Name: Analyse van genexpressie Veranderingen in het Rat Hippocampus Na Deep Brain Stimulation van de Anterior Thalamic Nucleus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Leer diepe hersenstimulatie van de anterieure thalamus en analyseer genexpressieveranderingen in de hippocampus van ratten. Deze methode onthult moleculaire mechanismen achter therapeutische effecten bij epilepsie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij zijn dankbaar voor de steun van de NREF-stichting.

OPMERKING: Ethiek Verklaring: Alle procedures besproken in dit handschrift zijn in overeenstemming met de NIH richtlijnen voor Animal Research (Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren) en zijn goedgekeurd door de Harvard Medical School IACUC commissie. 1. Pre-operatieve voorbereiding <ol><li> Zorg ervoor dat alle chirurgische instrumenten worden gesteriliseerd door ofwel een autoclaaf of door het reinigen met een antiseptische oplossing en / of ethanol als dat nodig is. Waar mogelijk, gebruik steriel wegwerpmateriaal zoals scalpels, naalden en spuiten. </li><li> Bedek de werkbank met chirurgisch afdekmateriaal en ervoor zorgen dat er een biologisch gevaarlijk afval beschikbaar. </li><li> Weeg de rat en bereken verdoving dosis. Gebruik een ketamine / xylazine mengsel (ketamine 75 mg / kg en xylazine 10 mg / kg) aan de ratten verdoven. OPMERKING: Tussen 200-250 g het optimale gewicht voor stevige bevestiging van het dier in het stereotactische frame en voor het nauwkeurig richten van de ATN. Isoflurane kan ook worden gebruikt als de verlamming middel. </li><li> Mount en veilig twee steriele elektroden (autoclaaf of met ethyleenoxide) op de elektrodehouder (figuur 2) van een stereotactische chirurgische frame en met behulp van een microscoop (10-40X vergroting), controleer de uiteinden van de elektrode voor juiste uitlijning. Bevestig de twee elektroden 3,0 mm van elkaar. LET OP: Wees voorzichtig om te voorkomen dat schade aan de elektrode door het aanraken op een harde ondergrond. </li></ol> 2. DBS Chirurgie <ol><li> Injecteer de Ketamine / Xylazine mix intraperitoneaal om het dier en bevestigen dat het dier een chirurgische vlak van anesthesie heeft bereikt (door te controleren op de teen-snuifje reflex, ademhalingsfrequentie en de diepte en de regelmatigheid van de ademhaling). Haal haar van het gebied van de hoofdhuid zal worden ingesneden en desinfecteren van de hoofdhuid met 3 afwisselend scrubs elk van betadine en ofwel alcohol of steriele zoutoplossing. Beveiligen en positioneren van het dier op de stereotactische frame. </li><li> Gebruik circulerende warm water pads om de lichaamstemperatuur van het dier op een optimaal niveau te houden. Solliciteer oog smeermiddel voor de ogen van het dier te beschermen tegen uitdrogen. </li><li> Gebruik de volgende stereotactische coördinaten voor het richten van de ATN (anterieure thalamus nucleus): anterioposterior -1,6 mm, mediolaterale 1,5 mm en dorsoventral 5.2 mm 1. OPMERKING: De stereotactische coördinaten zijn gebaseerd op de Paxinos en Watson (6de uitgave) rattenhersenen atlas 36. </li><li> Een insnijding in de hoofdhuid sagittaal aan de schedel te onthullen. Met behulp van een paar van retractors zet de ingesneden hoofdhuid aan de schedel bloot te leggen. Gebruik steriele zoutoplossing om de incisie te spoelen. Als incisie is te nat, te gebruiken steriele wattenstaafjes om te drogen. Zoek de bregma en markeer met een zwarte stift. Om de positie van de boorgaten leiden, maken twee merken ongeveer 1,5 mm mediolaterally aan beide zijden van de pijlnaad en 1,6 mm achter de Coronal hechtdraad. </li><li> Gebruik een handboormachine de boorgaten te maken. Zorg ervoor dat de punt van de braam gat is steriel door steriliseren met ethanol. Houd de boor van ongeveer 45 ° aan de schedel oppervlak bij het boren. Vaak wisselt tussen de twee boorgaten aan overmatige hitte op de locatie van een braam gaatje te voorkomen. </li><li> Boorproces totdat de dura wordt blootgesteld. Met behulp van een naald met de punt gebogen lijkt op de vorm van een &#39;L&#39;, verwijder eventuele gebroken stukken van het bot dat het inbrengen van de elektrode zou belemmeren. Neem zorg om te voorkomen beschadiging van de onderliggende dura en / of hersenweefsel tijdens het verwijderen van botsplinters behulp van de gebogen naald. OPMERKING: Met behulp van een afgestompte naald of fijne stompe pincet is ook een optie. </li><li> Bevestig de dubbele elektrodesamenstel de draaihendel van het stereotactische frame en bevestig het handvat van 90 °. Met behulp van de aanpassingen in het stereotactische frame, de positie van de linker elektrode precies boven de bregma. </li><li> De stereotactiek aanpassingen voor mediolaterale positionering, precies beweeg de linker elektrode van 1,5 mm aan de linkerkant van bregma zodanig dat er nu twee elektroden perfect uitgelijnd langs de coronale hechtdraad, maar op afstand van elkaar op 1,5 