Name: Ontwikkeling van inhibitoren van eiwit-eiwit interacties door middel van VERVANGEN: Toepassing op het ontwerp en de ontwikkeling van niet-concurrerende ATP CDK-remmers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Leer de REPLACE-strategie voor het ontwikkelen van remmers van eiwit-eiwitinteracties met behulp van computationele chemie en fragmentgebaseerde synthese. Deze methode helpt onderzoekers bij het ontwerpen van drugachtige moleculen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dr’s. Douglas Pittman en Michael Wyatt voor hun hulp bij celkweek en Dr Wyatt en mevrouw Erin Anderson voor hun hulp bij de ontwikkeling van de bindingsassays. We erkennen Mike Walla en Bill Cotham in het Department of Chemistry and Biochemistry aan de University of South Carolina voor hun hulp bij massaspectrometrie, Helga Cohen en Dr. Perry Pellechia voor NMR-spectrometrie. Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health via de onderzoeksprojectsubsidie, 5R01CA131368.

1. Computational identificatie van potentiële Small Molecule Afdekken Groepen Opmerking: in principe een grote docking of farmacofoor zoekmethoden worden gebruikt om potentiële capping groepen voorspellen. Het hoofddoel van computationele studie REPLACE is om kleine moleculen die de functies en interacties van de aminozuren die gesubstitueerd behouden te identificeren. <ol><li> Validatie van de LigandFit docking protocol 14 </li></ol> Opmerking: In eerdere studies, de docking werkwijze (LigandFit 15, een module in de moleculaire modeling programma suite, Discovery Studio 3,0) werd gevalideerd dat dit algoritme voldoende is om binding vormen van bekende Ncaps reproduceren en te tonen dat de resultaten verkregen voor onbekende verbindingen predictief 14. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Met behulp van de volgende stappen (1,2-1,5), te identificeren optimale parameters voor LigandFit als volgt: PLP1 energy grid voor pose generatie, minimalisering van de gegenereerde poses en de PLP1 scoren functie voor de analyse van de poses. </li><li> Om de verkregen conformaties beperken en liganden passende positie voor de vorming van covalente binding in de afgedekte peptide, stel de indool- stikstof en de amide-stikstofatomen van Trp217 en Gln254 respectievelijk interactie filters voor waterstofbinding. </li><li> Ontwerp en de dock een bibliotheek van fragment alternatieven in de CDK2 / cycline A receptor (2UUE). Prioriteren potentiële aftopping groepen voor synthese en commerciële inkoop op basis van PLP1 scoren, interacties met interactie filters en complementariteit met het CBG. De verschillende stappen voor LigandFit docking zijn als volgt. </li></ol><ol start="2"><li> Bereiding van receptorbindingsplaats 14 <ol><li> Importeer de CDK2 / cycline A kristalstructuur (pdb id: 2UUE) in een visualisatie venster in de software. Deze structuur bevat de eerder geïdentificeerde FLIP 5-methyl-1-fenyl-1H-1, 2,4-triazool-3-carboxamido (3,5-DCPT) RLIF gebonden aan cycline groef (figuur 3). </li><li> Verwijderen of in de plaats van de resten RLIF (C-terminus) te houden. Wanneer de peptidesequentie wordt vastgehouden, met de N-terminale aminogroep van het peptide een interactie filter voor de ligand. Uit de &quot;Receptor-ligand interacties&quot; gereedschappen, het creëren van een sfeer rond de N-cap 3,5-DCPT van Show / Hide website bol. De bol is gemaakt om het actieve gebied in de bindingsplaats waar de ligand-receptor interacties mogen optreden tijdens binding te definiëren. </li><li> Definieer de bindingsplaats verder van het &quot;vinden plaats het volume van geselecteerde ligand&quot; en verwijder het ligand 3,5- DCPT van het eiwit. Voer deze stap om het volume te binden binnen de bol gemaakt definiëren. </li><li> Stel het indoolstikstofatoom en amide-stikstofatomen van de resten Trp217 en Gln254 de interactie filters voor waterstofbinding. Stel de interactie filters, zodat alleen de poses die interact met de atomen van de set residuen worden gefilterd tijdens het docking proces dan ook het behoud van belangrijke interacties in de aangemeerd poses. </li></ol></li><li> Bereiding van liganden 14 <ol><li> Ontwerp een bibliotheek van 100 mogelijke capping groepen op basis van criteria waaronder molecuulgewicht lager dan 500, de aanwezigheid van een carboxylaatgroep voor ligatie met het afgeknotte peptide en opnemen van geschikte hydrofobe groepen (gesubstitueerde fenylgroep) Van der Waals interactie in de secundaire zak als Tabel 1. </li><li> Selecteer heterocyclische ringen voor het nabootsen van peptide waterstofbruggen interacties met Trp217 en substituenten inbegrepen voor het vervangen van ion-paring interacties van elementaire zijketens van de HAKRRLIF. Dok de liganden respectieve aldehyde moleculen zodat de carbonyl zuurstof kan communiceren met het amide stikstofatoom van Gln254 Soortgelijke peptideskelet in het ouder peptide (tabel 1). </li><li> Voorafgaand aan dockoning, minimaliseren ontworpen liganden aan een lage energie conformatie en voor te bereiden op een geschikte ionisatie toestand met behulp van de &quot;Bereid liganden&quot; protocol. Tekenen en deze potentiële N-caps in de .sdf bestandsindeling ChemDraw voor een spreadsheet exporteren voorafgaand aan in de software worden geïmporteerd. Opmerking: Bereid liganden protocol wordt gebruikt om alle liganden te minimaliseren worden gedokt in de laagste energietoestanden en de ionisatie lasten werden toegepast op de toepasselijke atomen. Default parameters worden gebruikt voor deze stap. </li></ol></li><li> Couperen