Uitgebreide beoordeling van Kiembaan chemische toxiciteit De nematode

Het algemene doel van deze procedure is om de kiemlijntoxiciteit van chemicaliën uitgebreid te beoordelen met behulp van de nematode C. elegans. Dit wordt bereikt door eerst de wormen te synchroniseren door een verdunde bleekoplossing toe te voegen aan een populatie wormen van verschillende stadia van de C. elegans PXOL1 GFP-stam. Deze stap genereert een groot aantal embryo's die door hun eischil beschermd zijn tegen de bleek.

De tweede stap is het genereren van een gesynchroniseerde L1-larvenpopulatie door de embryo's in vloeistof zonder voedsel te laten uitkomen. Vervolgens groeien de wormen naar hun vierde larvale stadium of L4, waarna ze 65 uur lang in vloeistof worden blootgesteld aan de betreffende chemicaliën. De laatste stap is de visualisatie via fluorescentiemicroscopie van de expressie van de GFP-reporters in embryo's in de uterus van de wormen.

Uiteindelijk weerspiegelt de proportie GFP-positieve embryo's in vergelijking met de DMSO-controle de antigeniciteit van de geteste verbindingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals Rodin-modellen of celcultuurassays, is dat we de geniciteit en kiembaantoxiciteit van chemicaliën kunnen beoordelen in een volledig diermodel, terwijl we tegelijkertijd een high-throughput assay uitvoeren tijdens de procedure. Vandaag wordt de procedure uitgevoerd door de postdoctoral fellow Dr. Daniella Perotti.

De GR-wormen voor deze procedure werden vooraf geprepareerd zoals beschreven in de bijbehorende protocoltekst. Verzamel de GR-wormen van het nematodegroeimedium of de NGM-platen door ze te wassen met één tot twee milliliter M9 en over te brengen naar een conische buis van 15 milliliter. Laat de GR-wormen gedurende ongeveer vijf tot 10 minuten bezinken op de bodem van de conische buis van 15 milliliter. Verwijder vervolgens het supernatant zonder het wormpellet te verstoren.

Draag het wormpellet over naar twee tot vier microcentrifugebuisjes en voeg één milliliter verdunde bleekoplossing toe aan elk buisje. Incubeer twee tot drie minuten bij kamertemperatuur. Volg de voortgang van de reactie onder de stereomicroscoop om te bevestigen dat alle wormen dood zijn.

Bleek niet langer dan vijf minuten, omdat de embryo's kunnen afsterven. Verzamel de wormen door één minuut te centrifugeren op 3000 RPM.

Verwijder het supernatant en voeg één milliliter steriele M nine toe om de reactie te neutraliseren. Zorg ervoor dat alle materialen die na de bleekbehandeling in contact komen met de wormen steriel zijn. Was de wormen twee keer met M nine-medium.

Verwijder het supernatant en voeg 100 tot 200 µL M9 toe. Gebruik een glazen Pasteurpipet om een druppel van het wormen-M9-mengsel op schone NGM-platen aan te brengen en incubeer deze gedurende ten minste 24 uur bij 20 °C zodat de embryo's zonder voedsel kunnen uitkomen. De groei van de larven zal worden gestopt in het L1-stadium. Twee synchronisatiestappen.

Bleken en L-woord-uithongering worden gebruikt omdat het cruciaal is om een zeer synchrone populatie te verkrijgen om het aantal L4-larven dat voor de blootstelling wordt gebruikt te maximaliseren. Verzamel één dag na de vestiging van een gesynchroniseerde L1-larvenpopulatie de L1-larven van de heldere NGM-platen. Was de platen met één tot twee milliliter M9 en breng de L1-larven over naar een conische buis van 15 milliliter.

Laat de dode volwassen wormen gedurende ongeveer vijf minuten bezinken naar de bodem van de conische buis van 15 milliliter. Verzamel het supernatant waarin de L1-wormen zich bevinden in een nieuwe conische buis van 15 milliliter. Pelleteer de wormen door centrifugatie gedurende twee minuten bij 2.600 RPM.

Verwijder het supernatant waarbij ongeveer 500 µL achterblijft. Bepaal de concentratie wormen in de M9-oplossing door het aantal wormen in druppels van 10 µL te tellen. Tel met behulp van een stereomicroscoop ten minste vijf druppels.

Pas de concentratie van de wormen aan naar 20 tot 25 wormen per µL in M9, en voeg vervolgens 50 µL van het wormen-M9-mengsel toe aan NGM-platen. Gezaaid met OP50, de voedingsbacteriën, incuberen gedurende 65 uur bij 15 °C om de gesynchroniseerde L1-populatie te laten groeien tot ze het L4-stadium bereiken. Deze screening maakt gebruik van een CL-tegenstam die een fluorescerende transcriptionele reporter bevat om kiemlijndisruptie en inductie van embryonale aneuploïdie te detecteren.

