Ontwikkeling van inhibitoren van eiwit-eiwit interacties door middel van VERVANGEN: Toepassing op het ontwerp en de ontwikkeling van niet-concurrerende ATP CDK-remmers
October 26th, 2015
We beschrijven de implementatie van de REPLACE-strategie voor het targeten van eiwit-eiwitinteracties. REPLACE is een iteratieve strategie die synthetische en computationele benaderingen omvat voor de omzetting van geoptimaliseerde peptidische remmers in geneesmiddelachtige moleculen.
Het algemene doel van de strategie is om een effectief klein molecuul-achtig therapeutisch middel te genereren door omzetting van een peptide-remmer van een eiwit-eiwit interactie. Dit wordt bereikt door een structuur-activiteitsrelatie voor de gewenste peptide-eiwit interactie vast te stellen om te begrijpen welke delen effectief kunnen worden vervangen als tweede stap. Computationele chemie wordt gebruikt om haalbare fragmentalternatieven voor de bekende peptide determinanten te identificeren, die vervolgens kunnen worden gebruikt om een bibliotheek van fragment-peptide hybriden te synthetiseren.
Vervolgens wordt een bibliotheek van hybriden gesynthetiseerd tussen deze fragmenten en het geamputeerde peptide om moleculen te genereren die kunnen worden getest in een in vitro-assay om moleculen te identificeren die meer lijken op geneesmiddelen en die de activiteit van het native peptide nabootsen. De resultaten laten zien dat meer geneesmiddel-achtige verbindingen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van de methodologie, en deze vertegenwoordigen effectieve uitgangspunten voor de ontdekking van remmers van eiwit-eiwit interacties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals high throughput screening is dus dat eiwit-eiwit interacties uiterst uitdagend zijn vanuit het oogpunt van geneesmiddelontdekking, en conventionele methoden werken niet goed.
De vervangstrategie omvat een stapsgewijze iteratieve aanpak en kan daarom langer duren of op lange termijn waarschijnlijk effectiever zijn. Vandaag zal ik de meeste procedures zelf demonstreren met enige hulp van mijn medewerker, Dr. Sandra Craig, die enkele van de reacties en procedures zal opzetten. Begin deze procedure met validatie van het dockingprotocol, gevolgd door voorbereiding van de receptorbindingsplaats en liganden zoals beschreven in het tekstprotocol om de liganden in de Cycline a-groef te docken.
Selecteer eerst de ligandfit-routine uit het receptor-ligandinteractieprotocol dat in de software is ingesteld, gebruik de receptor en de voorbereide liganden als invoer voor dit protocol. Selecteer voor deze runs PLP one als de energiegrid. De energiegrid die door het dockingprogramma wordt gebruikt, is de krachtveld voor het genereren van ligand-receptorinteracties en potentiële poses.
Plp one is peace wise linear potential, die specifiek voorrang geeft aan waterstofbindinginteracties. Geef op dat poses energie geminimaliseerd moeten worden en het aantal gegenereerde poses op 10. Laat alle andere parameters in eerste instantie op de standaardwaarden staan.
Toon poses in het visualizer-programma en sorteer vervolgens op afnemende waarden van de PLP one-score. Gebruik scorefuncties zoals plp, one om de bindingsaffiniteit van een gedockt ligand te schatten op basis van een kandidaat-ligandpose, geometrie en niet-covalente interactie met de doelreceptorstructuur. Analyseer visueel de top 25% van de gescoorde poses voor super onmogelijkheid met de bekende afsluitgroep.
Observeer ook of de pose de interactiefilters heeft vervuld, die zijn ingesteld om atomaire beperkingen op te nemen die intermoleculaire contacten vereisen die bekend zijn als kritiek voor binding en/of die nodig zijn om de potentiële afsluitgroep in de juiste geometrie voor amidebindingsvorming te positioneren. Bekijk ten slotte poses op visuele complementariteit, die wordt gedefinieerd als het efficiënt vullen van de bindingszak op een manier die consistent is met bekende structuur-activiteit. Relaties voor de synthese van end capping groepen, gebruik alle commerciële uitgangsmaterialen, oplosmiddelen en reagentia en synthetiseer door conventionele synthetische organische chemie.
Voer dunne laagchromatografie of TLC uit op silicagel voor het bewaken van reacties door eerst het uitgangsmateriaal en reactiemengsel op te lossen in de mobiele fase. Breng vervolgens het opgeloste uitgangsmateriaal en reactiemengsel op de TLC-plaat aan met behulp van capillaire buisjes. Plaats de TLC-plaat in de kamer met de mobiele fase.
