderzoekt het gebruik van niet-uniforme cyclische blokgolven (CSW) voor het verstoren van de microvesicle structuur van exosomen en het vrijgeven uitgevoerd lading. Deze methode maakt gebruik van spanningen in de honderden millivolt bereik, wat betekent dat de meeste biomoleculen niet worden verstoord. We tonen aan dat het gebruik van een cyclisch blokgolf kan afgifte van speeksel exosome mRNA gehalte bedienen in het omringende vloeibare omgeving. Deze versie van exosomaal inhoud naadloos geïntegreerd met een elektrode systeem dat kan worden gebruikt om de biomarker expressieniveaus kwantificeren 12,13. De voorgestelde werkwijze maakt snelle, gevoelige en lysis buffer vrij analyse van exosome inhoud. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig1highres.jpg" /> Figuur 1. Overzicht van Efirm Workflow.. De Efirm methode is in grote lijnen verdeeld in de drie grote fasen die nodig zijn voor het zuiveren en analyseren exosomen zijn. Deze CSW gebaseerd exosomaal inhoud vrijkomen en analyse methode wordt gebruikt in combinatie met CD63-specifieke magnetische microbolletjes voor exosome isolement. Deze CD63-affiniteitskorrels zorgen voor de selectieve isolatie van exosomen uit speeksel monsters (en andere biovloeistoffen). Na incubatie en extractie van exosomen gebruik de gemagnetiseerde kralen, zijn de kralen gemigreerd naar de elektrochemische sensor systeem voor de CSW gebaseerde inhoud vrijkomen en analyse deel van het experiment. Figuur 1 geeft een overzicht van het werkstromen van de Efirm methode.

<table><tbody><tr><td>Helios 16-Channel Reader System met Chip Interface&nbsp;</td><td>Genefluidics, USA</td><td>&nbsp;RS-1000-16</td><td></td></tr><tr><td>16x Sensor Chip, Bare Gold, pakket van 5 chips</td><td>Genefluidics, USA</td><td>SC1000-16X-B</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyleerde anti-menselijke CD63 Antilichaam</td><td>Ancell, USA</td><td>215-030</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Invitrogen, USA</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>Neodymium Magnetics (1/10" dia. x 1/32" dik)</td><td>K&amp;J Magnetics, USA</td><td>DH101</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazuiver Gedistilleerd Water</td><td>Life Technologies, USA</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Mettler Toledo 3 M KCl Oplossing</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>1911512</td><td></td></tr><tr><td>Pyrrole</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>W338605-100g</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fluoresceïne-POD, Fab fragmenten</td><td>Roche, Duitsland</td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;,5,5&prime;-tetramethylbenzidine substraat (TMB/H2O2, lage activiteit)</td><td>Neogen, USA</td><td>330175</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat Gebufferde Saline Oplossing</td><td>Life Technologies, USA</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Caseïne/PBS</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>37532</td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van exosomaal biomarker door electric field-geïnduceerde release and measurement (efirm)

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomen zijn microvesicular structuren die een bemiddelende rol in intercellulaire communicatie spelen. Het is van belang om de interne lading exosomes onderzoeken om te bepalen of ze dragen ziekte discriminerende biomarkers. Voor het uitvoeren exosomaal analyse moet een werkwijze voor het extraheren en analyseren exosomes van target biovloeistoffen zonder de interne inhoud te ontwikkelen. Elektrisch veld geïnduceerde vrijkomen en meting (Efirm) is een methode voor specifiek extraheren exosomen uit biovloeistoffen, lossen hun lading, en het testen van hun interne RNA / eiwitgehalte. Met behulp van een anti-humaan CD63 specifiek antilichaam magnetische microdeeltjes worden exosomes eerst geprecipiteerd uit biovloeistoffen. Na extractie, low-voltage elektrische cyclische blokgolven (CSW) worden toegepast op de vesiculaire membraan verstoren en leiden tot lading lossen. De inhoud van de exosome gehybridiseerd met DNA-primers of antilichamen geïmmobiliseerd op een elektrodeoppervlak voor quantification van moleculaire inhoud. De Efirm werkwijze is voordelig voor de extractie van exosomes en lossen van vracht analyse zonder lysis buffer. Deze methode is in staat om specifieke detectie van RNA en eiwit biomarker doelen in de exosoom. Efirm extracten exosomes precies gebaseerd op hun oppervlak markers tegenstelling maat gebaseerde technieken. Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) en test tonen de functionaliteit van de werkwijze voor exosoom acquisitie en analyse. De Efirm methode werd gebruikt voor analyse van 9 muizen geïnjecteerd met menselijke longkanker H640 cellen (een cellijn getransfecteerd met de humane exosoom marker CD63-GFP expressie) om hun exosome profiel testen tegen 11 muizen die zoutoplossing controles exosomaal. Verhoogde niveaus van exosomaal biomarkers (referentie-gen GAPDH en eiwitoppervlak marker menselijk CD63-GFP) werden gevonden voor de H640 geïnjecteerde muizen in zowel serum en speeksel. Bovendien saliva en serummonsters werden aangetoond lineariteit (R = 0,79) hebben. Deze resultaten zijn suggestief voor de levensvatbaarheid van speeksel exosome biomarkers voor detectie van distale ziekten.