mm mediolaterally uit de bregma. </li><li> Met behulp van de anterioposterior stereotactische aanpassingen, bewegen de elektroden 1,6 mm achter de coronale hechtdraad. </li><li> Gebruik de dorsoventral aanpassingen aan de elektroden te verlagen tot controleer dan eerst of de braam gaten zijn gemaakt op de juiste plaats, zodat de elektroden met gemak kunnen worden ingevoegd, zonder het aanraken van de ruwe randen van de boorgaten. Dan plaatst de elektroden tot een diepte van 5,2 mm vanaf het oppervlak van de schedel. </li><li> Sluit de elektroden via leidt tot een stimulator ingesteld op 130 Hz, 2,5 V en 90 psec pulsbreedte 1. </li><li> Lever hoogfrequente stimulatie voor een uur (of voor een gewenste periode van tijd als per experimentele opstelling). In de loop van de stimulatie, vergeet niet om p verzekerenRoper verdoving diepte regelmatig door te controleren op de afwezigheid van mond terugtrekking in reactie op een teen knijpen. Aanvullen anesthesie met ongeveer de helft van de initiële dosis gebruikt om anesthesie. Vermijd besmetting van uw steriele handschoenen bij het controleren verdoving diepte en ze te veranderen indien nodig. Voer unilaterale of bilaterale stimulatie gebaseerd op een experimentele behoeften. Omvatten controles zoals laagfrequente stimulatie (voor bv., 10 Hz) en niet gestimuleerde dieren (invoegen van elektroden zonder verdere stimulatie). </li><li> Na stimulatie gebeurt, verwijder de elektroden voorzichtig en hechtdraad de incisie met 3-0 hechtingen of met steriele chirurgische nietjes. </li><li> Dien buprenorfine (0,05 mg / kg) subcutaan als analgesie. Bewaak het dier tot het terugkeert naar de normale activiteit en dan terug naar de behuizing faciliteit. </li><li> Na een bepaalde periode op basis van de experimentele opzet (voor bv, 0, 3, 6 of 12 uur na DBS operatie), Euthanaseren het dier met verdoving overdosis. Na bevestiging van de afwezigheid van vitale functies, onthoofden het dier. </li><li> Ontleden van de hersenen door eerst de huid met behulp van een schaar te verwijderen. Snijd door het bot langs de pijlnaad behulp dissectie schaar. Voeg twee insnijdingen (ongeveer een centimeter elk) door het bot aan beide zijkanten. Behulp van een tang, til de gedeeltelijk doorgesneden stuk bot vanaf de bovenkant van de schedel de hersenen bloot. </li><li> Met behulp van fijne schaar of tang, verjagen de hersenen uit de schedel en over te brengen naar een petrischaal met koude PBS op ijs. OPMERKING: Zorg om schade aan de hersenen te voorkomen tijdens het maken van de insnijdingen door het bot. </li></ol> 3. Hippocampus Isolatie OPMERKING: Voer alle volgende stappen in dit gedeelte op het ijs. <ol><li> Plaats de hersenen op een voorgekoelde acryl brain matrix op ijs. Met behulp van een scheermesje, snijd de hersenen coronaalwaarts op ongeveer 7-8 mm van de voorste meest edge van de hersenen. Maak een tweede snede coronaalwaarts en posterior aan de eerste snede, zodanig dat een ongeveer 5 mm dikke plak hersenen verwijderd kon worden. </li><li> Breng de hersenen slice een petrischaal met ijskoude PBS. Met behulp van scheermesje, verbreken de twee halfronde delen en zorg te noteren welke halfrond respectievelijk overeen met de linker- en rechterkant. Dit is vooral belangrijk tijdens het uitvoeren van eenzijdige stimulatie. </li><li> Met behulp van fijne tang en schaar verwijder de hippocampus voorzichtig. </li><li> Flits bevriezen de hippocampus weefsel op droog ijs en op te slaan in -20 ° C vriezer totdat klaar voor de daaropvolgende RNA-extractie stappen. OPMERKING: Bij langdurige opslag, is het raadzaam om weefsel te slaan in een -80 ° C vriezer. </li></ol> 4. RNA-extractie en kwantitatieve PCR <ol><li> Zorg ervoor dat het weefsel blijft bevroren op droog ijs tot klaar voor homogenisering. </li><li> OPMERKING: Voer deze stap in de kap. <ol><li> Voeg 1 ml Tri reagens om hippocampal weefsel in een 1,5 ml centrifugebuis en homogeniseren door eerst pipetteren meerdere keren totdat het weefsel wordt gebroken in kleinere stukken. Verder homogeniseren het weefsel door het passeren door een spuit met een 25 G naald tot er geen ononderbroken weefsel zichtbaar. Voer de homogenisering stappen op het ijs. </li><li> Na homogenisatie van het weefsel, zodat de celsuspensie bij kamertemperatuur staan ​​gedurende 5 minuten om cellysis mogelijk. OPMERKING: Na dit punt de celsuspensie kan snel worden ingevroren en opgeslagen in -70 ° C tot verdere verwerking. </li></ol></li><li> Voeg 0,2 ml chloroform en door vortexen gemengd gedurende 20 seconden en laat de oplossing rusten bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. </li><li> Centrifugeer de monsters bij 12.