Name: Uitgebreide beoordeling van Kiembaan chemische toxiciteit De nematode Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Leer een high-throughput assay voor kiembaantoxiciteit met Caenorhabditis elegans en fluorescentie-microscopie. Deze methode helpt onderzoekers chemische effecten op embryonale ontwikkeling in vivo te beoordelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de volgende financieringsbronnen bedanken: NIH ES020353 en de Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award voor het mogelijk maken van dit werk.

1. Voorbereiding van Feeding Bacteriën OPMERKING: Deze sectie beschrijft de bereiding van het voeden van bacteriën (E. coli-stam OP50). <ol><li> Isoleren van een enkele kolonie van E. coli stam OP50 een lysogenie bouillon (LB) agar plaat en aseptisch inoculeren in 300 ml van geautoclaveerd LB-bouillon. </li><li> Laat de geïnoculeerde kweek gedurende de nacht groeien in een schudinrichting bij 200 rpm en 37 ° C, totdat verzadiging is bereikt. </li><li> Breng de OP50 in 6 steriele, vooraf gewogen 50 ml conische buizen. Pellet de bacteriën door centrifugeren gedurende 5 min bij 6000 rpm (5.000 xg). </li><li> Verwijder het supernatant en was de bacterie met 50 ml steriel M9. Tweemaal herhalen. </li><li> Na de tweede wasbeurt verwijdert u het overgebleven M9, ervoor te zorgen dat er geen M9 is links in de buis. </li><li> Bepaal het gewicht van de pellet door weging van de buis met de pellet bacteriën en aftrekken van het gewicht van de 50 ml conische buis. </li><li> Resuspendeer de pellet in M9 bij een concentratie van 100 mg / ml. </li><li> Bewaar de OP50 oplossing bij 4 ° C totdat het wordt gebruikt voor de worm cultuur. </li></ol> 2. Voorbereiding van Nematode groeimedium (NGM) Petri Platen OPMERKING: Deze sectie beschrijft de bereiding van NGM Petri platen, die de platen waar de C. zijn elegans wormen routinematig gehandhaafd in het laboratorium. <ol><li> Autoclaaf de NGM agar medium. </li><li> Met behulp van steriele procedures, afzien 17 ml van NGM agar oplossing in 6 cm Petri platen met behulp van een peristaltische pomp. OPMERKING: Een constante hoeveelheid agar in de platen vermindert de noodzaak voor heroriëntatie microscoop bij het overschakelen van de ene plaat naar de andere. </li><li> Laat de platen bij kamertemperatuur gedurende 2-3 dagen voor gebruik om de agar te laten stollen en laat het overtollige vocht te verdampen. </li><li> Zaad van de NGM platen met behulp van een steriele techniek. Solliciteer 1-2 druppels OP50 vloeibare cultuur en verspreiden met een glazen staaf. Zorg ervoor dat niethet gazon bacteriën verspreid tot aan de randen van de platen. </li><li> Laat het gazon OP50 te groeien gedurende 1-2 dagen bij kamertemperatuur voordat u de borden naar wormen groeien. </li></ol> 3. Bereiding van een synchrone wormenpopulatie OPMERKING: De levenscyclus van C. elegans omvat het beginstadium vier larvale stadia (L1-L4) en volwassenheid. Dit gedeelte beschrijft de bereiding van een tijdperk-synchrone bevolking van wormen. Alle materialen die in contact komen met C.elegans na het bleekmiddel behandeling moeten steriel zijn. <ol><li> Dag 1 - Voorbereiding van de Bij drachtige Worm Bevolking <ol><li> Gebruik NGM platen waarin het merendeel van de wormenpopulatie uit uitgehongerd L1 larven. </li><li> Verzamel de L1 larven met een gesteriliseerde worm te halen en over te brengen naar vers 6 cm NGM platen bezaaid met OP50. Incubeer gedurende ongeveer 65 uur bij 20 ° C totdat het merendeel van de wormen zwangere volwassenen. Naarvermijd plaat overbevolking en laat de wormen om te groeien zonder uitputting van de bacteriën, niet meer dan een of twee clusters van L1 larven niet overdragen aan elke verse NGM plaat. </li></ol></li><li> Dag 4 - Oprichting van een Gesynchroniseerde L1 Larven Bevolking <ol><li> Verzamel de gravid wormen uit de NGM platen door ze te wassen met 1-2 ml van M9 en overbrengen naar een conische buis van 15 ml. </li><li> Laat de zwangere wormen bezinken naar de bodem van de 15 ml conische buis gedurende ongeveer 5-10 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder verstoring van de worm pellet. </li><li> Breng de worm pellet tot 2-4 microcentrifugebuisjes en voeg 1 ml bleekwater / NaOH-oplossing. Incubeer gedurende 2-3 minuten bij kamertemperatuur. De voortgang van de reactie onder de stereomicroscoop bevestigen de wormen dood. Niet bleken langer dan 5 min als de embryo&#39;s kon sterven. </li><li> Verzamel de wormen door centrifugeren gedurende 1 min bij 3000 rpm (900 xg). Verwijder de bovenstaande vloeistof en voeg 1 ml steriel M9 aanneutraliseren de reactie. </li><li> Was de wormen tweemaal door centrifugeren gedurende 1 min bij 3000 rpm (900 xg). </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof verwijderd en M9 te 100-200 ul. </li><li> Met behulp van een glazen Pasteur pipet voeg een druppel van de worm / M9 mixen NGM duidelijk borden en incubeer ze gedurende ten minste 24 uur bij 20 ° C om het embryo te broeden. OPMERKING: Zonder voedsel groei van de larven zal worden gestopt in het stadium L1. </li></ol></li><li> Dag 5 - Oprichting van een Gesynchroniseerde L4 larven Bevolking <ol><li> Verzamel de L1 larven van het heldere NGM platen door het wassen van de platen met 1-2 ml van M9 en overbrengen