Name: Synthese van Indoxyl-glycosiden voor detectie van Glycosidase Activiteiten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Leer een nieuwe syntheseroute voor indoxylglycosiden met verbeterde opbrengst voor enzymactiviteitstests. Deze methode maakt efficiënte productie van chromogene substraten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De steun van dit werk door Glycom A/S, Kopenhagen, Denemarken, wordt met dank erkend.

Algemene opmerkingen:
Alle reacties werden uitgevoerd in een afzuigingskast en met geschikte beschermende kleding. Alle reagentia en oplosmiddelen (p.a.; watergehalte voor droge oplosmiddelen: MeCN <50 ppm; Et2O <0,01%; CH2Cl2 <0,003%; THF <0,005%) werden aangeschaft bij commerciële leveranciers en werden gebruikt zoals ontvangen. TLC werd uitgevoerd op Merck silica gel 60 F254 platen. Verbindingen werden gedetecteerd door UV en/of door behandeling met EtOH/H2SO4 (9:1) en vervolgens verwarmen. Kolomchromatografie werd uitgevoerd met Merck/Fluka silica gel 60 (230-400 mesh). Filtraties werden uitgevoerd met een Büchner-trechter en aspiratiepomp. Oplosmiddelen werden verwijderd met behulp van een rotatie-verdamper (40 °C, ~200 rpm). Producten werden gedroogd in hoog vacuüm (rotary vane pomp). Reacties die droge oplosmiddelen vereisen, werden uitgevoerd onder argonatmosfeer.
Hieronder wordt de synthese van X-Gal (16) beschreven met behulp van 5-bromo-4-chloro-indoxylic acid allyl ester (12). Voor verdere verbindingen met verschillende substitutiepatronen en methylesters die volgens deze synthetische sequentie zijn bereid, zie ref.17-19.
1. Acceptor: Synthese van 5-Bromo-4-Chloro-Indoxylic Acid Allyl Ester18 (12)
<ol>
	<li>N-Acetylering: Synthese van N-(4-bromo-3-chloro-2-methylfenyl)-acetaat (6)
	<ol>
		<li>Los 10,0 g (45,7 mmol) van 4-bromo-3-chloro-2-methylaniline op in 30 ml dichloromethaan. 
		Let op! Dichloromethaan is schadelijk en koel de oplossing in een ijsbad.</li>
		<li>Voeg 6,50 ml (68,7 mmol) azijnzuuranhydride druppelsgewijs toe en laat het mengsel opwarmen tot kamertemperatuur. Het mengsel kan 8 uur of overnacht worden geroerd. Let op! Azijnzuuranhydride is corrosief en ontvlambaar.</li>
		<li>Verwijder het oplosmiddel en kristalliseer opnieuw uit 9:1 ethylacetaat/methanol (opbrengst: 97% (11,6 g, 44,2 mmol), kleurloze vaste stof). 
		Let op! Ethylacetaat is irriterend en ontvlambaar. Let op! Methanol is giftig en ontvlambaar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oxidatie: Synthese van N-acetyl-5-bromo-6-chloro-anthranilzuur (7)
	<ol>
		<li>Reflux een mengsel van 2,30 g (8,76 mmol) van 6 (het product verkregen uit stap 1.1) en 2,10 g (8,52 mmol) MgSO4·7H2O in 40 ml water in een 3-hals ronde bodemkolf uitgerust met koeler en druppeltrechter.</li>
		<li>Voeg druppelsgewijs 50 ml verzadigde KMnO4 oplossing in water toe aan het reactiemengsel gedurende een periode van 3 uur. Verwarm vervolgens nog 2 uur onder reflux, ca. 135 °C oliebad. Let op! Kaliumpermanganaat is schadelijk en oxiderend.</li>
		<li>Laat afkoelen tot kamertemperatuur en filter de pyroloosiet (MnO2), die tijdens de reactie is gevormd. 
		Let op! Pyroloosiet is schadelijk.</li>
		<li>Voeg zoutzuur (37%) toe aan het filtraat tot pH 1, filter vervolgens het product en droog in vacuüm, (opbrengst: 70% (1,80 g, 6,15 mmol), kleurloze vaste stof). 
		Let op! Zoutzuur is corrosief.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Deacetylering: Synthese van 5-bromo-6-chloro-anthranilzuur (8)
	<ol>
		<li>Los 3,90 g (13,3 mmol) van 7 (het product verkregen uit stap 1.2) op in 70 ml van 1 N waterige natriumhydroxideoplossing en verwarm gedurende 5 uur op ca. 100 °C (oliebaad). 
		Let op! Natriumhydroxide is corrosief.</li>
		<li>Laat afkoelen tot kamertemperatuur en voeg zoutzuur (37%) toe tot pH 1, filter vervolgens het product met een Büchner-trechter en droog in vacuüm, (opbrengst: 88% (2,93 g, 11,7 mmol), kleurloze vaste stof).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Anhydridevorming: Synthese van 5-bromo-6-chloro-isatoic anhydride (9)
	<ol>
		<li>Suspendieer 8,17 g (32,6 mmol) van 8 (het product verkregen uit stap 1.3) in 33 ml droog acetonitrile. 
		Let op! Acetonitrile is schadelijk en ontvlambaar.</li>
		<li>Roer op kamertemperatuur en voeg 5,3 ml en een oplossing van 3,22 g (10,8 mmol) triphosgeen in 18,5 ml droog dichloromethaan druppelsgewijs toe gedurende een periode van 30 minuten. Verhit vervolgens 3 uur bij 50 °C (oliebaad). Let op! Pyridine is schadelijk en ontvlambaar. 
		Let op! Trifosgeen is giftig en kan fosgeen vrijgeven.</li>
		<li>Verwijder ongeveer 75% van het oplosmiddel en deactiveer de reactie door 100 ml gedestilleerd water toe te voegen en filter het product. Was met een kleine hoeveelheid koud dichloromethaan.</li>
		<li>Droog het product in vacuüm, (opbrengst: 88% (7,53 g, 27,2 mmol), kleurloze vaste stof).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>N-Alkylering: Synthese van 5-bromo-6-chloro-N-[(methoxycarbonyl)allyl]-isatoic anhydride (10)
	<ol>
		<li>Los 25 g (90 mmol) van 9 (het product verkregen uit s

