Generatie van muizen pacemaker celaggregaten Gebaseerd op ES-Cell-programmering in combinatie met Myh6-Promoter-Selection
17 februari 2015
Dit protocol beschrijft hoe functionele sinus nodale weefsel van muizen pluripotente stamcellen (PSC) te produceren. T-Box3 (TBX3) overexpressie plus hartmyosine-zware-keten (Myh6) promotor antibiotische selectie leidt tot zeer zuivere cel pacemaker aggregaten. Deze "Induced-sinoatriale-lichamen" ("iSABs") bevatten meer dan 80% pacemaker cellen, vertonen een zeer verhoogde kloppend tarieven en zijn in staat om myocard ex vivo tempo.
Het algemene doel van deze procedure is om zeer zuivere sinusknoopcellen te genereren. Dit wordt bereikt door eerst celdifferentiatie te induceren door het medium te wijzigen en druppels te maken die resulteren in de vorming van embryonale lichamen van een gedefinieerde grootte. Vervolgens worden de embryonale lichamen geplaatst op een gelatine-gecoate schaal zodat ze een cellage vormen.
Vervolgens wordt de antibioticumselectie geïnitieerd en alleen cardiomyocyten overleven. Ten slotte wordt de cel laag gedissocieerd om snel kloppende enkele sinusknoopcellen of kleine sinusknooplichamen te verkrijgen. Uiteindelijk wordt live celbeeldvorming gebruikt om hoge klopfrequenties van sinusknoopcellen te tonen.
Het grote voordeel van deze methode is dat je zeer zuivere sinusknoopcellen kunt produceren, bijvoorbeeld voor medicijntesten. De methode kan ons helpen om belangrijke vragen over sinusknoopziekte te beantwoorden omdat de cellen ons inzicht geven in de onderliggende mechanismen. De technologie zal in het laboratorium worden gepresenteerd door Julia Yung, onze PhD-student die de methode heeft ontwikkeld, beginnend met een ES-cellijn en pluripotente stamcellen gecultiveerd met bestraalde feedercellen zoals beschreven in het tekstprotocol twee dagen vóór de differentiatieprocedure, verwijderde de PSC's van de feedercellen door eerst het medium af te zuigen.
Gebruik 10 milliliter PBS om de cellen te wassen. Voeg vervolgens zeven milliliter collagenase vier-oplossing toe en incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Plaats vervolgens een steriele 40 micrometer filter in een 50 milliliter buisje.
Spuit vervolgens voorzichtig de PSC-kolonies door de collagenase-oplossing vijf keer op en neer te pipetten. Breng de celsuspensie over naar het filter en spoel het filter drie keer met acht milliliter PBS. Draai vervolgens het filter om en plaats het ondersteboven in een petrischaal en pipet 10 milliliter PBS op de bodem van het filter.
Om de PSC-kolonies te verwijderen, breng je de celsuspensie over naar een 15 milliliter buisje en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 300 keer G. Verwijder het PBS, suspendeer de cellen in één milliliter Accutane en incubeer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Voeg na de incubatie 10 milliliter PBS toe.
Meng de celoplossing door vijf keer op en neer te pipetten en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 300 keer G. Zodra het PBS is verwijderd, gebruik 10 milliliter celkweekmedium om de cellen te resuspenderen en bepaal het celaantal. Zaai 15.000 cellen per vierkante centimeter in een 75 vierkante centimeter filterflacon en kweek ze gedurende twee dagen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide wanneer de flacon 50 tot 70% confluent zou moeten zijn. Na het oogsten van de cellen en het Resus-suspenderen in differentiatiemedium volgens het tekstprotocol, pipet 20 milliliter water en vijf milliliter hanging drop of HD-oplossing in een vierkante petrischaal om uitdroging van de HDS te voorkomen.
Pipet vervolgens maximaal 50 milliliter celsuspensie in een bakje. Draai vervolgens het deksel van de petrischaal om en plaats met behulp van een 12-kanaals pipet 180 HDS, elk bevattend 20 microliter celsuspensie, op het deksel. Draai voorzichtig het deksel om en plaats het op de petrischaal.
Na incubatie gedurende twee dagen om de cellen toe te laten ebs te vormen, draai voorzichtig het deksel van de vierkante petrischaal om en breng de EBS afkomstig van twee petrischalen over in een 50 milliliter buisje. Wacht 10 minuten om de EBS naar de bodem van het buisje te laten bezinken, zuig vervolgens zoveel mogelijk medium af. Gebruik 10 milliliter differentiatiemedium om de EBS te suspenderen en breng de suspensie over in een 10 centimeter petrischaal.
Zodra de cellen gedurende vier dagen in suspensie zijn gekweekt, breng je de EBS over in een gelatine-gecoate 10 vierkante centimeter celkweekschaal en incubeer gedurende de volgende twee tot zes dagen onder de microscoop, controleer de cellen op klopfoci en de vorming van een cellage drie dagen nadat de cellen zijn begonnen te kloppen, zuig het medium af en voeg 10 milliliter vers differentiatie toe. Medium bevattend 400 microgram per milliliter van G vier 18 aan de cellen vier dagen later. Verwijder voorzichtig het medium zonder de cellage af te zuigen.