naar een conische buis van 15 ml. </li><li> Laat de dode volwassen wormen sediment op de bodem van de 15 ml conische buis gedurende ongeveer 5 min. </li><li> Verzamel de bovenstaande vloeistof, waarbij de L1 wormen in een nieuwe conische buis van 15 ml en precipiteren de wormen door centrifugeren gedurende 2 min bij 2600 rpm (1.000 xg). </li><li> Verwijder het supernatant leaving ongeveer 500 pi. </li><li> Bepaal de concentratie van wormen in de M9 oplossing door het tellen van het aantal wormen in 10 pl druppels met een stereomicroscoop. Telling minstens 5 druppels. </li><li> Stel de concentratie van de wormen tot 20-25 wormen / ul en voeg 50 ul van de worm / M9 mix NGM platen geënt met OP50. </li><li> Incubeer 65 uur bij 15 ° C (voor incubatie door het week-end) om de L1 gesynchroniseerde bevolking groeien tot ze de L4 stadium te bereiken. </li></ol></li></ol> 4. Blootstelling van Worms naar Chemicals in 96-well platen LET OP: Dit deel beschrijft het gebruik van Pxol1 :: GFP transcriptionele reporter met C. elegans stam screenen op de inductie van aneuploidie. <ol><li> Verzamel de L4 larven van het heldere NGM platen door het wassen van de platen met 1-2 ml van M9 en overbrengen naar een conische buis van 15 ml. </li><li> Laat de L4 wormen sediment op de bodem van de15 ml conische buis gedurende ongeveer 5-10 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof zonder verstoring van de worm pellet. </li><li> Voeg 3-5 ml M9 en bepaal de concentratie van wormen in de M9 oplossing door het tellen van het aantal wormen in 10 pl druppels met een stereomicroscoop. Telling tenminste 5 druppels per monster. </li><li> Resuspendeer de wormen in een concentratie van 1,000 wormen / ml in M9. </li><li> Verdun de OP50 bacteriën uit hoofdstuk 1 10-voudig met M9. Zorg ervoor dat de geresuspendeerd bacteriën bereiken kamertemperatuur omdat lagere temperatuur beïnvloedt worm ontwikkeling. </li><li> Met een multichannel pipet eerst toevoegen van 100 ul van de worm / M9 mengsel (van stap 4.4) en voeg 400 ul van de verdunde OP50 bacteriën (van stap 4.5) aan elk putje van een 2 ml diepe ronde bodem 96-well plaat. Aan het einde wordt elk putje met 100 wormen in 500 pi. </li><li> Voeg 0,5 ul van ofwel de teststof of de juiste controle op de gewenste putten, met een voorstel voor de definitieve krachtv bereikenatie 100 uM, concentratie algemeen in chemische schermen C. elegans 12. Expose ethanol of DMSO oplosmiddelcontroles bij een uiteindelijke concentratie van 0,1%. OPMERKING: Wij raden het gebruik van nocodazole (100 uM) als positieve controle. </li><li> Dicht de plaat met behulp van zelfklevende folie. Zorg ervoor dat u de plaat sluiten goed af om kruisbesmetting tussen de putten te voorkomen. </li><li> Wikkel de plaat met aluminiumfolie. </li><li> Breng de plaat op een schudinrichting (170-180 rpm) van de geschikte temperatuur voor een geschikte periode (24 of 65 uur). De temperatuur van de ruimte invloed op de groei van de wormen; Houd de temperatuur ongeveer 20 ° C. </li></ol> 5. Image Acquisition van Bij drachtige Worms in een 384-wells plaat LET OP: Dit deel beschrijft het gebruik van een hoog gehalte microscoop het imago van de blootgestelde Pxol1 :: GFP wormen, om de expressie van GFP visualiseren in het embryo in de baarmoeder van de volwassen hermafrodieten. Voorelk 384-well plaat worden gescreend, gebruik wormen 4 x 96 putjes. <ol><li> Na chemische blootstelling van de shaker, laat de 96-well plaat rust gedurende 10-15 minuten om de volwassen wormen bezinken naar de bodem van de plaat. </li><li> Met een multichannel pipet, verwijdert 350 gl van de M9, zeer voorzichtig de wormen te verstoren in de bodem van de plaat. </li><li> Was de wormen met 1 ml van M9 en herhaal stap 5.1. </li><li> Met een multichannel pipet, verwijdert 1 ml M9, waarbij vey voorzichtig de wormen te verstoren in de bodem van de plaat. </li><li> Met een multichannel pipet, resuspendeer de wormen in de resterende M9 en verzamel 100 ui de worm / M9 mengsel van 96-well platen en geladen in de putjes van een zwarte muren / onder 384-wells plaat. Herhaal het proces met wormen 4 x 96 putjes, tot alle putjes van de 384-wells plaat zijn geplaatst. OPMERKING: Het is belangrijk voor alle putten om hetzelfde volume hebben om het te vergrotenefficiëntie en snelheid van de autofocus tijdens de afbeelding overnameproces. Elk goed moet tussen de 80 tot 100 wormen. </li><li> Voeg 1 ul van levamisool (100 uM) aan elk putje en laat de wormen incubeer gedurende ongeveer 30 minuten. OPMERKING: Levamisole fungeert als een acetylcholine receptor agonist en immobiliseert de wormen. </li><li> Breng de plaat naar een groothoek hoog gehalte microscoop in staat om geautomatiseerde beeldvorming. </li><li> Voor het verwerven, gebruik dan een hoog gehalte afbeelding acquisitie en analyse software volgens de richtlijnen van de fabrikant. Selecteer de 4X doelstelling om 1 afbeelding per goed te verwerven. </li><li> Voordat u begint met het beeld acquisitie, pas de GFP beeldvorming parameters tot 45 msec van de blootstelling en de beeldresolutie aan 2.160 x 2.160. </li><li> Verzamel de gegevens als het aantal GFP positieve wormen gedeeld door het totale aantal wormen in de put, de laatste maatregel relatief consistente tussen putjes. </li></ol>

