Name: Transposon Mediated Integratie van plasmide DNA in de subventriculaire zone van pasgeboren muizen om Novel Modellen van glioblastoma Genereer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Leer hoe je glioblastoommodellen genereert bij pasgeboren muizen via transposon-geïntegreerd plasmide-DNA in de subventriculaire zone. Deze methode maakt tumormonitoring en genetische analyse mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dr. John Ohlfest en Dr. Stacey Decker13 voor de genereuze gift van plasmiden en voor de training die we kregen om deze methode onder de knie te krijgen. We danken Marta Dzaman voor haar hulp bij het standaardiseren van de Hematoxyline-Eosine kleuringsprocedure van in paraffine ingebedde secties. We danken ook Molly Dahlgren voor het doornemen van dit manuscript en het geven van nuttige suggesties. Dit werk wordt ondersteund door NIH/NINDS-subsidies aan MGC en PRL, Leah’s Happy Hearts Foundation-subsidie aan MCG en PRL. Alex’s Lemonade Foundation Young Investigator Award en de St. Baldrick’s Foundation Fellowship aan CK.

<ol><li>Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standards+of+care+for+treatment+of+recurrent+glioblastoma--are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet.</a> Neuro Oncol. 15 (1), 4-27 (2013).</li>
<li>Dai, C., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Glioma models.</a> Biochim Biophys Acta. 1551 (1), M19-M27 (2001).</li>
<li>Houchens, D. P., Ovejera, A. A., Riblet, S. M., Slagel, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+brain+tumor+xenografts+in+nude+mice+as+a+chemotherapy+model%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Human brain tumor xenografts in nude mice as a chemotherapy model.</a> Eur J Cancer Clin Oncol. 19 (6), 799-805 (1983).</li>
<li>Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+multiforme%3A+the+terminator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma multiforme: the terminator.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6242-6244 (2000).</li>
<li>Candolfi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology%3A+neuropathological+characterization+and+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> J Neurooncol. 85 (2), 133-148 (2007).</li>
<li>Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modeling+of+gliomas+in+mice%3A+new+tools+to+tackle+old+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems.</a> Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).</li>
<li>Rojiani, A. M., Dorovini-Zis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomeruloid+vascular+structures+in+glioblastoma+multiforme%3A+an+immunohistochemical+and+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Glomeruloid vascular structures in glioblastoma multiforme: an immunohistochemical and ultrastructural study.</a> J Neurosurg. 85 (6), 1078-1084 (1996).</li>
<li>Hambardzumyan, D., Amankulor, N. M., Helmy, K. Y., Becher, O. J., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Adult+Gliomas+Using+RCAS%2Ft-va+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Modeling Adult Gliomas Using RCAS/t-va Technology.</a> Translational Oncology. 2 (2), 89-95 (2009).</li>
<li>Friedmann-Morvinski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiation+of+neurons+and+astrocytes+by+oncogenes+can+induce+gliomas+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiation of neurons and astrocytes by oncogenes can induce gliomas in mice.</a> Science. 338 (6110), 1080-1084 (2012).</li>
<li>Lynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral-Induced+High-Grade+Gliomas+in+Rats%3A+The+Effects+of+PDGFB%2C+HRAS-G12V%2C+AKT%2C+and+IDH1-R132H%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics+%3A+the+journal+of+the+American+Society+for+Experimental+NeuroTherapeutic%22%5BJournal%5D)">Lentiviral-Induced High-Grade Gliomas in Rats: The Effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H.</a> Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutic. , (2014).</li>
<li>Uhrbom, L., Hesselager, G., Nister, M., Westermark, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+brain+tumors+in+mice+using+a+recombinant+platelet-derived+growth+factor+B-chain+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of brain tumors in mice using a recombinant platelet-derived growth factor B-chain retrovirus.</a> Cancer Res. 58 (23), 5275-5279 (1998).</li>
<li>Marumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+mouse+glioma+model+using+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors.</a> Nat Med. 15 (1), 110-116 (2009).</li>
<li>Wiesner, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+induction+of+genetically+engineered+brain+tumors+in+mice+using+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA.</a> Cancer Res. 69 (2), 431-439 (2009).</li>
<li>Bailey, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genesis+of+the+Percival+Bailey-Cushing+classification+of+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genesis of the Percival Bailey-Cushing classification of gliomas.</a> Pediatr Neurosci. 12 (4-5), 261-265 (1985).</li>
<li>Patel, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+highlights+intratumoral+heterogeneity+in+primary+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma.</a> Science. 344 (6190), 1396-1401 (2014).</li>
<li>Agnihotri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma%2C+a+brief+review+of+history%2C+molecular+genetics%2C+animal+models+and+novel+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Immunol+Ther+Exp+%28Warsz%29%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma, a brief review of history, molecular genetics, animal models and novel therapeutic strategies.</a> Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 61 (1), 25-41 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genomic+characterization+defines+human+glioblastoma+genes+and+core+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways.</a> Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).</li>
<li>Ivics, Z., Izsvak, Z., Minter, A., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functional+domains+and+evolution+of+Tc1-like+transposable+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of functional domains and evolution of Tc1-like transposable elements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (10), 5008-5013 (1996).</li>
<li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+reconstruction+of+Sleeping+Beauty%2C+a+Tc1-like+transposon+from+fish%2C+and+its+transposition+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells.</a> Cell. 91 (4), 501-510 (1997).</li>
<li>Hackett, P. B., Ekker, S. C., Largaespada, D. A., McIvor, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+beauty+transposon-mediated+gene+therapy+for+prolonged+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Sleeping beauty transposon-mediated gene therapy for prolonged expression.</a> Adv Genet. 54, 189-232 (2005).</li>
<li>Ammar, I., Izsvak, Z., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sleeping+Beauty+transposon+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Sleeping Beauty transposon toolbox.</a> Methods Mol Biol. 859, 229-240 (2012).</li>
<li>Mates, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evolution+of+a+novel+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+enables+robust+stable+gene+transfer+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates.</a> Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).</li>
<li>Koso, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+mutagenesis+identifies+genes+that+transform+neural+stem+cells+into+glioma-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).</li>
<li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COX-2+blockade+suppresses+gliomagenesis+by+inhibiting+myeloid-derived+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">COX-2 blockade suppresses gliomagenesis by inhibiting myeloid-derived suppressor cells.</a> Cancer Research. 71 (7), 2664-2674 (2011).</li>
<li>Geurts, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+genomes+of+human+cells+by+the+sleeping+beauty+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+Of+The+American+Society+Of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into genomes of human cells by the sleeping beauty transposon system.</a> Molecular Therapy: The Journal Of The American Society Of Gene Therapy. 8 (1), 108-117 (2003).</li>
<li>Dickins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+tumor+phenotypes+using+stable+and+regulated+synthetic+microRNA+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Probing tumor phenotypes using stable and regulated synthetic microRNA precursors.</a> Nat Genet. 37 (11), 1289-1295 (2005).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+double+markers+reveals+tumor+cell+of+origin+in+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma.</a> Cell. 146 (2), 209-221 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit artikel, we detail een veelzijdig en reproduceerbare werkwijze voor het genereren van nieuwe modellen van GBM gebruik SB transposase- gemedieerde integratie van oncogene plasmide-DNA in cellen rondom de subventriculaire zone van neonatale muizen. We presenteren een protocol om transposon plasmiden met nieuwe genen van belang te genereren, te illustreren hoe de progressie van de tumoren in levende dieren, en hoe histo-pathologische en immuno-histochemische kenmerken van deze tumoren te karakteriseren. <p class...

