Onderzoekt Single Molecule Hechting van Atomic Force Spectroscopie

Het algemene doel van deze procedure is om een enkelvoudig polymeer te koppelen aan een A FM cantilever tip om vier spectroscopische oppervlakte desorptie experimenten met één en dezelfde moleculen meerdere keren uit te voeren. Dit wordt bereikt door eerst het oppervlak van de tip te activeren met plasma om hydroxylgroepen te vormen als tweede stap. De cantilevertip wordt amino siloiseerd door een up test oplossing, die aminogroepen op het oppervlak van de tip vormt.

De derde stap is het koppelen van polyethyleenglycol moleculen aan de aminogroepen. Ze voorkomen onspecifieke interacties tussen de tip en het substraat en dienen als linkermoleculen voor de polymeren. Ten slotte worden polymeren gekoppeld aan de polyethyleenglycol moleculen om een sonde te vormen.

Metingen suggereren dat deze procedure het mogelijk maakt om één en dezelfde polymeer krachtsonde te gebruiken voor een complete experimentele set, of op dezelfde manier, honderden krachtafstandscurves. De belangrijkste voordelen van enkelmolecuul experimenten boven ensemble methoden zijn dat zeldzame bevestigingen en zeldzame toestanden kunnen worden bestudeerd, die anders verborgen zouden zijn in ensemble gemiddelden. Vanwege hun kleine omvang kunnen deze experimenten direct worden vergeleken met moleculaire dynamische simulaties.

De eerste stap is om sondemoleculen covalent aan de cantilever tip te hechten. Begin met vers siliciumnitride. Cantilever chips, gebruik chips met een veerconstante van 10 tot 100 pico newton per nanometer.

Gebruik pincetten om ze op een schone glazen plaat of petrischaal te plaatsen. Plaats vervolgens de plaat met de chips in een 100 watt plasmakamer na het vacuümpomp van de kamer en het vullen met zuurstof gedurende 0,25 millibar en 20 watt gedurende 15 minuten. Gebruik in de volgende stappen een kap om inademing van organische dampen tijdens de plasmabewerking te voorkomen.

Bereid de cantilevers voor op amino siloisatie in een glazen petrischaal, plaats 2,5 milliliter van up test oplossing. Reparatie bovendien een vat met aceton. Haal de cantilevers onmiddellijk op nadat de plasmabewerking voltooid is.

Duik elke cantilever één seconde in aceton en plaats het vervolgens in de Optus oplossing. Incubeer de cantilevers gedurende 15 minuten op kamertemperatuur voordat u verder gaat. Terwijl de cantilevers incuberen, begin met voorbereiding voor pegylatie om de effecten van water en lucht op de componenten te minimaliseren.

Begin met eerder voorbereide eph buisjes, één met m peg, NHS en de andere kleurstof. NHS Peg. Bepaal het gewicht van de inhoud van elke buis.

Werk vervolgens met de buis met EG NHS en bereid voor om chloroform toe te voegen. Giet het chloroform om een ​​eindconcentratie van 25 millimolair te bereiken en voldoende oplossing om de cantilevers in volgende stappen te bedekken. Plaats de buis op een vortex mixer om ervoor te zorgen dat het poeder zich oplost.

Leg de buis met de EG NHS opzij om met het dieet te werken. NHS peg. Voeg een chloroform toe om een ​​eindconcentratie van 0,25 millimolair te bereiken.

Gebruik een vortex mixer om ervoor te zorgen dat het poeder is opgelost. Meng vervolgens de oplossingen om de verhouding tussen de dieet NHS peg en de methyl peg NHS moleculen aan te passen. Deze verhouding is doorgaans één tot 500.

Verkrijg een kleine glazen petrischaal met een deksel om verdamping te beperken en vul deze met het mengsel zoals de cantilevers. Voltooi de incubatie. In APT test oplossing, heb twee containers met ongeveer 10 milliliter aceton en een met chloroform klaar voor het spoelen ervan.

Duik elk van hen twee keer in het aceton en eenmaal in chloroform en plaats ze in de polyethyleenglycol oplossing. Bedek de schaal en bewaar de cantilevers in de oplossing. Bereid gedurende één uur voor op de covalente koppeling van een sonde molecuul in dit geval poly aminozuur poly de tyrosine.

Begin met het volume van een molair natriumhydroxide opgelost in dit, de sonde molecuul tot een concentratie van één milligram per milliliter. Voor poly D tyrosine, vervang natriumhydroxide voor acht tot 8,5 pH natrium bore. Acht buffer onmiddellijk voor functionalisering.

Terwijl de cantilevers hun incubatie in polyethyleenglycol oplossing voltooien, bereid drie containers voor om ze te spoelen en een container van de poly tyrosine bore. Acht buffer oplossing voor het spoelen is vijf milliliter chloroform, vijf milliliter ethanol, vijf milliliter van de bore buffer. Gebruik ongeveer 300 microliters van de poly tyrosine bore buffer oplossing.

Haal de cantilevers op en duik ze eerst in chloroform, dan in ethanol en vervolgens in de bore acht buffer. Voordat u ze in de poly tyrosine bore acht buffer oplossing plaatst. Laat de cantilever chips één uur incuberen na één uur gereed zijn, ongeveer vijf milliliter van bate buffer in één container en vijf milliliter ultrapuur water in een andere voor het spoelen van de cantilevers hebben ook 20 milliliter ultrapuur water om ze op te slaan.

Haal de cantilevers op en duik ze eerst in Boite buffer, gevolgd door ultrapuur water voor het spoelen. Dompel het vervolgens in ultrapuur water voor opslag. De cantilevers kunnen nu worden gebruikt voor dataverzameling.

Zodra de A FM tip is gefunctionaliseerd en een oppervlak is voorbereid en gemonteerd, begin met stappen voor FM dataverzameling. Plaats eerst de gefunctioneerde cantilever in een A FM cantilever houder die geschikt is voor metingen in vloeistoffen. Verbind vervolgens de cantilever houder met de A FM kop.

Ga verder door water in de vloeistofcel te gieten om de cantilever en het oppervlak onder te dompelen. Laat vervolgens de A FM kop op de vloeistofcel zakken. Laat het systeem minstens een half uur gelijkwaardig worden.

Na e gelijkwaardigheid. Plaats de cantilever ver van het oppervlak, neem vervolgens spectra van thermische ruis op 10 of meer spectra zijn vereist om een ​​voldoende signaal-ruisverhouding te verkrijgen om oppervlaktedempingeffecten uit te sluiten. Ga vervolgens voorzichtig naar het oppervlak om een ​​meting van de inverse optische hefbooggevoeligheid te maken.

Dit omvat het duwen van de cantilever tip tegen een hard oppervlak om de kracht versus pizo reis afstand te registreren. Meet de helling tijdens contact en draai deze om om de inverse optische hefbooggevoeligheid te bepalen. Werk vervolgens de inverse optische hefbooggevoeligheid en de thermische ruis spectra. Bepaal de veerconstante van