<ol><li>Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T">http://www.gao.gov/cgi-bin/getrpt?GAO-06-1032T</a> (2009).</li>
<li>Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+abnormalities+in+the+human+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosome abnormalities in the human oocyte.</a> Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).</li>
<li>Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trisomy+in+humans%3A+incidence%2C+origin+and+etiology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Trisomy in humans: incidence, origin and etiology.</a> Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).</li>
<li>Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deaths%3A+final+data+for+2006%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Vital+Stat+Rep%22%5BJournal%5D)">Deaths: final data for 2006.</a> Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).</li>
<li>Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+in+mammals%3A+recombination%2C+non-disjunction+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment.</a> Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li>
<li>Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome-counting+mechanisms+that+determine+nematode+sex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex.</a> Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).</li>
<li>Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+msh-5+is+required+for+both+normal+and+radiation-induced+meiotic+crossing+over+but+not+for+completion+of+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis.</a> Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).</li>
<li>Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Screening+Platform+for+the+Rapid+Assessment+of+Chemical+Disruption+of+Germline+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function.</a> Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Toxicity+Testing+in+the+21st+Century%3A+A+Vision+and+a+Strategy%22">Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy</a>. , The National Academies Press. (2007).</li>
<li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium-+and+high-throughput+screening+of+neurotoxicants+using+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans.</a> Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

De hier beschreven methode vormt de eerste grootschalige strategie voor de identificatie van de kiembaan toxische stoffen. Het vereist het gebruik van een GFP transgene Pxol-1 :: GFP bevatten stam die getrouw rapporteert de inductie van aneuploïdie in vroege embryo&#39;s wordt gebruikt als een proxy voor kiemlijn dysfunctie. De werkwijze omvat de zorgvuldige synchronisatie van een C. elegans worm bevolking en blootstelling wormen tegen chemicaliën 96 putjes gevolgd door beeldvorming van GFP positieve w...

