Name: Met behulp van adeno-geassocieerd virus als een instrument om retinale Barrières in ziekte te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Ontdek hoe adeno-geassocieerd virus wordt ingezet om de bloed-retina barrière en de integriteit van de innerlijke beperkende membraan in diermodellen van retinaal ziekte te evalueren. Deze methode ondersteunt therapeutisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken het beeldvormingsplatform van het Institut de la Vision. We erkennen de French Muscular Dystrophy Association (AFM) voor een PhD-beurs aan O.V. en Allergan INC. Dit werk, uitgevoerd in het kader van de LABEX LIFESENSES [referentie ANR-10-LABX-65], werd ondersteund door Franse staatsfondsen beheerd door de ANR. We danken Peggy Barbe en Mélissa Desrosiers voor technische assistentie met AAV-voorbereidingen. We zijn dankbaar aan Stéphane Fouquet voor uitstekende technische assistentie bij confocale microscopie en zijn deskundige input bij de interpretatie van de resultaten.

Alle dieren die in deze studie werden verzorgd en behandeld volgens de ARVO verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Vision Research. 1. Productie van recombinant AAV (rAAV) van kortstondige transfectie van HEK-293 cellen 17,18 OPMERKING: Zie McClure C, Jupiter (2011) 19. <ol><li> Zuiver een grootschalige plasmidebereiding (tenminste 1 mg / ml) van de AAV vector plasmiden. Gebruik 3 plasmiden. De AAV helper plasmide dat de replicatie en capside genen zonder AAV omgekeerde terminale herhalingen ITR&#39;s, de transgene expressiecassette die de AAV ITR aangeduid als de overdracht plasmide en het plasmide levert het adenovirus helper genen E2, E4 en VA RNA genen bedoelde als pHELPER. </li><li> Transfecteren 293-cellen met deze 3 plasmiden met polyethyleenimine (of andere transfectie reagens). Boven 80% transfectie efficiëntie noodzakelijk voor een goede viral opbrengsten. </li><li> Zuiver recombinant AAV 293 cellysaten op iodixanol gradiënt. 15%, 25%, 40% en 60% iodixanol wordt gebruikt om de helling te verkrijgen. Verzamel 40% iodixanol fractie die AAV deeltjes, concentreren de fractie na ultracentrifugeren bij 500.000 xg gedurende 1 uur en uitwisseling van buffer tegen PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing) met 0,001% Pluronic. </li><li> Virale genomische titer 20 te bepalen, het uitvoeren van een DNAse ProteinaseK digest gevolgd door QPCR. De forward en reverse primers versterken de 62 bp regio gelegen in het AAV2 ITR. Voor het plasmide norm, wordt de sonde gelabeld met FAM en heeft een zwart gat quencher (BHQ). </li><li> Het uitvoeren van qPCR (kwantitatieve polymerase chain reaction) in een eindvolume van 25 pi met behulp van 340 nm te keren ITR primer, 100 nM vooruit ITR primer, 100 nM AAV2 ITR sonde, 0,4 mM dNTP, 2 mM MgCl2, 1x Platinum Taq Buffer, 1U Platinum Taq en 5 ul sjabloon (standaard, monster en geen template controle). </li><li> Voorde standaard, gebruikt het plasmide voor transfectie in 7 x 10-voudige seriële verdunningen (5 pi elk van 2 x 09-02 oktober x 10 3 genomen / ml resulteerde in een eindconcentratie van 10 oktober-10 april genomen / ml). </li><li> Begin het programma een initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 15 min gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 95 ° C gedurende 1 min en annealing / uitbreiding bij 60 ° C gedurende 1 min. Bewaar bij 4 ° C voor korte opslag of bij -20 ° C voor langere opslagperioden. </li></ol> 2. intravitreale injectie van AAV <ol><li> Verdoven C57BL6J muizen met ketamine (50 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) en controleer de meer verlies van evenwicht, de terugtrekking reflex en de staart knijpen reactie wijst op een goede verdoving. Verwijden de pupillen van de cornea toepassing van neosynephrine 5% en mydriaticum 0,5% oogdruppels. Gebruik vet zalf op ogen droog voorkomen terwijl onder verdoving. </li><li> Slagen voor een ultrafijne 30 G disposable naald door de evenaar en naast de limbus, in het glasvocht holte (zie Chiu K, Jupiter (2007) 21). Injecteer 1 pl voorraad met 1-4 x 10 11 VP ShH10-GFP of AAV5-GFP met directe observatie van de naald in het midden van het