Glioblastoma multiforme (GBM) is de meest voorkomende (60%) primaire hersentumor bij volwassenen, met een mediane overleving van 15-21 maanden bij behandeling met chirurgie, radiotherapie en chemotherapie 1. Nieuwe therapieën voor GBM zijn noodzakelijk. Experimentele therapieën vereisen testen in diermodellen waarin de meest opvallende kenmerken van de ziekte bij de mens adequaat reproduceren. Strategieën om GBM induceren in knaagdieren omvatten chemische mutagenese met alkylerende agentia, germline of somatische genetische veranderingen, of transplantatie met behulp glioomcellijnen 2. De meest gebruikte modellen gebruiken implantatie van glioma cellijnen, hetzij orthotopically, in de hersenen of subcutaan met syngene cellen bij dieren met identieke genotype; of xenogene cellen, meestal humane GBM cellijnen, geïmplanteerd in immuun gecompromitteerde muizen 3. Xenotransplantaties bieden vele voordelen voor de studie van intracraniële tumoren: gemak van reproduceerbaarheid, standardized groeicijfers, de tijd van de dood en tumorlokalisatie. Echter, deze modellen hebben beperkingen als gevolg van de kunstmatige, invasieve chirurgische benadering gebruikt voor implantaties en de beperkte mogelijkheid om histologische nauwkeurig te reproduceren beschikt kenmerk van de menselijke GBM (WHO graad IV): pseudo-pallisading necrose, nucleaire atypias, diffuse invasie, micro-vasculaire proliferatie en de vorming van glomeruloid vaatafwijkingen 4-7. Inductie van GBM door het veranderen van het genoom van somatische cellen met oncogeen DNA, of met virale vectoren 8-12, of transposon-gemedieerde integratie 13, reproduceert beter de etiologie van menselijke ziekten en herhaalt histo-pathologische kenmerken van menselijke GBM. Historisch, tumoren van het centrale zenuwstelsel zijn geclassificeerd op basis van de waargenomen cel van oorsprong, die werd waargenomen, zou een voorspellende factor voor overleving 14 zijn. GMB&#39;s worden ingedeeld in primaire en secundaire. Opkomende bewijs today wijst op de zeer heterogene karakter van de primaire glioblastoma 15. Secundaire GBM (15%), het resultaat van maligne transformatie laagwaardige astrocytomen (WHO graad I) en anaplasic astrocytomen (WHO graad II), geassocieerd eerder optreden van de ziekte, betere prognose en een &quot;proneural&quot; patroon van genexpressie , terwijl primaire GBM (85%) een late onset, slechte prognose en gliacellen (klassiek), neurale of mesenchymale expressie patronen tonen. Of de patronen van genexpressie correleren met de reële cel van oorsprong van de tumor is nog actief onderzocht. Accumulerende gegevens blijkt dat de combinatie van genetische mutaties geassocieerd met GBMs predictief te overleven. Bijvoorbeeld, het verlies van heterozygocity (LOH) chromosomen 1p / 19q, IDH1 mutaties, PDGFRα versterkingen, in verband worden gebracht met secundaire GBMs, proneural expressie patroon en betere prognose, terwijl EGFR overexpressie, Notch en Sonic hedgehog pathway activering, Nf1 en PTEN verlies en mutaties van p53 zijn gecorreleerd met neurale, klassiek, of mesenchymale primaire GBM en slechtere prognose 16,17. De komst van grootschalige sequentiebepalingsprojecten en de accumulatie van verschillende patiëntenmonsters voor het testen brengt een schat aan nieuwe informatie betreffende genetische mutaties en routes betrokken bij GBM pathogenese en progressie en de mogelijkheid van geïndividualiseerde geneeskunde, waar therapieën specifiek kunnen worden afgestemd de genetische afwijkingen van de patiënt. Uiteindelijk is de voorspellende waarde van deze mutaties en routes systematisch te evalueren en mogelijke behandelingen testen telkens vereist diermodellen van GBM met vooraf bepaalde genetische veranderingen. Transposon gemedieerde integratie van genomisch DNA biedt bruikbaar zijn. The Sleeping Beauty transposon systeem, lid van de Tc1 / zeeman