Validatie van exosome Capture van Beads behulp TEM Isolatie van exosomen uit speeksel behulp van anti-humaan CD63 magnetische parels werd gevalideerd na extractie protocol door transmissie elektronenmicroscopie (TEM) beelden. TEM toont magnetische korrels met 70-100 nm korrels onmiddellijk grenzend (zie figuur 3A en 3B), consistent met het bekende profiel van exosomes. Nr 70-100 nm granules werden waargenomen voor de magnetische kralen in sp...

Exosomen zijn microvesiculaire structuren die in biovloeistoffen worden aangetroffen en mogelijk belangrijke, voor ziekten discriminerende biomarkers dragen. Hier wordt een nieuwe methode gebruikt om specifiek exosomen te extraheren en het exosomale geladene snel te testen op zowel RNA/eiwitdoelen na de verstoring van exosomen met behulp van niet-uniforme elektrische cyclische vierkante golven.

Detectie van exosomaal Biomarker door Electric Field-geïnduceerde Release and Measurement (Efirm)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Het algemene doel van deze procedure is om exosomen efficiënt uit biovloeistoffen te extraheren, de lading van de exosomen vrij te maken en deze lading snel te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst exosomen uit biovloeistoffen te extraheren met behulp van magnetische micropartikels met targetingsantistoffen voor exosoommarkers, om vervolgens de geëxtraheerde exosomen op een elektrode-oppervlak te laden. Daarna wordt het exosoom gelyseerd met behulp van een elektrisch veld en wordt de lading van het exosoom gehybridiseerd met probes op het oppervlak van de elektrode.Er wordt ook een reportermolecuul gehybridiseerd aan het systeem. De laatste stap is het toevoegen van een substraatoplossing aan het elektrode-oppervlak, waarna de uitlezing wordt verkregen door de elektrische stroom te meten. Uiteindelijk wordt elektrochemische stroommeting gebruikt om de hoeveelheid nucleïnezuren of eiwitgehalte in de exosoommonster aan te tonen.Het belangrijkste voordeel van deze technologie ten opzichte van bestaande methoden, zoals ultracentrifugatie en het gebruik van lysinebuffer, is dat het een eenvoudige en snelle methode is voor het extraheren en testen van exosoominhoud. We zijn zeer enthousiast over deze technologie omdat deze efim-technologie ons voor het eerst in staat stelt om gebruik te maken van de informatie die door organen wordt afgegeven bij ziekte of in gezonde toestand, welke via de vasculatuur wordt getransporteerd en in onze mondholte terechtkomt. Deze technologie stelt ons in staat om deze informatie op te vangen en de moleculaire inhoud vrij te maken, die we gelijktijdig en op flexibele wijze kunnen detecteren.Deze ziekte-discriminerende informatie. Over het algemeen kunnen gebruikers die nieuw zijn aan deze methode problemen ervaren, aangezien het gebruik van magnetische microdeeltjes lastig kan zijn als men niet voorzichtig is. Bovendien kan het gebruik van elektrochemische methoden bij de analyse van biologische monsters voor sommigen een nieuw paradigma zijn. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de handelingen met magnetische microdeeltjes en het laden op de elektroden moeilijk aan te leren zijn. Er moet speciale zorg worden betracht bij het hanteren van magnetische microdeeltjes en het laden ervan op de elektroden.Begin met het resuspenderen van een stockoplossing die 10 µg/ml streptavidine-gecoate magnetische microdeeltjes bevat en voeg vijf µL van deze oplossing toe aan een microcentrifugebuis met 495 µL PBS om de beads te wassen. Plaats de buis vervolgens gedurende één minuut in een magneethouder en verwijder voorzichtig de buffer zonder de beads te verstoren.Plaats de buis vervolgens in een niet-magnetisch rek. Voeg 500 µL PBS toe en spoel de beads door middel van pipetteren. Herhaal dit in totaal drie keer; gebruik na de laatste wasbeurt een centrifuge.Suspendeer de beads in 490 µL PBS en voeg vervolgens vijf µL gebiotineerd muis anti-human CD 63 antilichaam toe vanuit een voorraadoplossing van 1 mg/mL. Meng de oplossing door te pipetteren; programmeer een monsterrotator voor een reciproque rotatie van 90 graden gedurende vijf seconden en vibratie van vijf graden gedurende één seconde. Plaats de buisjes in de rotator en voer het programma 30 minuten lang uit bij kamertemperatuur.Plaats vervolgens de buisjes gedurende vijf minuten in het magnetische rek. Was de beads drie keer met 500 µL PBS en resuspendeer ze daarna in 490 µL PBS waarin Caine is opgelost. Label een buisje met de monsteridentificatie en voeg vervolgens 10 µL van het monster toe; pipetteer dit meerdere keren om het monster met de antilichaam-geconjugeerde beads te mengen.Breng vervolgens de buisjes over naar de monsterrotator en voer hetzelfde programma twee uur lang uit bij kamertemperatuur. Was de beads daarna drie keer met 500 µL van een 1 M tris-hydrochloridebuffer. Met behulp van het magnetische rek zijn de exosomen nu gebonden aan de magnetische beads om de elektrode voor te bereiden.Verdun eerst de voorraadreagentia van de probe, kaliumchloride en de ole-monomeer in gedestilleerd water. De biotinylated DNA-probe van vijf primeren is specifiek voor GA DH mRNA. Meng de monomeer-probeprul door middel van vortexen.Gebruik een elektrode-array met 16 sensoren, waarbij elke enkelvoudige elektrode bestaat uit werk-, tegen- en referentie-elektroden van puur goud. Plaats een plastic well op de elektrode-array om kruiscontaminatie van de elektroden te voorkomen. Breng 60 µL van de monomeer-probetoplossing aan op het oppervlak van een gouden elektrode, zodat de werk-, tegen- en referentie-elektroden door de vloeistof worden bedekt.Pas een cyclisch vierkante golf elektrisch veldprofiel toe, bekend als het A-C-S-W-E-veld, om een monomeer-sonde elektropolymerisatie te ondergaan. Dit creëert een geleidende polymeerlaag op het elektrode-oppervlak. Spoel de sensor drie keer af met gedestilleerd water en droog deze vervolgens met stikstofgas om vloeistof van het elektrode-oppervlak te verwijderen.Nadat de elektrode is gefunctionaliseerd met de capture-probe, worden vijf µL van een 1 µM oplossing van de detector-probe toegevoegd aan 495 µL van de bead-exosoomcomplex-oplossing, waarna het mengsel door pipetteren wordt gemengd. De probe is een 3'-fluoresceïne-geconjugeerde DNA-primer die specifiek is voor GA dh. Plaats een gefunctionaliseerde elektrode-array over een magneet-array bestaande uit 16 magneten die zijn uitgelijnd met de werkelektroden van de sensor.Breng vervolgens 