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Na centrifugeren, verwijder de buizen voorzichtig zonder verstoring van de drie afzonderlijke lagen die zichtbaar zal zijn. OPMERKING: De onderste (rode) fase bevat eiwitten, midden bewolkt fase bevat DNA en de top duidelijke fase bevat RNA. </li><li> Breng de bovenste heldere fase (RNA) in een schoon 1,5 ml centrifugebuis (kenmerkend 500 gl van het RNA bevattende fase wordt verkregen). Om dit toe te voegen 0,5 ml isopropanol en meng door vortexen. Om deze add 2-3 pl glycogeen (20 mg / ml) als drager voor het RNA. Laat het monster rusten op de tafel bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. </li><li> Centrifugeer het monster bij 12.000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C. Zorg ervoor dat de RNA pellet zichtbaar op de bodem van de buis. </li><li> Verwijder het supernatant en was de RNA pellet door toevoeging van 1 ml 75% ethanol (gemaakt met nuclease vrij water). Inverteer de monster meerdere keren totdat de pellet loskomt van de bodem van de buis en drijft in de oplossing. Centrifugeer de oplossing bij 12.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. OPMERKING: De pellet in 75% ethanol kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C tot verdere stappen. </li><li> Laat de RNA-pellet aan de lucht drogen met de buizen open 5 minuten bij kamertemperatuur. Neem voorzorgsmaatregelen om ove voorkomenr het drogen van de pellet, omdat dit de ontbinding van invloed kunnen zijn op het water in de volgende stap. </li></ol> 5. Het verwijderen van het DNA RNA bereiding <ol><li> Voeg 9 ul van nuclease gratis water aan de RNA pellet en zorg ervoor dat de pellet wordt opgelost voordat u verder door zachtjes vortexen de buis. Om deze voeg 1 pl 10x DNase I buffer en 1 ui recombinant DNase (van DNase I kit) Meng door voorzichtig flicking de buizen kort draaien de buizen en incubeer bij 37 ° C in een waterbad gedurende 30 min. </li><li> Voeg 2 ul DNase inactivatie reagens (van DNase I kit) verdund en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten en meng vaak door voorzichtig flicking de buis. Centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 10 min en overdracht ongeveer 10 pl van de heldere supernatant naar een nieuwe 1,5 ml centrifugebuis. </li><li> Meet RNA-concentratie met behulp van een NanoDrop of spectrofotometer. </li></ol> 6. een cDNA uit RNA <ol><li> Voeg vereiste volume thop bevat 1 ug RNA en brengen het totaal volume 8 pl door toevoeging van nuclease vrij water. Om dit toe te voegen 1 ui 10 mM dNTP mix en 1 ui van willekeurige hexameren van de Superscript First Strand Synthesis Kit. Meng voorzichtig en incubeer bij 65 ° C gedurende 5 min in ofwel een waterbad of een voorgeprogrammeerde thermocycler. </li><li> Maak een voormengsel met de volgende reagentia: 2 ui 10X Buffer RT, 4 ui 25 M MgCl2, 2 pl 0,1 M DTT en 1 pl RNAse OUT (40 U / ul). OPMERKING: Volumes gegeven zijn per reactie, zou de gebruiker moeten opschalen volgens een experimentele behoeften. </li><li> Na verwijdering van het RNA-bevattende monster van 65 ° C, zet de buis bij kamertemperatuur gedurende een minuut. Voeg 9 ul premix-oplossing en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Voeg 1 pl Superscript II reverse transcriptase enzym (50 U / ul) en vervolgens geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. </li><li> Incubeer de monsters bij 42 ° C gedurende 50min voor reverse transcriptie optreden. </li><li> Incubeer de monsters bij 70 ° C gedurende 15 min om de reactie te beëindigen. </li><li> Plaats de monsters op ijs kort en voeg 1 pl RNAse H (2 U / pl) en incubeer bij 37 ° C gedurende 20 min. </li><li> Kort centrifuge de buizen bij 3000 xg om spin down de condensaatvloeistof. Opmerking: Dit is het cDNA dat wordt gebruikt voor kwantitatieve PCR. cDNA kan worden opgeslagen in -20 ° C vriezer totdat de PCR setup. cDNA kan ook worden verdund met nuclease gratis water alvorens tot PCR. </li></ol> 7. Kwantitatieve PCR <ol><li> Maak een master mix met de volgende reagentia (volumes gegeven zijn per reactie): 6.3 ul 2x Sybr Green Mix, 0,6 ul van Forward Primer (10 uM), 0,6 pi Reverse Primer (10 uM) en 0,5 pi van Nuclease gratis water . OPMERKING: Primer ontwerp werd gedaan met behulp van &quot;pick Primers&quot; optie NCBI nucleotidesequentie pagina voor het gen van interesse. </li><li> Voeg 10 ul mastermix aan elk putje van een 96 goed PCR plaat. Voeg 2,5 ul van cDNA eerder tot het putje met de mastermix gemaakt. Zorg ervoor dat op te zetten drievoud PCR reacties voor elk monster. </li><li> Na de toevoeging van mastermix en cDNA omvatten de PCR-plaat met een optische kleefvel aan de putjes dichten. Draai de plaat kort gedurende 5 min bij 500 xg in een tafelblad centrifuge om alle vloeistof naar de bodem van de put. </li><li> Laad de PCR-plaat op een voorgeprogrammeerde RT-PCR machine. Met de PCR parameters gegeven in tabel 1. </li><li> Gegevensanalyse: gebruik de Ct-waarden van de qPCR uitgang voor verdere berekeningen. Naast het testgen opgerichte PCR reacties interne controle genen, 18S rRNA en β-actine (negatieve controle) (gelijke invoer te garanderen). Bereken fold veranderingen gebaseerd op ΔΔCt methode 37. </li></ol>