klasse van transposons, werd &quot;wakker&quot; (gebouwd) in een multi-step process van plaatsspecifieke mutagenese van een zalmachtige transposase gen, die slapende meer dan 10 miljoen jaar geleden werd 18,19. In wezen DNA transposons geflankeerd door specifieke sequenties (omgekeerde herhalingen / directe herhalingen: IR / DR) kan door middel van de activiteit van Doornroosje transposase worden geïntegreerd in het genoom in een &quot;knip en plak&quot; wijze. Het transposase erkent de uiteinden van de IR sites accijns de transposon en integreert willekeurig in een andere DNA-plaats tussen de basen T en A, basen die worden gedupliceerd aan beide uiteinden van het transposon tijdens omzetting (figuur 1a). Doornroosje transposase bestaat uit drie domeinen, een transposon bindend domein, een nucleair lokalisatiesignaal sequentie en een katalytisch domein. Vier transposase moleculen dienen de twee uiteinden van de transposon samen te brengen en zorgen voor de omzetting echter, indien te veel moleculen transposase aanwezig zijn, kunnen ze dimeriseren en tetrameer te remmende omzetting reactie 20. Een efficiënte omzetting reactie vereist een optimale verhouding van transposasegen om transposons. Het DNA dat codeert voor het transposase kan worden uitgebracht op hetzelfde plasmide met de transposon (CIS) of op een ander plasmide (trans). De optimale verhouding tussen het transposase en de transposons garanderen, kan een promoter met voldoende activiteit gekozen voor de expressie van het transposase (de &quot;cis&quot; model) of de verhouding van de plasmiden in de injectieoplossing kan worden geoptimaliseerd (de &quot;trans&quot; model). The Sleeping Beauty transposon systeem met succes kan worden gebruikt voor functionele genomica, insertiemutagenese, transgenese en somatische gentherapie 21. Omdat het een synthetische constructie opnieuw ontworpen om een functionele molecuul van een slapende zalmachtige variant, doet de Sleeping Beauty transposase niet binden aan andere transposons in mensen of andere zoogdieren 20. Sinds de ontdekking, moleculaire technieken heeft audiotoebed de omzetting werkzaamheid van het SB transposon systeem door veranderingen in het IR sequenties en toevoeging van TATA dinucleotiden flankeren de transposon, waardoor de pT2 transposons. Deze transposons hebben binding van de RvC geoptimaliseerd om de IR-website en de toegenomen effectiviteit van excisie. De SB transposase onderging ook een significante verbetering; het transposase gebruikt in experimenten die hierin is SB100X een hyperactief transposase gegenereerd door DNA shuffling strategie gevolgd door een grote genetische screen in zoogdiercellen 22. In dit rapport presenteren we een snelle, veelzijdige en reproduceerbare methode intrinsieke GBM induceren in muizen met niet-virale, transposon-gemedieerde integratie van plasmide-DNA in cellen van de sub- ventriculaire zone van neonatale muizen 23. We presenteren een eenvoudige manier om transposons met nieuwe genen vatbaar voor genomische integratie met behulp van de Schone Slaapster transposase maken en demonstreren hoe plasmide opname te controleren enprogressie van de ziekte met behulp van bioluminescentie. We hebben ook karakteriseren histologische en immuno-histochemische kenmerken van de GBM gereproduceerd met dit model. Bovendien presenteren we een snelle methode om primaire GBM cellijnen van deze tumoren genereren. Doornroosje model, waarin tumoren worden geïnduceerd uit cellen origineel aan het dier, kan de functionele beoordeling van de rol van GBM kandidaat genen in de inductie en progressie van tumoren. Dit systeem is ook goed geschikt voor het testen van nieuwe GBM behandelingen, waaronder immune therapieën in immunocompetente muizen, zonder de noodzaak van invasieve inflammatoire chirurgische procedures, waarbij de lokale micro-omgeving kunnen veranderen.

