Analyse van genexpressie Veranderingen in het Rat Hippocampus Na Deep Brain Stimulation van de Anterior Thalamic Nucleus
March 8th, 2015
Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de therapeutische effecten van diepe hersenstimulatie (DBS) chirurgie moet onderzocht worden. De methoden die in dit manuscript worden gepresenteerd, beschrijven een experimentele benadering om de cellulaire gebeurtenissen geactiveerd door DBS te onderzoeken door de genexpressieprofiel van kandidaatgenen te analyseren die neurogenese na DBS-chirurgie kunnen bevorderen.
Het algemene doel van deze procedure is om diepe hersenstimulatie uit te voeren van de anterieure thalamuskern en veranderingen in genexpressie in de hippocampus van ratten te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst het dier te anesthetiseren. Vervolgens wordt het dier voorbereid op de operatie.
Er wordt een incisie gemaakt in de hoofdhuid en de schedel wordt blootgelegd. Vervolgens worden op de juiste positie ten opzichte van de bgma de burr holes gemaakt. De DBS-elektroden worden geïnserteerd en stimulatie wordt uitgevoerd.
Ten slotte wordt het dier geëuthanaseerd en wordt de hersenen gedisseceerd. Om de hippocampus te verwijderen, wordt het weefsel verwerkt voor RNA-extractie en cDNA-voorbereiding en QPCR wordt uitgevoerd. Uiteindelijk laten de resultaten zien dat diepe hersenstimulatie de genexpressie in de hippocampus van de rat beïnvloedt.
Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden in diepe hersenstimulatiechirurgie, zoals wat zijn de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan het therapeutische effect van diepe hersenstimulatiechirurgie? De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de therapie van niet alleen epilepsie, maar ook andere neuronale aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer en dystonie. Omdat DPS opkomt als een chirurgische aanpak om veel neuronaandoeningen te behandelen. Gebruik chirurgische kussentjes om het werkblad af te dekken en zorg ervoor dat er een beschikbare afvoer voor biologisch gevaarlijk afval is.
Weeg de rat en bereken de anesthesie dosis volgens het tekstprotocol. Monteer en bevestig twee elektroden op de elektrodenhouder van een stereotactisch chirurgisch frame en inspecteer met een microscoop de uiteinden van de elektrode op de juiste uitlijning. Bevestig de elektroden drie millimeter uit elkaar, zorg ervoor dat de elektrodentip niet op harde oppervlakken raakt. Injecteer het ketamine-xylazine.
Meng intraperitoneaal naar het dier en bevestig dat het dier een chirurgisch vlak van anesthesie heeft bereikt door de teenprikreflex, de ademhalingssnelheid en de diepte en regelmaat van de ademhaling te controleren. Bevestig en positioneer het dier op het stereotactisch frame. Breng oogsmeer aan in de ogen van het dier om te beschermen tegen overdrogen en desinfecteer de hoofdhuid met drie afwisselende scrubs, elk van Betadine en ofwel alcohol of steriele zoutoplossing.
Plaats het dier op een circulair warmwaterpad of gebruik verwarmingslampen om de lichaamstemperatuur van het dier op een optimaal niveau te houden. Gebruik op basis van de Paxos en Watson rattenbreinatlas de volgende stereotactische coördinaten voor het targeten van de anterieure thalamuskern of een NT anterieure posterior negatieve 1,6 millimeter. Media lateraal 1,5 millimeter en dorso ventraal 5,2 millimeter.
Maak vervolgens een incisie in de hoofdhuid sagitsaal om de schedel te onthullen. Gebruik een paar retractoren om de ingesneden hoofdhuid vast te zetten om de schedel bloot te leggen. Reinig vervolgens met steriele wattenstokken gedoopt in ethanol het gesneden gebied om de hechtingen duidelijk zichtbaar te maken. Lokaaliseer de bgma en gebruik een zwarte stift om de positie van de burr holes aan te geven.
Maak twee extra markeringen op ongeveer 1,5 millimeter. Media lateraal aan beide zijden van de sagittale hechting en 1,6 millimeter posterieur aan de coronale hechting. Gebruik nu ethanol om het uiteinde van de boor te desinfecteren om de twee burr holes te maken.
Gebruik een boor gehouden op een hoek van 45 graden, boor de burr holes vaak wisselend tussen de twee gaten om overmatige hitte in het centrum van elk burr hole te voorkomen. Blijf boren totdat de dura wordt blootgelegd. Gebruik een naald met een punt gebogen in de vorm van een L om eventuele gebroken botdeeltjes te verwijderen die de invoer van de elektrode zouden kunnen belemmeren.
Zorg ervoor dat u de onderliggende dura en/of hersenweefsel niet beschadigt tijdens het verwijderen van botfragmenten. Bevestig de dubbele elektrodenassemblage aan de roterende handgreep van het stereotactisch frame en fixeer de handgreep op een hoek van 90 graden. Gebruik de aanpassingen in de stereotactische framepositie om de linker elektrode precies boven de bgma te plaatsen.
Gebruik de stereotactische aanpassingen voor media. Laat de linker elektrode precies 1,5 millimeter naar de linkerkant van bgma bewegen, zodat er nu twee elektroden perfect uitgelijnd zijn langs de coronale hechting, maar 1,5 millimeter media lateraal uit elkaar geplaatst van de bgma.