Zodra de mobiele fase 90% van de TLC-plaat bereikt, verwijder en laat de plaat aan de lucht drogen. Gebruik UV-licht om het uitgangsmateriaal en reactiemengsels te detecteren als zichtbare vlekken. Bereken vervolgens de RF van elke vlek, dat is de verhouding van de afgelegde afstand door de vlek en de mobiele fase.
Plaats vervolgens het reactiemengsel in een scheidingskolven en was het met aqueuze zuur- of baseoplossing, zoals passend. Verzamel het organische oplosmiddel en verdampt het in een rotatievevaporator voordat het wordt gedroogd. Het ruwe product dat onder vacuüm wordt verkregen, lost 500 milligram ruw product op in drie tot vijf milliliters geschikt oplosmiddel en wordt toegevoegd aan een silica of RP 18-monster voordat het onder lucht wordt gedroogd, plaats een monster met het ruwe product in silica, omgekeerde fase snap cartridges.
Zuiver het ruwe materiaal met behulp van geautomatiseerde hoge prestatie-flitschromatografie. Gebruik een snap 100 gram kolom met een gradiënt. Laat over 15 kolomvolumes lopen.
Droog het gezuiverde product dat is verzameld in oplosmiddel uit flitschromatografie met behulp van een rotatievevaporator door alle oplosmiddel tot droogheid te verdampen. Droog het product vervolgens verder onder vacuüm om alle resterende oplosmiddelen te verwijderen. Voer karakterisering uit van het gezuiverde product door NMR MS en analytische HPLC zoals beschreven in het tekstprotocol om end-capped fragment, geligeerde remmende peptiden of flip-assemblee te synthetiseren.
Eindig peptische verbindingen door standaard vaste fasesynthesemethoden. Activeer vijf equivalenten van het C-terminale aminozuur in 4,4 equivalenten HBTU in twee milliliters DIMETHYLFORMAMIDE of DMF gedurende vijf minuten. Laad het mengsel op rinkhars met behulp van zes equivalenten di-isopropyl ethyl amine gedurende één uur bij kamertemperatuur.
Verwijder de FM-beschermingsgroep van de C-terminale rest met behulp van 20%INE in drie milliliters DMF gedurende 10 minuten. Koppel vervolgens aminozuren stap voor stap bij elke stap. Koppel vijf equivalenten van het volgende aminozuur met behulp van zes equivalenten DI-isopropyl, ethyl amine en 4,4 equivalenten HBTU in twee milliliters DMF gedurende één uur bij kamertemperatuur.
Bij kamertemperatuur, pas wascycli toe na aminozuurkoppeling en FM D-beschermingsstappen na peptidesamenstelling. Koppel N-cappinggroepen met behulp van zes equivalenten DI-isopropyl, ethyl amine en 4,4 equivalenten HBTU
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft de REPLACE-strategie voor het targeten van eiwit-eiwit interacties, met als doel peptideremmers om te zetten in geneesmiddelachtige moleculen. De methodologie combineert synthetische en computationele benaderingen om geneesmiddelontdekking te verbeteren.
Belangrijke onderdeelcomponenten van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Geneesmiddelontdekking
- Eiwit-eiwit interacties
- Computationele chemie
Achtergrond
- Eiwit-eiwit interacties zijn uitdagende doelen voor geneesmiddelontdekking.
- Conventionele methoden zoals high throughput screening falen vaak in dit gebied.
- Peptideremmers kunnen dienen als startpunten voor de ontwikkeling van kleine moleculaire therapieën.
- De REPLACE-strategie heeft als doel de geneesmiddelachtige eigenschappen van deze remmers te verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Effectieve kleine moleculaire geneesmiddelen genereren van peptideremmers.
- Structuur-activiteitsrelaties vaststellen voor peptide-eiwit interacties.
- Haalbare fragmentalternatieven identificeren voor bekende peptide determinanten.
Gebruikte methoden
- Vaststellen van structuur-activiteitsrelaties.
- Computationele chemie voor fragmentidentificatie.
- Synthese van een bibliotheek van fragment peptide hybriden.
- In vitro assays om de geneesmiddelachtige eigenschappen van gesynthetiseerde moleculen te testen.