<table><tbody><tr><td>Stoelting's Lab Standard with Rat and Mouse Adaptors</td><td>Stoelting</td><td>51670</td><td>Andere bedrijven produceren vergelijkbare frames, elk van hen met kleine muisadapters is geschikt&nbsp;</td></tr><tr><td>Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td>Injecties kunnen zonder worden gemaakt,,maar&nbsp;&nbsp;&nbsp; de automatische injector zorgt voor verhoogde reproduceerbaarheid en gemak</td></tr><tr><td>10 &mu;l 700 series hand fitted MICROLITER syringe</td><td>Hamilton</td><td>Model 701</td><td>Dit spuitmodel zal betrouwbaar van 0,5 tot 500 ul oplossing afgeven. Andere spuiten (bijvoorbeeld 5 ul, Model 75) kunnen ook worden gebruikt</td></tr><tr><td>30 gauge hypodermic needle (1.25", 15o bevel)&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>S/O# 197462</td><td>Deze naald is ideaal om de huid en de schedel van een neonatale muis te doorboren zonder dat andere invasieve procedures nodig zijn. Als deze boter (dringt niet gemakkelijk de huid binnen) wordt, moet deze worden vervangen.</td></tr><tr><td>in vivo-jetPEI</td><td>Polyplus Transfection</td><td>201-10G</td><td>Portioneren in kleine volumes en bewaren bij -20 oC&nbsp;</td></tr><tr><td>D-Luciferin, Potassium Salt</td><td>Goldbio.com</td><td>LuckK-1g</td><td>Andere bronnen van vuurvlieg lucifierase zijn net zo adequaat</td></tr><tr><td>Hematoxylin Solution, Harris Modified</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HHS128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62550-01</td><td>Voor het inbedden van hersenen voor cryosectie en immunohistochemie</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12, no glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td>Voor de kweek van neurosferen</td></tr><tr><td>B-27&uml; Supplement (50X), serum free&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>Serumvrij supplement voor de kweek van neurosferen</td></tr><tr><td>N2 Supplement (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>Serumvrij supplement voor de kweek van neurosferen</td></tr><tr><td>Normocyn</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-1</td><td>Anti-mycoplasmamiddel voor de kweek van neurosferen</td></tr><tr><td>Recombinant Human EGF</td><td>PEPROTECH</td><td>AF-100-15</td><td>Groeifactorsupplement voor de kweek van&nbsp; neurosferen</td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF-basic</td><td>PEPROTECH</td><td>100-18B</td><td>Groeifactorsupplement voor de kweek van&nbsp; neurosferen</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>HyClone HyQTase&nbsp; Cell Detachment Reagent&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV3003001</td><td>Voor de dissociatie van neurosferen</td></tr><tr><td>Kimble-Chase Kontes Pellet Pestle</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749510-0590</td><td>Voor de dissociatie van vers verzamelde tumoren</td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers mesh size 70 um</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>Voor het genereren van enkele celsuspensies van gedissocieerde neurosferen</td></tr><tr><td>Xylenes Histological grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>C8H10</td><td></td></tr><tr><td>Protocol Harris Hematoxylin Mercury free (acidified)</td><td>Fisher Scientific</td><td>245-678</td><td></td></tr><tr><td>Protocol Eosyn Y Solution (intensified)</td><td>Fisher Scientific</td><td>314-631</td><td></td></tr></tbody></table>