<ol><li>Clark, R. J. H., Cooksey, C. J., Daniels, M. A. M., Withnall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indigo%2C+Woad%2C+and+Tyrian+Purple%3A+Important+Vat+Dyes+from+Antique+to+the+Present%5BTitle%5D)+AND+%22Endeavour%22%5BJournal%5D)">Indigo, Woad, and Tyrian Purple: Important Vat Dyes from Antique to the Present.</a> Endeavour. 17, 191-199 (1993).</li>
<li>Hunger, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHunger%2C+K+%22Industrial+Dyes%3A+Chemistry%2C+Properties%2C+Applications%22">Industrial Dyes: Chemistry, Properties, Applications</a>. , 1st, Weinheim. Wiley-VHC. (2003).</li>
<li>Kiernan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indigogenic+Substrates+for+Detection+and+Localization+of+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechn.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Indigogenic Substrates for Detection and Localization of Enzymes.</a> Biotechn. Histochem. 82, 73-103 (2007).</li>
<li>Barnett, R. J., Seligman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+Demonstration+of+Esterases+by+Production+of+Indigo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Histochemical Demonstration of Esterases by Production of Indigo.</a> Science. 114, 579-582 (1951).</li>
<li>Pearson, B., Andrews, M., Grose, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+Demonstration+of+Mammalian+Glucosidase+by+Means+of+3-%285-Bromoindolyl%29-%CE%B2-%E1%B4%85-glucopyranoside%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Histochemical Demonstration of Mammalian Glucosidase by Means of 3-(5-Bromoindolyl)-β-ᴅ-glucopyranoside.</a> Exp. Biol. Med. 108, 619-623 (1961).</li>
<li>Anderson, F. B., Leaback, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrates+for+the+Histochemical+Localization+of+some+Glycosidases%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron%22%5BJournal%5D)">Substrates for the Histochemical Localization of some Glycosidases.</a> Tetrahedron. 12, 236-239 (1961).</li>
<li>Van Dort, M. E., Lee, K. C., Hamilton, C. A., Rehemtulla, A., Ross, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosynthesis+and+Evaluation+of+5-%5B125I%5DIodoindolyl-3-yl-%CE%B2-%E1%B4%85-galactopyranoside+%28%5B125I%5DIBDG%29+as+a+%CE%B2-Galactosidase+Imaging+Radioligand%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Radiosynthesis and Evaluation of 5-[125I]Iodoindolyl-3-yl-β-ᴅ-galactopyranoside ([125I]IBDG) as a β-Galactosidase Imaging Radioligand.</a> Mol. Imaging. 7, 187-197 (2008).</li>
<li>Yoshida, K., Iino, N., Koga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntheses+of+Halogen+Substituted+%CE%B2-%E1%B4%85-Glucuronides+and+Their+Hydrolysis+by+Rabbit+Liver+%CE%B2-Glucoronidase%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Pharm.+Bull%22%5BJournal%5D)">Syntheses of Halogen Substituted β-ᴅ-Glucuronides and Their Hydrolysis by Rabbit Liver β-Glucoronidase.</a> Chem. Pharm. Bull. 32, 1759-1769 (1975).</li>
<li>Horwitz, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrates+for+Cytochemical+Demonstartion+of+Enzyme+Activity+I.+Some+Substituted+3-Indolyl-%CE%B2-%E1%B4%85-glycopyranosides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrates for Cytochemical Demonstartion of Enzyme Activity I. Some Substituted 3-Indolyl-β-ᴅ-glycopyranosides.</a> J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).</li>
<li>Eschenfelder, V., Brossmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Bromo-indol-3-yl+5-Acetamido-3%2C5-dideoxy-%CE%B1-%E1%B4%85-glycero-%E1%B4%85-galactononulopyranosidic+Acid%2C+a+Novel+Chromogenic+Substrate+for+the+Staining+of+Sialidase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+J%22%5BJournal%5D)">5-Bromo-indol-3-yl 5-Acetamido-3,5-dideoxy-α-ᴅ-glycero-ᴅ-galactononulopyranosidic Acid, a Novel Chromogenic Substrate for the Staining of Sialidase Activity.</a> Glycoconjugate J. 4, 171-178 (1987).</li>