van de liganden in de Cycline A Groove 14 <ol><li> Selecteer de LigandFit routine van receptor-ligand interacties protocol set van de software. Gebruik de receptor en de liganden bereid als input voor dit protocol. </li><li> Voor deze runs select PLP1 als energienet, aangeven dat vormt zijn energie tot een minimum beperkt en dat het aantal gegenereerde poses als 10. Laat alle andere parameters op de standaardwaarden. Opmerking: LigandFit isdocking methode die poses hoge complementariteit en mogelijke affiniteit kunnen identificeren en genereren de actieve plaats van een eiwit met een vorm gebaseerd vergelijking filter dat wordt gecombineerd met een Monte Carlo conformationele zoekalgoritme. De energienet gebruikt door het docking-programma is het krachtenveld voor het genereren van ligand-receptor interacties en mogelijke poses. PLP1 is stuksgewijs lineaire potentiaal specifiek prioriteit waterstofbruggen en waarbij het PLP atoom type wordt toegewezen voor elk niet-waterstof atoom of ligand niet- waterstofatomen receptor atoom. </li></ol></li><li> Analyse van de resultaten <ol><li> In eerste instantie weergave stelt in de visualizer programma en vervolgens sorteren op dalende waarden van de PLP1 score. Gebruik scoring functies zoals PLP1 het schatten van de bindingsaffiniteit van een gekoppelde ligand op basis van een kandidaat ligand vormen geometrie en non-covalente interactie met het doelwit receptorstructuur. Let op: Hier werd de PLP1 scoring functie gevonden give de beste resultaten als deze een schatting van waterstofbinding. </li><li> Analyseer visueel de top 25% van de ingesneden poses voor 1) superimposability de bekende capping groep (met een relatieve gemiddelde kwadratische afwijking (RMSD) waarde kleiner dan 2 A), 2) voldaan interactie filters en 3) visueel complementariteit met het cycline groef . Het is in dat aanvaard een correct gedokt vormen (in vergelijking met een experimentele structuur) heeft een RMSD waarde van &lt;2 Å. </li><li> Onderzoek poses voor visuele complementariteit die wordt begrensd efficiënte vulling van de bindingsplaats op een wijze die consistent is met bekende structuur-activiteitsrelaties. Interactie filters worden ingesteld atoom beperkingen die intermoleculaire contacten bekend kritisch voor het binden en / of nodig zijn om de potentiële capping groep positie in de juiste geometrie voor de vorming amidebinding worden gevraagd zijn. Drie voorbeelden van aangemeerd poses van de potentiële-N aftopping groepen die waterstofbruggen met interaction filters worden weergegeven in figuur 4. </li></ol></li></ol> 2. Synthese en karakterisering van potentiële N -capping Groepen <ol start="1"><li> Synthese van N-kapgroepen. </li><li> Synthese Gebruik alle commerciële uitgangsmaterialen, oplosmiddelen en reagentia verkregen. Synthesize potentiële N-kapgroepen met gebruikelijke synthetische organische chemie (figuur 5 12,13 voor een voorbeeld). </li><li> Voer dunnelaagchromatografie (TLC) op silicagel toezicht reacties. <ol><li> Los het uitgangsmateriaal en reactiemengsel (1 mg) in de mobiele fase en spot ze op de TLC-plaat door middel van capillaire buisjes. </li><li> Plaats de DLC-plaat in de kamer die mobiele fase (ethylacetaat en hexaan in een verhouding 35:65). Zodra de mobiele fase 90% van de TLC-plaat bereikt, te verwijderen en de lucht drogen van de plaat. </li><li> Met UV-licht om het uitgangsmateriaal en reactiemengsels detecteren zichtbare vlekken. Calkeningen de Rf van alle plekken (verhouding van afgelegde afstand door de plek en de mobiele fase). Opmerking: De reactie is volledig wanneer er geen gebrek gezien bij de Rf van het uitgangsmateriaal. </li></ol></li><li> Na voltooiing van de reactie opgewerkt het reactiemengsel door in een scheidtrechter en gewassen met waterig zuur of base oplossing geschikt. Verzamel de organische oplosmiddel verdampen in rotatieverdamper droog en het ruwe product verkregen onder vacuüm. </li><li> Los 500 mg ruw product in 3-5 ml geschikt oplosmiddel en toevoegen van een 1 g silica of RP18 samplet en droog onder lucht. Plaats de samplet met het ruwe product in de silica / RP SNAP flash patronen en zuiveren van het ruwe materiaal met behulp van geautomatiseerde high performance flash-chromatografie (volgens het protocol van de fabrikant) gebruik van een SNAP 100 g kolom met een gradiënt run vanaf 6% ethylacetaat: 94 % hexanen tot 50% ethylacetaat en 50% hexaan in15 kolomvolumes. </li><li> Droog het gezuiverde product in oplosmiddel vanuit flashchromatografie met behulp van een rotatieverdamper verdampen van de oplosmiddelen tot droog en het product verder gedroogd onder vacuüm om alle resterende oplosmiddelen te verwijderen. Voer karakterisering van het gezuiverde product door NMR, MS en analytische HPLC. <ol><li> Voor 1H NMR en 13C NMR, weegt ongeveer 10 mg van het gezuiverde monster oplossen in een geschikt gedeutereerde oplosmiddel en breng de inhoud ervan een droge NMR-buis voor het opnemen van de NMR-spectra 2,14. </li><li> Noteer de 1H NMR en 13C NMR spectra met een hoog veld NMR Spectrometer (minimaal 300 MHz). Verwerven massaspectra met een QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight massaspectrometer), elektrospray ionisatie (ESI) of een VG 70S (Double-focus sector massa magnetische spectrometer, EI) 2,14. </li><li> Analyseer de zuiverheid van producten door HPLC met een diode array detector en voorzieneen C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 urn kolom voor analyse. Gebruik een gradiënt run vanaf 100% water (0,1% trifluorazijnzuur) tot 