Analyse van genexpressie Veranderingen in het Rat Hippocampus Na Deep Brain Stimulation van de Anterior Thalamic Nucleus
8 maart 2015
Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de therapeutische effecten van diepe hersenstimulatie (DBS) chirurgie moet onderzocht worden. De methoden die in dit manuscript worden gepresenteerd, beschrijven een experimentele benadering om de cellulaire gebeurtenissen geactiveerd door DBS te onderzoeken door de genexpressieprofiel van kandidaatgenen te analyseren die neurogenese na DBS-chirurgie kunnen bevorderen.
Het algemene doel van deze procedure is om diepe hersenstimulatie uit te voeren van de anterieure thalamuskern en veranderingen in genexpressie in de hippocampus van ratten te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst het dier te anesthetiseren. Vervolgens wordt het dier voorbereid op de operatie.
Er wordt een incisie gemaakt in de hoofdhuid en de schedel wordt blootgelegd. Vervolgens worden op de juiste positie ten opzichte van de bgma de burr holes gemaakt. De DBS-elektroden worden geïnserteerd en stimulatie wordt uitgevoerd.
Ten slotte wordt het dier geëuthanaseerd en wordt de hersenen gedisseceerd. Om de hippocampus te verwijderen, wordt het weefsel verwerkt voor RNA-extractie en cDNA-voorbereiding en QPCR wordt uitgevoerd. Uiteindelijk laten de resultaten zien dat diepe hersenstimulatie de genexpressie in de hippocampus van de rat beïnvloedt.
Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden in diepe hersenstimulatiechirurgie, zoals wat zijn de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan het therapeutische effect van diepe hersenstimulatiechirurgie? De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de therapie van niet alleen epilepsie, maar ook andere neuronale aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer en dystonie. Omdat DPS opkomt als een chirurgische aanpak om veel neuronaandoeningen te behandelen. Gebruik chirurgische kussentjes om het werkblad af te dekken en zorg ervoor dat er een beschikbare afvoer voor biologisch gevaarlijk afval is.
Weeg de rat en bereken de anesthesie dosis volgens het tekstprotocol. Monteer en bevestig twee elektroden op de elektrodenhouder van een stereotactisch chirurgisch frame en inspecteer met een microscoop de uiteinden van de elektrode op de juiste uitlijning. Bevestig de elektroden drie millimeter uit elkaar, zorg ervoor dat de elektrodentip niet op harde oppervlakken raakt. Injecteer het ketamine-xylazine.
Meng intraperitoneaal naar het dier en bevestig dat het dier een chirurgisch vlak van anesthesie heeft bereikt door de teenprikreflex, de ademhalingssnelheid en de diepte en regelmaat van de ademhaling te controleren. Bevestig en positioneer het dier op het stereotactisch frame. Breng oogsmeer aan in de ogen van het dier om te beschermen tegen overdrogen en desinfecteer de hoofdhuid met drie afwisselende scrubs, elk van Betadine en ofwel alcohol of steriele zoutoplossing.
Plaats het dier op een circulair warmwaterpad of gebruik verwarmingslampen om de lichaamstemperatuur van het dier op een optimaal niveau te houden. Gebruik op basis van de Paxos en Watson rattenbreinatlas de volgende stereotactische coördinaten voor het targeten van de anterieure thalamuskern of een NT anterieure posterior negatieve 1,6 millimeter. Media lateraal 1,5 millimeter en dorso ventraal 5,2 millimeter.
Maak vervolgens een incisie in de hoofdhuid sagitsaal om de schedel te onthullen. Gebruik een paar retractoren om de ingesneden hoofdhuid vast te zetten om de schedel bloot te leggen. Reinig vervolgens met steriele wattenstokken gedoopt in ethanol het gesneden gebied om de hechtingen duidelijk zichtbaar te maken. Lokaaliseer de bgma en gebruik een zwarte stift om de positie van de burr holes aan te geven.
Maak twee extra markeringen op ongeveer 1,5 millimeter. Media lateraal aan beide zijden van de sagittale hechting en 1,6 millimeter posterieur aan de coronale hechting. Gebruik nu ethanol om het uiteinde van de boor te desinfecteren om de twee burr holes te maken.
Gebruik een boor gehouden op een hoek van 45 graden, boor de burr holes vaak wisselend tussen de twee gaten om overmatige hitte in het centrum van elk burr hole te voorkomen. Blijf boren totdat de dura wordt blootgelegd. Gebruik een naald met een punt gebogen in de vorm van een L om eventuele gebroken botdeeltjes te verwijderen die de invoer van de elektrode zouden kunnen belemmeren.