Verzamel de L4-larven van de heldere NGM-platen door de platen te wassen met één tot twee milliliter M9 en breng ze over naar een conische buis van 15 milliliter. Laat de L4-wormen ongeveer vijf tot 10 minuten bezinken naar de bodem van de conische buis van 15 milliliter. Verwijder vervolgens het supernatant zonder de wormpellet te verstoren.

Voeg drie tot vijf milliliter M9 toe en bepaal de concentratie wormen in de M9-oplossing door het aantal wormen in druppels van 10 µL te tellen. Tel met behulp van een stereomicroscoop ten minste vijf druppels per monster. Resuspendeer de wormen in M9 tot een concentratie van één worm per milliliter.

Verdun de eerder bereide OP 50 bacteriën tienvoudig met M nine. Zorg ervoor dat de resuspendereerde bacteriën kamertemperatuur hebben bereikt, aangezien lagere temperaturen de ontwikkeling van de wormen beïnvloeden. Voeg eerst met een multichannelpipet 100 µL van het worm M nine-mengsel toe aan elke well van een 96-wells plaat met ronde bodem en een volume van twee milliliter. Voeg ten slotte 400 µL van de verdunde OP 50 bacteriën toe aan elke well.

Elke put bevat 100 wormen in 500 µL. Voeg 0,5 µL van de testchemische stof toe aan de gewenste putten om een eindconcentratie van 100 µM te bereiken. Een concentratie die gewoonlijk wordt gebruikt in chemische screens in CL elgan expose ethanol of DMSO-oplosmiddelcontroles bij een eindconcentratie van 0,1% als positieve controle.

Gebruik 100 micromolair zonder cosolvent. Seal de plaat met een adhesieve folie. Zorg ervoor dat de plaat goed is afgesloten om kruiscontaminatie tussen de wells te voorkomen.

Wikkel de plaat in aluminiumfolie. Plaats de plaat voor een passende periode in een schudmachine op de juiste temperatuur. Houd de kamertemperatuur rond de 20 °C, aangezien de temperatuur de groei van de wormen beïnvloedt na afloop van de chemische blootstelling in de schudmachine.

Laat de 96-wellplaten 10 tot 15 minuten rusten zodat de volwassen wormen naar de bodem van de plaat kunnen sedimenteren. Verwijder met een multichannelpipet 350 µL M9 uit elke well, waarbij u erop let dat de wormen op de bodem van de plaat niet worden verstoord. Was de wormen met 1 mL M9 en laat de plaat opnieuw 10 tot 15 minuten rusten zodat de volwassen wormen naar de bodem kunnen sedimenteren.

Verwijder één milliliter M9 uit elke well, waarbij u er zeer zorgvuldig op let de wormen op de bodem van de plaat niet te verstoren. Resuspendeer de wormen in de resterende M9. Neem 100 µL van het worm-M9-mengsel uit de 96-wells plaat en breng dit over naar de wells van een 384-wells plaat met zwarte wanden en een transparante bodem.

Herhaal het proces met wormen uit 4 platen van 96 putjes totdat alle putjes van de plaat van 384 putjes zijn gevuld. Het is belangrijk dat alle putjes hetzelfde volume hebben om de efficiëntie en snelheid van de autofocus tijdens het proces van beeldverwerving te verhogen. Voeg vervolgens één µL lale toe aan elk putje en laat de wormen ongeveer 30 minuten incuberen.

Lale werkt als een acetylcholinereceptor-agonist en immobiliseert de wormen; breng de plaat over naar een wide-field high-content microscoop die in staat is tot geautomatiseerde beeldvorming. Gebruik software voor high-content beeldacquisitie en analyse volgens de richtlijnen van de fabrikant. Selecteer het 4x objectief om per [eenheid] één afbeelding te verkrijgen.

Stel de GFP-beeldvormingsparameters in op een belichtingstijd van 45 milliseconden en een beeldresolutie van 2160 bij 2160. Begin met de beeldacquisitie waarbij de blootgestelde wormen direct worden afgebeeld op 384-wells platen. Het aantal wormen dat ten minste één GFP-positief embryo bevat, wordt voor elke well geteld en genormaliseerd naar het totale aantal wormen in die well, zoals hier wordt getoond.

Blootstelling aan chemische agentia zoals het microtubuli-gif no-code AOL leidt tot de inductie van een hoog percentage GFP-expresserende embryo's in vergelijking met de DMSO-controle. De GFP-positieve embryo's zijn significant helderder dan de zwakke achtergrondfluorescentie die in andere embryo's wordt waargenomen, evenals de autofluorescentie in de darm van de dieren. De rode pijl geeft GFP-positieve embryo's aan die duidelijk zichtbaar zijn in de uterus van een met no-code AOL behandelde worm.

Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals DNA-kleuring van de wormen, om een gedetailleerder beeld te krijgen van het effect van de chemicaliën op de kiemlijn. Deze techniek stelt onderzoekers op het gebied van de toxicologie in staat om snel de reproductieve toxiciteit en de kiemlijntoxiciteit van chemicaliën te beoordelen.