glasachtige holte (figuur 1). Gebruik één oog als controle voor ILM experimenten. Injecteren beide ogen voor BRB experimenten. Breng een anti-inflammatoire en antibacteriële topische behandeling geïnjecteerde ogen. </li><li> Verwijden leerlingen met neosynephrine en mydriaticum oogdruppels voor de beeldvorming. Voer fundus onderzoek met het oog fundus camera GFP (Green Fluorescent Protein) expressie 1 week, 2 weken, 1 maand en 2 maanden na intravitreale injectie (Figuur 1) volgen. Offer muizen met CO2 inhalatie 1 tot 2 maanden na injectie. </li></ol> 3. Immunohistochemistry <ol><li> Voor retinale cryosecties (figuur 1), ontleden verwijderde ogen om l te verwijderenens en het hoornvlies, en onderdompeling fix in 4% paraformaldehyde gedurende 1 uur. <ol><li> Cryoprotect de eerder vastgestelde ogen in 10% sucrose gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, 20% sucrose gedurende een uur bij kamertemperatuur geroerd. Cryoprotect in 30% sucrose oplossing overnacht bij 4 ° C. Bevriezen en insluiten oogschelpen in het inbedden van hars zoals Cryo-matrix. Maak 10 micrometer cryocoupes en monteren op dia&#39;s, speciaal behandeld voor ingevroren weefsel secties en dat te verbeteren weefsel volgen ervan tijdens de kleuring. </li><li> Permeabilize secties met 0,1% Triton X100 in PBS pH 7,4 gedurende 5 minuten. Was 2x in PBS en blok 1 uur bij kamertemperatuur in PBS met 1% BSA, 0,1% Tween 20. </li></ol></li><li> Voor retinale flatmounts (figuur 1), vast ontkernde ogen in 4% paraformaldehyde gedurende 15 min bij de dissectie te bevorderen. <ol><li> In 15-30 min, ontleden de ogen aan het hoornvlies en de lens te verwijderen. Scheid het netvlies van de netvliespigmentepitheel (RPE) en sclera door te snijden rond de ora serrata ende oogzenuw. Dompel in 4% paraformaldehyde gedurende nog eens 30 min naar het netvlies en het fluorescerende eiwit in getransduceerde retinale cellen (fixatie niet meer dan 24 uur) vast. Was 5 minuten in steriel PBS, pH 7.4. </li><li> Verander de PBS blokkerende buffer (PBS met 1% BSA, 2% normaal geit of ezel serum, 0,5% Triton X-100) en incubeer in blokkerende buffer voor of 4 uur bij kamertemperatuur of 4 ° C overnacht. </li></ol></li><li> Incubeer weefsels met primaire antilichamen in blokkeerbuffer voor of 4 uur bij kamertemperatuur of bij 4 ° C overnacht. Was 3x met PBS. OPMERKING: De antilichamen die zijn: anti-laminine (1 / 1.000) labelen van de ILM, anti-rhodopsine kloon 4D2 (1/500) etikettering staven, anti-glutamine synthetase kloon GS-6 (1 / 1.500) labeling Müllercellen , PNA Lectine (1/40) etikettering kegels. </li><li> Incubeer weefsels met 1: 500 verdunning van Alexa Fluor geconjugeerde secundaire antilichamen in het blokkeren van buffer gedurende 1 uur (cryocoupes) of 2 uur (flatmounts) bij kamertemperatuur tempetuur en beschermd tegen licht. Was 3x met PBS. </li><li> Maak verlichten bezuinigingen op de retina en flatmount het op een glasplaatje met ofwel de fotoreceptor of retinale ganglioncellen (RGC) naar boven gericht. Voeg waterige mountingmedium, gelden dekglaasje en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Voeren confocale microscopie op laser scanning confocale microscoop. Acquire beelden sequentieel, regel voor regel, om excitatie en emissie overspraak te verminderen. Definieer stap grootte volgens de Nyquist-Shannon sampling theorema. Gebruik belichtingsinstellingen die oververzadigd pixels in de uiteindelijke beelden te minimaliseren. Proces 12-bits afbeeldingen met Fiji, project Z-profielen op een enkel vlak met behulp van maximale intensiteit onder Z-project functie en uiteindelijk om te zetten naar 8-bits RGB-kleurenmodus. </li></ol> 4. PCR analyse van muis bloedmonsters <ol><li> Injecteer 100 ui voorraad met 1-4 x 10 11 deeltjes van een AAV-GFP in de penis ader van verdoofde muizen C57BL6J (5% isofluraanvoor inductie in een nauwe ruimte en 2,5% van isofluraan via een neuskegel tijdens de operatie) met behulp van een insuline spuit met een ultra-fijne 6 mm naald. Dit dier zal dienen als een positieve controle van circulerende AAV deeltjes. </li><li> Monster bloed van de muis staart vóór de injectie en 3 uur, 24 uur, 2 dagen en 3 dagen