<li>Fujii, I., Iwabuchi, Y., Teshima, T., Shiba, T., Kikuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-Neu5Ac%3A+A+Novel+Substrate+for+Chromogenic+Assay+of+Neuraminidase+Activity+in+Bacterial+Expression+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">X-Neu5Ac: A Novel Substrate for Chromogenic Assay of Neuraminidase Activity in Bacterial Expression Systems.</a> Bioorg. Med. Chem. 1, 147-149 (1993).</li>
<li>Berlin, W., Sauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+Color+Detection+of+%CE%B1-%CA%9F-Arabinofuranisodase%2C+a+%26%2334%3BNo-Background%26%2334%3B+Reporter+Gene%2C+with+5-Bromo-3-indolyl-%CE%B1-%CA%9F-arabinofuranoside%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">In situ Color Detection of α-ʟ-Arabinofuranisodase, a &#34;No-Background&#34; Reporter Gene, with 5-Bromo-3-indolyl-α-ʟ-arabinofuranoside.</a> Anal. Biochem. 243, 171-175 (1996).</li>
<li>Marmuse, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Chromogenic+Substrates+for+Feruloyl+Esterases%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">New Chromogenic Substrates for Feruloyl Esterases.</a> Org. Biomol. Chem. 6, 1208-1214 (2008).</li>
<li>Kaneko, S., Kiaoka, M., Kuno, A., Hayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntheses+of+4-Methylumbelliferyl-%CE%B2-%E1%B4%85-Xylobioside+and+5-Bromo-3-Indolyl-%CE%B2-%E1%B4%85-Xylobioside+for+Sensitive+Detection+of+Xylanase+Activity+on+Agar+Plates%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Biotechnol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Syntheses of 4-Methylumbelliferyl-β-ᴅ-Xylobioside and 5-Bromo-3-Indolyl-β-ᴅ-Xylobioside for Sensitive Detection of Xylanase Activity on Agar Plates.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 64, 741-745 (2000).</li>
<li>Robertson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntheses+of+Glucosides.+Part+I.+The+Synthesis+of+Indican%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Syntheses of Glucosides. Part I. The Synthesis of Indican.</a> Chem. Soc. , 1937-1943 (1927).</li>
<li>Robertson, A., Waters, R. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthese+of+Glucosides.+Part+VII.+The+Synthesis+of+6-Bromoindican%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthese of Glucosides. Part VII. The Synthesis of 6-Bromoindican.</a> Chem. Soc. , 2239-2243 (1929).</li>
<li>Böttcher, S., Thiem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indoxylic+Acid+Esters+as+Convenient+Intermediates+Towards+Indoxyl+Glycosides%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Indoxylic Acid Esters as Convenient Intermediates Towards Indoxyl Glycosides.</a> Eur. J. Org. Chem. , 564-574 (2014).</li>
<li>Böttcher, S., Hederos, M., Champion, E., Dékány, G., Thiem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Efficient+Routes+to+Indoxyl+Glycosides+for+Monitoring+Glycosidase+Activities%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Novel Efficient Routes to Indoxyl Glycosides for Monitoring Glycosidase Activities.</a> Org. Lett. 15, 3766-3769 (2013).</li>
<li>Böttcher, S., Thiem, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+Preparation+of+Indoxyl-+and+Nitrophenyl+Glycosides+of+Lactosamine+and+Isolactosamine%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Facile Preparation of Indoxyl- and Nitrophenyl Glycosides of Lactosamine and Isolactosamine.</a> RSC Adv. 4, 10856-10861 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Vanwege lage opbrengsten en beperkingen, vooral voor glucosetype structuren en complexere suikers, werd een nieuwe synthetische benadering voor indoxyl glycosiden ontwikkeld. Indoxylzuur esters bleken waardevolle tussenproducten te zijn en werden verkregen in een modulair, schaalbaar proces. Alle stappen leveren hoge opbrengsten op en vanwege goedkope uitgangsmaterialen en eenvoudige nabehandeling zijn syntheses in grammen mogelijk. Het voordeel van de allyl-ester benadering is het blokkeren van de reactieve 2-positie. H...