60 µL van de exosoom-beadoplossing over naar het elektrode-oppervlak. Pas een A-C-S-W-E-veld toe gedurende 20 cycli. De vrijgekomen exosomale lading zal hybridiseren met de probe op het elektrode-oppervlak.Spoel het elektrode-oppervlak drie keer af met gedestilleerd water om eventuele ongebonden analyten te verwijderen en droog de elektrode vervolgens met stikstofgas. Maak daarna een verdunning van 1:1000 van anti-fluoresceïne HRP-geconjugeerd antilichaam in PBS met Caseïne. Voeg vervolgens 60 µL van de antilichaamverdunning toe aan het elektrode-oppervlak.Breng een A-C-S-W-E-veld aan op het elektrode-oppervlak om het anti-fluoresceïne HRP-antilichaam aan de detectorsonde te conjugeren. Spoel het sensoroppervlak drie keer met gedestilleerd water om overtollig antilichaam te verwijderen en droog de elektrode vervolgens met stikstofgas. Breng vervolgens met een multikanalenpipet 60 µL TMB-substraat aan op elk sensoroppervlak en meet met een elektrochemische potentiostaat de elektrodecurrent bij -200 mV gedurende 60 seconden.Om de tric-uitlezing te verkrijgen, werd transmissie-elektronenmicroscopie gebruikt om te bepalen of exosomen gebonden waren aan de magnetische kraaltjes. De korrels met een grootte van 70 tot 100 nanometer die aan de kraaltjes vastzitten, zijn consistent met de bekende grootte van exosomen na lysis door het elektrische veld of detergent. Er zijn geen exosomen zichtbaar in de nabijheid van de kraaltjes.GA DH mRNA in exosomen werd gedetecteerd via atric readout. De hoeveelheid aanwezige GA DH neemt na verloop van tijd af, zoals verwacht bij exosoomlyse door zowel het elektrische veld als detergent, wat wijst op blootstelling aan de extravesiculaire omgeving van het speeksel. Efim werd gebruikt om de exosomale inhoud van het serum en het speeksel te meten van muizen die waren geïnjecteerd met humane longkankercellen die een humane CD 63 GFP exosomale marker produceren.Na 20 dagen werden hogere concentraties CD 63 GFP aangetroffen in zowel het serum als het speeksel van de muizen die waren geïnjecteerd met de kankercellen, maar niet bij de muizen die waren geïnjecteerd met zoutoplossing. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de kralen niet aangeraakt mogen worden bij het extraheren van een adequate hoeveelheid vloeistof tijdens het wassen van de kralen, om het elektrode-oppervlak uniform te reinigen en de regio's op de elektrode correct te laden. Deze technologie, deze efim-technologie, bood de cruciale, nog niet vervulde mogelijkheid om te bepalen hoe een systemische ziekte in een distaal orgaan informatie kan afscheiden en deze kan kwantificeren in deze entiteiten die exosomen worden genoemd.Hoe ze in het speeksel, in onze mondholte terechtkomen en hoe het mogelijk is om exosomen op te vangen, deze moleculaire targets vrij te laten en hiermee gelijktijdig levensbedreigende ziekten, zoals diabetes, pancreascarcinoom of andere levensbedreigende aandoeningen, te detecteren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe exosomen snel uit een biofluid kunnen worden geëxtraheerd, hoe de cargo van de exosomen kan worden vrijgemaakt en hoe de inhoud van de exosomen snel kan worden geanalyseerd met behulp van een geïntegreerd electrodesysteem.