Er zijn ongeveer 87.000 chemische stoffen geregistreerd voor de handel in de Verenigde Staten, maar slechts een klein aantal van deze zijn getest voor mogelijke gevolgen voor de gezondheid 1. Van degenen die zijn getest, is slechts een deel beoordeeld voor reproductieve gezondheidseffecten deels te wijten aan de moeilijkheid bij het bepalen van de wijziging van de vroege reproductieve gebeurtenissen in zoogdieren, vooral tijdens vrouwelijke ontwikkeling en differentiatie kiemcel. Inderdaad, de eerste meiotische gebeurtenissen plaatsvinden tijdens de vroege stadia van embryonale ontwikkeling bij vrouwelijke zoogdieren en zijn daardoor moeilijk toegankelijk en in een aantal geschikt zijn voor screening doeleinden. De kiemlijn geeft het cruciale verband tussen generaties, en de gewenste functie is afhankelijk van de precieze uitvoering van de ingewikkelde programma van cellulaire en chromosomale scheiding genoemd meiose. Ontregeling van het meiose kan tot verminderde vruchtbaarheid en de productie vangameten en embryo&#39;s met een afwijkend aantal chromosomen, een voorwaarde genoemd aneuploïdie. Chromosoomscheiding fouten in de meiose zeer relevant zijn voor de menselijke gezondheid. Chromosoomafwijkingen komen vaak met een frequentie van 1 in 150 levendgeborenen Trisomie 21, 18 en 13 en X en Y-chromosoom fouten zijn de meest voorkomende vormen 2,3. Bovendien, aangeboren afwijkingen, waaronder die van chromosomale oorsprong, zijn de belangrijkste oorzaak van kindersterfte dood in de VS 4 Het idee dat omgevingsinvloeden chromosomale segregatie en gedrag kunnen beïnvloeden is niet nieuw 5, maar is nog steeds slecht begrepen. Het is daarom van cruciaal belang om te onderzoeken welke van de chemicaliën geïntroduceerd in onze omgeving zijn interfereren met de menselijke vruchtbaarheid, vroege ontwikkeling en de algemene reproductieve gezondheid. In het licht van deze beperkingen van de zoogdieren modellen, hebben we een high-throughput screen test ontwikkeld tot reproductieve toxiciteit testen in de rondworm &lt;em&gt; C. elegans. We hebben een aantal belangrijke functies van deze veelgebruikte genetisch modelsysteem gemobiliseerd, zoals zijn kleine formaat, lage kosten, korte voortplantingscyclus, hoog percentage van geslachtscellen en het gemak van manipulatie 6. Wormen kunnen worden gekweekt in 96-well platen of hoog volume vloeibare kweken en door hun transparantie direct kan worden afgebeeld op platen voor detectie van fluorescerende reporters. De hieronder beschreven test maakt gebruik van deze eigenschappen en maakt gebruik van een worm stam die de fluorescente reporter Pxol-1 :: GFP kiemlijn verstoring en inductie van embryonale aneuploïdie detecteren. Het gebruik van deze reporter stam is gebaseerd op de algemeen zeldzaam voorkomen van mannetjes in een hoofdzakelijk hermafrodiete worm bevolking. Deze mannen (&lt;0,2%) van nature afkomstig van fout in de scheiding van het X-chromosoom 7. Aangezien kiemlijn verstoring leidt vaak tot fouten in segregatie autosomenen heterochromosomes, correleert beide met een verhoogde incidentie van mannetjes fenotype (X missegregation) als embryonale letaliteit (autosoom missegregation). Om de inductie van mannetjes gemakkelijk detecteren te omzeilen het vraagstuk van embryonale letaliteit wordt een mannelijk promotor (xol-1) toegepast om expressie van GFP rijden vroege embryo&#39;s vertoonden nog in de baarmoeder van de worm. Als zodanig is het uiterlijk van GFP-expressie embryo&#39;s gebruikt als een proxy voor de aanwezigheid van aneuploïde embryo&#39;s. Deze werkwijze is eerder gebruikt om genen die kiemlijn onderhoud en meiose 8,9 identificeren. Aangepast aan chemische screening, wordt deze stam die werkzaam zijn in een medium tot high-throughput screen. Belangrijk is dat de stam trouw meldt de aneugenicity chemicaliën en daarom relevant voor zoogdieren reproductieve eindpunten 10. De beschreven test is bijzonder nuttig toxicologen in farmaceutische en chemische industrie instellingen uitziendede toxiciteit van chemicaliën naar reproductieve eindpunten snelle beoordeling. Bovendien is deze test volledig in lijn met de bestuurlijke prioriteiten gemarkeerd in de toxiciteit in de ste eeuw rapport 21 11.