transposon mediated integratie van plasmide dna in de subventriculaire zone van pasgeboren muizen om novel modellen van glioblastoma genereer

Transposon Mediated Integration of Plasmid DNA into the Subventricular Zone of Neonatal Mice to Generate Novel Models of Glioblastoma

Er bestaat een dringende behoefte om de bijdrage van nieuwe genen aan de pathogenese en progressie van menselijke glioblastomen (GBM) te testen, de meest voorkomende primaire hersentumor bij volwassenen met een sombere prognose. Er komen snel nieuwe potentiële therapieën uit het laboratorium en deze vereisen systematische testen in experimentele modellen die de belangrijkste kenmerken van de menselijke ziekte nauwgezet reproduceren. Hierin beschrijven we in detail een methode om nieuwe modellen van GBM te induceren met transposon-gemedieerde integratie van plasmide-DNA in cellen van de subventriculaire zone van neonatale muizen. We presenteren een eenvoudige manier om nieuwe transposons te klonen die geschikt zijn voor genomische integratie met behulp van het Sleeping Beauty transposon systeem en illustreren hoe plasmide-opname en ziekteprogressie te volgen met behulp van bioluminescentie, histologie en immuno-histochemische analyse. We beschrijven ook een methode om nieuwe primaire GBM-cellijnen te creëren. Idealiter zal dit rapport de verdere verspreiding van het Sleeping Beauty transposon systeem onder hersentumoronderzoekers mogelijk maken, wat leidt tot een diepgaand begrip van GBM-pathogenese en progressie en tot het tijdig ontwerpen en testen van effectieve therapieën voor patiënten.

Om histo-pathologische kenmerken van SB-geïnduceerde glioblastoma karakteriseren, werden C57 / BL6 neonatale muizen geïnjecteerd op P1 met een plasmide dat codeert voor luciferase (pT2 / SB100x-Luc) in combinatie met plasmiden die coderen transposons met oncogeen DNA, dwz NRAS (pT / CAGGS -NRASV12) en SV40 LGT (pT / CMVSV40-LGT) (figuur 3c) of een plasmide dat codeert voor een korte haarspeld met p53 PDGFβ en een GFP reporter (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) in combinatie met NRAS (figuur 3d)...

Hier beschrijven we een efficiënt en veelzijdig protocol om nieuwe glioblastoma (GBM) te induceren, monitoren en analyseren met behulp van transposon DNA dat in de ventrikels van neonatale muizen wordt geïnjecteerd. Cellen van de subventriculaire zone, die het plasmide opnemen, transformeren, prolifereren en genereren tumoren met histo-pathologische kenmerken van menselijk GBM.

Transposon Mediated Integratie van plasmide DNA in de subventriculaire zone van pasgeboren muizen om Novel Modellen van glioblastoma Genereer

An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary ...