60% acetonitril (0,1% trifluorazijnzuur) meer dan 30 minuten en houd de gradiënt voor 4 min. Pak de chromatogrammen op 226 en 254 nm 2,14. Opmerking: Analytische zuiverheden geëvalueerde verbindingen waren&gt; 95%. </li></ol></li></ol> 3. vastefasesynthese voor de opwekking van Flips 2 <ol start="1"><li> Synthese van N-bedekte Flips <ol><li> Assembleren N-bedekte peptide verbindingen via standaard vaste-fase synthese methoden met behulp van de volgende stappen. <ol><li> Activeren 5 equivalenten van het C-terminale aminozuur (Fmoc-Phe) in 4,4 equivalenten O -Benzotriazole- N, N, N &#39;, N&#39;-tetramethyl-uronium-hexafluor-fosfaat (HBTU, 221,93 mg) in 2 ml DMF gedurende 5 min. Laad de Fmoc-Phe HBTU mengsel op de Rink hars met 6 equivalenten van diisopropylethylamine (DIPEA, 103,13mg) gedurende 1 uur bij KT. </li><li> Verwijder de Fmoc beschermende groep van het C-terminale rest met behulp 20% piperidine in 3 ml DMF gedurende 10 min. Paar daaropvolgende aminozuren (bijvoorbeeld Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg-PMC) stap voor stap. Bij elke stap 5 equiv partner van het volgende aminozuur behulp 6 equivalenten DIPEA (103,13 mg) en 4,4 equivalenten HBTU (221,93 mg) in 2 ml DMF gedurende 1 uur bij KT. </li><li> Breng wascycli (5 x 10 ml DMF + 5 x 10 ml DCM) na aminozuur- koppeling en Fmoc ontscherming bovenbeschreven stappen. Na peptide montage paar N-kapgroepen behulp 6 equivalenten DIPEA (103,13 mg) en 4,4 equivalenten HBTU (221,93 mg) in 2 ml DMF gedurende 1 uur bij KT. </li><li> Na voltooiing van assemblage peptide behandelen van het reactiemengsel met 2 ml van de splitsing mengsel (90: 5: 5 TFA / H2O / TIPS) O / N om zijketens te verwijderen beschermende groepen en splitsen klapt uit de hars. Vermaal het verkregen product met koude diethylether om te precipiteren en if nodig concentraat in een roterende verdamper. </li></ol></li></ol></li><li> Synthese van N-bedekte-C-capped Flips <ol><li> Weeg en los het N-eindstandig afgedekte beschermde Arg-Leu peptide (16,1 mg, 0,02 mmol) in dichloormethaan en voeg [4- (3-chloorfenoxy) pyridin-2-yl] methaanamine (C-cap) met O - benzotriazole- N, N, N &#39;, N&#39; tetramethyluroniumhexafluorfosfaat (HBTU, 16,7 mg, 0,02 mmol) en N, N-diisopropylethylamine (DIPEA, 6,5 mg, 0,02 mmol). </li><li> Roer en bewaken van de reactie bij kamertemperatuur totdat TLC / HPLC geeft het volledige verbruik van uitgangsmateriaal. Na voltooiing van de reactie geconcentreerd het ruwe reactiemengsel met een rotatieverdamper en verdeel tussen ethylacetaat en water. </li><li> Scheid de waterige en de organische laag; Was de organische laag met 1 N NaOH, 1 N HCl en pekel. Droog de organische laag met ongeveer 1 g natriumsulfaat en concentreren het product rotatieverdamper. Finally behandel het product O / N bij de splitsing mengsel (95: 2,5: 2,5 trifluorazijnzuur / H 2 O / TIPS) voor ontscherming. </li><li> Vermaal het verkregen product met koude diethylether en eventueel concentraat rotatieverdamper drooggedampt voltooien om alle oplosmiddel te verwijderen. Verdere het product gedroogd onder vacuüm om alle resterende oplosmiddelen te verwijderen. </li></ol></li><li> Zuivering en karakterisering van Flips <ol><li> Zuiver ruwe Flips met semi preparatieve reverse-fase HPLC methoden. Lyofiliseren het gezuiverde salto&#39;s en karakteriseren hun moleculaire massa met behulp van massaspectrometrie 2,14. </li><li> Bepaal de analytische zuiverheid van de flips door HPLC met een diode array detector en uitgerust met een C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 urn kolom. Gebruik gradientmethode vanaf 95% H2O (0,1% trifluorazijnzuur) / 5% acetonitril (0,1% trifluorazijnzuur) naar 35% H2O (0,1% trifluorazijnzuur) / 65% acetonitril (0,1% trifluoroacetic zuur) meer dan 30 minuten en houd de gradiënt voor 4 min. Extract chromatogrammen bij 226 en 254 nm. </li></ol></li></ol> 4. Fluorescentie Polarisatie bindingsbepaling voor het bepalen van competitieve binding 2,14 <ol start="1"><li> Voer de test in zwart 384 putjes (138 ui) platen met de volgende procedure. </li><li> Verdun de monsters tracer peptides (4 nM), en kinasecomplexen (CDK2 / cycline A - 18 gg / ml, CDK4 / cycline D - 37 gg / ml) om de gewenste concentraties in testbuffer (25 mM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0,01% Nonidet P-40, 1 mM dithiothreitol (DTT). </li><li> Aan elk putje van de 384-well plate, voeg 5 ul CDK4D1 of CDK2CA (0,3 ug / putje gezuiverd recombinant humaan kinase complex), 5 ui verbinding, oplossing, 5 ui 30 nM tracer peptide (fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val Lys-Arg-Arg-Leu- (3ClPhe) -Gly of fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Phe-Gly tracer peptide). Gebruik 5 pi van elke DMSO (6%), buffer, tracer en 5 gl DMSO (6%), kinase complex, als tracer controleputjes </li><li> Na de toevoeging van alle componenten, Centrifugeer de plaat bij 500 rpm gedurende 1 min (41,16 x g) bij kamertemperatuur en vervolgens incubeer de plaat met roeren gedurende 45 min bij kamertemperatuur. Met een multimode plaatlezer en detector voorzien van 485 nm / 535 nm excitatie / emissie filters en dichroïsche spiegel lezen van de fluorescentie-intensiteit van elk putje in de plaat. </li><li> Bereken het relatieve gemiddelde polarisatie (mp) van de monsters met behulp van de onderstaande vergelijking tonen. Bepaal IC 50 waarden logaritmische regressie door het correleren relatieve mps en het testen van concentraties. </li></ol><img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/52441/52441eq1.jpg" />