na ShH10 intravitreale injectie of na intrapenile injectie (figuur 1). Ongeveer 10-20 pl verzameld in héparine buizen. Offeren muizen door CO 2 inhalatie na afronding van de procedure. </li><li> Uittreksel genoom DNA van bloedmonsters met behulp van de extractie kit van uw keuze. </li><li> Voer PCR amplificatie van genomisch DNA. Voor dit protocol gebruikt u de volgende primerpaar: GFP, voelen 5&#39;-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 &#39;, antisense 5&#39;-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3&#39;. De volgende PCR-programma werd uitgevoerd: 95 ° C 2 min (1 cyclus); 95 ° C 45 sec, 55 ° C 1 min, 72 ° C 45 seconden (30 cycli); 72 ° C 5 min (1 cyclus);4 ° C te houden. </li></ol> 5. Optioneel Evans Blue Methode OPMERKING: Kwantificeren vasculaire permeabiliteit door het meten van albumine lekkage van bloedvaten in het netvlies met behulp van de Evans blauwe methode 10. <ol><li> Bereid Evans Blue kleurstof door oplossing in een fysiologische zoutoplossing (6 mg / ml), sonicatie gedurende 5 minuten in een ultrasoon reiniger en filtratie door een 5 urn filter. </li><li> Verdoven C57BL6J muizen (isofluraan inademing, zie stap 4.1), controleer dan de meer verlies van evenwicht, de terugtrekking reflex en de staart knijpen reactie wijst op een goede verdoving, en injecteer Evans blauw (45 mg / kg) door de penis ader (figuur 1). Controleer of de poten, snuit en oren van muizen worden duidelijk blauwe volgende Evans blauw injectie, ter bevestiging van de opname en verdeling van de kleurstof. </li><li> Verdoven C57BL6J muizen 3 uur na injectie van de kleurstof met ketamine (50 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg) en controleer het verlies van righting reflex wijst op een goede verdoving. Voorbeeld intracardiaal 500 gl bloed in heparine buizen en perfuseren muizen gedurende 2 min via de linker ventrikel met een citraatbuffer (0,05 M, pH 3,5, opgelost 7,8 g citroenzuur en 3,8 g natriumcitraat in 1 liter gedestilleerd water) voorverwarmd tot 37 ° C vasoconstrictie voorkomen. Muizen worden opgeofferd via de perfusie. </li><li> Na perfusie, ophelderen en zorgvuldig ontleden beide ogen onder een operationele microscoop om het netvlies te verzamelen (zie paragraaf 3.2). Droge retina in een centrifugale verdamper nachts, wegen en extraheer de Evans blauwe kleurstof door incubatie netvlies met 100 pl formamide gedurende 18 uur bij 65 ° C onder schudden (100 xg). Centrifuge retina monsters 30K omega filter buizen bij 20,798.5 xg gedurende 2 uur bij 4 ° C en centrifugeer bloedmonsters 20,798.5 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Gebruik beide bovenstaande vloeistoffen om absorptie te meten. Bepaal absorptie van elk monster door het aftrekken van de maximale extinctie for Evans blauw bij 620 nm om de absorptie minimum bij 740 nm. Bereken Evans blauw-concentratie in het plasma en het netvlies van een standaard curve van Evans blauw in formamide. Express BRB permeabiliteit in microliter Evans blue per gram droge retina per uur (gl plasma / g retinale drooggewicht / uur). </li></ol> 6. Optioneel fluorescentie-angiografie OPMERKING: Lekkage van retinale bloedvaten in muizen kan worden gevisualiseerd door intraperitoneale injectie van natriumfluoresceïne. <ol><li> Verdoven C57BL6J muizen (isofluraan inademing, zie stap 4.1) en verwijden de pupillen met oogdruppels (neosynephrine en mydriaticum). Gebruik vet zalf op ogen droog voorkomen terwijl onder verdoving. </li><li> Intraperitoneaal injecteren 0,01-0,02 ml 10% natrium fluoresceïne in 0,1 ml steriele zoutoplossing fluoresceïne angiografie. </li><li> Verzamel beelden van beide ogen na injectie met behulp van een oogfundus camera. Offeren muizen door CO 2 inhalatie na de proprocedure. OPMERKING: 20 sec zijn nodig voor de retinale vaten zichtbaar op angiografie geworden. Beelden moeten worden vastgelegd tussen 3-10 min maximale na fluoresceïne injectie. De lekkage vlekken (indien aanwezig) zijn waarneembaar na 2,5 min. Op latere tijdstippen de beeldkwaliteit verloren gaat door natriumfluoresceïne diffunderen in het glasvocht, dus slechts kort beelden verkregen na gebruikt voor analyse. </li></ol>