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.

Na het oriëntatiepuntwerk door Benabid et al. Het gebruik diepe hersenstimulatie voor het behandelen Parkinson en essentiële tremor, heeft de DBS operatietechniek onderzocht met veel belangstelling de afgelopen tien jaar veel neurologische aandoeningen 6,10,43 behandelen. DBS studies gericht op diverse neuro-anatomische gebieden van de hersenen circuits worden momenteel uitgevoerd door vele groepen tot grote neuronale ziekten aan te pakken en zich in verschillende stadia van klinische proeven. Stimul...

De geschiedenis achter de ontwikkeling van Deep Brain Stimulation als een neurochirurgische techniek dateert uit de jaren 1870, wanneer de mogelijkheid van het elektrisch stimuleren van de hersenen circuits werd verkend 2. Het gebruik van chronische hoogfrequente stimulatie als behandeling van neuronale aandoeningen begon in 1960 3. Later in de jaren 1990 met de komst van chronische implantatie DBS elektroden 4-6, het aantal neuronale aandoeningen die werden behandeld met DBS blijven stijgen. DBS werd eerst gebruikt in de Verenigde Staten voor de behandeling van essentiële tremor 6. Vandaag de operatie wordt veel gebruikt om neuronale stoornissen die momenteel onbehandelbaar farmacologisch ingrijpen behandelen. DBS wordt momenteel gebruikt voor bewegingsstoornissen van Parkinson en dystonie 7-9 behandelen. Type Alzheimer dementie, de ziekte van Huntington, epilepsie, pijn en neuropsychiatrische aandoeningen depressie, OCD, syndroom7, syndroom en verslaving aantal van de voorwaarden vatbaar voor behandeling door DBS 10-12. Terwijl DBS chirurgie FDA goedgekeurd voor behandeling van ziekten, dystonie en essentiële tremor Parkinson, het gebruik van DBS voor de behandeling van overige bovengenoemde voorwaarden in verschillende stadia van laboratorium en klinische studies met veelbelovend patiënten 13,14. Klinisch wordt DBS operatie uitgevoerd in twee fasen. De eerste fase operatief plaatsen van de DBS elektroden de gerichte anatomische locatie met behulp van een combinatie van radiologische positioneren, CT, MRI en micro-elektrode metingen voor verbeterde nauwkeurigheid. De tweede stap omvat het implanteren van een pulsgenerator borst van de patiënt en het installeren verlengkabels van de hoofdhuid op de pulsgenerator. Op basis van de neurologische aandoening, hebben verscheidene regelingen programmering van de pulsgenerator gestandaardiseerd en wordt gebruikt om de gewenste spanning te leveren. De finale voltage bereikt stapsgewijs om de beste klinische respons met minimale spanning 15 ontvangen. In onze studies, in tegenstelling tot chronische DBS implantaten klinisch toegepast omwille van de eenvoud hebben we toevlucht te bestuderen eenmalig hoogfrequente stimulatie (1 uur) in onze diermodellen. Een deel van het onderzoek van onze groep richt zich op onderzoek naar het gebruik van DBS chirurgie voor de behandeling-refractaire epilepsie. Stereotactische chirurgische benadering en de hoogfrequente stimulatie werd onderzocht door velen als een effectieve mogelijkheid om medisch refractaire epilepsie ongeveer 30% van alle gevallen van epilepsie 10,16,17 vormt behandelen. Cerebellaire corticale stimulatie gericht op het oppervlak als de diepe kernen werden in het verleden gebruikt als doelwit om epilepsie te behandelen 10,18,19. Daarnaast heeft hippocampus stimulatie ook geprobeerd maar met gemengde resultaten 20,21. Enkele van de andere onderzochteDBS targets voor epilepsie zijn de cerebrale cortex, thalamus, subthalamische kern en nervus vagus 8. Echter, na de resultaten van verschillende studies in de afgelopen jaren, de anterieure thalamus nucleus (ATN) heeft ontpopt als de meest voorkomende DBS doelwit voor de behandeling van epilepsie 10,22. Gebaseerd op kennis neuroanatomical circuits en bevindingen uit diermodellen, hebben verschillende studies gericht op het therapeutisch effect van diepe hersenstimulatie van de ATN bij de behandeling van epilepsie 23-26. Het ATN is onderdeel van het limbische circuit en ligt in het gebied van de hersenen dat aanvalsfrequentie beïnvloedt. Studies door Hamani et al., Hebben de werkzaamheid van ATN-DBS in een pilocarpine-geïnduceerde epilepsie model getest en dat bilaterale ATN stimulatie verlengd latencies voor pilocarpine-geïnduceerde aanvallen en status epilepticus 24. Bovendien hoogfrequente stimulatie van de ATN bleek de frequentie van aanvallen te verminderen in een pentyleentetrazol (PTZ) model van de epilepsy 25,27-29. Lee et al., Hebben gemeld een gemiddelde verlaging van de frequentie van aanvallen met ongeveer 75% bij chronische diepe hersenstimulatie van de ATN in de behandeling van refractaire partiële epilepsie 30. Een recente klinische studie over de behandeling-refractaire epilepsie heeft veelbelovende resultaten na DBS operatie gericht op de anterieure thalamus nucleus (ATN) 22. Een multicenter gerandomiseerde klinische studie met 110 patiënten die een bilaterale DBS van de ATN voor behandeling refractaire epilepsie (SANTE trial) wees op een daling van de frequentie van aanvallen met ongeveer 40% 31. De resultaten van deze studie ook doorschemeren op een vertraagde optimale anti-epileptisch effect waargenomen bij 2-3 maanden na de operatie. Verdere studies van Toda et al., Bevestigd deze bevindingen waar zij aangetoond neurogenese er op een later tijdstip na DBS (dagen 3-5) in diermodellen 1. Bovendien Encinas et al. Hebben gemeld hippocampale neurogenesis in de volwassen muis gyrus dentatus na hoogfrequente stimulatie van de ATN 32. Eerdere studies 33-35 hebben gemeld dalende hippocampus neurogenese in bepaalde epileptische gevallen zoals chronische temporale kwab epilepsie en een associatie met tekorten leren, geheugenstoornissen en spontane terugkerende motorische aanvallen. Bovendien was er een vermindering van neurale stamcellen progenitor factoren zoals FGF2 en IGF-1 in het chronisch epileptische hippocampus in diermodellen 33. Gezien dit, interventiestrategieën zoals DBS dat een vergroting van neurogenese in de dentate gyrus zien zijn spannende mogelijkheden voor onderzoek. Deze bevindingen hebben ons aangemoedigd om verder te diepen in het mechanisme onderliggende neurogenese post-DBS behandeling voor epilepsie. We hebben de ATN gericht zowel eenzijdig (gegevens niet gemeld) als bilateraal (in representatieve resultaten) en gezien verhoogde neurotrophin (BDNF) expressie in de rat dentate gyrus. Onze cUIDIGE hypothese is dat BDNF expressie initieert een cascade genexpressie die culmineert in neurogenese dat vertaalt naar het anti-epileptisch effect DBS chirurgie. In dit artikel presenteren we onze werkwijzen voor DBS operatie gericht op de ATN ratten gevolgd door analyse van genexpressie als een aantrekkelijke benadering voor het mechanisme achter de voordelen van DBS bestuderen.