Het doel van deze procedure is om nieuwe modellen voor glioblastomen te creëren en uiteindelijk nieuwe therapeutische benaderingen te ontwikkelen door de vorming van glioblastomen te induceren die specifieke genetische mutaties bevatten in muizen. Dit wordt bereikt door eerst transposon-plasmiden te maken die de specifieke genen van belang coderen. De volgende stappen zijn het voorbereiden van de plasmiden met een transfectiereagens en het injecteren hiervan in het laterale ventrikel van pasgeboren muizen.De opname in de tumorprogressie wordt vervolgens gemonitord via luminescentie. Wanneer de tumoren groter worden, worden de dieren geofferd voor histologische en immunohistochemische analyse. Op deze manier worden nieuwe glioblastomen met specifieke genetische alteraties geïnduceerd in wild-type of genetisch gemodificeerde achtergronden.Deze tumoren kunnen in vivo worden bestudeerd of in vitro worden gebruikt om nieuwe cellijnen te genereren die geschikt zijn voor biochemische analyse en cytotoxiciteitsexperimenten met chemotherapeutica. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals bijvoorbeeld orthotopische injecties van een glioblastoom-cellijn, is dat tumoren worden geïnduceerd door de maligne transformatie van endogene cellen in één immuuncompetent dier, middels zeer specifiek gekozen genetische alteraties. Dit proces reproduceert de etiologie van de menselijke ziekte nauwkeuriger en recapituleert de belangrijkste histopathologische kenmerken van menselijk GBM.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de neuro-oncologie, zoals welke drivermutaties verantwoordelijk zijn voor het induceren van verschillende typen glioblastoma multiforme, zoals het klassieke, proneurale en neurale subtype bij volwassenen of in pediatrische tumoren. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van GBM, aangezien nieuwe chemotherapeutica, radiotherapie, immunotherapieën of een combinatie daarvan relatief snel in vivo of in vitro getest kunnen worden met behulp van dit model.Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode tijdens een overleg met mijn collega, Dr. John aan de University of Minnesota, die het initiële hersentumormodel had ontwikkeld met behulp van de door sleeping beauty transposasen gemedieerde integratie van oncogenen, een inhibitor van tumorsuppressorgenen, in het genomische DNA van de gastheer. Ik dacht dat deze methodologie zeer krachtig zou zijn om de impact van nieuwe mutaties op de tumorprogressie te bestuderen en zou kunnen helpen bij het ontwikkelen van doelgerichte therapieën voor hersenkanker. Richt drie tot vier weken vóór het experiment een kooi voor de muizenfokkerij in met één mannetje en één vrouwtje, inclusief een gekleurde plastic iglo om de omgeving te verrijken en de kans op paring te vergroten. Verwijder het mannetje zodra een zwangerschap is bevestigd en begin 18 dagen na de paringsdag met het monitoren van het vrouwtje op de bevalling.Zorg ervoor dat er rond het tijdstip van de bevalling een surrogaatmoeder beschikbaar is. Voer op de eerste postnatale dag de intraventriculaire injecties uit. Bereid de injectieoplossing voor door eerst 20 µL van het DNA-mengsel te nemen, dat de transpose op plasmiden bevat met een uiteindelijke concentratie van 0,5 µg DNA per µL.Voeg vervolgens een aliquot van 20 µL PEI-oplossing toe aan de DNA-oplossing en laat deze 20 minuten tot een uur incuberen bij kamertemperatuur, waarna het mengsel op ijs moet worden bewaard. Bevestig voor de injectienaald een spuit van 10 µL aan een hypodermische naald van 30 gauge, met een schuinte van 12,5 graden. Bevestig vervolgens de spuit aan een micropomp met automatische injectie.Test de opstelling met 10 µL water en zorg ervoor dat de spuit volledig is geleegd. Koel vervolgens het neonatale stereotaxische podium af met een mengsel van droogijs en alcohol. Wanneer de temperatuur tussen de twee en acht °C ligt, kunnen de injecties worden uitgevoerd.Anestheseer eerst een pup door deze twee minuten op ijs te plaatsen. Terwijl de pup op het ijs ligt, wordt de spuit gevuld met de injectie-oplossing. Zodra de pup is geanestheseerd, wordt deze naar het frame overgebracht en wordt de kop geïmmobiliseerd tussen de met gaas beklede oorstangen.Controleer of de dorsale zijde van de schedel horizontaal en parallel aan het oppervlak van het frame staat. Daarnaast moeten de craniale suturen duidelijk zichtbaar zijn. Als de kop van het pupje niet stevig genoeg is geïmmobiliseerd, zal deze tijdens de injectie bewegen.Wanneer de pup echter te stevig tussen de oorstangen van het frame wordt geklemd, zal de lambda niet zichtbaar zijn en zal de druk in de kop ervoor zorgen dat de geïnjecteerde oplossing weglekt. Terwijl de pup stevig door het frame wordt vastgehouden, wordt de kop afgeveegd met 70% ethanol; laat vervolgens de naald zakken en pas de positie aan zodat deze de lambda raakt. Til de naald daarna op en verplaats deze 0,8 millimeter lateraal en 1,5 