Gedurende een lange periode was de productie van indigo een economisch zeer belangrijk proces. Voordat grootschalige chemische syntheses een goedkope toegang tot indigo boden, werden precursoren sinds voorchristelijke tijden uit natuurlijke bronnen verkregen. De teelt van indigo-producerende planten (natuurlijk indigo) in Europa werd in de 17e eeuw onrendabel, aangezien de hoeveelheid indigo-precursoren van de Indiase indigoplant (0,2-0,8 %) ongeveer 30 keer hoger is. Aan het einde van de 19e eeuw verving de chemische synthese van indigo de conventionele teelt1,2.
Indigo-precursoren die van nature in planten voorkomen, zijn onder meer Indican (1), Insatan A (2) en Isatan B (3) (Figuur 1). Al deze stoffen bestaan uit een indoxyl-motief gekoppeld aan een glycosylresidu. Splijting van de glycosidische binding, bijvoorbeeld door enzymatische hydrolyse, leidt tot de afgifte van indoxyl (4). Indoxyl zelf is vrijwel kleurloos, maar kan snel worden geoxideerd tot een indigokleurstof (5). Deze gevoelige reactie is in de biochemie, histochemie, bacteriologie en moleculaire biologie aangepast voor het monitoren van enzymactiviteiten. Activity screening in vivo zonder isolatie of zuivering van enzymen, evenals snelle tests op agarplaten of in oplossing (bijv. blauw-wit screening, micro-wells), is mogelijk. Afhankelijk van het residu (bijv. esters, glycosiden, sulfaten) dat aan de indoxylgroep is gekoppeld, zijn geschikte substraten voor verschillende enzymklassen (bijv. esterasen, glycosidasen, sulfatasen) ontwikkeld3. In het vervolg ligt de focus op de vorming en toepassing van indoxylglycosiden.
<img alt="Diagram van het indicanhydrolyseproces met weergave van indoolderivaten en de vorming van indigokleurstof." src="/files/ftp_upload/52442/52442fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1: Natuurlijke indigoprecursoren en vorming van indigokleurstof door hydrolyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52442/52442fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Het substitutiepatroon van de indoxylgroep bepaalt de kleur en de fysische eigenschappen van de resulterende indigokleurstof. De meest voorkomende substitutiepatronen zijn 5-bromo-4-chloro (afgekort als X; groenblauw), 5-bromo (blauw) en 5-bromo-6-chloro (magenta), aangezien deze de kleinste kleurstofdeeltjes vormen, geen granulen vormen en de minste diffusie vertonen vanuit de plaatsen van hydrolyse. Deze laatste eigenschap is vooral belangrijk voor in vivo experimenten3.
Het eerste verslag van een indigogene methode voor de detectie van esterase-activiteit werd in 1951 gepubliceerd door Barrnett en Seligman, die indoxylacetaat en -butyraat gebruikten4. Ongeveer een decennium later werd het indigogene principe aangepast voor de lokalisatie van glucosidase bij zoogdieren5. Tot nu toe zijn verschillende indoxylglycosiden ontwikkeld, hoewel de synthese daarvan moeilijk bleek te zijn. De meeste syntheses zijn gebaseerd op het gebruik van een N-geacetyleerd indoxyl als acceptor en het respectievelijke glycosylhalide als donor6-14. Glycosylering wordt uitgevoerd in aceton met natriumhydroxide. Onder deze omstandigheden treden een aantal nevenreacties op, waardoor de opbrengst aanzienlijk afneemt. Vooral voor structuren van het glucosetype werden zeer lage glycosyleringsopbrengsten gerapporteerd (bijv. 15% voor (N-acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-glucopyranoside6 en 26% voor (N-acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,2',3',4'-penta-O-acetyl-β-ᴅ-xylobioside14 in een recenter voorbeeld). Via een nieuwe benadering, waarbij gebruik wordt gemaakt van indoxylzuuresters, is een aanzienlijk aantal indoxylglycosiden met goede opbrengsten geprepareerd (bijv. (N-acetyl-5-bromo-4-chloro-indol-3-yl)-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-ᴅ-glucopyranoside met een opbrengst van 57%).
Het volgende protocol beschrijft de eenvoudige synthese van indoxylozuur allylester (5-broom-4-chloor) en op basis daarvan de synthese van een indoxylglycoside (X-Gal). Een eenvoudig modeleexperiment toont de enzymactiviteit van β-galactosidase met gebruik van X-Gal.

