Functionele karakterisatie van Na ⁺ / H ⁺ Warmtewisselaars van intracellulaire compartimenten met Proton-doden Selectie om ze te uiten op het plasmamembraan

Het algemene doel van het volgende experiment is om de activiteit van intracellulair uitgedrukte natrium protonenwisselaars te meten. Dit wordt bereikt door eerst cellen te selecteren die de intracellulaire natrium protonenwisselaars op het plasmamembraan tot expressie brengen door middel van protondoodselectie. Als tweede stap worden de geselecteerde cellen geacidificeerd, en vervolgens wordt de herstelsnelheid van de intracellulaire pH gemeten om de natrium protonenuitwisselingsactiviteit van de cellen te bevestigen.

De snelle kinetica van het ionentransport worden vervolgens gemeten om de affiniteitsconstanten voor het getransporteerde kation en remmers te bepalen. Uiteindelijk maakt het monitoren van de veranderingen in de intracellulaire pH en de snelle kinetica van de geselecteerde somatische cellen de functionele karakterisering van de intracellulaire eiwituitwisseling mogelijk. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals het tot expressie brengen van mutante transporteurs of het gebruik van per cellen, is dat het de expressie van intracellulaire transporteurs van het witte type op het plasmamembraan mogelijk maakt, waardoor hun functie direct kan worden gemeten.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Mallory dichter, een onderzoekswetenschapper uit mijn laboratorium. Om de protondoodprocedure te beginnen. Incubeer eerst de cellen die het intracellulaire natrium protonenwisselaar van belang tot expressie brengen in laadoplossing bij 37 graden Celsius en een koolstofdioxidevrije incubator gedurende één uur. Zuig vervolgens de laadoplossing af en was de cellen twee keer met vers medium.

Na de tweede wassing, zuig het medium af en incubeer de cellen in hersteloplossing in een koolstofdioxidevrije incubator. Na nog een uur, vervang het herstelmedium door normaal kweekmedium en laat de cellen groeien onder standaard kweekomstandigheden. Herhaal deze selectiecyclus twee keer per week tot stabiele klonen ontstaan om de intracellulaire fluorescentie pH van de cellen te beeldvormen.

Rust eerst een beeldvormingsset uit die bestaat uit een omgekeerd microscoop gekoppeld aan een hooggevoelige videocamera met 450 nanometer en 490 nanometer smalle band interferentiefilters, gecombineerd met de juiste kwarts neutrale dichtheidsfilters voor excitatie. Gebruik indien mogelijk de juiste set filters en verlichtingscondities om vergelijkbare fluorescentiewaarden voor kanaal een en twee in te stellen, zodat de verhouding nadert naar één om de voorwaartse activiteit van de natrium protonenwisselaar te meten. Zuig vervolgens de cellen aan met een één uur durende incubatie in ammoniumlaadoplossing.

In afwezigheid van koolstofdioxide tijdens de laatste vijf minuten van de incubatie, kleurt u de cellen met een ratiometrische pH-gevoelige fluorescerende kleurstof. Aan het einde van de incubatieperiode, spoelt u de cellen met ammoniumlaadoplossing om de extracellulaire sonde te elimineren en monteert u de gekleurde cellen op de microscoop. Selecteer de gebieden van belang waar de fluorescentiewaarden zullen worden gemeten, zoals gepast.

Neem vervolgens verschillende beelden op om een basislijn vast te stellen en perfuseer de cellen met de RIN-oplossing om een daling in de fluorescentie te initiëren. Nadat de pH is gestabiliseerd, perfuseer de cellen met de oplossing van belang om de pH-herstelsnelheden te meten zoals gemedieerde door lithiumwaterstof, natriumwaterstof of kaliumwaterstof uitwisseling. Perfuseer vervolgens de cellen met de oplossing van hippies aangevuld met kaliumchloride en gerin.

Verzamel vervolgens de fluorescentiemetingen uit de beelden en exporteer de gegevens naar een spreadsheetprogramma in tekstformaat om de initiële snelheid van de natrium protonenwisselaar te meten. Zeven, door middel van snelle lithiumopname, zuurt u de cellen en multi-well platen aan door middel van de Imodium-laadtechniek zoals net gedemonstreerd. Spoel vervolgens de platen twee keer snel af zoals net gedemonstreerd.

Vervolgens incubeert u de cellen in opnameoplossingen met één tot 10 micromolar lithium en de gewenste concentraties van het kation of de remmer van belang gedurende ongeveer één minuut of minder. Aan het einde van de opnameperiode, verwijdert u voorzichtig het opnamemedium en wast u de cellen snel vier keer met ijskoud PBS in minder dan 10 seconden totaal om lithiumefflux te voorkomen, vervolgens lyst u de cellen in 250 microliters van 25% salpeterzuur per putje gedurende ten minste één uur. Schraap elk putje schoon met het uiteinde van de pipettentip aan het einde van de incubatie en breng de suspensies van elk putje over in nieuwe microcentrifugebuisjes. Centrifugeer ten slotte de monsters gedurende vijf minuten bij 15.000 G bij kamertemperatuur om het cellulaire puin te verwijderen en meet vervolgens het lithiumgehalte van de snat door middel van atomaire absorptiespectroscopie.

Volgens de instructies van de fabrikant is protondoodselectie gebaseerd op de diffusie van de ammoniumzwakke base. Bijvoorbeeld, cellen die geen functionele natrium protonenwisselaar tot expressie brengen op het plasmamembraan, kunnen geen neutrale pH-waarde herstellen en vertonen daarom een typische geacidificeerde uitstraling met een platte vorm en een korrelig cytosol zoals te zien is in deze representatieve afbeelding na herhaalde selectiecycli, cellen die volledig en stabiel overleven. De acidificatie vormt echter individuele cellulaire klonen zoals hier te zien is, zoals aangetoond de activiteit en ionenselectiviteit van de intracellulaire natrium protonenwisselaars tot expressie gebracht op het plasmamembraan kunnen worden gekenmerkt door het meten van de veranderingen in de intracellulaire pH geïnduceerd onder verschillende experimentele omstandigheden zoals waargenomen in deze grafieken na Imodium-laadoplossing acidificatie.

Wat betreft de enzymkinetiek, kan de dosisrespons voor de initiële opname snelheden verder worden gebruikt om de affiniteitsconstanten voor de substraten en voor de remmingsconstanten van de remmers af te leiden. Inderdaad, een interessant kenmerk van de transporteurs is dat verschillende koppelingskationen zullen concurreren voor het transport, waardoor de mogelijkheid ontstaat om de affiniteitsconstante voor natrium te meten door middel van concurrentie met de lithiumopname zoals gedemonstreerd in deze figuur. Volgend deze procedure. Andere experimenten zoals celoppervlak BioInnovation gekoppeld aan RNA-silencing kunnen worden uitgevoerd om te verifiëren dat de transporteur van be