<table><tbody><tr><td>Diepe Hersenstimulatie Chirurgie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereotactische frame</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td></td></tr><tr><td>Boor&nbsp;</td><td>Dremmel</td><td>7700, 7.2 V</td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td>BD</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-803-6637</td><td>Schedule III Gecontroleerde Stof, aanschaf, gebruik en opslag volgens institutionele regels</td></tr><tr><td>Xylacine</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-808-1947</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfine</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-850-2280</td><td>Schedule III Gecontroleerde Stof, aanschaf, gebruik en opslag volgens institutionele regels</td></tr><tr><td>Chirurgische clips</td><td>ConMed Corporation</td><td>8035</td><td></td></tr><tr><td>Hechtdraad (3-0)&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-3333</td><td></td></tr><tr><td>Spuit (1 ml, 29 1/2 G)</td><td>BD</td><td>329464</td><td>Steriele, gebruik voor Anesthesie toediening intraperitoneaal</td></tr><tr><td>Spuit (3 ml, 25 G)</td><td>BD</td><td>309570</td><td>Steriele, gebruik voor Pijnstilling toediening subcutaan</td></tr><tr><td>Naalden</td><td>BD</td><td>305761</td><td>Steriele, gebruik voor het verwijderen van gebroken bot stukken uit de boor gaten</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25309B</td><td>Gebruik voor algemene sterilisatie&nbsp;</td></tr><tr><td>Oog Smeermiddel</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-898-350</td><td></td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>Medtronic</td><td>Model 3628</td><td></td></tr><tr><td>DBS elektroden</td><td>Rhodes Medical Instruments, CA</td><td>SNEX100x-100 mm</td><td>Elektroden zijn platina, concentrisch en bipolair</td></tr><tr><td>Betadine (Povidon-Jodium)&nbsp;</td><td>PDI</td><td>S23125</td><td>Eenmalig gebruik wattenstaafjes, gebruik voor het steriliseren van de hoofdhuid voor het maken van incisie&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;Hersen Dissectie en Hippocampus weefsel isolatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrylic Knaagdier Hersen Matrix</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>175-300</td><td>www.emsdiasum.com</td></tr><tr><td>Vleesmes</td><td>V W R</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Guillotine Schaar</td><td>Clauss</td><td>18039</td><td>Voor onthoofding, zorg ervoor dat deze scharen in schone en werkende conditie worden gehouden</td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Codman Classic</td><td>34-4098</td><td>Gebruik voor het verwijderen van de hersenen uit de schedel</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72957-06</td><td>Gebruik voor het verwijderen van de hersenen uit de schedel en voor handeling tijdens dissectie</td></tr><tr><td>Fosfaat Gebufferde Saline&nbsp;</td><td>Boston Bioproducts</td><td>BM-220</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;RNA Extractie en cDNA Voorbereiding</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tri Reagent</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td>Gebruik altijd in een afzuigkap en draag beschermende bril tijdens handeling; vermijd contact met de huid</td></tr><tr><td>Spuit (3 ml, 25 G)</td><td>BD</td><td>309570</td><td>Gebruik voor weefsel homogenisatie</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td>Gebruik altijd in een afzuigkap en draag beschermende bril tijdens handeling; vermijd contact met de huid</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Superscript First Strand Synthese Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11904-018</td><td></td></tr><tr><td>Bureau Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Kwantitatieve PCR</td><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>204143</td><td></td></tr><tr><td>Custom Oligos</td><td>Invitrogen</td><td>10668051</td><td></td></tr><tr><td>PCR Platen (96 wells)</td><td>Denville Scientific</td><td>C18080-10</td><td></td></tr><tr><td>Optische Lijm Vellen</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB1170</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease Vrij Water</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30538-02</td><td></td></tr><tr><td>Real Time PCR Machine</td><td>Applied Biosystems</td><td>7500</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse van genexpressie veranderingen in het rat hippocampus na deep brain stimulation van de anterior thalamic nucleus

Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

Diepe hersenstimulatie (DBS) chirurgie, gericht op diverse gebieden van de hersenen, zoals de basale ganglia, thalamus, en subthalamische regio&#39;s, is een effectieve behandeling voor verschillende bewegingsstoornissen die niet hebben gereageerd op medicatie. Recente vooruitgang op het gebied van DBS chirurgie is begonnen met de toepassing van deze chirurgische techniek andere condities zo divers als morbide obesitas, depressie en obsessieve compulsieve stoornis verlengen. Ondanks deze uitbreiding van indicaties, is er weinig bekend over de onderliggende fysiologische mechanismen die de gunstige effecten van DBS operatie te vergemakkelijken. Een manier om deze vraag genexpressie analyse op neuronen die de elektrische stimulatie ontvangt. Eerdere studies hebben aangetoond dat neurogenese in de dentate gyrus rat wordt opgewekt in DBS richten van de voorste nucleus van de thalamus 1. DBS operatie gericht op de ATN wijd gebruikt voor behandeling van epilepsie. Het is derhalve van veel interest voor ons om de transcriptionele veranderingen bij elektrisch stimuleren van de ATN verkennen. In dit manuscript, beschrijven we onze methoden voor stereotactische-begeleide DBS operatie gericht op de ATN bij volwassen mannelijke Wistarratten. We bespreken ook de volgende stappen voor weefseldissectie, RNA isolatie, cDNA bereiding en kwantitatieve RT-PCR voor het meten van genexpressie verandert. Deze methode kan worden toegepast en aangepast voor het stimuleren van de basale ganglia en andere gebieden van de hersenen vaak klinisch gericht. De genexpressie studie die hier beschreven wordt uitgegaan van een kandidaat-target-gen benadering voor het ontdekken van de moleculaire spelers die kunnen worden regisseren het mechanisme voor DBS.

Figuren 1A en 1B tonen de relatieve expressie van BDNF en GABRD opzichte van de controle gen β-actine. BDNF is een neurotrofine vaak geassocieerd met neuroprotectieve effecten in veel neuronale ziekten 38-41. Het is daarom interessant om het expressieprofiel van BDNF te analyseren in respons op stimulatie van de ATN die therapeutische voordelen epileptische patiënt oplevert. In figuur 1A waarin het genexpressieprofiel van BDNF in de aangegeven tijdstippen too...

Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de therapeutische effecten van diepe hersenstimulatie (DBS) chirurgie moet onderzocht worden. De methoden die in dit manuscript worden gepresenteerd, beschrijven een experimentele benadering om de cellulaire gebeurtenissen geactiveerd door DBS te onderzoeken door de genexpressieprofiel van kandidaatgenen te analyseren die neurogenese na DBS-chirurgie kunnen bevorderen.

Analyse van genexpressie Veranderingen in het Rat Hippocampus Na Deep Brain Stimulation van de Anterior Thalamic Nucleus