<table><tbody><tr><td>Azijnzuuranhydride</td><td>Gr&uuml;ssing</td><td>10298</td><td>Corrosie, ontvlambaar</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>608-001-00-3</td><td>Schadelijk, ontvlambaar</td></tr><tr><td>Allylalcohol</td><td>Aldrich</td><td>453021</td><td>Schadelijk, gevaarlijk voor het milieu</td></tr><tr><td>Amberlite IR-120 H+</td><td>Fluka</td><td>06428</td><td>Irritativum</td></tr><tr><td>Broomazijnzuur</td><td>Merck</td><td>802260</td><td>Corrosie, giftig, gevaarlijk voor het milieu</td></tr><tr><td>4-Broom-3-chloor-2-methylaniline</td><td>ABCR</td><td>AB 171687</td><td>Irritativum</td></tr><tr><td>Dichloormethaan</td><td>ACROS</td><td>326850010</td><td>Schadelijk</td></tr><tr><td>Di-ethylether</td><td>Gr&uuml;ssing</td><td>10274</td><td>Schadelijk, zeer ontvlambaar</td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>ACROS</td><td>348430010</td><td>Schadelijk, ontvlambaar</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41648</td><td></td></tr><tr><td>Ethylacetaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>607-022-00-5</td><td>Irritativum, ontvlambaar</td></tr><tr><td>Etheen-diamine-tetra-azijnzuur</td><td>AppliChem</td><td>A1103.0500</td><td>Irritativum</td></tr><tr><td>&beta;1,3-Galactosidase, recombinant, E. coli</td><td>Calbiochem</td><td>345795</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>VWR</td><td>20252.290</td><td>Corrosie</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaathydraat</td><td>Merck</td><td>105885</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>ACROS</td><td>326950010</td><td>Giftig, ontvlambaar</td></tr><tr><td>Morpholine</td><td>Janssen Chimica</td><td>15.868.57</td><td>Corrosie, ontvlambaar</td></tr><tr><td>Petroleumether</td><td>Azelis</td><td>111053</td><td>Ontvlambaar, irriterend, gevaarlijk voor het milieu</td></tr><tr><td>Kaliumcarbonaat</td><td>Gr&uuml;ssing</td><td>12005</td><td>Corrosie</td></tr><tr><td>Kaliumpermanganaat</td><td>Gr&uuml;ssing</td><td>12056</td><td>Schadelijk, oxiderend</td></tr><tr><td>Kalium-tert-butoxide</td><td>Merck</td><td>804918</td><td>Corrosie, ontvlambaar</td></tr><tr><td>Pyridien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>613-002-00-7</td><td>Schadelijk, ontvlambaar</td></tr><tr><td>Zilveracetaat</td><td>Fluka</td><td>85140</td><td>Irritativum, gevaarlijk voor het milieu</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Gr&uuml;ssing</td><td>12144</td><td>Corrosie</td></tr><tr><td>Natriumhydride</td><td>Merck</td><td>814552</td><td>Corrosie, ontvlambaar</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Riedel-de H&auml;en</td><td>S181200</td><td>Corrosie</td></tr><tr><td>Natriummethoxide</td><td>Merck</td><td>806538</td><td>Corrosie, ontvlambaar</td></tr><tr><td>Natriumsulfaat</td><td>Gr&uuml;ssing</td><td>12175</td><td></td></tr><tr><td>Tetrabutylammonium-waterstofsulfaat</td><td>Lancaster</td><td>5438</td><td>Schadelijk</td></tr><tr><td>Tetrahydrofuraan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87371</td><td>Schadelijk, ontvlambaar</td></tr><tr><td>Tetrakis (trifenylfosfine)palladium(0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216666</td><td></td></tr><tr><td>Trifosgeen</td><td>Fluka</td><td>15217</td><td>Giftig</td></tr><tr><td>Tris (hydroxymethyl)aminomethaanhydrochloride</td><td>Sigma</td><td>T-3253</td><td>Irritativum</td></tr></tbody></table>