<ol><li>Halfter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+retinal+basal+lamina+during+early+embryonic+development+leads+to+a+retraction+of+vitreal+end+feet%2C+an+increased+number+of+ganglion+cells%2C+and+aberrant+axonal+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Disruption of the retinal basal lamina during early embryonic development leads to a retraction of vitreal end feet, an increased number of ganglion cells, and aberrant axonal outgrowth.</a> J Comp Neurol. 397 (1), 89-104 (1998).</li>
<li>Halfter, W., Dong, S., Balasubramani, M., Bier, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporary+disruption+of+the+retinal+basal+lamina+and+its+effect+on+retinal+histogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporary disruption of the retinal basal lamina and its effect on retinal histogenesis.</a> Dev Biol. 238 (1), 79-96 (2001).</li>
<li>Halfter, W., Willem, M., Mayer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane-dependent+survival+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Basement membrane-dependent survival of retinal ganglion cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 1000-1009 (2005).</li>
<li>Abdelkader, E., Lois, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+limiting+membrane+peeling+in+vitreo-retinal+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Internal limiting membrane peeling in vitreo-retinal surgery.</a> Surv Ophthalmol. 53 (4), 368-396 (2008).</li>
<li>Dalkara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inner+limiting+membrane+barriers+to+AAV-mediated+retinal+transduction+from+the+vitreous%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Inner limiting membrane barriers to AAV-mediated retinal transduction from the vitreous.</a> Mol Ther. 17 (12), 2096-2102 (2009).</li>
<li>Bringmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muller+cells+in+the+healthy+and+diseased+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Muller cells in the healthy and diseased retina.</a> Prog Retin Eye Res. 25 (4), 397-424 (2006).</li>
<li>Eichler, W., Kuhrt, H., Hoffmann, S., Wiedemann, P., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+release+by+retinal+glia+depends+on+both+oxygen+and+glucose+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">VEGF release by retinal glia depends on both oxygen and glucose supply.</a> Neuroreport. 11 (16), 3533-3537 (2000).</li>
<li>Kaur, C., Foulds, W. S., Ling, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-retinal+barrier+in+hypoxic+ischaemic+conditions%3A+basic+concepts%2C+clinical+features+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Blood-retinal barrier in hypoxic ischaemic conditions: basic concepts, clinical features and management.</a> Prog Retin Eye Res. 27 (6), 622-647 (2008).</li>
<li>Kaur, C., Sivakumar, V., Foulds, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+response+of+neurons+and+glial+cells+to+hypoxia+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Early response of neurons and glial cells to hypoxia in the retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1126-1141 (2006).</li>
<li>Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+blood-retinal+barrier+breakdown+quantitation+using+Evans+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).</li>
<li>Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+visualization+of+the+retina+by+angiography+with+high-molecular-weight+fluorescein-labeled+dextrans+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse.</a> Microvasc Res. 46 (2), 135-142 (1993).</li>
<li>Yang, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-mediated+transduction+of+murine+retina+with+adeno-associated+virus%3A+effects+of+viral+capsid+and+genome+size%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size.</a> J Virol. 76 (15), 7651-7660 (2002).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+following+subretinal+AAV5+vector+delivery+is+not+affected+by+a+previous+intravitreal+AAV5+vector+administration+in+the+partner+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Gene therapy following subretinal AAV5 vector delivery is not affected by a previous intravitreal AAV5 vector administration in the partner eye.</a> Mol Vis. 15, 267-275 (2009).</li>
<li>Koerber, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evolution+of+adeno-associated+virus+for+enhanced+glial+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Molecular evolution of adeno-associated virus for enhanced glial gene delivery.</a> Mol Ther. 17 (12), 2088-2095 (2009).</li>
<li>Klimczak, R. R., Koerber, J. T., Dalkara, D., Flannery, J. G., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+adeno-associated+viral+variant+for+efficient+and+selective+intravitreal+transduction+of+rat+Muller+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel adeno-associated viral variant for efficient and selective intravitreal transduction of rat Muller cells.</a> PLoS One. 4 (10), e7467(2009).</li>
<li>Vacca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+gene+delivery+in+Dp71-null+mouse+model+with+compromised+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated gene delivery in Dp71-null mouse model with compromised barriers.</a> Glia. , (2013).</li>
<li>Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Curr Protoc Hum Genet. 12 (Unit 12 19), (2007).</li>
<li>Choi, V. W., Asokan, A., Haberman, R. A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+for+in+vitro+and+in+vivo+use%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant adeno-associated viral vectors for in vitro and in vivo use.</a> Curr Protoc Mol Biol. 16 (Unit 16 25), (2007).</li>
<li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. (57), e3348(2011).</li>
<li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreous+injection+for+establishing+ocular+diseases+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravitreous injection for establishing ocular diseases model.</a> J Vis Exp. (8), 313(2007).</li>
<li>Kolstad, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+adeno-associated+virus-mediated+gene+delivery+in+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Changes in adeno-associated virus-mediated gene delivery in retinal degeneration.</a> Hum Gene Ther. 21 (5), 571-578 (2010).</li>
<li>Sene, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+implication+of+Dp71+in+osmoregulation+and+vascular+permeability+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Functional implication of Dp71 in osmoregulation and vascular permeability of the retina.</a> PLoS One. 4 (10), e7329(2009).</li>
<li>Benard, R. A New Quantifiable Blood Retinal Barrier Breakdown Model In Mice. ARVO Annual Meeting. , (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De BRB regelt de uitwisseling van moleculen tussen bloed en retina. De verdeling wordt geassocieerd met verschillende ziekten zoals diabetische retinopathie of leeftijd gerelateerde maculaire degeneratie (AMD). We hebben onlangs aangetoond dat in een dystrofine knock-out muis, die permeabel BRB weergeeft, het netvlies toleranter voor genoverdracht gemedieerd door adeno-geassocieerde virale vectoren (AAV). Ondanks BRB permeabiliteit AAV deeltjes geïnjecteerd intraoculair beperkt blijven tot de oculaire compartimenten in ...