<ol><li>Andrews, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REPLACE%3A+a+strategy+for+iterative+design+of+cyclin-binding+groove+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">REPLACE: a strategy for iterative design of cyclin-binding groove inhibitors.</a> Chembiochem. 7, 1909-1915 (2006).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Non-ATP+Competitive+CDK%2FCyclin+Groove+Inhibitors+through+REPLACE-Mediated+Fragment+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Optimization of Non-ATP Competitive CDK/Cyclin Groove Inhibitors through REPLACE-Mediated Fragment Assembly.</a> J Med Chem. 56, 1573-1582 (2013).</li>
<li>McInnes, C. Chapter 29. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcInnes%2C+C+%22Annual+Reports+in+Medicinal+Chemistry%22">Annual Reports in Medicinal Chemistry</a>. Bernstein, M., Desai, P. 47, Elsevier. 459-474 (2012).</li>
<li>Bower, J. F., Pannifer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fragment-based+technologies+to+target+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Using fragment-based technologies to target protein-protein interactions.</a> Curr Pharm Des. 18, 4685-4696 (2012).</li>
<li>Makley, L. N., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+number+of+%27druggable%27+targets%3A+non-enzymes+and+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+biology%2C+and+drug+design%22%5BJournal%5D)">Expanding the number of 'druggable' targets: non-enzymes and protein-protein interactions.</a> Chemical biology, and drug design. 81, 22-32 (2013).</li>
<li>Walensky, L. D., Bird, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrocarbon-Stapled+Peptides%3A+Principles%2C+Practice%2C+and+Progress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrocarbon-Stapled Peptides: Principles, Practice, and Progress.</a> J Med Chem. , (2014).</li>
<li>Shapiro, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin-dependent+kinase+pathways+as+targets+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment.</a> J Clin Oncol. 24, 1770-1783 (2006).</li>
<li>Thais, M., Sielecki, J. F. B., Enfield, P. A., Trainor, G. l <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+dependant+kinase+inhibitors%3A+Useful+targets+in+cell+cycle+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">Cyclin dependant kinase inhibitors: Useful targets in cell cycle regulation.</a> Journal of medicinal chemistry. 43, 1-18 (2000).</li>
<li>Morphy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectively+nonselective+kinase+inhibition%3A+striking+the+right+balance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Selectively nonselective kinase inhibition: striking the right balance.</a> J Med Chem. 53, 1413-1437 (2010).</li>
<li>Chen, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+killing+of+transformed+cells+by+cyclin%2Fcyclin-dependent+kinase+2+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Selective killing of transformed cells by cyclin/cyclin-dependent kinase 2 antagonists.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4325-4329 (1999).</li>
<li>Orzaez, M., Gortat, A., Mondragon, L., Bachs, O., Perez-Paya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-noncompetitive+inhibitors+of+CDK-cyclin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">ATP-noncompetitive inhibitors of CDK-cyclin complexes.</a> ChemMedChem. 4, 19-24 (2009).</li>
<li>Kontopidis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+cyclin+groove+recognition%3A+complex+crystal+structures+and+inhibitor+design+through+ligand+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Insights into cyclin groove recognition: complex crystal structures and inhibitor design through ligand exchange.</a> Structure. 11, 1537-1546 (2003).</li>
<li>McInnes, C., Andrews, M. J., Zheleva, D. I., Lane, D. P., Fischer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidomimetic+design+of+CDK+inhibitors+targeting+the+recruitment+site+of+the+cyclin+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Current+medicinal+chemistry.+Anti-cancer+agents%22%5BJournal%5D)">Peptidomimetic design of CDK inhibitors targeting the recruitment site of the cyclin subunit.</a> Current medicinal chemistry. Anti-cancer agents. 3, 57-69 (2003).</li>
<li>Premnath, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragment+based+discovery+of+arginine+isosteres+through+REPLACE%3A+towards+non-ATP+competitive+CDK+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic%2C+and+medicinal%22%5BJournal%5D)">Fragment based discovery of arginine isosteres through REPLACE: towards non-ATP competitive CDK inhibitors.</a> Bioorganic, and medicinal. 22, 616-622 (2014).</li>
<li>Venkatachalam, C. M., Jiang, X., Oldfield, T., Waldman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LigandFit%3A+a+novel+method+for+the+shape-directed+rapid+docking+of+ligands+to+protein+active+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Graph+Model%22%5BJournal%5D)">LigandFit: a novel method for the shape-directed rapid docking of ligands to protein active sites.</a> J Mol Graph Model. 21, 289-307 (2003).</li>
<li>Mendoza, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+cyclin-dependent+kinase+2%2Fcyclin+A+antagonists+that+differ+from+ATP+site+inhibitors+block+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Selective cyclin-dependent kinase 2/cyclin A antagonists that differ from ATP site inhibitors block tumor growth.</a> Cancer Res. 63, 1020-1024 (2003).</li>
<li>Denizot, F., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+colorimetric+assay+for+cell+growth+and+survival.+Modifications+to+the+tetrazolium+dye+procedure+giving+improved+sensitivity+and+reliability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability.</a> J Immunol Methods. 89, 271-277 (1986).</li>
<li>Zheleva, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+potent+p21%28WAF1%29-derived+peptide+inhibitors+of+CDK-mediated+pRb+phosphorylation%3A+delineation+and+structural+insight+into+their+interactions+with+cyclin+A%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+peptide+research+%3A+official+journal+of+the+American+Peptide+Society%22%5BJournal%5D)">Highly potent p21(WAF1)-derived peptide inhibitors of CDK-mediated pRb phosphorylation: delineation and structural insight into their interactions with cyclin A.</a> The journal of peptide research : official journal of the American Peptide Society. 60, 257-270 (2002).</li>
<li>Ivanov, A. A., Khuri, K. F. R., Fu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein-protein+interactions+as+an+anticancer+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Targeting protein-protein interactions as an anticancer strategy.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 34, (2013).</li>
<li>Thayer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+and+Engineering+News%22%5BJournal%5D)">Improving peptides.</a> Chemical and Engineering News. 89, 13-20 (2011).</li>
<li>Yin, H., Hamilton, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+targeting+protein-protein+interactions+with+synthetic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Strategies for targeting protein-protein interactions with synthetic agents.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 44, 4130-4163 (2005).</li>
<li>Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+and+drug+discovery+for+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Structural biology and drug discovery for protein-protein interactions.</a> Trends Pharmacol Sci. 33, 241-248 (2012).</li>
<li>Cannon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmaceutics+and+drug+delivery+aspects+of+heme+and+porphyrin+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Pharmaceutics and drug delivery aspects of heme and porphyrin therapy.</a> J Pharm Sci. 82, 435-446 (1993).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Targeting van eiwit-eiwitinteracties (PPI) bij medicijnontdekking is zeer uitdagend omdat deze doorgaans een groot, ondiep contactoppervlak omvatten dat bestaat uit talrijke en diffuse contacten19. Bovendien zijn peptidische verbindingen die PPI's remmen die geschikt zijn voor medicijnontdekking problematisch vanwege hun hogere molecuulgewicht, metabole instabiliteit en slechte biologische beschikbaarheid20. Huidige strategieën die zijn toegepast voor de ontwikkeling van PPI-remmers omvatten het ont...

