Met behulp van adeno-geassocieerd virus als een instrument om retinale Barrières in ziekte te bestuderen

Het algemene doel van deze procedure is om de permeabiliteit van de bloed-retinale barrière en de integriteit van het membra own inner limiting membrane te onderzoeken in diermodellen van retinale aandoeningen. Dit wordt bereikt door eerst AAV-partikels die een GFP-transgen bevatten in het glasachtig lichaam of in de bloedbaan te injecteren. De tweede stap is het afnemen van bloedmonsters op verschillende tijdstippen na de injecties.

De bloedafname wordt aangevuld met wekelijkse in vivo beeldvorming van het fundus. De laatste stap is het uitvoeren van immunohistochemie op retina-flatmounts en cryosneden van de retina. Ten slotte worden confocale microscopie en PCR gebruikt om het transductiepatroon aan te tonen als indicator voor de integriteit van de ILM en om AAV-partikels in de bloedbaan te detecteren, waarmee de permeabiliteit van de bloed-retina-barrière wordt aangetoond.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van onze bestaande methoden is dat de AAV-pastamethode informatie verschaft over de permeabiliteit van de bloed-retina-barrière die niet door andere cellen wordt geboden. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot AAV-gemedieerde gentherapie, omdat het helpt te waarborgen dat de bloed-retina-barrière permeabel is voor AAV-partikels, waardoor ongewenste bijwerkingen worden vermeden. Deze methode kan inzicht bieden in de integriteit van het membraना limitans internu in diermodellen van andere retina-ziekten, zoals diabetische ratten.

Het idee voor deze methode ontstond toen we zagen dat het netvlies van ons DP 71 null-muismodel, dat een doorbraak van de bloed-retina-barrière vertoonde, efficiënter werd getransduceerd dan het wildtype netvlies.

Begin met het anesthetiseren van C-57 black-six J muizen. Controleer op het verlies van drie reflexen: de rightingreflex, de terugtrekkingsreflex en de staartknijprespons.

Het wegvallen van deze reflexen bevestigt de anesthesie. Verwijden vervolgens de pupillen door met een druppelaar 5% neosynephrine en 0,5% mydriaticum op het hoornvlies aan te brengen. Gebruik daarna een veterinaire zalf om de ogen te smeren, zodat deze niet te veel uitdrogen. Vul nu een ultrafijne wegwerpnaald van 30 gauge met een stamoplossing die 1 tot 4 × 10¹¹ particles AAV-GFP bevat.

Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat zij de veiligst mogelijke intravitreale injectie moeten uitvoeren zonder de lens of het netvlies aan te raken. Voer vervolgens een ultrafijne disposable naald van 30 gauge door de equator en naast de limbus in de glasvochtholte. Injecteer, nadat de naald in het oog is ingebracht, één microliter van de oplossing terwijl men controleert of de naald zich in het centrum van de glasvochtholte bevindt.

Gebruik één oog als controle voor experimenten met het intern limiterend membraan en injecteer beide ogen voor experimenten met de bloed-retinale barrière. Breng na de injectie een ontstekingsremmende en antibacteriële topische behandeling aan in elk geïnjecteerd oog. Laat na één week de pupillen verwijden met neosynefrine en mydriaticum en voer fundusonderzoeken uit met een oogfunduscamera.

Volg de GFP-expressie met observaties één week, twee weken, één maand en twee maanden na de injectie. Na het oogsten van de ogen van een geëuthanaseerd geïnjecteerd dier, worden de ogen gedisseceerd om de lens en het hoornvlies te verwijderen. Fixeer vervolgens het gedisseceerde oog door immersie in 4% paraformaldehyde gedurende een uur. Na een uur worden de ogen gedurende nog een uur bij kamertemperatuur cryobeschermd in 10% sucrose. Week de ogen vervolgens gedurende twintig minuten bij kamertemperatuur in 20% sucrose.

Laat de ogen tot slot gedurende de nacht in een 30% sucrose-oplossing bij vier graden Celsius weken. Bedt en vries de oogcups de volgende dag in een inbedhars in, zoals cryo-matrix. Maak vervolgens met de cryostaat coupes van 10 micron en monteer deze op objectglazen die zijn geprepareerd voor bevroren weefsel.

Permeabiliseer nu de coupes op de objectglazen gedurende vijf minuten met detergent. Volg dit op met twee korte wasbeurten in PBS. Blok vervolgens de ogen gedurende een uur bij kamertemperatuur.