synthese van indoxyl-glycosiden voor detectie van glycosidase activiteiten

Synthesis of Indoxyl-glycosides for Detection of Glycosidase Activities

Indoxyl glycosiden bleken waardevolle en veelzijdige hulpmiddelen te zijn voor het monitoren van glycosidase-activiteiten. Indoxylen worden vrijgegeven door enzymatische hydrolyse en worden snel geoxideerd, bijvoorbeeld door atmosferische zuurstof, tot indigo-kleurstoffen. Deze reactie maakt snelle en eenvoudige screening in vivo mogelijk zonder isolatie of zuivering van enzymen, evenals snelle tests op agarplaten of in oplossing (bijv. blue-white screening, micro-wells) en wordt gebruikt in biochemie, histochemie, bacteriologie en moleculaire biologie. Helaas bleek de synthese van dergelijke substraten moeilijk, vanwege verschillende nevenreacties en de lage reactiviteit van de indoxyl hydroxyl functie. Vooral voor glucose type structuren werden lage opbrengsten waargenomen. Onze nieuwe aanpak gebruikt indoxylzuur ester als sleutel tussenproducten. Indoxylzuur esters met gevarieerde substitutiepatronen werden bereid op schaalbare paden. Faseoverdracht glycosyleringen met die acceptoren en peracetyleerde glycosyl halogeniden kunnen onder gewone omstandigheden in hoge opbrengsten worden uitgevoerd. Ester splitsing en daaropvolgende milde zilver gemedieerde glycosylering levert de peracetyleerde indoxyl glycosiden in hoge opbrengsten op. Ten slotte wordt de deprotectie uitgevoerd volgens Zemplén.

De allereerste syntheses van indicane en 5-broom-indicane werden al in 1927 en 1929 gepubliceerd door Robertson15,16. Door gebruik te maken van indoxylozuurmethylester als acceptor werd de reactieve 2-positie geblokkeerd, waardoor nevenreacties gedeeltelijk werden onderdrukt. Glycosylering in aceton/natriumhydroxide, gevolgd door beschermgroepverwijdering en decarboxylering (160 °C, azijnzuuranhydride, 1 uur) en tot slot deacetylering, leverde indicane en 5-broom-indicane op. Op basis van dit concept hebben we...

Indoxyl glycosides zijn goed gevestigde en veelgebruikte hulpmiddelen voor enzymscreening en het bewaken van enzymactiviteit. Vooral voor glucose-type structuren bleken eerdere syntheses uitdagend en met een lage opbrengst. Onze nieuwe aanpak gebruikt indoxylzuur esters als waardevolle tussenproducten om een aanzienlijk aantal indoxyl glycosides met een goede opbrengst te verkrijgen.

Synthese van Indoxyl-glycosiden voor detectie van Glycosidase Activiteiten

Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are ...