<table><tbody><tr><td>60 mm Vented, sharp edge Petri dishes</td><td>Tritech</td><td>T3315</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Apex</td><td>20-274</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 96-well clear round bottom 2 ml polypropylene deep well plate</td><td>Corning</td><td>P-DW-20-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptone</td><td>Apex</td><td>20-261</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-tryptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-2</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride (CaCl2)</td><td>VWR</td><td>AA12316-A1</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10138225</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>IC19018680</td><td></td></tr><tr><td>E. coli (OP50)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td><a href="http://www.cbs.umn.edu/cgc" target="_blank">http://www.cbs.umn.edu/cgc</a></td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>VWR</td><td>EM-4455S</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 384 well plates</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1937-32EA</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro XLS System</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Levamisole hydrochloride</td><td>Fluka</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate anhydrous (MgSO4)</td><td>VWR</td><td>97061-438</td><td></td></tr><tr><td>MetaXpress High Content Image Acquisition &amp; Analysis Software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Rayon films for biological cultures</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>BDH0316</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td>Deze microscoop heeft een totale vergroting van 3.35X tot 300X. Elke microscoop met vergelijkbare kenmerken zal werken.</td></tr><tr><td>TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td><a href="http://www.cbs.umn.edu/cgc" target="_blank">http://www.cbs.umn.edu/cgc</a></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Becton Dickinson</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

uitgebreide beoordeling van kiembaan chemische toxiciteit de nematode<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Het identificeren van de reproductieve toxiciteit van de duizenden chemische stoffen aanwezig in onze omgeving is een van de meest prikkelende uitdagingen op het gebied van milieu en gezondheid. Dit is deels te wijten aan het gebrek aan modelsystemen dat (1) nauwkeurig kan recapituleren toetsen kenmerken van reproductieve processen en (2) dit doen in een middellange tot high-throughput manier, zonder de noodzaak van een groot aantal gewervelde dieren. We beschrijven hier een test in de nematode C. elegans dat de snelle identificatie van kiembaan toxische stoffen mogelijk maakt door het monitoren van de inductie van aneuploïde embryo&#39;s. Door gebruik van een GFP reporter lijn worden fouten in chromosoomsegregatie gevolg zijn van door kiemlijn verstoring gemakkelijk gevisualiseerd en gekwantificeerd door geautomatiseerde fluorescentie microscopie. Dus de screening van een bepaalde reeks van verbindingen op de toxiciteit kan worden uitgevoerd in een 96- tot 384-well plaat formaat enkele dagen. Secundaire analyse van positieve hhet kan worden uitgevoerd om te bepalen of het chromosoom afwijkingen afkomstig van meiotische verstoring of vroege embryonale chromosoomsegregatie fouten. Al met al, deze test is een snelle first-pass-strategie voor de snelle beoordeling van kiembaan dysfunctie na blootstelling aan chemische stoffen.

Blootstelling van de Pxol-1 :: GFP reporter stam chemische middelen zoals het microtubule gif Nocodazole (figuur 1) leidt tot de inductie van een hoog percentage van GFP-expressie embryo in de baarmoeder blootgestelde volwassen hermafrodieten vergeleken met DMSO controle. De GFP-positieve embryo aanzienlijk helderder dan de zwakke achtergrond fluorescentie waargenomen in andere embryo en de auto-fluorescentie waargenomen in de darm van de dieren. Blootgestelde wormen rechtstreeks afgebeeld op 3...

We beschrijven de gedetailleerde stappen van een hoog-doorvoer chemische test bij de rondworm Caenorhabditis elegans die wordt gebruikt om de toxiciteit van de kiemcellen te beoordelen. Bij deze test wordt de verstoring van de kiemcellenfunctie na blootstelling aan chemicaliën gemonitord met behulp van een fluorescerende reporter specifiek voor aneuploïde embryo's.