In dit artikel wordt een case study van de toepassing van de REPLACE (vervangen met gedeeltelijke ligand alternatieven met behulp van computationele verrijking) strategie om peptidische remmers van eiwit-eiwit interacties te zetten in meer farmaceutisch relevante moleculen beschreven 1-3. Terwijl PPI&#39;s vertegenwoordigen een rijke maar onderbenut bron van potentiële drug targets, bestaande methoden zijn grotendeels onvoldoende om deze op grote schaal toegankelijk te maken. De huidige strategieën waaronder fragment based design 4, high-throughput screening 5 en geniete peptiden 6 verstrekte voorschotten, maar deze zijn in veel gevallen niet effectief. Hierdoor meer vooruitgang en efficiëntere benadering vereist. REPLACE is volledig gevalideerd in de ontwikkeling van kinaseremmers die drug-achtige eigenschappen zijn verbeterd en hebben potentieel voor verdere ontwikkeling als anti-tumor therapieën. Deze strategie is geïllustreerd in de ontwikkeling van niet-ATP remmers celcycle CDKs en gaat als volgt: 1) het verkrijgen van 3D structurele gegevens over de interactie van HAKRRLIF / RRLIF het cycline bindende groef; 2) het bepalen van de belangrijke determinanten voor binding peptide interactie; 3) afknotting van het peptide N-terminus bevattende een of meer bindende determinanten; 4) computationele identificatie van potentiële kleine molecule alternatieven (gedeeltelijke ligand alternatieven, PLA) voor het afgeknotte deel van het peptide en die te behouden belangrijke interacties van de ouder peptide; 5) synthese of commerciële inkoop van Plas voorspeld te gretig te binden met de subsite eerder door de verwijderde peptide residu (s) bezet; 6) synthese van flips door middel van ligatie van de beste PLA om het afgeknotte peptide met vastefasesynthese; 7) het testen van klapt in een in vitro binding of functionele test (fluorescentie polarisatie in de CDK / cycline context) gevolgd door verdere karakterisering in cellevensvatbaarheid assay. Een schematische weergave van VERVANGEN strategy is weergegeven in figuur 1. In dit artikel worden iteraties van REPLACE strategie besproken en de toepassing CDK2 / cycline A beschreven. CDK&#39;s zouden direct of indirect gedereguleerd in de meeste tumoren en worden derhalve geacht passend kanker drug targets 7. CDKs vereisen samenwerking met cyclinen voor volledige activering en vervolgens fosforyleren belangrijkste eiwitten die betrokken zijn bij de celcyclus regulatie 8. De twee grote groepen van CDKs zijn de isotypen dat celcyclus controleposten controle [G1 / S (CDK4 / Cycline D, CDK6 / cycline D en CDK4 / cycline E), S-fase (CDK2 / cycline A) en G2 / M (CDK1 / cycline B)] en de toezichthouders van de RNA-polymerase door middel van fosforylering (cdk7 / cycline H, CDK8 / cycline C, CDK9 / cycline T). Een belangrijke stap in de S-fase progressie optreedt wanneer de transcriptiefactor E2F1 gecomplexeerd het DP-eiwit dat vervolgens bindt aan DNA en initieert gentranscriptie. CDK2 / cycline A is vereist om transcriptie te neutraliseren E2F1activiteit door middel van fosforylering hetgeen leidt tot loslaten van de E2F1-DP complex en de daaropvolgende degradatie. Remming van CDK2 / cycline A wordt aangenomen dat E2F1 in zijn DNA gebonden toestand leidt tot aanhoudende activatie handhaven. De resulterende mate van E2F-1 activiteit de drempel moeten p53 onafhankelijke apoptose induceert dus duidt op een therapeutische strategie overtreffen. Door gedereguleerd p53 en pRb pathways, hoge niveaus van E2F-1 regelmatig optreden in kankercellen en remming van CDK2 / cycline A moet leiden tot selectieve apoptose in tumoren en kan worden beschouwd als een gevalideerde kanker doelwit 7. Onderzocht CDK remmers klinisch richten de sterk geconserveerde ATP-bindingsplaats leidt tot de reactiviteit steken van de meer dan 500 eiwitkinasen in de menselijke kinome en mogelijk aanleiding geven tot effecten en toxiciteit 9 zijkant. Een alternatieve benadering is niet ATP-competitieve remming door zich te richten werving substraat door het CBGaanwezig op positieve regulerende cycline subunit en dat derhalve gescheiden en op afstand van ATP bindingsplaats 10,11. Het CBG is vooral een hydrofoob groef aanwezig cycline A, cycline D en cycline E en blijkt een consensussequentie in substraten en tumor suppressors herkennen. Aangezien een geïsoleerd peptide, het cycline bindende motief (CBM) bindt aan het CBG en is aangetoond dat kinaseactiviteit van de celcyclus CDK&#39;s remmen. De CBM is geoptimaliseerd om een octapeptide (HAKRRLIF, CDK2 / cycline A IC50 0,07 ± 0,02 uM, CDK4 / cycline D, IC 50 0,88 ± 0,34 uM) en voorts afgeknotte een pentapeptide die een goed compromis tussen moleculaire gewicht voor drugs- gelijkenis en potentie (RRLIF, CDK2 / cycline A IC 50 1,01 ± 0,17 uM, CDK4 / cycline D, IC 50 25.12 ± 2.97 uM) 12,13. Het CBGS bestaat uit een grote primaire en secundaire kleinere hydrofobe pocket die worden overbrugd door een acidic regio (inclusief Glu220, Glu224 en Asp283). De belangrijkste bindingsdeterminanten van HAKRRLIF omvatten de interactie van Ala2 met additionele hydrofobe pocket, ionenparing en waterstofbindingen van Lys3, Arg 4 en Arg5 het zure gebied en een hoge mate van complementariteit van Leu6 en pHE8 de primaire lipofiele plaats. Bovendien worden talrijke waterstofbruggen bijdrage van het peptide hoofdketen terwijl Ile7 fungeert als afstandhouder residu zodat optimaal contact met de primaire zak. De bindingsmodus en interacties van HAKRRLIF met CBG is getoond in figuur 2. Gericht op de CBM / CBG eiwit-eiwit interacties zullen kinaseactiviteit van CDK2 / cycline A, CDK2 / cycline E &amp; CDK4 / cycline D te remmen en dit moet leiden E2F1 gemedieerde apoptose van kankercellen zonder dat afgeweken normale cellen 7. Hoewel CBM afgeleide peptiden zijn effectieve remmers van celcyclus-CDK&#39;s, is het onwaarschijnlijk dat zij nuttig als geneesmiddelen zullen zijn vanwege hun metabolischeinstabiliteit en algemene gebrek aan celdoorlaatbaarheid. Daartoe hebben we de REPLACE strategie om deze potente peptidische remmers te zetten in meer drug-achtige verbindingen voor de verdere ontwikkeling van anti-tumor therapieën benutten gedereguleerd E2F1 tot CDK2 / cycline A inhibitie toegepast. Het volgende protocol vat werk dat bij de toepassing van REPLACE de cycline groove voltooid. In eerste instantie werden drug-like capping groep vervanging van het N-terminale tetrapeptide van HAKRRLIF geïdentificeerd. Bovendien werden verbeteringen in deze groepen onderzocht in een extra validatie studie voor te vervangen. Representatieve resultaten van deze studies worden gepresenteerd.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Computational Chemistry</td></tr><tr><td>Accelyrs Discovery studio 3.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dell Optiplex Workstations</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Synthetic Organic Chemistry</td></tr><tr><td colspan="4">Silica gel (GF-254 platen) voor TLC, Biotage (Uppsala, Zweden) voor flitschromatografie, Waters Alliance 2695 HPLC met een 2996 diode-array detector en uitgerust met een C18 (2) 100 A, 250 x 4,6&nbsp;mm, 5&nbsp;&mu;m kolom (Phenomenox Luna) voor zuiverheidsbepaling, 1H NMR en 13C NMR spectra werden opgenomen met een Varian Mercury 300 en 400 Spectrometer, respectievelijk. Massaspectra werden gemeten met een Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight massaspectrometer), elektrospray ionisatie (ESI) en VG 70S (Dubbel gefocuste magnetische sector massaspectrometer, EI).</td></tr><tr><td colspan="4">Fluorescentie Polarisatie Assay</td></tr><tr><td>384 micro well platen, Micro pipetten</td><td>Grenier Bio-one</td><td>110256602</td><td></td></tr><tr><td>CDK4D1 en CDK2CA (goed gezuiverde recombinante humane kinase complex)</td><td>BPS Bio Sciences</td><td>40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0,01% Nonidet P-40, 1&nbsp;mM dithiothretiol (DTT))</td></tr><tr><td>25 nM HEPES</td><td>CALBIOCHEM</td><td>375368</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>127838</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-70 &#176;C vriezer</td><td>Revco (Ultima II)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTX880 multimode detector uitgerust met 485&nbsp;nm/535&nbsp;nm excitatie/emissie filters en een dichroisch spiegel geschikt voor fluoresceïne</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Celcultuur</td></tr><tr><td>96 well platen</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bevroren voorraden van U2OS (osteosarcoom) en DU145 (prostaatkanker) cellijnen</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU serum, DMEM media, trypsine, PEN/STRIP, MTT reagens</td><td>Fisher, Life Technology, Alfa Aesar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heemocytometer</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-70 &#176;C vriezer</td><td>Revco (Ultima II)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>Koelkast 4-8 &#176;C</td><td>Isotemp Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTX880 multimode detector uitgerust met 595&nbsp;nm filter</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van inhibitoren van eiwit-eiwit interacties door middel van vervangen: toepassing op het ontwerp en de ontwikkeling van niet-concurrerende atp cdk-remmers

