Functionele karakterisatie van Na

Het algemene doel van het volgende experiment is om de activiteit van intracellulair tot expressie gebrachte natrium-protonenuitwisselaars te meten. Dit wordt bereikt door eerst cellen te selecteren die de intracellulaire natrium-protonenuitwisselaars in het plasmamembraan tot expressie brengen via proton-killingselectie. Als tweede stap worden de geselecteerde cellen verzuurd, waarna het herstel van de intracellulaire pH wordt gemeten om de natrium-protonenuitwisselingsactiviteit van de cellen te bevestigen.

De snelle kinetiek van het ionentransport wordt vervolgens gemeten om de affiniteitsconstanten voor het getransporteerde kation en remmers te bepalen. Uiteindelijk maakt het monitoren van de veranderingen in de intracellulaire pH en de snelle kinetiek van de geselecteerde somatische cellen de functionele karakterisering van de intracellulaire eiwituitwisseling mogelijk. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het tot expressie brengen van mutante transporters of het gebruik van per cells, is dat het de expressie van wild-type intracellulaire transporters aan het plasmamembraan mogelijk maakt, waardoor hun functie direct gemeten kan worden.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Mallory Poet, een onderzoeker uit mijn laboratorium. Om te beginnen met de proton-killing procedure: incubeer eerst de cellen die de intracellulaire natrium-protonenuitwisselaar van belang tot expressie brengen in laadoplossing bij 37 °C in een CO2-vrije incubator gedurende één uur. Aspireer vervolgens de laadoplossing en was de cellen tweemaal met vers medium.

Zuig na de tweede wasbeurt het medium af en incubeer de cellen in hersteloplossing in een incubator zonder kooldioxide. Vervang na nog een uur het herstelmedium door regulier kweekmedium en kweek de cellen onder standaard kweekcondities. Herhaal deze selectiecyclus tweemaal per week tot er stabiele klonen ontstaan om de intracellulaire fluorescentie-pH van de cellen te beelden.

Rust eerst een beeldset uit bestaande uit een omgekeerde microscoop gekoppeld aan een video-camera met een hoge gevoeligheid, met smalbandige interferentiefilters van 450 nanometer en 490 nanometer, gecombineerd met de passende kwarts neutraaldichtheidsfilters voor excitatie. Gebruik indien mogelijk de juiste set filters en verlichtingsomstandigheden om vergelijkbare fluorescentiewaarden in te stellen voor kanaal één en twee, zodat de ratio nadert tot één om de voorwaartse activiteit van de natrium-protonenuitwisselaar te meten. Verzuur vervolgens de cellen met een incubatie van één uur in een ammoniumlaadoplossing.

Kleur de cellen in afwezigheid van kooldioxide tijdens de laatste vijf minuten van de incubatie met een ratio-metrische pH-gevoelige fluorescente kleurstof. Spoel aan het einde van de incubatieperiode de cellen met ammoniumlaadoplossing om de extracellulaire probe te verwijderen en plaats de gekleurde cellen op de microscoop. Selecteer de relevante regio's van interesse (regions of interest) waar de fluorescentiewaarden zullen worden gemeten.

Neem vervolgens enkele beelden op om een basislijn vast te stellen en perfuseer de cellen met de RIN-oplossing om een daling in de fluorescentie te initiëren. Nadat de pH is gestabiliseerd, perfuseer dan de cellen met de betreffende oplossing om de pH-herstelpercentages te meten, gemedieerd door de lithiumwaterstof-, natriumwaterstof- of kaliumwaterstofuitwisseling. Perfuseer de cellen nu met de hippies-oplossing aangevuld met kaliumchloride en gerine.

Verzamel vervolgens de fluorescentiemetingen van de beelden en exporteer de gegevens in tekstformaat naar een spreadsheetprogramma om de initiële snelheid van de natrium-protonenuitwisselaar te meten. Zeven: verzuur de cellen en multi-well platen door middel van snelle lithiumopname via de zojuist gedemonstreerde Imodium-laadtechniek. Spoel de platen vervolgens twee keer snel af, zoals zojuist gedemonstreerd.

Incubeer vervolgens de cellen in opname-oplossingen met 1 tot 10 µM lithium en de gewenste concentraties van het betreffende kation of de remmers gedurende ongeveer één minuut of minder. Verwijder aan het einde van de opnameperiode voorzichtig het opnamemedium en was de cellen snel vier keer met ijskoud PBS in minder dan 10 seconden in totaal om lithium-efflux te voorkomen, lys vervolgens de cellen in 250 µL 25% salpeterzuur per put gedurende ten minste één uur. Schraap aan het einde van de incubatie elke put met het uiteinde van de pipetpunt en breng de suspensies uit elke put over in nieuwe microcentrifugebuisjes. Centrifugeer tot slot de monsters vijf minuten bij 15.000 ×g bij kamertemperatuur om het cellulaire debris te verwijderen en meet vervolgens de lithiuminhoud van het supernatant via atoomabsorptiespectroscopie.

Volgens de instructies van de fabrikant is de selectie op basis van protonendoding gebaseerd op de diffusie van de zwakke base ammonium. Zo kunnen cellen die geen functionele natrium-protonenuitwisselaar in het plasmamembraan tot expressie brengen geen neutrale pH-waarde herstellen en vertonen zij daarom een typisch verzuurd aspect met een platte vorm en een granulair cytosol, zoals te zien is in deze representatieve afbeelding na herhaalde selectiecycli, waarbij cellen die volledig en stabiel overleven zichtbaar zijn. De verzuring vormt echter individuele cellulaire klonen zoals hier te zien is; zoals aangetoond kan de activiteit en ionselectiviteit van de intracellulaire natrium-protonenuitwisselaars die in het plasmamembraan tot expressie komen, worden gekarakteriseerd door de veranderingen in de intracellulaire pH te meten die worden geïnduceerd onder verschillende experimentele condities, zoals waargenomen in deze grafieken na verzuring door belading met Imodium.

Wat betreft de enzymkinetiek kunnen de dosis-responscurves voor de initiële opnamesnelheden verder worden gebruikt om de affiniteitsconstanten voor de substraten en de inhibitiestandaarden voor de inhibitoren af te leiden. Een interessant kenmerk van de transporters is namelijk dat verschillende koppelingscationen zullen concurreren om het transport, waardoor het mogelijk is om de affiniteitsconstante voor natrium te meten door competitie met de lithiumopname, zoals gedemonstreerd in deze figuur bij het volgen van deze procedure. Andere experimenten, zoals celoppervlak BioInnovation gekoppeld aan RNA-silencing, kunnen worden uitgevoerd om te verifiëren dat de betreffende transporter inderdaad wordt tot expressie gebracht in het plasmamembraan.