millimeter posterieur. Laat de naald vervolgens opnieuw zakken tot deze de huid lichtjes indrukt.Noteer de coördinaten van deze positie. Breng vervolgens de naald 1,5 millimeter door de huid en de schedel naar beneden, in de cortex bij het laterale ventrikel. Injecteer 0,75 µL gedurende 90 seconden en wacht een minuut om de oplossing te laten verspreiden.De volgende pup die geïnjecteerd moet worden, kan worden geanestheseerd. Til na het wegen de naald langzaam omhoog en verplaats de pup vervolgens naar een herstelplaats onder een warmtelamp. De tijd tussen de anesthesie en het opwarmen moet minder dan 10 minuten bedragen.Houd de ademhaling nauwgezet in de gaten en wrijf indien nodig voorzichtig over de ledematen om de ademhaling te stimuleren. Zodra de pup is opgewarmd, een gezonde roze kleur heeft en een stabiele ademhaling vertoont, kan deze terug naar de moeder worden gebracht. Dit duurt gewoonlijk vijf tot zeven minuten na de injectie.Als er meerdere pups worden geïnjecteerd, moeten ze allemaal volledig zijn bijgekomen voordat er pups naar de moeder worden teruggebracht. Als alle pups na een half uur nog niet klaar zijn, breng dan de helft van hen terug naar haar en breng de rest later terug aan het einde van de procedure; monitor de moeder. Na het terugbrengen van de pups.Als zij niet reageert op de jongen, voeg dan de surrogaatmoeder aan de kooi toe. Controleer 24 tot 72 uur na de injectie de plasmidopname en breng alle jongen over naar zeswellse weefkweekschalen, met één jong per well. Vul vervolgens een spuit van 1 ml met 30 mg/ml Lucifer in saline of PBS en bevestig een hypodermische naald van 30 gauge.Injecteer 30 µL van de oplossing subcutaan tussen de schouderbladen van elke pup; om letsel aan de pup te voorkomen, dient de oplossing onder een kleine huidplooi te worden geïnjecteerd. Plaats de pups onmiddellijk in een in vivo bioluminescentie-beeldingsysteem. Stel een sequentie in om vier opeenvolgende beelden te verkrijgen met intervallen van één minuut, automatische belichting, grote binning en een diafragma van één. Later.Na ongeveer 17 dagen kunnen de dieren macroscopische tumoren beginnen te vormen die detecteerbaar zijn via bioluminescentie en histologie. Voor het monitoren van de tumoren kan tot zes weken nodig zijn. Injecteer 100 µL Luciferian-oplossing intraperitoneaal met een naald van gauge 26.Anestheseer de dieren na drie minuten in een isofluraan-zuurstofkamer en plaats de dieren in de beeldkamer die is uitgerust met kegels om het isofluraan te verspreiden. Neem een serie van zes beelden op met intervallen van twee minuten, een automatische belichtingstijd, medium binning en een open diafragma-F-stop van één. De regio van belang is doorgaans een ovaal over de kop; meet de luminescentie-intensiteit in elk dier met dezelfde instellingen om histopathologische kenmerken van SB-geïnduceerde glioblastomen te karakteriseren.C 57 black six pasgeboren muizen werden op P1 geïnjecteerd met een plasmide dat luciferase codeert in combinatie met NRAS- en SV 40 large T-plasmiden, Inod-transposonen met oncogeen DNA. Alternatief werd een plasmide dat een short hairpin P 53 codeert met PDGF bèta en een GFP-reporter geïnjecteerd in combinatie met NRAS. Pseudopalisadenecrose was duidelijk zichtbaar, evenals perivasculaire en diffuse infiltratie in de hersenen.Parenchymale glioblastomen werden eveneens gemonitord met bioluminescentie. Dieren bezwijken gewoonlijk aan de tumorlast. Dit gebeurde wanneer de luminescentie een intensiteit van 10⁷ tot 10⁹ gekalibreerde eenheden bereikte.De mediane overleving van de dieren was voorspelbaar afhankelijk van de combinaties van oncogene transposonen die in de neonatale hersenen waren geïnjecteerd. De meest agressieve tumoren werden geïnduceerd met NRS; SV 40 large T-antigeen de novo-tumoren werden gekenmerkt door de expressie van kenmerkende moleculen. Opkomende tumoren die GFP tot expressie brachten en geïnduceerd waren met SHP 53 en nras, drukten de neurale stamcelmarker neston uit, en sommige drukten ook gliofibrillair zuur protein uit.Na 56 dagen werd een tumor aangetroffen, omringd door talrijke GFAP-positieve astrocyten. Deze tumorcellen vertoonden expressie van nein, maar niet van GFAP. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe glioblastomen, met specifieke genetische mutaties, kunnen worden geïnduceerd via intraventriculaire injecties in neonatale muizen, en hoe de progressie van de ziekte met bioluminescentie kan worden gemonitord.In het artikel vindt u details over hoe u eenvoudig nieuwe trans pro-plasmiden kunt klonen die genen van belang coderen, en hoe u de tumoren kunt monitoren en analyseren via histologie en immunohistochemie. Daarnaast vindt u een gedetailleerde methode voor het genereren van nieuwe glioblastoomcellijnen uit dieren met genetisch gemodificeerde tumoren. We hopen dat dit artikel zal helpen de ontdekking van nieuwe therapieën voor deze verwoestende menselijke ziekte te versnellen.