Het algemene doel van deze procedure is het presenteren van een nieuwe synthetische benadering voor endo-glycosiden, inclusief die met complexe koolhydraatstructuren, met goede opbrengsten. Dit wordt bereikt door eerst een iniczuur-allo-ester-acceptor te synthetiseren, beginnend vanuit methyleen. De tweede stap omvat de glycosylering van deze acceptor met een geacetyleerde glycosylhalide-donor.Vervolgens wordt de allelester gesplitst door een palladiumkatalysator, waarna een daaropvolgende zilver-gemedieerde decarboxylering wordt toegepast om het geacetyleerde inox-glycoside te creëren. De laatste stap is deacetylering met zeplan om het onbeschermde inox-glycoside te verkrijgen. Uiteindelijk wordt het geprepareerde chromogene substraat gebruikt voor een kwalitatieve enzymactiviteitstest.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat complexly en labiele koolhydraatstructuren gemakkelijk als glycosiden kunnen worden geproduceerd. We kregen het idee voor deze methode toen we een publicatie van Alexander Robertson uit 1927 lazen, waarin hij de eerste synthese van Inca employ inic acid methyl eta beschreef. Latere methoden maakten gebruik van occi inox cell-acceptoren vanwege de betere toegankelijkheid, maar kampten met een lage opbrengst en problemen bij de zuivering. Om met de synthese te beginnen, wordt een satelliet, een halogeensubstitueerd lene zoals beschreven in het tekstprotocol, gebruikt.Verhit vervolgens 2,3 gram van het resulterende gehalogeneerde methylolacetamide in 40 milliliters water met 2,1 gram magnesiumsulfaatheptahydraat gedurende drie uur onder reflux in een drieneck ronde bodemkolf. Voeg druppelsgewijs 50 milliliters van een verzadigde kaliumpermanganaatoplossing in water toe en verhit het mengsel vervolgens nog twee uur onder reflux bij ongeveer 135 °C in een oliebad. Koel het mengsel af tot kamertemperatuur en filtreer het daarna om het pyrocyte-bijproduct te verwijderen; stel de pH van de oplossing in op 1 met 37% zoutzuur.Filter vervolgens het product van het oplosmiddel en droog het onder vacuüm. Na het drogen van deci wordt het product geïsoleerd zoals beschreven in het tekstprotocol, waarna 8,17 gram van het resulterende deci-product wordt gesuspendeerd in 33 milliliter droge acetonide trial. Voeg gedurende 30 minuten gelijktijdig druppelgewijs 5,3 milliliter pyridine en een oplossing van 3,22 gram tristine in 18,5 milliliter droog dichloormethaan toe aan de oplossing. Verwarm de reactie vervolgens tot 50 °C in een oliebad.Verwijder na drie uur ongeveer 75% van het oplosmiddel en voeg 100 milliliter gedestilleerd water toe om de reactie te stoppen. Filtreer het product en was het filter vervolgens met vijf tot 10 milliliter koud chloormethaan. Droog het product na het wassen in vacuüm, alkyleer dit intermediair en open vervolgens het resulterende anhydride zoals beschreven in het tekstprotocol.Isoleer het resulterende product via kolomchromatografie. Begin de Dickman-condensatie door drie gram van het product te mengen met 1,75 gram kaliumoxide in 100 milliliter droge dathylether; laat het refluxmengsel twee uur lang verwarmen bij 40 tot 45 °C. Verwijder vervolgens ongeveer 75% van het oplosmiddel in vacuüm en precipiteer het product met 100 milliliter één molaire zoutzuur.Filtreer het product en droog het vervolgens onder vacuüm. Om te beginnen met de synthese van XG, meng 400 milligram van de indoc cliczuur allylester met 410 milligram TBAs en 500 milligram alfa xto bromogalactose in 10 milliliter chloormethaan. Voeg vervolgens 10 milliliter eenmolaire waterige kaliumcarbonaat toe aan de reactie.Roer de reactie gedurende ongeveer drie uur bij kamertemperatuur en volg de consumptie van alfa-acetobromogalactose via dunlaagchromatografie in een oplossing van petroleumether en ethylacetaat in een verhouding van één-op-één. Zodra het alfa-acetobromogalactose volledig is geconsumeerd, wordt de organische fase van de oplossing geïsoleerd met een scheidtrechter. Droog vervolgens de organische fase over natriumsulfaat om resterend water te verwijderen en gebruik daarna kolomchromatografie om het product te zuiveren zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de allo-ester af te splitsen, worden 600 milligram van de galactopuricide opgelost in 15 milliliter droge tetrahydrofuraan.Verwijder het oplosmiddel onder vacuüm. Voeg 400 milligram zilveracetaat, 800 milligram kaliumcarbonaat en 10 milliliter azijnzuuranhydride toe aan het product en verhit de reactie vervolgens gedurende 20 minuten tot ongeveer 95 °C. Laat de reactie afkoelen tot kamertemperatuur en verdun de reactie vervolgens met 50 milliliter dichloormethaan. Om deze reactie te verwerken, wordt het mengsel tweemaal gewassen met water en eenmaal met een 10% natriumbicarbonaatoplossing.Droog de organische fase over natriumsulfaat en concentreer vervolgens de oplossing. Gebruik kolomchromatografie om de resulterende geacetyleerde galactopurine-zijketen te zuiveren. Los daarna 396 milligram van het gezuiverde materiaal op in 10 milliliter methanol.Voeg een spateltje natriummethylaat toe en roer het reactiemengsel vervolgens een nacht lang. Gebruik een kationuitwisselingshars om de reactie te neutraliseren en concentreer de oplossing daarna in vacuüm. Droog het product tot slot onder vacuüm om xal te verkrijgen en de geldigheid van de synthetische route te testen.Los eerst de xal op in enkele microliters dimethylsulfoxide. Maak vervolgens een 0,5 millimolaire voorraadoplossing van xal in een geschikte buffer. Voeg daarna één microliter beta galacto toe en schud het mengsel bij 600 omwentelingen per seconde.Houd de reactie bij 37 °C visueel in de gaten voor de vorming van een levendige indigo kleurstof. De vorming van blauwe kleurstof in de oplossing is een duidelijke indicatie van enzymactiviteit in doxyl. Glycosiden zijn belangrijk voor het monitoren van glycosate-enzymactiviteit, maar ze zijn moeilijk te synthetiseren.De hier gepresenteerde synthetische benadering levert het uiteindelijke endo galacto puric side op met een totale opbrengst van 66%. Dit is een significante verbetering ten opzichte van eerdere methodologie, waarbij slechts 28% opbrengst werd behaald. De resulterende doxylglycosiden kunnen worden gebruikt om de activiteit van zuivere of onzuivere enzymoplossingen te testen.In dit voorbeeld werd de indigo kleur alleen waargenomen in wells die beta-galactoside bevatten, en werd deze geproduceerd met een concentratie van slechts 0,1 millimolair XG. Zodra de indoc cel-acceptor is samengesteld, kan deze synthetische route om indoc cel-glycosiden op te brengen binnen twee dagen worden voltooid indien correct uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van de synthese en het gebruik van iniale glycosiden. Deze synthetische route produceert deze verbindingen met een goede opbrengst, ondanks de complexe structuren.

synthesis-indoxyl-glycosides-for-detection-glycosidase

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Het gebruik van specifieke glycosidases om suikers te verwijderen uit glycoproteïnen, gevolgd door SDS-PAGE is een waardevolle methode om glycan wijzigingen op eiwit-samples te detecteren en is een goede keuze voor de eerste glycobiologie studies. Veranderingen na deglycosylatie kunnen worden gedetecteerd als verschuivingen in gel mobiliteit of door kleuring met glycan gevoelige reagentia.