detection-exosomal-biomarker-electric-field-induced-release

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In this video, we demonstrate a procedure to isolate exosomes from target biofluids using magnetic microbeads. The procedure enables the rapid capture of exosomes, which can be used for downstream analysis.

Magnetic Bead-based Exosome Extraction: A Technique to Isolate Specific Exosomes from Biofluids

In dit artikel wordt een methode gepresenteerd voor het isoleren van exosomen uit vol bloed en verdere analyse door middel van nanodeeltjestracking met behulp van een semi-automatisch instrument. De gepresenteerde technologie biedt een uiterst gevoelige methode voor het visualiseren en analyseren van deeltjes in vloeibare suspensie.

Een innovatieve methode voor exosome kwantificering en Size Measurement

Extracellulaire vesicles spelen een belangrijke rol in fysiologische en pathologische processen, zoals coagulatie, immuunresponsen en kanker of als potentiële therapeutische middelen bij geneesmiddelafgifte of regeneratieve geneeskunde. Dit protocol geeft methoden voor de kwantificering en de grootte karakterisering van geïsoleerde en niet-geïsoleerde extracellulaire blaasjes in verschillende vloeistoffen met behulp van instelbare weerstand puls detectie.

Kwantificering en Maat-profilering van extracellulaire blaasjes behulp Melodieuze Resistive Pulse Sensing

In dit protocol beschrijven we de complete workflow voor snelle isolatie van extracellulaire blaasjes uit menselijk bloed en karakterisering van specifieke markers door fluorescentie-gebaseerde analyse van het nanoparticle-tracking. De gepresenteerde resultaten geven een hoge graad van reproduceerbaarheid en kunnen worden aangepast aan de cel cultuur supernatant.

Snelle fluorescentie gebaseerde karakterisering van één extracellulaire blaasjes in menselijk bloed met Nanoparticle-tracking analyse

De klinische vertaling van exosoom biomarkers voor zieke en kwaadaardige cellen wordt belemmerd door het ontbreken van snelle en accurate kwantificatie methoden. Dit rapport beschrijft het gebruik van low-vergroting Dark-Field Microscoop beelden te kwantificeren specifieke exosoom subtypen in kleine volume serum of plasma monsters.

Met behulp van Nanoplasmon-Enhanced verstrooiing en low-vergroting Microscoop Imaging te kwantificeren tumor-afgeleide Exosomes

We demonstreren hoe we een nieuw nanodeeltjesvolganalyse-instrument kunnen gebruiken om de grootteverdeling en de totale deeltjesconcentratie van extracellulaire blaasjes geïsoleerd uit perigonadaal vetweefsel van muizen en menselijk plasma te schatten.

Nanodeeltjes tracking analyse voor de kwantificering en groottebepaling van extracellulaire blaasjes

Dit artikel stelt een nieuwe generatie multiparametrische analytische platforms voor met een verhoogde doorvoer voor de karakterisering van extracellulaire vesikelsubsets. De methode is gebaseerd op een combinatie van multiplexed biosensing-methoden met metrologische en morfomechanische analyses door atomaire krachtmicroscopie, gekoppeld aan Raman-spectroscopie, om vesiculaire doelen te kwalificeren die vastzitten op een microarray-biochip.

Multimodaal analytisch platform op een multiplexed surface plasmon resonance imaging chip voor de analyse van extracellulaire vesikel subsets

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol dat in vitro beoordeling van de overvloed aan fluorescerend gelabelde microRNA's mogelijk maakt om de dynamiek van microRNA-verpakking en export naar extracellulaire vesikels (EV's) te bestuderen.

Volgen van miRNA-afgifte in extracellulaire blaasjes met behulp van flowcytometrie

Hier demonstreren we de karakteriseringsmethode voor extracellulaire blaasjes (EV's) verzameld uit biologische vloeistoffen, zoals tranen en speeksel, van menselijke proefpersonen. De scanner die bij deze methode wordt gebruikt, is in staat om het fenotype, de grootte en het totale aantal deeltjes van EV's van 1 μL van het monster te detecteren.

Karakterisering van extracellulaire blaasjes uit biologische vloeistoffen

Hier presenteren we een protocol om individuele kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) te analyseren met labelvrije oppervlakte-versterkte Raman-spectroscopie (SERS), waardoor minimaal invasieve ziektediagnostiek en beoordeling van sEV's als therapeutische toedieningsmiddelen mogelijk worden.

Onderzoek naar de toepassing van oppervlakteversterkte Raman Scattering-gebaseerde biosensing van individuele sEV's in ziektediagnose en therapieën

Leer een efficiënte methode voor exosoomextractie uit biofluïda met behulp van magnetische micropartikelen en elektrische velden voor snelle biomarkeranalyse. Deze techniek maakt elektrochemische detectie van RNA en eiwitten mogelijk.

Detectie van exosomaal Biomarker door Electric Field-geïnduceerde Release and Measurement (Efirm)

Meer video's verkennen