Müller cellen zijn de belangrijkste gliale component van het netvlies. Morfologisch weerszijden van de retina radiaal en hun eindvoetjes van astrocyten in contact met het glasachtige lichaam, het gezicht van de ILM en geheime componenten van de laatstgenoemde. De ILM is een basaal membraan samengesteld uit een tiental verschillende extracellulaire matrix eiwitten (laminin, agrine, perlecan, nidogen, collageen en verscheidene heparinesulfaat proteoglycanen). Tijdens de ontwikkeling, haar aanwezigheid is onmisbaar voor het netvlies histogenese, navigatie van optische axonen, en overleving van ganglioncellen 1-3. Echter, ILM is onwezenlijke bij volwassen netvlies en kan operatief verwijderd worden in bepaalde pathologieën zonder dat er schade aan het netvlies 4. Bij gentherapie, dit membraan wordt een fysieke barrière voor efficiënte transductie van het netvlies met AAV door intravitreale injectie 5. Door de uitgebreide arborization van hun processen, Müller cellen voedings- en regelgeving Support zowel retinale neuronen en vasculaire cellen. Müllercellen zijn ook betrokken bij de regulatie van de retinale homeostase, bij de vorming en instandhouding van de BRB 6. Krappe kruispunten tussen retinale capillaire endotheelcellen, Müller cellen, astrocyten en pericyten vormen de BRB. BRB voorkomt dat bepaalde stoffen uit het invoeren van de retina.In vele ziekten zoals diabetische retinopathie, retinale veneuze occlusie en aandoeningen van de luchtwegen, hypoxie van het netvlies veroorzaakt lekkage door de BRB 7-9. Deze breuk wordt geassocieerd met een verhoogde vasculaire permeabiliteit leidt tot vasogeen oedeem, retinale loslating en schade aan het netvlies. Müllercellen zijn sterk geassocieerd met bloedvaten en de basale membraan, speelt een belangrijke rol in zowel BRB en ILM integriteit. Bijgevolg labelen Müller gliacellen is bijzonder relevant voor de studie van de fysische toestand van deze retina barrières. Klassiekbondgenoot, wordt BRB doorlatendheid gemeten met de Evans blauw test bestaat uit systemische injectie van Evans blauwe kleurstof, die niet-covalent bindt aan plasma-albumine. Deze test meet de albumine lekkage (eiwit van tussenmaat, ~ 66 kDa) van de bloedvaten in het netvlies (zie protocollen hoofdstuk 5) 10. Als alternatief kan de vasculaire lekkage worden gevisualiseerd door fluorescentie retinale angiografie procedures voor de lekkage van fluoresceïne (kleine molecule, ~ 359 Da; zie Protocollen hoofdstuk 6) 11. Toch beide methoden is het mogelijk de evaluatie van de BRB permeabiliteit voor kleine moleculen en eiwitten, maar ze hebben geen informatie over de ILM integriteit. Vandaar dat BRB permeabiliteit onderzoeken gebruikten we een AAV gebaseerde methode die informatie over de BRB permeabiliteit voor grotere moleculen (bijvoorbeeld AAV deeltjes 25 nm diameter) geeft. Inderdaad, kan onze methode aanwezigheid van AAV transgen op te sporen in het bloed, wat zou suggereren dat ~ deeltjes 25 nm diameter zoukunnen infiltreren in de bloedbaan. Deze werkwijze geeft ook informatie over de structuur van de ILM en extracellulaire matrixeiwitten in pathologische omstandigheden. Twee AAV varianten zijn nuttig voor een dergelijke studie: AAV5 en ShH10. Subretinally geïnjecteerd, AAV5 een natuurlijk tropisme voor fotoreceptoren en retinale pigmentepitheel 12 maar het kan niet over naar de buitenste retina bij toediening in het glaslichaam in wildtype retina&#39;s met intacte ILM 5,13. ShH10 een AAV variant die is ontworpen om specifiek te richten gliale cellen over neuronen 14,15. ShH10 etiketten selectief Müller cellen bij zowel gezonde als zieke netvliezen met een verhoogde efficiëntie in het netvlies met een gecompromitteerde barrières 16. Deze virale gereedschap in combinatie met immuhistochemistry en bloed-DNA-analyse geven informatie over de toestand van het netvlies barrières en hun betrokkenheid bij de ziekte (figuur 1).