Uitgebreide beoordeling van Kiembaan chemische toxiciteit De nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Het algemene doel van deze procedure is om de kiemlijntoxiciteit van chemicaliën uitgebreid te beoordelen met behulp van de nematode C. elegans. Dit wordt bereikt door eerst de wormen te synchroniseren door een verdunde bleekoplossing toe te voegen aan een populatie wormen van verschillende stadia van de C. elegans PXOL1 GFP-stam. Deze stap genereert een groot aantal embryo's die door hun eischil beschermd zijn tegen de bleek.De tweede stap is het genereren van een gesynchroniseerde L1-larvenpopulatie door de embryo's in vloeistof zonder voedsel te laten uitkomen. Vervolgens groeien de wormen naar hun vierde larvale stadium of L4, waarna ze 65 uur lang in vloeistof worden blootgesteld aan de betreffende chemicaliën. De laatste stap is de visualisatie via fluorescentiemicroscopie van de expressie van de GFP-reporters in embryo's in de uterus van de wormen.Uiteindelijk weerspiegelt de proportie GFP-positieve embryo's in vergelijking met de DMSO-controle de antigeniciteit van de geteste verbindingen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals Rodin-modellen of celcultuurassays, is dat we de geniciteit en kiembaantoxiciteit van chemicaliën kunnen beoordelen in een volledig diermodel, terwijl we tegelijkertijd een high-throughput assay uitvoeren tijdens de procedure. Vandaag wordt de procedure uitgevoerd door de postdoctoral fellow Dr. Daniella Perotti.De GR-wormen voor deze procedure werden vooraf geprepareerd zoals beschreven in de bijbehorende protocoltekst. Verzamel de GR-wormen van het nematodegroeimedium of de NGM-platen door ze te wassen met één tot twee milliliter M9 en over te brengen naar een conische buis van 15 milliliter. Laat de GR-wormen gedurende ongeveer vijf tot 10 minuten bezinken op de bodem van de conische buis van 15 milliliter. Verwijder vervolgens het supernatant zonder het wormpellet te verstoren.Draag het wormpellet over naar twee tot vier microcentrifugebuisjes en voeg één milliliter verdunde bleekoplossing toe aan elk buisje. Incubeer twee tot drie minuten bij kamertemperatuur. Volg de voortgang van de reactie onder de stereomicroscoop om te bevestigen dat alle wormen dood zijn.Bleek niet langer dan vijf minuten, omdat de embryo's kunnen afsterven. Verzamel de wormen door één minuut te centrifugeren op 3000 RPM.Verwijder het supernatant en voeg één milliliter steriele M nine toe om de reactie te neutraliseren. Zorg ervoor dat alle materialen die na de bleekbehandeling in contact komen met de wormen steriel zijn. Was de wormen twee keer met M nine-medium.Verwijder het supernatant en voeg 100 tot 200 µL M9 toe. Gebruik een glazen Pasteurpipet om een druppel van het wormen-M9-mengsel op schone NGM-platen aan te brengen en incubeer deze gedurende ten minste 24 uur bij 20 °C zodat de embryo's zonder voedsel kunnen uitkomen. De groei van de larven zal worden gestopt in het L1-stadium. Twee synchronisatiestappen.Bleken en L-woord-uithongering worden gebruikt omdat het cruciaal is om een zeer synchrone populatie te verkrijgen om het aantal L4-larven dat voor de blootstelling wordt gebruikt te maximaliseren. Verzamel één dag na de vestiging van een gesynchroniseerde L1-larvenpopulatie de L1-larven van de heldere NGM-platen. Was de platen met één tot twee milliliter M9 en breng de L1-larven over naar een conische buis van 15 milliliter.Laat de dode volwassen wormen gedurende ongeveer vijf minuten bezinken naar de bodem van de conische buis van 15 milliliter. Verzamel het supernatant waarin de L1-wormen zich bevinden in een nieuwe conische buis van 15 milliliter. Pelleteer de wormen door centrifugatie gedurende twee minuten bij 2.600 RPM.Verwijder het supernatant waarbij ongeveer 500 µL achterblijft. Bepaal de concentratie wormen in de M9-oplossing door het aantal wormen in druppels van 10 µL te tellen. Tel met behulp van een stereomicroscoop ten minste vijf druppels.Pas de concentratie van de wormen aan naar 20 tot 25 wormen per µL in M9, en voeg vervolgens 50 µL van het wormen-M9-mengsel toe aan NGM-platen. Gezaaid met OP50, de voedingsbacteriën, incuberen gedurende 65 uur bij 15 °C om de gesynchroniseerde L1-populatie te laten groeien tot ze het L4-stadium bereiken. Deze screening maakt gebruik van een CL-tegenstam die een fluorescerende transcriptionele reporter bevat om kiemlijndisruptie en inductie van embryonale aneuploïdie te detecteren.Verzamel de L4-larven van de heldere NGM-platen door de platen te wassen