Transposon Mediated Integratie van plasmide DNA in de subventriculaire zone van pasgeboren muizen om Novel Modellen van glioblastoma Genereer

Het doel van deze procedure is om nieuwe modellen voor glioblastoma's te creëren en uiteindelijk nieuwe therapeutische benaderingen te ontwikkelen door het induceren van de vorming van glioblastoma's met specifieke genetische mutaties bij muizen. Dit wordt bereikt door eerst transposon-plasmiden te maken, die de specifieke genen van belang coderen. De volgende stappen zijn het voorbereiden van de plasmiden met een transfectie reagens en ze te injecteren in de laterale ventrikel van neonatale muizen.

Opname in tumorprogressie wordt vervolgens bewaakt door luminiscentie. Wanneer de dieren talrijker worden, worden ze geslacht voor histologische en immunohistochemische analyse. Zo worden nieuwe glioblastoma's met specifieke genetische veranderingen geïnduceerd in wild type of doelgerichte genetische achtergronden.

Deze tumoren kunnen in vivo worden bestudeerd of in vitro worden gebruikt om nieuwe cellijnen te genereren die geschikt zijn voor biochemische analyse en cytotoxiciteitsexperimenten met chemotherapeutische middelen. Het grote voordeel van deze techniek boven andere methoden, zoals bijvoorbeeld orthotopische injecties van glioblastoma-cellijnen, is dat tumoren worden geïnduceerd door de kwaadaardige transformatie van cellen die endogeen zijn in één immunocompetent dier, met behulp van genetische veranderingen die zeer specifiek zijn gekozen. Dit proces reproduceert de etiologie van de menselijke ziekte nauwkeuriiger en hervat de belangrijkste histopathologische kenmerken van menselijke GBM.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neuro-oncologie, zoals wat de drivermutaties zijn die verantwoordelijk zijn voor het induceren van verschillende typen glioblastoma multiforme, klassiek, pre-neuronaal, neuronaal chy bij volwassenen of bij kindertumoren. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de therapie van GPM, aangezien nieuwe chemotherapeutica, stralingsimmunotherapieën of een combinatie daarvan relatief snel in vivo of in vitro kunnen worden getest met behulp van dit model.

Ik kreeg het idee voor deze methode voor het eerst toen ik het besprak met mijn collega, Dr. John aan de Universiteit van Minnesota, die het oorspronkelijke hersentumormodel had ontwikkeld met behulp van de door slaapschoonheid gemediëerde integratie van oncogenen, een remmer van tumorsuppressorgenen in het gastheergenoom-DNA. Ik dacht dat deze methodologie zeer krachtig zou zijn om de impact van nieuwe mutaties in tumorprogressie te bestuderen en te helpen bij de ontwikkeling van gerichte therapieën voor hersenkanker. Drie tot vier weken voorafgaand aan het experiment, zet een muizenfokkerijkooi op met één mannetje en één vrouwtje, inclusief een gekleurde plastic iglo om de omgeving te verrijken en de kans op paring te vergroten. Verwijder het mannetje zodra een zwangerschap is bevestigd, en start 18 dagen na de paringsdag met het monitoren van de vrouwtjes op levering.

Zorg ervoor dat er een draagmoeder beschikbaar is rond de tijd van de bevalling. Op de eerste postnatale dag, voer de intraventriculaire injecties uit. Bereid de injectie-oplossing voor door eerst Ali, 20 microliters van de DNA-mix te citeren, die de transpose op plasmiden bevat met een eindconcentratie van 0,5 microgram DNA per microliter.

Voeg vervolgens een 20 microliter aliquot PEI-oplossing toe aan de DNA-oplossing en laat ze 20 minuten tot een uur incuberen bij kamertemperatuur, waarna het mengsel op ijs moet worden bewaard. Voor de injectienaald, bevestig een 10 microliter spuit aan een 30 gauge hypodermische naald, afgeschuind op 12,5 graden. Bevestig vervolgens de spuit aan een micropomp met automatische injectie.

Test de setup met 10 microliter water en zorg ervoor dat de spuit leeg is. Koel nu de neonatale stereotactische fase af met een slurry van droog ijs en alcohol. Wanneer deze is afgekoeld tot tussen de twee en acht graden Celsius, gaat u verder met de injecties.

Verdoof eerst een pup door hem twee minuten op ijs te leggen. Terwijl de pup op ijs ligt, laadt u de spuit met de injectie-oplossing. Zodra de pup verdoofd is, brengt u deze over naar de frame en immobiliseert u het hoofd tussen de met gaas bedekte oorstaven.

Controleer of de dorsale zijde van de schedel horizontaal en evenwijdig aan het frameoppervlak is. Ook de craniale naden moeten duidelijk zichtbaar zijn. Als het hoofd van de pup niet stevig genoeg geïmmobiliseerd is, zal het bewegen tijdens de injectie.

Terwijl als het te stevig tussen de oorstaven van de frame wordt ingedrukt, zal het lambda niet zichtbaar zijn en zal de druk in het hoofd ervoor zorgen dat de geïnjecteerde oplossing lekt Met de pup stevig vastgegrepen door de frame, veegt u het hoofd af met 70% ethanol, laat vervolgens de naald zakken en pas de positie aan zodat deze het lambda raakt. Vervolgens verhoogt u de naald en beweegt u deze 0,8 millimeter lateraal en 1,5 millimeter tally. Laat het dan weer zakken tot het de huid licht verdiept.

Noteer de coördinaten van deze positie. Laat vervolgens de naald zakken, 1,5 millimeter door de huid en schedel en de cortex bij de laterale ventrikel daar. Injecteer 0,75 microliter gedurende 90 seconden en wacht een minuut om de oplossing te laten verspreiden terwijl u wacht.

De volgende pup die geïnjecteerd moet worden, kan worden verdoofd. Na het gewicht, laat de naald langzaam zakken en breng de pup vervolgens over naar een herstelplaats onder een verwarmingslamp. De tijd van verdoving tot opwarming moet minder dan 10 minuten zijn.

Hoe sneller hoe beter, controleer de ademhaling en wrijf indien nodig zachtjes over de ledematen om de ademhaling te stimuleren. Zodra de pup is opgewarmd, een roze kleur heeft en gelijkmatig ademt, brengt u hem terug naar zijn moeder. Dit duurt meestal vijf tot zeven minuten vanaf de injectie.

Als meerdere pups worden geïnjecteerd, moeten ze allemaal hersteld zijn voordat ze worden teruggegeven aan de moeder. Als na een half uur alle pups er nog niet klaar voor zijn, dan retourneert u er de helft en retourneert u de rest later aan het einde van de procedure, controleer de dam. Na het retourneren van de pups.

Als ze niet reageert op de pups, voegt u de draagmoeder toe aan de kooi. 24 tot