Ontwikkeling van inhibitoren van eiwit-eiwit interacties door middel van VERVANGEN: Toepassing op het ontwerp en de ontwikkeling van niet-concurrerende ATP CDK-remmers

Het algemene doel van de strategie is om een effectief klein molecuul-achtig therapeutisch middel te genereren door omzetting van een peptide-remmer van een eiwit-eiwit interactie. Dit wordt bereikt door een structuur-activiteitsrelatie voor de gewenste peptide-eiwit interactie vast te stellen om te begrijpen welke delen effectief kunnen worden vervangen als tweede stap. Computationele chemie wordt gebruikt om haalbare fragmentalternatieven voor de bekende peptide determinanten te identificeren, die vervolgens kunnen worden gebruikt om een bibliotheek van fragment-peptide hybriden te synthetiseren.

Vervolgens wordt een bibliotheek van hybriden gesynthetiseerd tussen deze fragmenten en het geamputeerde peptide om moleculen te genereren die kunnen worden getest in een in vitro-assay om moleculen te identificeren die meer lijken op geneesmiddelen en die de activiteit van het native peptide nabootsen. De resultaten laten zien dat meer geneesmiddel-achtige verbindingen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van de methodologie, en deze vertegenwoordigen effectieve uitgangspunten voor de ontdekking van remmers van eiwit-eiwit interacties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals high throughput screening is dus dat eiwit-eiwit interacties uiterst uitdagend zijn vanuit het oogpunt van geneesmiddelontdekking, en conventionele methoden werken niet goed.

De vervangstrategie omvat een stapsgewijze iteratieve aanpak en kan daarom langer duren of op lange termijn waarschijnlijk effectiever zijn. Vandaag zal ik de meeste procedures zelf demonstreren met enige hulp van mijn medewerker, Dr. Sandra Craig, die enkele van de reacties en procedures zal opzetten. Begin deze procedure met validatie van het dockingprotocol, gevolgd door voorbereiding van de receptorbindingsplaats en liganden zoals beschreven in het tekstprotocol om de liganden in de Cycline a-groef te docken.

Selecteer eerst de ligandfit-routine uit het receptor-ligandinteractieprotocol dat in de software is ingesteld, gebruik de receptor en de voorbereide liganden als invoer voor dit protocol. Selecteer voor deze runs PLP one als de energiegrid. De energiegrid die door het dockingprogramma wordt gebruikt, is de krachtveld voor het genereren van ligand-receptorinteracties en potentiële poses.

Plp one is peace wise linear potential, die specifiek voorrang geeft aan waterstofbindinginteracties. Geef op dat poses energie geminimaliseerd moeten worden en het aantal gegenereerde poses op 10. Laat alle andere parameters in eerste instantie op de standaardwaarden staan.

Toon poses in het visualizer-programma en sorteer vervolgens op afnemende waarden van de PLP one-score. Gebruik scorefuncties zoals plp, one om de bindingsaffiniteit van een gedockt ligand te schatten op basis van een kandidaat-ligandpose, geometrie en niet-covalente interactie met de doelreceptorstructuur. Analyseer visueel de top 25% van de gescoorde poses voor super onmogelijkheid met de bekende afsluitgroep.

Observeer ook of de pose de interactiefilters heeft vervuld, die zijn ingesteld om atomaire beperkingen op te nemen die intermoleculaire contacten vereisen die bekend zijn als kritiek voor binding en/of die nodig zijn om de potentiële afsluitgroep in de juiste geometrie voor amidebindingsvorming te positioneren. Bekijk ten slotte poses op visuele complementariteit, die wordt gedefinieerd als het efficiënt vullen van de bindingszak op een manier die consistent is met bekende structuur-activiteit. Relaties voor de synthese van end capping groepen, gebruik alle commerciële uitgangsmaterialen, oplosmiddelen en reagentia en synthetiseer door conventionele synthetische organische chemie.

Voer dunne laagchromatografie of TLC uit op silicagel voor het bewaken van reacties door eerst het uitgangsmateriaal en reactiemengsel op te lossen in de mobiele fase. Breng vervolgens het opgeloste uitgangsmateriaal en reactiemengsel op de TLC-plaat aan met behulp van capillaire buisjes. Plaats de TLC-plaat in de kamer met de mobiele fase.

Zodra de mobiele fase 90% van de TLC-plaat bereikt, verwijder en laat de plaat aan de lucht drogen. Gebruik UV-licht om het uitgangsmateriaal en reactiemengsels te detecteren als zichtbare vlekken. Bereken vervolgens de RF van elke vlek, dat is de verhouding van de afgelegde afstand door de vlek en de mobiele fase.

Plaats vervolgens het reactiemengsel in een scheidingskolven en was het met aqueuze zuur- of baseoplossing, zoals passend. Verzamel het organische oplosmiddel en verdampt het in een rotatievevaporator voordat het wordt gedroogd. Het ruwe product dat onder vacuüm wordt verkregen, lost 500 milligram ruw product op in drie tot vijf milliliters geschikt oplosmiddel en wordt toegevoegd aan een silica of RP 18-monster voordat het onder lucht wordt gedroogd, plaats een monster met het ruwe product in silica, omgekeerde fase snap cartridges.

Zuiver het ruwe materiaal met behulp van geautomatiseerde hoge prestatie-flitschromatografie. Gebruik een snap 100 gram kolom met een gradiënt. Laat over 15 kolomvolumes lopen.

Droog het gezuiverde product dat is verzameld in oplosmiddel uit flitschromatografie met behulp van een rotatievevaporator door alle oplosmiddel tot droogheid te verdampen. Droog het product vervolgens verder onder vacuüm om alle resterende oplosmiddelen te verwijderen. Voer karakterisering uit van het gezuiverde product door NMR MS en analytische HPLC zoals beschreven in het tekstprotocol om end-capped fragment, geligeerde remmende peptiden of flip-assemblee te synthetiseren.

Eindig peptische verbindingen door standaard vaste fasesynthesemethoden. Activeer vijf equivalenten van het C-terminale aminozuur in 4,4 equivalenten HBTU in twee milliliters DIMETHYLFORMAMIDE of DMF gedurende vijf minuten. Laad het mengsel op rinkhars met behulp van zes equivalenten di-isopropyl ethyl amine gedurende één uur bij kamertemperatuur.

Verwijder de FM-beschermingsgroep van de C-terminale rest met behulp van 20%INE in drie milliliters DMF gedurende 10 minuten. Koppel vervolgens aminozuren stap voor stap bij elke stap. Koppel vijf equivalenten van het volgende aminozuur met behulp van zes equivalenten DI-isopropyl, ethyl amine en 4,4 equivalenten HBTU in twee milliliters DMF gedurende één uur bij kamertemperatuur.

Bij kamertemperatuur, pas wascycli toe na aminozuurkoppeling en FM D-beschermingsstappen na peptidesamenstelling. Koppel N-cappinggroepen met behulp van zes equivalenten DI-isopropyl, ethyl amine en 4,4 equivalenten HBTU