Identificatie en karakterisering van proteïne glycosylering met behulp van specifieke endo-en exoglycosidases

This video describes a spectrophotometric assay for the estimation of glycogen synthase activity. The method relies on the reduction in the absorbance of NADH with time and indicates glycogen synthase activity.

Spectrophotometric Assay to Determine Glycogen Synthase Activity

We presenteren een geautomatiseerde modulaire methode met hoge doorvoer voor de identificatie en karakterisering van microbiële exopolysachariden op kleine schaal. Deze methode combineert een snelle preselectie om de totale hoeveelheid uitgescheiden polysacchariden te analyseren met een gedetailleerd koolhydraat-vingerafdruk om het snelle screenen van nieuw geïsoleerde bacteriestammen of hele stamcollecties mogelijk te maken.

Geautomatiseerde Modular High Throughput exopolysaccharide Screening Platform Samen met Highly Sensitive Koolhydraten Fingerprint Analysis

Een high-throughput assay voor enzymscreening wordt beschreven. Deze multiplexed, gebruiksklare assaykit bestaat uit vooraf gekozen Chromogene Polymer Hydrogel (CPH) substraten en complexe Insoluble Chromogene Biomass (ICB) substraten. Doelenzym zijn polysacharide-afbrekende endo-enzymen en proteasen.

High-throughput screening van Carbohydrate-afbrekende enzymen via innovatieve Onoplosbare chromogeen substraat Assay Kits

Immunoglobuline G (IgG) N-glycan wordt gekenmerkt met behulp van hydrofiele interactie CHROMATOGRAFIE UPLC. Daarnaast is de structuur van IgG N-glycan duidelijk gescheiden. Hier gepresenteerd is een inleiding tot deze experimentele methode, zodat het op grote schaal kan worden gebruikt in onderzoeksinstellingen.

Immunoglobuline G N-Glycan-analyse door Ultra-prestatie vloeistofchromatografie

Een niet-gelabelde, niet-radio-isotopische methode om uracil-DNA glycosylase activiteit te testen werd ontwikkeld met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie voor directe apurine / apyrimidinische site-bevattende productanalyse. De test bleek vrij eenvoudig, specifiek, snel en gemakkelijk te gebruiken voor DNA-glycosylasemeting.

Uracil-DNA Glycosylase Assay door Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Bergmeyer glucosekwantificering is een spectrofotometrische enzymatische techniek die voornamelijk wordt gebruikt voor klinische tests die de hoeveelheid glucose nauwkeurig en gevoelig meten. Hierin presenteren we een protocol voor het gebruik van deze methode voor microbiologische monsters.

Bergmeyer glucosekwantificering voor microbiologische monsters

Deze studie stelt een reeks standaard operationele procedures (SOP's) vast voor het efficiënt screenen en isoleren van darmbacteriën die in staat zijn om C-glycosiden te splitsen.

Screening en isolatie van C-glycoside-splitsende darmbacteriën

Recente studies benadrukken de rol van enzymen van de menselijke darmmicrobiota bij het metaboliseren van C-glycosiden. Hier presenteren we een uitgebreide methodologie die analytische chemietechnieken (LC-MS/MS en NMR) integreert met structurele biologische benaderingen om de structurele en enzymatische reactieketens van deze C-glycoside-metaboliserende enzymen systematisch te karakteriseren.

Structurele biologie en analytische chemie benaderingen voor het karakteriseren van C-glycoside metabole enzymen in de menselijke darmmicrobiota

Dit protocol beschrijft een colorimetrische methode om betrouwbaar de invloed van chemicaliën op de Deiodinase 1 (DIO1)-activiteit in menselijke levermicrosomen te beoordelen met behulp van de Sandell-Kolthoff-reactie. Het bevat vooraf gedefinieerde acceptatiecriteria en statistische prestatie-indicatoren en ondersteunt lopende inspanningen richting opname van OESO-testrichtlijnen.

Colorimetrische beoordeling van deiodinase 1-activiteit in menselijke levermicrosomen met behulp van de Sandell-Kolthoff-reactie

Leer een nieuwe syntheseroute voor indoxylglycosiden met verbeterde opbrengst voor enzymactiviteitstests. Deze methode maakt efficiënte productie van chromogene substraten mogelijk.

Synthese van Indoxyl-glycosiden voor detectie van Glycosidase Activiteiten

Meer video's verkennen