Zorg ervoor dat u de onderliggende dura en/of hersenweefsel niet beschadigt tijdens het verwijderen van botfragmenten. Bevestig de dubbele elektrodenassemblage aan de roterende handgreep van het stereotactisch frame en fixeer de handgreep op een hoek van 90 graden. Gebruik de aanpassingen in de stereotactische framepositie om de linker elektrode precies boven de bgma te plaatsen.
Gebruik de stereotactische aanpassingen voor media. Laat de linker elektrode precies 1,5 millimeter naar de linkerkant van bgma bewegen, zodat er nu twee elektroden perfect uitgelijnd zijn langs de coronale hechting, maar 1,5 millimeter media lateraal uit elkaar geplaatst van de bgma.
Vervolgens, met de anterieure posterieure stereotactische aanpassingen, verplaats de elektroden 1,6 millimeter posterieur aan de coronale hechting. Vervolgens, met de dorsale ventrale aanpassingen, laat de elektroden zakken om eerst te controleren of de burr holes op de juiste locatie zijn gemaakt, zodat de elektroden gemakkelijk kunnen worden geïnserteerd zonder de ruwe randen van de burr holes te raken. Zo ja, steek de elektroden in tot een diepte van 5,2 millimeter vanaf het oppervlak van de schedel.
Verbind de elektroden via leidingen naar een stimulator ingesteld op 130 hertz, 2,5 volt en 90 microseconde pulsbreedte. Lever hoogfrequente stimulatie gedurende een gewenste periode. Uitvoering van unilateraal of bilateraal stimuleren.
Nadat de stimulatie is voltooid, verwijdert u voorzichtig de elektroden en naait u de incisie met drie nulnaden of steriele chirurgische klemmen, brengt u buprenorfine subcutaan toe, en bewaakt u het dier totdat het terugkeert naar normale activiteit, en plaatst u het vervolgens terug in de behuizing. Plaats de hersenen op een voorgekoelde acryl hersenmatrix op ijs met behulp van een scheermes. Snijd de hersenen corly op ongeveer zeven tot acht millimeter vanaf de voorste rand van de hersenen.
Maak een tweede snede corly en posterieur naar de eerste snede, zodat een ongeveer vijf millimeter dikke hersensnede kan worden verwijderd. Breng de hersensnede over naar een petrischaal met ijskoud PBS met behulp van een scheermes, scheid de twee halfronde secties en let op welke sectie overeenkomt met respectievelijk de linker- en rechterzijde. Gebru
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het uitvoeren van diepe hersenstimulatie (DBS) van de anterior thalamic nucleus (ATN) bij volwassen mannelijke Wistar-ratten, gevolgd door een analyse van veranderingen in de genexpressie in de hippocampus. De methodologie omvat stereotactische chirurgie, elektrische stimulatie, weefseldissectie, RNA-extractie, cDNA-synthese en kwantitatieve RT-PCR. Deze aanpak maakt het mogelijk om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de therapeutische effecten van DBS te onderzoeken, in het bijzonder in de context van epilepsie en andere neurologische aandoeningen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Moleculaire biologie
- Neurofysiologie
Achtergrond
- DBS is een gevestigde behandeling voor bewegingsstoornissen en wordt onderzocht voor aandoeningen zoals epilepsie, depressie en obesitas.
- De fysiologische mechanismen waardoor DBS zijn therapeutische effecten uitoefent, zijn nog onvoldoende begrepen.
- Genexpressieanalyse in gestimuleerde hersengebieden kan inzicht bieden in door DBS geïnduceerde moleculaire veranderingen.
- Eerdere studies hebben neurogenese en genregulatie aangetoond na DBS in diermodellen.
Doel van de studie
- Om een reproduceerbaar protocol vast te stellen voor DBS gericht op de ATN bij ratten.
- Om veranderingen in de genexpressie in de hippocampus na DBS te beoordelen.
- Om moleculaire paden te identificeren die mogelijk betrokken zijn bij de therapeutische effecten van DBS bij epilepsie.
Gebruikte methoden
- Stereotactische chirurgie om elektroden in de ATN te implanteren met behulp van nauwkeurige coördinaten.
- Elektrische stimulatie bij 130 Hz, 2.5 V en een pulsbreedte van 90 μs gedurende een bepaalde periode.
- Euthanasie na stimulatie, dissectie van de hersenen en isolatie van hippocampusweefsel.
- RNA-extractie, cDNA-synthese en kwantitatieve RT-PCR om genexpressie te meten (bijv. BDNF, GABRD).
Belangrijkste resultaten
- DBS van de ATN leidt tot upregulatie van BDNF in de hippocampus, met een maximale expressie drie uur na stimulatie.