Vervolgens, met de anterieure posterieure stereotactische aanpassingen, verplaats de elektroden 1,6 millimeter posterieur aan de coronale hechting. Vervolgens, met de dorsale ventrale aanpassingen, laat de elektroden zakken om eerst te controleren of de burr holes op de juiste locatie zijn gemaakt, zodat de elektroden gemakkelijk kunnen worden geïnserteerd zonder de ruwe randen van de burr holes te raken. Zo ja, steek de elektroden in tot een diepte van 5,2 millimeter vanaf het oppervlak van de schedel.
Verbind de elektroden via leidingen naar een stimulator ingesteld op 130 hertz, 2,5 volt en 90 microseconde pulsbreedte. Lever hoogfrequente stimulatie gedurende een gewenste periode. Uitvoering van unilateraal of bilateraal stimuleren.
Nadat de stimulatie is voltooid, verwijdert u voorzichtig de elektroden en naait u de incisie met drie nulnaden of steriele chirurgische klemmen, brengt u buprenorfine subcutaan toe, en bewaakt u het dier totdat het terugkeert naar normale activiteit, en plaatst u het vervolgens terug in de behuizing. Plaats de hersenen op een voorgekoelde acryl hersenmatrix op ijs met behulp van een scheermes. Snijd de hersenen corly op ongeveer zeven tot acht millimeter vanaf de voorste rand van de hersenen.
Maak een tweede snede corly en posterieur naar de eerste snede, zodat een ongeveer vijf millimeter dikke hersensnede kan worden verwijderd. Breng de hersensnede over naar een petrischaal met ijskoud PBS met behulp van een scheermes, scheid de twee halfronde secties en let op welke sectie overeenkomt met respectievelijk de linker- en rechterzijde. Gebru
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie onderzoekt de cellulaire gebeurtenissen die worden veroorzaakt door operaties voor Diepe Hersenstimulatie (DBS), met een focus op veranderingen in genexpressie in de hippocampus van ratten. De beschreven methoden zijn bedoeld om het begrip van neurogenese na DBS te verbeteren.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Genexpressie
- Diepe Hersenstimulatie
Achtergrond
- Diepe Hersenstimulatie (DBS) is een chirurgische ingreep die wordt gebruikt om verschillende neurologische aandoeningen te behandelen.
- Beter begrip van de mechanismen van DBS kan therapeutische resultaten verbeteren.
- Genexpressieprofilering kan inzichten geven in neurogenese.
- Deze studie gebruikt een rattenmodel om deze mechanismen te onderzoeken.
Doel van het onderzoek
- Om de effecten van DBS op genexpressie in de hippocampus te onderzoeken.
- Om kandidaatgenen te identificeren die neurogenese na DBS faciliteren.
- Om bij te dragen aan het begrip van therapeutische mechanismen van DBS.
Gebruikte methoden
- De rat verdoven voor de operatie.
- Het dier voorbereiden door de schedel blootleggen.
- DBS-elektroden in de anterieure thalamuskern inbrengen.
- Stimulatie uitvoeren en veranderingen in genexpressie analyseren.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van specifieke veranderingen in genexpressie na DBS.
- Inzichten in de cellulaire mechanismen van neurogenese.
- Mogelijke implicaties voor het verbeteren van DBS-therapie.
- Totstandbrenging van een methodologie voor toekomstige studies.
Conclusies
- DBS heeft invloed op genexpressie gerelateerd aan neurogenese.
- Er is verder onderzoek nodig om deze mechanismen volledig te begrijpen.
- De bevindingen kunnen therapeutische strategieën voor neurologische aandoeningen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of gene expression changes in the rat hippocampus following deep brain stimulation (DBS) of the anterior thalamic nucleus (ATN) provides a mechanistic window into the molecular pathways modulated by neuromodulation therapies. This approach enables biopharma R&D teams to interrogate target engagement and downstream biological effects, supporting predictive confidence in translational neuroscience portfolios. The methodology is positioned at the intersection of target validation and mechanistic de-risking for CNS therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking DBS to specific gene expression changes in disease-relevant brain regions.
- Supports biological de-risking by identifying molecular mediators such as BDNF and GABRD implicated in neuroprotection and seizure suppression.
- Facilitates functional target validation through quantitative RT-PCR outputs following controlled neuromodulation.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated workflow for preparing and analyzing CNS tissue post-stimulation for downstream molecular assays.
- Delivers reproducible, quantitative gene expression data suitable for assay standardization and cross-study comparison.
- Enables screening of candidate genes or pathways modulated by DBS for further mechanistic or pharmacological exploration.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular readouts with disease-relevant endpoints in preclinical epilepsy and neuroprotection models.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical validation by linking stimulation parameters to gene expression outcomes.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying the molecular basis of DBS efficacy in CNS disorders.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven testing of neuromodulation effects on gene expression, supporting both target validation and mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Quantitative RT-PCR of hippocampal tissue post-DBS clarifies pathway engagement and molecular response.
- Screening: Standardized tissue processing and gene expression analysis enable reproducible comparison across experimental conditions.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (e.g., BDNF, GABRD expression) for robust statistical analysis.
- Translational Research: Connects molecular changes to disease-relevant outcomes in preclinical epilepsy models.
- Enterprise Reuse: Protocol can be adapted for other brain regions or neuromodulation targets, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in CNS target engagement and downstream biological effects.
- Operational Value: Standardizes tissue processing and molecular analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking neuromodulation to quantifiable molecular endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets and neuromodulation strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery, molecular biology, and quantitative PCR analysis.
- Demands access to specialized instrumentation for DBS, tissue dissection, and molecular assays.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of surgical and analytical procedures.
- Adaptable to different brain regions or disease models with protocol modifications.
- Dependent on precise timing and handling to ensure reliable gene expression measurements.