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

REPLACE is een unieke strategie ontwikkeld om gerichter eiwit-eiwitinteracties (PPI). Het doel is om beschikbare drug doel ruimte uit te breiden door middel van een verbeterde methode voor het identificeren van remmers voor dergelijke bindingsplaatsen en die vormen de meerderheid van de potentiële drug targets. Het belangrijkste doel van deze paper is om een ​​methodologisch overzicht van het gebruik en de toepassing van de VERVANGEN strategie die computational en synthetische chemie benaderingen gaat bieden. REPLACE wordt geïllustreerd door middel van de toepassing ervan op de ontwikkeling van niet-competitieve ATP cycline afhankelijke kinasen (CDK) inhibitoren als anti-tumor therapieën. CDK&#39;s worden vaak gedereguleerd bij kanker en dus worden beschouwd als belangrijke doelen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen. Remming van CDK2 / cycline A in S-fase is gerapporteerd selectieve apoptose van kankercellen in een p53-onafhankelijke wijze te verminderen door de E2F1 route. Gericht op de interactie eiwit-eiwit op het cycline binding groef (CBG) is een benadering die de specifieke remming van de celcyclus dan transcriptie CDKs zal toestaan. Het CBG wordt herkend door een consensus sequentie afgeleid van CDK substraten en tumor suppressor eiwitten aangeduid als de cycline bindingsmotief (CBM). De CBM eerder is geoptimaliseerd om een ​​octapeptide uit p21WAF (HAKRRIF) en dan verder ingekort tot een pentapeptide behoud van voldoende activiteit (RRLIF). Peptiden in het algemeen niet celpermeabel, metabolisch onstabiel en derhalve de REPLACE (gedeeltelijke vervanging Ligand Alternatieven tot Computational Enrichment) strategie om meer geneesmiddelachtige inhibitors genereren toegepast. De strategie begint met het ontwerp van het Fragment afgebonden remmende peptiden (salto) die selectief celcyclus CDK / cycline complexen remmen. Flips werden gegenereerd door het vervangen van residuen van iteratieve HAKRRLIF / RRLIF met fragment zoals kleine moleculen (kapgroepen) vanaf de N-terminus (Ncaps), gevolgd door vervanging vande C-terminus. Deze verbindingen zijn uitgangspunten voor het genereren van niet-competitieve ATP CDK inhibitoren als anti-tumor therapieën.