- Een verhoogde expressie van het gen voor de GABA-receptor subunit (GABRD) werd waargenomen bij gestimuleerde dieren in vergelijking met de controlegroep.
- Deze veranderingen in genexpressie suggereren dat neuroprotectieve en anti-epileptische mechanismen geactiveerd kunnen worden door DBS.
- Het protocol maakt verdere moleculaire analyses mogelijk, zoals eiwitexpressie en chromatine-immunoprecipitatie.
Conclusies
- De beschreven methode maakt nauwkeurige DBS bij ratten en een daaropvolgende moleculaire analyse van de aangetaste hersengebieden mogelijk.
- DBS induceert specifieke veranderingen in de genexpressie die ten grondslag kunnen liggen aan de therapeutische effecten bij epilepsie en andere aandoeningen.
- Deze aanpak kan worden aangepast om andere hersengebieden en neurologische aandoeningen te bestuderen die met DBS worden behandeld.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Kwantitatieve analyse van veranderingen in genexpressie in de hippocampus van de rat na diepe hersenstimulatie (DBS) van de anterior thalamic nucleus (ATN) biedt een mechanistisch inzicht in de moleculaire pathways die worden gemoduleerd door neuromodulatietherapieën. Deze benadering stelt biopharma R&D-teams in staat om target engagement en downstream biologische effecten te onderzoeken, wat het voorspellende vertrouwen in translationele neurowetenschappelijke portfolio's ondersteunt. De methodologie bevindt zich op het snijvlak van targetvalidatie en mechanistische risicoreductie voor de ontwikkeling van therapeutica voor het centraal zenuwstelsel.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door DBS te koppelen aan specifieke veranderingen in genexpressie in ziekterelevante hersengebieden.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door het identificeren van moleculaire mediatoren zoals BDNF en GABRD die betrokken zijn bij neuroprotectie en het onderdrukken van epileptische aanvallen.
- Faciliteert functionele validatie van targets via kwantitatieve RT-PCR-outputs na gecontroleerde neuromodulatie.
Screening & assay-ontwikkeling
- Stelt een gevalideerde workflow vast voor het prepareren en analyseren van CNS-weefsel na stimulatie voor downstream moleculaire assays.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve genexpressiegegevens die geschikt zijn voor assay-standaardisatie en vergelijking tussen studies.
- Maakt screening mogelijk van kandidaatgenen of pathways die worden gemoduleerd door DBS voor verdere mechanistische of farmacologische exploratie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt moleculaire read-outs uit met ziekterelevante eindpunten in preklinische modellen voor epilepsie en neuroprotectie.
- Biedt continuïteit van mechanische ontdekking naar preklinische validatie door stimulatieparameters te koppelen aan resultaten van genexpressie.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door de moleculaire basis van de effectiviteit van DBS bij CNS-stoornissen te verduidelijken.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol integreert in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door hypothesegestuurde toetsing van neuromodulatie-effecten op genexpressie mogelijk te maken, wat zowel targetvalidatie als mechanistische risicoreductie ondersteunt.
- Discovery Biology: Kwantitatieve RT-PCR van hippocampusweefsel na DBS verduidelijkt de betrokkenheid van pathways en de moleculaire respons.
- Screening: Gestandaardiseerde weefselverwerking en genexpressieanalyse maken reproduceerbare vergelijkingen tussen experimentele condities mogelijk.
- Analytics: Levert kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen (bijv. expressie van BDNF, GABRD) voor een robuuste statistische analyse.
- Translationeel onderzoek: Verbindt moleculaire veranderingen met ziekterelateerde uitkomsten in preklinische epilepsiemodellen.
- Enterprise Reuse: Het protocol kan worden aangepast voor andere hersengebieden of neuromodulatiedoelen, wat de schaalbaarheid van het platform ondersteunt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in de binding aan CNS-doelen en de daaropvolgende biologische effecten.
- Operationele waarde: Standaardiseert weefselverwerking en moleculaire analyse voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door neuromodulatie te koppelen aan kwantificeerbare moleculaire eindpunten.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van CNS-doelen en neuromodulatiestrategieën mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in stereotactische chirurgie, moleculaire biologie en kwantitatieve PCR-analyse.
- Vereist toegang tot gespecialiseerde instrumentatie voor DBS, weefseldissectie en moleculaire assays.
- Necessiteert strikte standaardisatie van chirurgische en analytische procedures tussen teams.
- Aanpasbaar aan verschillende hersengebieden of ziekte-modellen door middel van protocolwijzigingen.
- Afhankelijk van nauwkeurige timing en behandeling om betrouwbare metingen van genexpressie te garanderen.