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van diepe hersenstimulatie van de nucleus thalamicus anterior en het bestuderen van veranderingen in de genexpressie in de hippocampus van de rat. Dit wordt bereikt door het dier eerst te anesthetiseren. Vervolgens wordt het dier voorbereid op de chirurgische ingreep.Er wordt een incisie in de hoofdhuid gemaakt en de schedel wordt blootgelegd. Vervolgens worden, op de juiste positie ten opzichte van de bgma, de boorgaten gemaakt. De DBS-elektroden worden ingebracht en de stimulatie wordt uitgevoerd.Ten slotte wordt het dier geëuthanaseerd en wordt het brein gedisseceerd. Om de hippocampus te verwijderen, wordt het weefsel verwerkt voor RNA-extractie en cDNA-preparatie, waarna qPCR wordt uitgevoerd. Uiteindelijk tonen de resultaten aan dat diepe hersenstimulatie de genexpressie in de hippocampus van de rat beïnvloedt.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over diepe hersenstimulatiechirurgie, zoals wat de moleculaire mechanismen zijn die ten grondslag liggen aan het therapeutische effect van diepe hersenstimulatiechirurgie. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van niet alleen epilepsie, maar ook andere neuronale aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer en dystonie. Omdat DPS opkomt als een chirurgische benadering voor de behandeling van vele neuronale aandoeningen, dienen ter voorbereiding op de operatie chirurgische pads te worden gebruikt om de werkbank te bedekken en moet er een voorziening aanwezig zijn voor de afvoer van biologisch gevaarlijk afval.Weeg de rat en bereken de anesthesiedosis volgens het tekstprotocol; bevestig twee elektroden op de elektrodehouder van een stereotactisch chirurgisch frame en inspecteer met een microscoop de punten van de elektroden op een juiste uitlijning. Bevestig de elektroden met een tussenruimte van drie millimeter, waarbij u er zorg voor draagt dat de elektrodepunt geen harde oppervlakken raakt. Injecteer de ketamine-xylazine.Injecteer het mengsel intraperitoneaal bij het dier en bevestig dat het dier een chirurgisch vlak van anesthesie heeft bereikt door de tenenknijpreflex, de ademhalingsfrequentie en de diepte en regelmaat van de ademhaling te controleren. Fixeer en positioneer het dier op het stereotaxische frame. Breng oogsmeermiddel aan in de ogen van het dier om uitdroging te voorkomen en desinfecteer de hoofdhuid met drie afwisselende scrubs, telkens van Betadine en óf alcohol óf steriele zoutoplossing.Plaats het dier op een circulerend warmwaterkussen of gebruik warmtelampen om de lichaamstemperatuur van het dier op een optimaal niveau te houden. Gebruik op basis van de Paxos and Watson rattenbreinatlas de volgende stereotactische coördinaten voor het targeten van de anterior thalamic nucleus: een anterieur-posterieure waarde van -1,6 millimeters, een mediaal-laterale waarde van 1,5 millimeters en een dorso-ventrale waarde van 5,2 millimeters.Maak vervolgens een sagittale incisie in de hoofdhuid om de schedel vrij te leggen. Gebruik een set retractoren om de ingesneden hoofdhuid vast te zetten en de schedel bloot te leggen. Reinig daarna het ingesneden gebied met steriele wattenstaafjes gedoopt in ethanol om de suturen duidelijk zichtbaar te maken. Lokaliseer de bgma en gebruik een zwarte marker om de positie van de boorgaten te markeren.Zet nog twee markeringen op ongeveer 1,5 millimeter mediaal aan beide zijden van de sagitturale naad en 1,6 millimeter posterieur aan de coronale naad. Desinfecteer nu de boorpunt met ethanol om de twee boorgaten te maken.Boor met een boor die in een hoek van 45 graden wordt vastgehouden de boorgaten, waarbij u frequent wisselt tussen de twee gaten om overmatige hitte in het centrum van elk boorgat te voorkomen. Boor door totdat de dura is blootgesteld. Gebruik een naald met een in een L-vorm gebogen punt om eventuele botfragmenten te verwijderen die de inbreng van de elektrode zouden kunnen belemmeren.Zorg ervoor dat de onderliggende dura mater en/of het hersenweefsel niet worden beschadigd tijdens het verwijderen van botfragmenten. Bevestig de dubbele elektrode-assemblage aan de draaibare handgreep van het stereotactisch frame en zet de handgreep vast in een hoek van 90 graden. Positioneer de linker elektrode met behulp van de instellingen van het stereotactisch frame exact boven de bgma.Gebruik de stereotactische aanpassingen voor de media. De laterale positionering verschoof de linker elektrode nauwkeurig 1,5 millimeter naar de linkerzijde van de bgma, zodat er nu twee elektroden perfect zijn uitgelijnd langs de coronale naad, maar van elkaar gescheiden. 1,5 millimeter mediaal-lateraal vanaf de bgma.Beweeg vervolgens de elektroden met de anterieur-posterieure stereotactische aanpassingen 1,6 millimeter posterieur ten opzichte van de coronale naad. Verlaag daarna de elektroden met de dorsaal-ventrale aanpassingen om eerst te controleren of de boorgaten op de juiste locatie zijn gemaakt, zodat de elektroden gemakkelijk kunnen worden ingebracht zonder de ruwe randen van de boorgaten te raken. Indien dit het geval is, breng de elektroden in tot een diepte van 5,2 millimeter vanaf het schedeloppervlak.Verbind de elektroden via draden met een stimulator die is ingesteld op 130 hertz, 2,5 volts en een pulsbreedte van 90 microseconden. Dien hoogfrequente stimulatie toe gedurende de gewenste periode. Voer unilaterale of bilaterale stimulatie uit.Nadat de stimulatie is voltooid, verwijdert u voorzichtig de elektroden en hecht u de incisie met drie nul-hechtmaterialen of steriele chirurgische nietjes. Dien subcutaan buprenorfine toe en monitor het dier totdat het normale activiteitsniveau is hervat, waarna het dier kan terugkeren naar de huisvestingsfaciliteit. Plaats de hersenen met een scheermesje op een vooraf gekoelde acryl hersenmatrix op ijs. Snijd de hersenen coronaal door op ongeveer zeven tot acht millimeter van de meest anterieure rand van de hersenen.Maak een tweede snede parallel en posterieur aan de eerste snede, zodat een hersensectie van ongeveer vijf millimeter dik kan worden verwijderd. Verplaats de hersensectie met een scheermesje naar een Petrischaal met ijskoud PBS, scheid de twee hemisferische secties en noteer zorgvuldig welke sectie respectievelijk overeenkomt met de linker- en rechterzijde. Verwijder de hippocampus voorzichtig met een fijne pincet en een schaar, vries het weefsel snel in op droogijs en bewaar dit bij -20 °C tot het klaar is voor de daaropvolgende RNA-stappen die worden uitgevoerd volgens het tekstprotocol; hier zijn de relatieve expressieniveaus van BDNF vergeleken met het controlegen beta actin over de aangegeven tijdspunten.Na DBS-stimulatie. Een upregulatie van BDNF wordt direct na de DBS-chirurgie waargenomen, met een piekexpressie drie uur na de stimulatie. Deze waarneming suggereert dat een verhoogde BDNF-expressie en de daaruit voortvloeiende neuroprotectie kunnen bijdragen aan het therapeutische voordeel van DBS voor epileptische patiënten.Dit paneel illustreert de expressie van de GABA-receptor, G-A-B-R-D, die een verhoogde expressie vertoont in de gestimuleerde dieren vergeleken met ongestimuleerde controles drie uur na DBS. Gezien het feit dat GABA-agonisten worden gebruikt als effectieve onderdrukkers van insulten, is het interessant om een verhoogde expressie van G-A-B-R-D na DBS waar te nemen, wat wijst op een mogelijke rol voor GABA en het anti-epileptische effect van DBS. Na deze procedure.Andere methoden zoals western blot, chromatine-immunoprecipitatie en vele andere standaard moleculair-biologische assays kunnen worden uitgevoerd. Dit helpt bij het beantwoorden van vragen met betrekking tot veranderingen in eiwitexpressie, post-translationele modificaties, de bezetting van transcriptiefactoren op specifieke promoterregio's van genen, enzovoort. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een chirurgische ingreep voor diepe hersenstimulatie bij ratten uitvoert.Isoleer het hippocampusweefsel en analyseer dit op veranderingen in de genexpressie.

analysis-gene-expression-changes-rat-hippocampus-after-deep-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Casquero-Veiga, M. et al. In vivo Positron Emission Tomography to Reveal Activity Patterns Induced by Deep Brain Stimulation in Rats. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the metabolic effects of deep brain stimulation (DBS) using FDG-PET imaging in a rat model. It outlines the steps involved in FDG administration, DBS application, and PET/CT imaging to map brain regions with increased or suppressed metabolic activity.