Belangrijkste resultaten
- Meer geneesmiddelachtige verbindingen werden geïdentificeerd met behulp van de REPLACE-methodologie.
- Deze verbindingen vertegenwoordigen effectieve startpunten voor geneesmiddelontdekking.
- De aanpak overwint beperkingen van traditionele high throughput screening methoden.
Conclusies
- De REPLACE-strategie verbetert het potentieel voor het ontwikkelen van remmers van eiwit-eiwit interacties.
- Deze methode biedt een systematische aanpak voor geneesmiddelontdekking.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om therapeutische opties verder te verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
The REPLACE strategy addresses a critical bottleneck in oncology drug discovery by enabling the conversion of peptide-based protein-protein interaction inhibitors into drug-like small molecules. This approach expands the targetable space for cyclin-dependent kinases (CDKs), which are frequently deregulated in cancer and represent high-value therapeutic targets. By improving the drug-like properties of peptide inhibitors targeting the cyclin binding groove, the method supports early-stage target validation and lead identification efforts in oncology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by validating the cyclin binding groove as a druggable site for selective CDK inhibition.
- Operational Value: Provides a systematic workflow for structure-activity relationship mapping to identify key residues amenable to replacement with fragment-like moieties.
- Predictive Value: Generates starting compounds with improved drug-likeness that recapitulate peptide inhibitor activity, supporting preclinical de-risking of CDK2/cyclin A interactions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces fragment peptide hybrid libraries suitable for in vitro fluorescence polarization binding assays to quantify competitive binding at the cyclin binding groove.
- Operational Value: Establishes a reproducible synthesis and purification protocol using standard organic chemistry techniques, enabling scalable generation of analogs.
- Assay Readiness: Delivers compounds with defined binding poses and interaction filters that can be used to establish robust, quantitative screening assays for downstream hit-to-lead campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Supports progression from biochemical inhibition to cellular context by yielding compounds that inhibit cell cycle CDK/cyclin complexes, linking target engagement to phenotypic outcomes.
- Preclinical Alignment: Focuses on non-ATP competitive inhibition, offering a mechanistic avenue to avoid kinase domain selectivity challenges associated with ATP-competitive CDK inhibitors.
- Risk Mitigation: Enables early assessment of binding mode conservation and interaction fingerprints, reducing uncertainty in target engagement prior to cellular efficacy testing.
Pipeline & Workflow Integration
The REPLACE strategy fits within the early discovery continuum, bridging peptide-based target validation and small molecule lead generation for oncology targets like CDKs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven validation of protein-protein interfaces by converting peptide inhibitors into synthetically tractable, drug-like molecules.
- Screening: Enables assay-ready compound libraries with measurable binding affinity and defined structure-activity relationships for hit identification.
- Analytics: Relies on docking scores, interaction filters, and visual complementarity assessments to prioritize compounds with favorable binding geometry and non-covalent interactions.
- Translational Research: Connects biochemical binding data to functional inhibition of CDK/cyclin complexes, supporting alignment with cell-based readouts.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular, iterative framework applicable to other protein-protein interactions beyond CDKs, promoting platform-like utilization across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target confidence by enabling structure-guided optimization of protein-protein interaction inhibitors with defined binding modes.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized computational docking, fragment library synthesis, and purification protocols.
- Strategic Value: Increases predictive confidence in early-stage projects by reducing reliance on empirical screening for challenging targets.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of CDK inhibitors by providing early chemical matter with validated target engagement and improved drug-like properties.
Implementation Considerations
- Requires expertise in computational chemistry for docking protocol validation and pose analysis using energy minimization and scoring functions.
- Depends on access to standard synthetic organic chemistry infrastructure for peptide assembly, fragment ligation, and purification via flash chromatography.
- Necessitates cross-team alignment between modeling, synthesis, and assay teams to ensure consistency in fragment selection and hybrid library design.
- Involves adaptation considerations when applying the strategy to different protein-protein interfaces, particularly in defining interaction filters and capping group geometries.
- Practical limitations include the iterative nature of the approach, which may require multiple cycles of design, synthesis, and testing to achieve optimal drug-like properties.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:57
Computational Identification of Potential Small Molecule Capping Groups
4:03
Synthesis of Potential N-capping Groups
6:25
Solid Phase Synthesis for the Generation of FLIPs
8:45
Results: Identification of More Drug-like Inhibitors of CDK2 through the Cyclin Groove
9:59
Conclusion