<table><tbody><tr><td>C57BL6J mice strain</td><td>JANVIER LABS</td><td></td><td>muizen</td></tr><tr><td>Ketamine 500</td><td>Virbac France</td><td></td><td>anestheticum</td></tr><tr><td>Xylazine Rompun 2%</td><td>Bayer Healthcare</td><td></td><td>anestheticum</td></tr><tr><td>Neosynephrine 5% Faure</td><td>Europhta</td><td></td><td>dilatans</td></tr><tr><td>Mydriaticum 0.5%</td><td>Thea</td><td></td><td>dilatans</td></tr><tr><td>Sterdex</td><td>Novartis</td><td></td><td>ontstekingsremmer</td></tr><tr><td>Cryomatrix embedding resin</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Adhesion Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143352</td><td>glazen platen</td></tr><tr><td>anti-laminin</td><td>Sigma</td><td>L9393</td><td>antilichaam</td></tr><tr><td>anti-rhodopsin clone 4D2</td><td>Millipore</td><td>MABN15</td><td>antilichaam</td></tr><tr><td>anti-glutamine synthetase clone GS-6</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td>antilichaam</td></tr><tr><td>Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein</td><td>Dako</td><td>334</td><td>antilichaam</td></tr><tr><td>PNA Lectin</td><td>Invitrogen</td><td>L32459</td><td>sonde</td></tr><tr><td>Alexa fluor conjugated secundaire antilichamen</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>antilichaam</td></tr><tr><td>Fluorsave reagent</td><td>Calbiochem</td><td>345789</td><td>montagemedium</td></tr><tr><td>QIAmp DNA Micro Kit</td><td>QIAGEN</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq DNA polymerase</td><td>Promega</td><td>M3001</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue kleurstof</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td>kleurstof</td></tr><tr><td>5 &micro;m filter</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitraat</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Citruszuur</td><td>Sigma</td><td>C1909-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Formamide spectrofotometrisch</td><td>Sigma</td><td>295876-2L</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein</td><td>Sigma</td><td>F2456</td><td>kleurstof</td></tr><tr><td>Micron III</td><td>Phoenix Research Labs</td><td></td><td>Microscoopsysteem gebaseerd op 3-CCD kleurencamera, frame grabber en off-the-shelf software waardoor onderzoekers muisretina's kunnen beeldvormen.</td></tr><tr><td>Insuline spuiten</td><td>Terumo</td><td>SS30M3109</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 10 &micro;l Hamilton</td><td>Dutscher</td><td>74487</td><td>Seringue 1701</td></tr><tr><td>Naald RN G33, 25 mm, PST 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>11530332</td><td>Intravitreale injectie</td></tr><tr><td>UltraMicroPump UMP3</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td>Veelzijdige injector gebruikt microspuiten om picolitervolumes te leveren</td></tr><tr><td>UltraMicroPump (UMP3) (één) met SYS-Micro4 Controller</td><td>UMP3-1</td><td>Digitaal besturingssysteem</td><td></td></tr><tr><td>Binoculaire vergroting SZ76</td><td>ADVILAB</td><td>ADV-76B2</td><td>Zoom 0,66 x 5 x LEDs met standaard epi en dia / Retinas dissectie</td></tr><tr><td>Rechte veerscharen - 8,5 cm</td><td>Bionic France S.a.r.l</td><td>15003-08</td><td>Retina's dissectie</td></tr><tr><td>gebogen Vanna schaar</td><td>15004-08</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont 5</td><td>11254-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-Well Thermal Cycler</td><td>Life technologies</td><td>4375786</td><td>Thermocycler</td></tr><tr><td>Ultrasoonreiniger</td><td>Laboratory Supplies</td><td>G1125P1T</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep 30k omega buizen</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speedvac</td><td>Fisher Scientific</td><td>SC 110 A</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofluorometer</td><td>TECAN</td><td>infinite M1000</td><td></td></tr></tbody></table>