De interacties van HAKRRLIF met cycline groef getoond in figuur 2. Het peptide resten die het belangrijkste bindingsdeterminanten vertegenwoordigen omvatten Ala2, Arg4, Leu6 en pHE8 met andere residuen leveren kleinere bijdragen 12,13,18. In deze case REPLACE strategie is gebruikt om fragment alternatieven voor residuen in de N-terminale tetrapeptide van HAKRRLIF, vooral nabootsen van de interactie van Ala2 en Arg4 vinden. Een bibliotheek van potentiële NCAP fragmenten <stron...

We beschrijven de implementatie van de REPLACE-strategie voor het targeten van eiwit-eiwitinteracties. REPLACE is een iteratieve strategie die synthetische en computationele benaderingen omvat voor de omzetting van geoptimaliseerde peptidische remmers in geneesmiddelachtige moleculen.

Ontwikkeling van inhibitoren van eiwit-eiwit interacties door middel van VERVANGEN: Toepassing op het ontwerp en de ontwikkeling van niet-concurrerende ATP CDK-remmers

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

Het algemene doel van de strategie is om een effectief klein molecuul-achtig therapeutisch middel te genereren door omzetting van een peptide-remmer van een eiwit-eiwit interactie. Dit wordt bereikt door een structuur-activiteitsrelatie voor de gewenste peptide-eiwit interactie vast te stellen om te begrijpen welke delen effectief kunnen worden vervangen als tweede stap. Computationele chemie wordt gebruikt om haalbare fragmentalternatieven voor de bekende peptide determinanten te identificeren, die vervolgens kunnen worden gebruikt om een bibliotheek van fragment-peptide hybriden te synthetiseren.Vervolgens wordt een bibliotheek van hybriden gesynthetiseerd tussen deze fragmenten en het geamputeerde peptide om moleculen te genereren die kunnen worden getest in een in vitro-assay om moleculen te identificeren die meer lijken op geneesmiddelen en die de activiteit van het native peptide nabootsen. De resultaten laten zien dat meer geneesmiddel-achtige verbindingen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van de methodologie, en deze vertegenwoordigen effectieve uitgangspunten voor de ontdekking van remmers van eiwit-eiwit interacties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals high throughput screening is dus dat eiwit-eiwit interacties uiterst uitdagend zijn vanuit het oogpunt van geneesmiddelontdekking, en conventionele methoden werken niet goed.De vervangstrategie omvat een stapsgewijze iteratieve aanpak en kan daarom langer duren of op lange termijn waarschijnlijk effectiever zijn. Vandaag zal ik de meeste procedures zelf demonstreren met enige hulp van mijn medewerker, Dr. Sandra Craig, die enkele van de reacties en procedures zal opzetten. Begin deze procedure met validatie van het dockingprotocol, gevolgd door voorbereiding van de receptorbindingsplaats en liganden zoals beschreven in het tekstprotocol om de liganden in de Cycline a-groef te docken.Selecteer eerst de ligandfit-routine uit het receptor-ligandinteractieprotocol dat in de software is ingesteld, gebruik de receptor en de voorbereide liganden als invoer voor dit protocol. Selecteer voor deze runs PLP one als de energiegrid. De energiegrid die door het dockingprogramma wordt gebruikt, is de krachtveld voor het genereren van ligand-receptorinteracties en potentiële poses.Plp one is peace wise linear potential, die specifiek voorrang geeft aan waterstofbindinginteracties. Geef op dat poses energie geminimaliseerd moeten worden en het aantal gegenereerde poses op 10. Laat alle andere parameters in eerste instantie op de standaardwaarden staan.Toon poses in het visualizer-programma en sorteer vervolgens op afnemende waarden van de PLP one-score. Gebruik scorefuncties zoals plp, one om de bindingsaffiniteit van een gedockt ligand te schatten op basis van een kandidaat-ligandpose, geometrie en niet-covalente interactie met de doelreceptorstructuur. Analyseer visueel de top 25% van de gescoorde poses voor super onmogelijkheid met de bekende afsluitgroep.Observeer ook of de pose de interactiefilters heeft vervuld, die zijn ingesteld om atomaire beperkingen op te nemen die intermoleculaire contacten vereisen die bekend zijn als kritiek voor binding en/of die nodig zijn om de potentiële afsluitgroep in de juiste geometrie voor amidebindingsvorming te positioneren. Bekijk ten slotte poses op visuele complementariteit, die wordt gedefinieerd als het efficiënt vullen van de bindingszak op een manier die consistent is met bekende structuur-activiteit. Relaties voor de synthese van end capping groepen, gebruik alle commerciële uitgangsmaterialen, oplosmiddelen en reagentia en synthetiseer door conventionele synthetische organische chemie.Voer dunne laagchromatografie of TLC uit op silicagel voor het bewaken van reacties door eerst het uitgangsmateriaal en reactiemengsel op te lossen in de mobiele fase. Breng vervolgens het opgeloste uitgangsmateriaal en reactiemengsel op de TLC-plaat aan met behulp van capillaire buisjes. Plaats de TLC-plaat in de kamer met de mobiele fase.Zodra de mobiele fase 90% van de TLC-plaat bereikt, verwijder en laat de plaat aan de lucht drogen. Gebruik UV-licht om het uitgangsmateriaal en reactiemengsels te detecteren als zichtbare vlekken. Bereken vervolgens de RF van elke vlek, dat is de verhouding van de afgelegde afstand door de vlek en de mobiele fase.Plaats vervolgens het reactiemengsel in een scheidingskolven en was het met aqueuze zuur- of baseoplossing, zoals passend. Verzamel het organische oplosmiddel en verdampt het in een rotatievevaporator voordat het wordt gedroogd. Het ruwe product dat onder vacuüm wordt verkregen, lost 500 milligram ruw product op in drie tot vijf milliliters geschikt oplosmiddel en wordt toegevoegd aan een silica of RP 18-monster voordat het onder lucht wordt gedroogd, plaats een monster met het ruwe product in silica, omgekeerde fase snap cartridges.Zuiver het ruwe materiaal met behulp van geautomatiseerde hoge prestatie-flitschromatografie. Gebruik een snap 100 gram kolom met een gradiënt. Laat over 15 kolomvolumes lopen.Droog het gezuiverde product dat is verzameld in oplosmiddel uit flitschromatografie met behulp van een rotatievevaporator door alle oplosmiddel tot droogheid te verdampen. Droog het product vervolgens verder onder vacuüm om alle resterende oplosmiddelen te verwijderen. Voer karakterisering uit van het gezuiverde product door NMR MS en analytische HPLC zoals beschreven in het tekstprotocol om end-capped fragment, geligeerde remmende peptiden of flip-assemblee te synthetiseren.Eindig peptische verbindingen door standaard vaste fasesynthesemethoden. Activeer vijf equivalenten van het C-terminale aminozuur in 4,4 equivalenten HBTU in twee milliliters DIMETHYLFORMAMIDE of DMF gedurende vijf minuten. Laad het mengsel op rinkhars met behulp van zes equivalenten di-isopropyl ethyl amine gedurende één uur bij kamertemperatuur.Verwijder de FM-beschermingsgroep van de C-terminale rest met behulp van 20%INE in drie milliliters DMF gedurende 10 minuten. Koppel vervolgens aminozuren stap voor stap bij elke stap. Koppel vijf equivalenten van het volgende aminozuur met behulp van zes equivalenten DI-isopropyl, ethyl amine en 4,4 equivalenten HBTU in twee milliliters DMF gedurende één uur bij kamertemperatuur.Bij kamertemperatuur, pas wascycli toe na aminozuurkoppeling en FM D-beschermingsstappen na peptidesamenstelling. Koppel N-cappinggroepen met behulp van zes equivalenten DI-isopropyl, ethyl amine en 4,4 equivalenten HBTU