met één tot twee milliliter M9 en breng ze over naar een conische buis van 15 milliliter. Laat de L4-wormen ongeveer vijf tot 10 minuten bezinken naar de bodem van de conische buis van 15 milliliter. Verwijder vervolgens het supernatant zonder de wormpellet te verstoren.Voeg drie tot vijf milliliter M9 toe en bepaal de concentratie wormen in de M9-oplossing door het aantal wormen in druppels van 10 µL te tellen. Tel met behulp van een stereomicroscoop ten minste vijf druppels per monster. Resuspendeer de wormen in M9 tot een concentratie van één worm per milliliter.Verdun de eerder bereide OP 50 bacteriën tienvoudig met M nine. Zorg ervoor dat de resuspendereerde bacteriën kamertemperatuur hebben bereikt, aangezien lagere temperaturen de ontwikkeling van de wormen beïnvloeden. Voeg eerst met een multichannelpipet 100 µL van het worm M nine-mengsel toe aan elke well van een 96-wells plaat met ronde bodem en een volume van twee milliliter. Voeg ten slotte 400 µL van de verdunde OP 50 bacteriën toe aan elke well.Elke put bevat 100 wormen in 500 µL. Voeg 0,5 µL van de testchemische stof toe aan de gewenste putten om een eindconcentratie van 100 µM te bereiken. Een concentratie die gewoonlijk wordt gebruikt in chemische screens in CL elgan expose ethanol of DMSO-oplosmiddelcontroles bij een eindconcentratie van 0,1% als positieve controle.Gebruik 100 micromolair zonder cosolvent. Seal de plaat met een adhesieve folie. Zorg ervoor dat de plaat goed is afgesloten om kruiscontaminatie tussen de wells te voorkomen.Wikkel de plaat in aluminiumfolie. Plaats de plaat voor een passende periode in een schudmachine op de juiste temperatuur. Houd de kamertemperatuur rond de 20 °C, aangezien de temperatuur de groei van de wormen beïnvloedt na afloop van de chemische blootstelling in de schudmachine.Laat de 96-wellplaten 10 tot 15 minuten rusten zodat de volwassen wormen naar de bodem van de plaat kunnen sedimenteren. Verwijder met een multichannelpipet 350 µL M9 uit elke well, waarbij u erop let dat de wormen op de bodem van de plaat niet worden verstoord. Was de wormen met 1 mL M9 en laat de plaat opnieuw 10 tot 15 minuten rusten zodat de volwassen wormen naar de bodem kunnen sedimenteren.Verwijder één milliliter M9 uit elke well, waarbij u er zeer zorgvuldig op let de wormen op de bodem van de plaat niet te verstoren. Resuspendeer de wormen in de resterende M9. Neem 100 µL van het worm-M9-mengsel uit de 96-wells plaat en breng dit over naar de wells van een 384-wells plaat met zwarte wanden en een transparante bodem.Herhaal het proces met wormen uit 4 platen van 96 putjes totdat alle putjes van de plaat van 384 putjes zijn gevuld. Het is belangrijk dat alle putjes hetzelfde volume hebben om de efficiëntie en snelheid van de autofocus tijdens het proces van beeldverwerving te verhogen. Voeg vervolgens één µL lale toe aan elk putje en laat de wormen ongeveer 30 minuten incuberen.Lale werkt als een acetylcholinereceptor-agonist en immobiliseert de wormen; breng de plaat over naar een wide-field high-content microscoop die in staat is tot geautomatiseerde beeldvorming. Gebruik software voor high-content beeldacquisitie en analyse volgens de richtlijnen van de fabrikant. Selecteer het 4x objectief om per [eenheid] één afbeelding te verkrijgen.Stel de GFP-beeldvormingsparameters in op een belichtingstijd van 45 milliseconden en een beeldresolutie van 2160 bij 2160. Begin met de beeldacquisitie waarbij de blootgestelde wormen direct worden afgebeeld op 384-wells platen. Het aantal wormen dat ten minste één GFP-positief embryo bevat, wordt voor elke well geteld en genormaliseerd naar het totale aantal wormen in die well, zoals hier wordt getoond.Blootstelling aan chemische agentia zoals het microtubuli-gif no-code AOL leidt tot de inductie van een hoog percentage GFP-expresserende embryo's in vergelijking met de DMSO-controle. De GFP-positieve embryo's zijn significant helderder dan de zwakke achtergrondfluorescentie die in andere embryo's wordt waargenomen, evenals de autofluorescentie in de darm van de dieren. De rode pijl geeft GFP-positieve embryo's aan die duidelijk zichtbaar zijn in de uterus van een met no-code AOL behandelde worm.Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals DNA-kleuring van de wormen, om een gedetailleerder beeld te krijgen van het effect van de chemicaliën op de kiemlijn. Deze techniek stelt onderzoekers op het gebied van de toxicologie in staat om snel de reproductieve toxiciteit en de kiemlijntoxiciteit van chemicaliën te beoordelen.