met behulp van adeno-geassocieerd virus als een instrument om retinale barrières in ziekte te bestuderen

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

Müller cellen zijn de belangrijkste gliale cellen van de retina. Hun end feet vormen de grenzen van het netvlies aan de buitenste en binnenste beperkende membranen (ILM), en in samenhang met astrocyten, pericyten en endotheliale cellen daarin voor de bloed-retina barrière (BRB). BRB beperkt materiaaltransport tussen de bloedstroom en het netvlies tijdens de ILM fungeert als een basaalmembraan die histologisch definieert de grens tussen het netvlies en het glasachtige holte. Labelen Müller cellen is bijzonder relevant voor de fysieke toestand van het netvlies barrières te bestuderen, omdat deze cellen zijn een integraal onderdeel van de BRB en ILM. Zowel BRB en ILM worden vaak veranderd bij ziekte van het netvlies en zijn verantwoordelijk voor de symptomen van de ziekte. Er zijn verschillende goed gevestigde werkwijzen om de integriteit van de BRB bestuderen, zoals Evans blue assay of fluoresceïne angiografie. Maar deze methoden geven geen informatie over de mate van BRB permeabiliteit to grotere moleculen, in het nanometer bereik. Bovendien hoeven zij geen informatie over de toestand van andere retinale barrières zoals de ILM. Om BRB permeabiliteit te bestuderen naast retinale ILM, gebruikten we een AAV gebaseerde methode met informatie over doorlaatbaarheid van BRB tot grotere moleculen terwijl die de status van de ILM en extracellulaire matrixeiwitten ziektetoestanden. Twee AAV varianten zijn nuttig voor een dergelijke studie: AAV5 en ShH10. AAV5 een natuurlijk tropisme voor fotoreceptoren, maar het kan niet over naar de buitenste retina bij toediening in het glaslichaam bij de ILM intact (dwz in wildtype retina). ShH10 heeft een sterke tropism richting gliacellen en zal selectief Müller glia labelen bij zowel gezonde als zieke netvliezen. ShH10 biedt efficiëntere genaflevering in netvlies waar ILM in het gedrang komt. Deze virale gereedschap in combinatie met immunohistochemie en bloed-DNA-analyse licht werpen op de toestand van het netvlies barrières bij de ziekte.

We verwachten verhoogde retinale transductie van Müller gliacellen met ShH10 als het diermodel toont verstoringen in de structuur van het VLM (Figuur 2A - B). Zo hebben we aangetoond dat in afwezigheid van Dp71, ShH10 targets specifiek maar efficiënter Müller gliacellen door intravitreale injectie aangeeft verhoogde permeabiliteit van de ILM in deze muis lijn vergeleken met wild-type muizen 16 (figuur 2C - F). AAV...

Om de permeabiliteit van de bloed-retinabarrière en de integriteit van de binnenste begrenzingsmembraan in diermodellen van retinale aandoeningen te onderzoeken, hebben we verschillende adeno-geassocieerde virus (AAV) varianten gebruikt als hulpmiddelen om retinale neuronen en gliacellen te labelen. Virusgemedieerde reportergenexpressie wordt vervolgens gebruikt als een indicator van de permeabiliteit van de retinabarrière.

Met behulp van adeno-geassocieerd virus als een instrument om retinale Barrières in ziekte te bestuderen

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Het algemene doel van deze procedure is om de permeabiliteit van de bloed-retinale barrière en de integriteit van het membra own inner limiting membrane te onderzoeken in diermodellen van retinale aandoeningen. Dit wordt bereikt door eerst AAV-partikels die een GFP-transgen bevatten in het glasachtig lichaam of in de bloedbaan te injecteren. De tweede stap is het afnemen van bloedmonsters op verschillende tijdstippen na de injecties.De bloedafname wordt aangevuld met wekelijkse in vivo beeldvorming van het fundus. De laatste stap is het uitvoeren van immunohistochemie op retina-flatmounts en cryosneden van de retina. Ten slotte worden confocale microscopie en PCR gebruikt om het transductiepatroon aan te tonen als indicator voor de integriteit van de ILM en om AAV-partikels in de bloedbaan te detecteren, waarmee de permeabiliteit van de bloed-retina-barrière wordt aangetoond.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van onze bestaande methoden is dat de AAV-pastamethode informatie verschaft over de permeabiliteit van de bloed-retina-barrière die niet door andere cellen wordt geboden. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot AAV-gemedieerde gentherapie,

using-adeno-associated-virus-as-tool-to-study-retinal-barriers

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

In deze video gebruiken we een adenovirus het dragen van de Cre-recombinase-gen tot de primaire muis embryonale fibroblasten het dragen van een floxed Rac1 allel infecteren.