transposon-mediated-integration-plasmid-dna-into-subventricular-zone

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video describes an efficient technique to induce glioblastomas (GBM) using transposon DNA injected into the ventricles of neonatal mice. Cells of the subventricular zone, which take up the plasmid, transform, proliferate, and generate tumors with histopathological characteristics of human GBM.

Glioblastoma Induction Using SB Mediated Transposition: A Technique for Generating Novel Mouse Model Using Transposon Mediated Integration of SB Plasmid into Neonatal Mouse Brain

Neuroblast migratie is een fundamentele gebeurtenis in postnatale neurogenese. We beschrijven een protocol voor efficiëntie-etikettering van neuroblasts door in vivo postnatale elektroporatie en de daaropvolgende visualisatie van hun migratie met behulp van time-lapse imaging van acute hersenen plakjes. Wij beschikken over een beschrijving van de kwantitatieve analyse van neuroblast dynamiek door video-tracking.

In vivo Postnatale Elektroporatie en time-lapse imaging van neuroblast Migratie in Muis Acute Brain Slices

We hebben een corticaal orthotope glioblastoom model vastgesteld muizen intravitale twee-foton microscopie dat de biofysische beperkingen recapituleert beginsel zullen spelen tijdens de groei van de tumor. Een chronische glazen venster vervangen van de schedel boven de tumor kan de follow-up van de progressie van de tumor na verloop van tijd door twee-foton microscopie.

Een orthotope Glioblastoma Muis Model Handhaving Brain Parenchymale fysieke beperkingen en geschikt voor intravitale twee-foton microscopie

Deze procedure laat zien hoe interneuronen in de zich ontwikkelende voorhersenen van muizen kunnen worden gericht door middel van in utero elektroporatie. Deze techniek was bijzonder efficiënt om selectieve genexpressie in interneuron-subtypen te bereiken die bestemd zijn voor de oppervlakkige lagen van de cortex.

Subtype-selectieve Electroporatie van corticale Interneurons

Hier demonstreren we een techniek voor wijdverspreide neuronale transductie door intraventriculaire injectie van adeno-geassocieerd virus in de neonatale muisbrein. Deze methode biedt een snelle en eenvoudige manier om levenslange expressie van vireel aangeboden transgenen te bereiken.

Intracerebroventriculaire Viral Injectie van de Neonatale Mouse Brain voor persistent en wijdverbreide Neuronale Transduction

Hier voorgesteld is een eenvoudige methode voor het isoleren en flowcytometrische analyse van glioma infiltrerende perifere mononucleaire cellen die tijdsafhankelijk kwantitatieve gegevens over het aantal en activeringsstatus van immuuncellen die het begin hersentumor micro oplevert.

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen

Cel-autonome functies van genen in de hersenen kunnen worden bestudeerd door het induceren van verlies of winst van functie in dunbevolkte van cellen. Hier beschrijven we in utero electroporation om te Cre recombinase leveren in dunbevolkte corticale neuronen met floxed genen te ontwikkelen om te leiden tot verlies van functie in vivo.

Cre-lox recombinatie bij muis hersenschors via In Utero Electroporation inducerende

Laser microdissectie (LMD) is een gevoelige en zeer reproduceerbare techniek die kan worden gebruikt om paden die glioom heterogeniteit en invasie te bemiddelen blootleggen. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol om discrete gebieden te isoleren van glioomweefsel met behulp van laser LMD, gevolgd door transcriptomische analyse.

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Het gebruik van een immunocompetent, autochtoon tumormodel aangedreven door gemeenschappelijke patiëntmutaties voor preklinische tests is van cruciaal belang voor immunotherapeutische tests. Dit protocol beschrijft een methode om muismodellen voor hersentumoren te genereren met behulp van op elektroporatie gebaseerde afgifte van plasmide-DNA die veelvoorkomende patiëntmutaties vertegenwoordigen, waardoor een nauwkeurig, reproduceerbaar en consistent muismodel wordt verkregen.

Modellering van hersentumoren in vivo met behulp van op elektroporatie gebaseerde afgifte van plasmide-DNA dat de handtekeningen van patiëntmutaties vertegenwoordigt

Sepsis verwijst naar een systemic inflammatory response syndrome als gevolg van een bacteriële infectie, en kan worden gesimuleerd door een chirurgische techniek genoemd cecal ligatie en punctie (CLP). Hier beschrijven we een methode om CLP-geïnduceerde diermodel te gebruiken om geneeskrachtige kruiden te screenen op therapeutische middelen.

Het gebruik van dierlijk model van Sepsis op nieuwe kruidentherapieën Evalueer

Leer hoe je glioblastoommodellen genereert bij pasgeboren muizen via transposon-geïntegreerd plasmide-DNA in de subventriculaire zone. Deze methode maakt tumormonitoring en genetische analyse mogelijk.

Transposon Mediated Integratie van plasmide DNA in de subventriculaire zone van pasgeboren muizen om Novel Modellen van glioblastoma Genereer (Video) | JoVE Journal

Transposon Mediated Integratie van plasmide DNA in de subventriculaire zone van pasgeboren muizen om Novel Modellen van glioblastoma Genereer

Meer video's verkennen