comprehensive-assessment-germline-chemical-toxicity-using-nematode

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Deze video introduceert een overlevingstest op korte termijn die een behandeling op acute toxiciteit test of een genetische stam test op resistentie tegen een toxische aandoening.  Het voorbeeldprotocol toont een voorbeeld overlevingstest waarbij wormen worden getest op hun vermogen om oxidatieve stress veroorzaakt door paraquat (PQ) te weerstaan.

C. elegans Overlevingstest: een toxiciteitstest op korte termijn

Hier presenteren we een Caenorhabditis elegans -specifieke test die is ontworpen om veranderingen in het koperen aversiegedrag te evalueren en het vermogen om een ​​gemeenschappelijke voedingsbron te lokaliseren, als het organisme zich voortbrengt van een goed gevoed aan hongerige voedingswaarde.

EEN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Voedingsstatus gebaseerde Koper Aversion Assay

We presenteren een gedragsopname-opstelling en protocol waarmee geautomatiseerde analyse van de nematode, Caenorhabditis elegans , de voorkeur geeft aan oplosbare verbindingen in een populatie gebaseerde assay. Dit artikel beschrijft de constructie van een gedragskamer, het gedragsprotocol en het gebruik van videoanalyse software.

Geautomatiseerde Analyse van een Chemische Sensorische Preference Assay van een Nematodebevolking

Een basisprotocol te beoordelen van de giftigheid van chemische stoffen in een model dier, Caenorhabditis elegans, wordt beschreven. De methode is geschikt en nuttig is voor de ontwikkeling van geneesmiddelen, alsook wat betreft de risico-evaluatie van verschillende milieuverontreinigende stoffen.

Meten van het Effect van chemische stoffen op de groei en voortplanting van Caenorhabditis elegans

Blootstelling aan toxische stoffen in het milieu kan acuut ontwikkeling met effecten op lange termijn beïnvloeden. Gedetailleerde protocollen worden geleverd om te illustreren een strategie met behulp van een effectieve lab-model om te bestuderen van het effect van vroege embryonale blootstelling aan Bisfenol A. Wij bieden vruchtbaarheid en gedrags tests om de doelmatigheid van onze toxische blootstelling bio-tests.

Gedrags- en reproductieve gevolgen van embryonale blootstelling aan toxische stoffen in lage dosis op lange termijn

Een kwantitatieve methode is ontwikkeld om te identificeren en te voorspellen van de acute toxiciteit van chemische stoffen door het automatisch analyseren de fenotypische profilering van Caenorhabditis elegans. Dit protocol wordt beschreven hoe behandelen van wormen met chemicaliën in een 384-well-plate, vastleggen van video's en kwantificeren van toxicologische verwante fenotypen.

Een High-throughput Assay voor de voorspelling van de chemische toxiciteit door geautomatiseerde fenotypische profilering van Caenorhabditis elegans

Trans-en multi generationele effecten van persistente chemicaliën zijn essentieel voor het beoordelen van hun langetermijngevolgen in het milieu en op de menselijke gezondheid. Wij bieden nieuwe gedetailleerde methoden voor het bestuderen van trans-en multi-generationele effecten met behulp van Free-Living nematode Caenorhabditis elegans.

Met behulp van Caenorhabditis elegans voor het bestuderen van trans-en multi-generationele effecten van toxicantia

Hier presenteren we een protocol om de neuroprotectieve activiteiten van testverbindingen in Caenorhabditis elegans te beoordelen, inclusief polyglutamineaggregatie, neuronale dood en chemoavoidancegedrag, evenals een voorbeeldige integratie van meerdere fenotypen.

Caenorhabditis elegans als een modelsysteem voor het ontdekken van bioactieve verbindingen tegen polyglutamine-gemedieerde neurotoxiciteit

Jongvolwassen Caenorhabditis elegans-nematoden worden gedurende 2-24 uur blootgesteld aan verschillende concentraties commerciële pesticiden of andere toxische stoffen. Vervolgens kunnen verschillende neuronen worden gevisualiseerd met behulp van fluorescerende spanningen. Dit artikel laat zien hoe nematoden kunnen worden blootgesteld aan pesticiden en neuronschade kan worden beoordeeld.

Onderzoek naar het effect van pesticiden op Caenorhabditis elegans Neuronen

De protocollen beschrijven twee in vitro ontwikkelingstoxiciteit testsystemen (UKK en UKN1) op basis van menselijke embryonale stamcellen en transcriptoom studies. De testsystemen voorspellen mens ontwikkelingsstoornissen giftigheidsgevaar, en kunnen bijdragen aan dierproeven, de kosten en de tijd die nodig is voor de chemische veiligheid testen te verminderen.

Pluripotente menselijke stamcellen Gebaseerd Ontwikkelingstoxiciteit Testen voor Chemical Safety Screening and Systems Biology gegevens Generation

Leer een high-throughput assay voor kiembaantoxiciteit met Caenorhabditis elegans en fluorescentie-microscopie. Deze methode helpt onderzoekers chemische effecten op embryonale ontwikkeling in vivo te beoordelen.

Uitgebreide beoordeling van Kiembaan chemische toxiciteit De nematode

Meer video's verkennen