Adenovirus-gemedieerde Genetische Verwijdering van signaalmoleculen in gekweekte primaire muis embryonale fibroblasten

This video shows infecting primary mouse midbrain neurons with Adeno-Associated Viruses carrying a fluorescent calcium indicator. The indicator's fluorescence confirms successful infection and enables real-time monitoring of neuronal infection.

Infecting Primary Mouse Midbrain Neurons with Engineered Adeno-Associated Viruses

Source: Grames, M. S., et al. Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the tail vein injection of recombinant adeno-associated virus (AAV) in rats. After injection into the lateral tail vein, the virus enters the bloodstream, circulates through the heart, and reaches the brain, where it enters neurons and facilitates target protein production for...

 Intravenous Administration of Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in a Rat Model 

Subretinale injectie is een chirurgische techniek voor effectieve genoverdracht naar het retinale pigmentepitheel in het oog van de muis. Hier beschrijven we een eenvoudige en reproduceerbare methode voor subretinale injectie van virale vectoren naar het retinale pigmentepitheel bij experimentele muizen.

Limbale Aanpak-Subretinal injectie van virale vectoren voor gentherapie in Muizen retinaal pigment epitheel

Methoden voor een grootschalige centrale zenuwstelsel gene levering in de rat vallen. In dit voorbeeld is het doel om na te bootsen van een ziekte die het hele ruggenmerg aantast. De wijdverbreide transductie kan worden gebruikt voor een therapeutische eiwitten naar het CNS van een eenmalige, perifere administratie.

Methoden en Tips voor intraveneuze toediening van Adeno-associated Virus voor ratten en evaluatie van het centrale zenuwstelsel transductie

Hier presenteren we een methode voor het onderzoeken van neurietmorfogenese in postnatale muis retinale explantaten door time-lapse confocale microscopie. We beschrijven een aanpak voor schaarse etikettering en acquisitie van retinale celtypen en hun fijne processen met behulp van recombinante adeno-geassocieerde virusvectoren die membraangerichte fluorescerende eiwitten op een Cre-afhankelijke manier tot expressie brengen.

Time-lapse beeldvorming van neuronale arborisatie met behulp van schaarse Adeno-geassocieerde virusetikettering van genetisch gerichte retinale celpopulaties

Dit protocol presenteert hoe AAV-transductie-efficiëntie in het netvlies van muizen kan worden gekwantificeerd met behulp van digitale druppel PCR (dd-PCR) samen met kleinschalige AAV-productie, intravitreale injectie, retinale beeldvorming en retinale genomische DNA-isolatie.

Digitale druppel PCR-methode voor de kwantificering van AAV-transductie-efficiëntie in murine retina

In dit manuscript wordt subconjunctivale injectie gedemonstreerd als een geldige vectorafgiftemethode voor oculaire weefsels bij muizen met behulp van een injectiesysteem bestaande uit een infusie/opzuigspuitpomp en een gasdichte verwijderbare spuit in combinatie met micro-injectienaalden. Dit injectiesysteem is ook aanpasbaar voor andere intraoculaire toedieningsroutes.

Subconjunctivale toediening van Adeno-geassocieerde virusvectoren in modellen met kleine dieren

Adeno-geassocieerd virus wordt geproduceerd in suspensiecelkweek en gezuiverd door centrifugatie met dubbele jodixanoldichtheidsgradiënt. Er zijn stappen opgenomen om de totale virusopbrengst te verhogen, het risico op virusneerslag te verminderen en het uiteindelijke virusproduct verder te concentreren. De verwachte uiteindelijke titers bereiken 10tot 12 virale deeltjes/ml en zijn geschikt voor preklinisch in vivo gebruik.

Productie en zuivering van adeno-geassocieerd virus door centrifugatie met diodixanoldichtheidsgradiënt voor in-vivotoepassingen

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor het genereren en zuiveren van adeno-geassocieerde virale vectoren met behulp van een geoptimaliseerde op heparine gebaseerde affiniteitschromatografiemethode. Het biedt een eenvoudige, schaalbare en kosteneffectieve aanpak, waardoor ultracentrifugatie niet nodig is. De resulterende vectoren vertonen een hoge zuiverheid en biologische activiteit, wat hun waarde bewijst in preklinische studies.

Isolatie van adeno-geassocieerde virale vectoren door middel van een eenstaps en semi-geautomatiseerd heparine-affiniteitschromatografieprotocol

Ontdek hoe adeno-geassocieerd virus wordt ingezet om de bloed-retina barrière en de integriteit van de innerlijke beperkende membraan in diermodellen van retinaal ziekte te evalueren. Deze methode ondersteunt therapeutisch onderzoek.

Met behulp van adeno-geassocieerd virus als een instrument om retinale Barrières in ziekte te bestuderen

Meer video's verkennen