Voor retina-flatmounts kan de dissectie worden vergemakkelijkt door de geënucleerde ogen gedurende 15 tot 30 minuten te fixeren in 4% paraformaldehyde. Deze fixatie en de fixatie na de dissectie moeten correct worden uitgevoerd, aangezien dit essentieel is voor het behoud van de GFP-fluorescentie. Dissekeer de ogen binnen 15 tot 30 minuten na de fixatieperiode en verwijder het hoornvlies en de lens.

Scheid het netvlies van het retinaal pigmentepitheel en de sclera door rond de ora serrata en de oogzenuw te snijden. Dompel de netvliezen na de dissectie nog 30 minuten onder in 4% paraformaldehyde om het weefsel en het fluorescerende eiwit in de getransduceerde netvliesscellen te fixeren. Was het preparaat na de fixatie vijf minuten in steriele PBS bij pH 7.4.

Vervang vervolgens de PBS door blokkeringsbuffer en incubeer de retina's gedurende vier uur bij kamertemperatuur of overnacht bij vier graden Celsius. Begin de labelingsstap door de monsters te incuberen met de primaire antilichamen in blokkeringsbuffer gedurende vier uur bij kamertemperatuur of overnacht bij vier graden Celsius. Nadat het primaire antilichaam is aangebracht, worden de weefsels drie keer gewassen met PBS, waarna de weefsels worden geïncubeerd in een verdunning van 1:500 van Alexa Fluor-geconjugeerde antilichamen in blokkeringsbuffer.

Incubeer gedurende één uur voor cryosecties of twee uur voor flat mounts. Doe dit bij kamertemperatuur en bescherm het monster tegen licht. Nadat het secundaire antilichaam is aangebracht, wordt dit verwijderd door drie keer te wassen met PBS, zoals eerder beschreven.

Maak nu ontlastingssneden in het netvlies, zodat het vlak op een objectglas kan worden gemonteerd met ofwel de fotoreceptoren of de retinale ganglioncellen naar boven gericht. Breng een waterig montagemedium en een dekglas aan. De preparaten kunnen op vier graden Celsius worden bewaard voorafgaand aan beeldvorming met confocale microscopie.

Begin met het genereren van een positieve controle voor circulerende AAV-partikels. Neem eerst een bloedmonster van 10 tot 20 µL vóór het injecteren van de AAV. Injecteer vervolgens, zodra het dier is geanestheseerd, 100 µL van de stock-virale oplossing in de bloedbaan.

De eenvoudigste manier om stoffen in de bloedbaan te injecteren is via de penisader. In deze video-opname injecteren we blauwe kleurstof als visuele controle van de injectie. Neem gedurende de volgende drie dagen periodiek een kleine bloedmonster en offer daarna de muis. Extraheer uit een weefselmonster het genomische DNA met behulp van een commerciële kit; voer met dit DNA een PCR-amplificatie uit met een primerpaar voor GFP. Voer 30 cycli uit met extensies van 45 seconden en een annealing-temperatuur van 55 °C. De transductiepatronen van de SHH 10-vector werden verwacht toe te nemen in de DP 71 null-muizen. Indien het diermodel verstoringen in de structuur van de innerlijke limiterende membraan vertoonde, hebben DP 71 null-muizen aangetaste retinale barrières en vormen zij daarom een nuttige vergelijking; bij de DP 71 null-muizen is de intravitreale injectie van SHH 10 effectiever gericht op Müller-gliacellen.

Dit duidt op een destabilisatie van het membraना internum limitans in deze transgene muizenlijn vergeleken met wild-type controles. De injectie van AAV5-GFP toonde eveneens permeabiliteit van het membraना internum limitans aan. AAV5 was ineffectief bij intravitreale injectie in wild-type muizen, maar bleek zeer effectief voor gentransfer naar fotoreceptoren in muizen met aangetaste retinale barrières, zoals bij de DP 71 null-muizen.

Via PCR-analyse blijft de bloed-retina-barrière in DP 71-null muizen selectief voor AAV-partikels, aangezien er na intravitreale injectie geen sporen van AAV werden gevonden in hun bloedmonsters. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe adeno-geassocieerd virus kan worden gebruikt om de integriteit van het membrana limitans interna of de permeabiliteit van de bloed-retina-barrière te testen door het transductiepatroon van de retina of de aanwezigheid van AAV-partikels in de bloedbaan te analyseren.