Assessing Metabolic Neuromodulation Induced by Acute Deep Brain Stimulation in Rats Using In Vivo FDG-PET

Source: Selvakumar, T., et al., Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the procedure for implanting electrodes into the rat brain to apply deep brain stimulation (DBS), which modulates neuronal activity and enhances communication with the hippocampus, supporting neuronal survival and neurogenesis.

Effects of Deep Brain Stimulation on Hippocampal Neuronal Activity in a Rat Model

This video demonstrates the detection of serotonin receptor RNA synthesis using oligonucleotide probes in rat brain tissue affected by serotonin syndrome. The protocol includes tissue pretreatment, probe hybridization, and enzymatic detection to visualize and quantify serotonin receptor RNA expression under a microscope.

In Situ Hybridization Using Oligonucleotide Probes to Study RNA Expression in Rat Brain Sections

We beschrijven hoe laser capture microdissectie (LCM) om verrijkte populaties van hippocampale neuronen of afzonderlijke neuronen vastgezette gewonden rattenhersenen voor daaropvolgende analyse van genexpressie met kwantitatieve real time PCR en / of hele genoom microarrays verkrijgen.

Laser Capture Microdissection van Verrijkt populaties van neuronen of Single Neuronen voor de analyse van genexpressie na traumatisch hersenletsel

Dit protocol beschrijft een standaard methode voor gelijktijdige functionele magnetische resonantie imaging en diepe hersenstimulatie bij de knaagdieren. Het gecombineerde gebruik van deze experimentele instrumenten maakt de exploratie van wereldwijde downstream activiteit in antwoord op elektrische stimulatie vrijwel elk doel hersenen.

Deep Brain Stimulation met gelijktijdige fMRI in Knaagdieren

Er wordt een methode beschreven voor het implanteren van elektroden in de subthalamische nucleus (STN) van ratten. Betere lokalisatie van de STN werd bereikt door het gebruik van een micro-opnamesysteem. Verder wordt een stimulatie-opstelling gepresenteerd die wordt gekenmerkt door langdurige verbindingen tussen het hoofd van het dier en de stimulator.

Micro-elektrode Begeleide Implantatie van elektroden in de nucleus subthalamicus van Rats naar Lange termijn Deep Brain Stimulation

Diepe hersenstimulatie (DBS) is een effectieve behandelingsoptie voor de ziekte van Parkinson. We hebben een onderzoeksontwerp opgesteld om nieuwe stimulatieparadigma's bij ratten te screenen. Het protocol beschrijft het gebruik van de trappentest en cilindertest voor de beoordeling van motorische resultaten bij DBS-behandelde hemiparkinsonische ratten.

Trap en Cilinder Test: een nieuwe benadering voor Motor Resultaat van Deep Brain Stimulation Effecten op het Hemiparkinsonian Rat Assess

We hebben repetitieve transcraniale magnetische stimulatie (rTMS) toegepast op de unilaterale hemisfeer van de hersenen van een rat, door een 25 mm figure-8 spoel 1 cm lateraal van de vertex op de biauriculaire lijn te plaatsen en de spoel te kantelen met 45°. Er werd een in-house waterkoelsysteem gebruikt voor rTMS gedurende meer dan 20 minuten.

Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation aan de eenzijdige halfrond van de hersenen van de rat

Dit protocol laat zien hoe u een betrouwbare HFS-methode in muizen. Neuronen in de hippocampal getand gyrus zijn elektrisch gestimuleerd door HFS direct en niet indirect in vivo. Neuronale activiteit en moleculaire signalering zijn onderzocht door c-fos en Notch1 immunefluorescentie kleuring, respectievelijk; neurogenese wordt gekwantificeerd door bromodeoxyuridine labeling assay.

Een invasieve methode voor de activatie van de muis getand Gyrus door hoogfrequente stimulatie

Transcraniële gelijkstroom stimulatie (TDC's) is een therapeutische techniek voorgesteld voor de behandeling van psychiatrische ziekten. Een dierlijk model is van essentieel belang voor het begrijpen van de specifieke biologische veranderingen die door TDC's opgeroepen. Dit protocol beschrijft een muismodel van TDC's die gebruikmaakt van een chronisch geïmplanteerde elektrode.

Transcraniële gelijkstroom stimulatie (TDC's) in muizen

We beschrijven een preklinische experimentele methode om metabole neuromodulatie geïnduceerd door acute diepe hersenstimulatie met in vivo FDG-PET te evalueren. Dit manuscript bevat alle experimentele stappen, van stereotaxische chirurgie tot de toepassing van de stimulatiebehandeling en de verwerving, verwerking en analyse van PET-beelden.

In vivo Positronemissietomografie om activiteitspatronen te onthullen die worden geïnduceerd door diepe hersenstimulatie bij ratten

Leer diepe hersenstimulatie van de anterieure thalamus en analyseer genexpressieveranderingen in de hippocampus van ratten. Deze methode onthult moleculaire mechanismen achter therapeutische effecten bij epilepsie.

Analyse van genexpressie Veranderingen in het Rat Hippocampus Na Deep Brain Stimulation van de Anterior Thalamic Nucleus

Meer video's verkennen