development-inhibitors-protein-protein-interactions-through-replace

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We ontwikkelden computationele de novo eiwit-ontwerpmethoden die in staat zijn om verschillende belangrijke gebieden van eiwit-ontwerp aan te pakken. Om deze methoden te verspreiden, presenteren we Protein WISDOM, een online tool voor eiwit-ontwerp (http://www.proteinwisdom.org). Uitgaande van een structurele sjabloon, kan het ontwerp van monomere eiwitten voor verhoogde stabiliteit en complexen voor verhoogde bindingsaffiniteit worden uitgevoerd.

Proteïne WIJSHEID: Een Workbench voor<em&gt; In silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Ontwerp van biomoleculen

Opkomst van genetische resistentie tegen kinase remmer therapie vormt een serieuze uitdaging voor een effectieve behandeling van kanker. Identificatie en karakterisatie van resistente mutaties tegen een nieuw ontwikkelde geneesmiddel helpt bij een betere klinische behandeling en de volgende generatie geneesmiddelen. Hier beschrijven we ons protocol in vitro screening en validatie van resistente mutaties.

Een werkwijze voor het screenen en Validatie van Resistente Mutaties Tegen kinaseremmers

Fosforylering van eiwitten is een centrale eigenschap van hoe cellen informatie in hun extracellulaire milieu interpreteren en hierop reageren. Hier presenteren we een hoogdoorlaatscreeningprotocol met behulp van kinasen gezuiverd uit zoogdiercellen om snel kinasen te identificeren die een substraat(s) van belang fosforyleren.

Identificatie van de kinase-substraat Paren Met behulp van high throughput screening

Cycline-afhankelijk kinase 1 (Cdk1) wordt geactiveerd in de G2-fase van de celcyclus en regelt veel cellulaire routes. Hier presenteren we een protocol voor een kinase in vitro assay met Cdk1, dat voorziet in de identificatie van Cdk1-specifieke fosforylatie sites vaststelling van cellulaire doelen van deze belangrijke kinase.

Identificatie van cycline-afhankelijk Kinase 1 specifieke fosforylatie Sites door een Kinase In Vitro Assay

Deze paper gebruikt een stroom cytometry-gebaseerde assay naar scherm bibliotheken van chemische inhibitoren voor de identificatie van remmers en de bijbehorende doelen die van invloed zijn T-cel receptor signalering. De hier beschreven methoden kunnen ook worden uitgebreid voor high-throughput screening.

Identificatie van bemiddelaars/Mediators van T-cel Receptor signalering via de Screening van chemische remmer bibliotheken

De doelstelling van dit protocol is label, verrijken en identificeren van substraten voor proteïne kinase CK2 uit een complexe biologische monster zoals een cel lysate of weefsel homogenaat. Deze methode maakt gebruik van unieke aspecten van CK2 biologie voor dit doel.

Identificatie van nieuwe CK2 Kinase substraten met behulp van een veelzijdige benadering van de biochemische

Een gedetailleerd protocol voor het genereren van zelf-geassembleerde humane eiwit arrays voor de screening van kinase remmers wordt gepresenteerd.

Kinase remmer screening in zelf-geassembleerde humane Eiwit Microarrays

Hier presenteren we een protocol voor het structuurgestuurde ontwerp van eiwit-ligandbindingsinteractie tussen Sanglifehrin A en Cyclophiline A/Ganoderiol-F, essentieel voor de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen. De stabiliteit van het ligand-receptorcomplex werd geëvalueerd met behulp van moleculaire dynamica-simulatie.

Structuurgeleid ontwerp en ontwikkeling van nieuwe cyclophiline A-remmers en ganoderiol-F-derivaten: een in-silico-benadering

Dit protocol laat zien hoe het behoud van gezonde, ongedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen (ES) cellen.

Cultuur en onderhoud van menselijke embryonale stamcellen

SC1 functies door dubbele remming van Ras-GAP en ERK1. We testten de functie van SC1 in de ondersteuning van muis ES-cel zelf-vernieuwing in de afwezigheid van LIF en liet zien dat SC1 in staat is om zelf-vernieuwing van de muis ES-celculturen te behouden.

Het gebruik van SC1 (Pluripotin) naar Mesc Zelfvernieuwing Ondersteuning bij de afwezigheid van LIF

Leer de REPLACE-strategie voor het ontwikkelen van remmers van eiwit-eiwitinteracties met behulp van computationele chemie en fragmentgebaseerde synthese. Deze methode helpt onderzoekers bij het ontwerpen van drugachtige moleculen.

Ontwikkeling van inhibitoren van eiwit-eiwit interacties door middel van VERVANGEN: Toepassing op het ontwerp en de ontwikkeling van niet-concurrerende ATP CDK-remmers (Video) | JoVE Journal

Ontwikkeling van inhibitoren van eiwit-eiwit interacties door middel van VERVANGEN: Toepassing op het ontwerp en de ontwikkeling van niet-concurrerende ATP CDK-remmers

Meer video's verkennen