Voeg vervolgens 10 milliliter PBS toe om de cellen te wassen. Nadat je het PBS voorzichtig hebt verwijderd, voeg je 10 milliliter collagenase vier-oplossing toe en breng je de cellen over naar een 50 milliliter buisje. Na incubatie gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius, meng je de suspensie krachtig door vijf keer op en neer te pipetten en incubeer je de cellen gedurende nog eens vijf minuten bij 37 graden Celsius.
Er zou een suspensie van kleine clusters aanwezig moeten zijn. Voeg vervolgens 20 milliliter PBS toe en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 keer G, zuig voorzichtig het PBS af en als je geïnduceerde sinoatriale lichamen of sabs genereert, gebruik je 12 milliliter differentiatiemedium bevattend 400 microgram per milliliter van G vier 18 om Resus te suspenderen, de cellen op te hangen en twee milliliter op zes putjes van een 24-putjes gelatine-gecoate plaat te pipetten om enkele knoopcellen te genereren in plaats van differentiatiemedium toe te voegen.
Na verwijdering van het PBS, gebruik je vijf milliliter Accutane om de cellen op te hangen en incubeer je gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Pipet op en neer om de suspensie krachtig te mengen na incubatie gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius.
Voeg 20 milliliter PBS toe en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 300 keer G met 12 milliliter differentiatiemedium bevattend G vier 18. Suspendeer de cellen en pipet twee milliliter op zes putjes van een 24-putjes gelatine-gecoate plaat en voer analyse van cellen uit volgens het tekstprotocol.
Met behulp van het protocol dat in deze video wordt gedemonstreerd, kunnen isab S worden gegenereerd uit pluripotente stamcellen met een klopfrequentie van ongeveer 450 slagen per minuut zoals hier te
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de generatie van zeer zuivere sinusknoopcellen vanuit pluripotente muizenstamcellen. Het proces omvat het induceren van differentiatie, het vormen van embryonale lichamen en het selecteren van cardiomyocyten via antibiotische behandeling.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk gebied
- Cardiale biologie
- Stamcelonderzoek
- Celdifferentiatie
Achtergrond
- Sinusknoal weefsel is cruciaal voor de regulatie van het hartritme.
- Pluripotente stamcellen kunnen differentiëren naar diverse celtypen.
- Antibiotische selectie kan de zuiverheid van de gewenste celtypen verbeteren.
- Live cell imaging is essentieel voor het beoordelen van de celfunctionaliteit.
Doel van de studie
- Om functioneel sinusnodal weefsel uit PSC te produceren.
- Om een hoge zuiverheid van pacemakercellen te bereiken.
- Om aan te tonen dat deze cellen in staat zijn om het myocard ex vivo te stimuleren.
Gebruikte methoden
- Inductie van celdifferentiatie door aanpassing van het medium.
- Vorming van embryonale lichamen met behulp van hangende druppels.
- Uitplaten van embryonale lichamen op met gelatine gecoate schaaltjes.
- Antibioticaselectie om cardiomyocyten te isoleren.
Belangrijkste resultaten
- Generatie van "geïnduceerde sinoatriale lichamen" met meer dan 80% pacemakercellen.
- Verhoogde slagfrequenties waargenomen in de gegenereerde cellen.
- Vermogen van iSABs om het myocard ex vivo aan te sturen bevestigd.
Conclusies
- Het protocol genereert succesvol zuivere sinusknootcellen.
- Hoge zuiverheid en functionaliteit van cellen zijn cruciaal voor hartonderzoek.
- Deze methode kan studies naar cardiac tissue engineering bevorderen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het genereren van zeer zuivere aggregaten van murine pacemakercellen pakt een kritieke bottleneck aan in het modelleren van hartaandoeningen en het screenen van geneesmiddelenveiligheid. Het protocol maakt schaalbare productie mogelijk van functionele sinusknexcludingcellen met fysiologische slagfrequenties, wat mechanische risicoanalyse van ionkanaal- en autonome modulatoren ondersteunt. Dit positioneert de methode als een translationeel instrument voor preklinische targetvalidatie en leadoptimalisatie in cardiovasculaire discovery-pipelines.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar ionkanalen en signaleringspaden die specifiek zijn voor pacemakercellen mogelijk onder gecontroleerde omstandigheden.
- Operationele waarde: Biedt een hernieuwbare bron van >80% zuivere sinusknopendcellen voor consistente target-engagement assays.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de functionele validatie van kandidaat-geneesmiddelen op ex vivo pacemakeractiviteit die vergelijkbaar is met de natuurlijke situatie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert elektrisch actieve celaggregaten die de automaticiteit van de sinoatriale knoop en de respons op geneesmiddelen nabootsen.
- Operationele waarde: Levert cellen op die reageren op chronotrope middelen (bijv. isoprenaline, carbachol) voor dosis-respons-profilering.
- Assay-gereedheid: Maakt read-outs van de slagfrequentie op basis van live-cell imaging mogelijk als kwantitatieve, real-time functionele maatstaf.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen de generatie van pacemakercellen uit stamcellen en ex vivo myocardiale pacing, waardoor de fysiologische relevantie wordt gevalideerd.
- Nut voor preklinische modellen: Ondersteunt ziektemodellering van sinusknexusdysfunctie en de evaluatie van gen- of celgebaseerde therapeutische strategieën.
- Mechanische risicoreductie: Maakt beoordeling van pro-arritmisch risico mogelijk via autonome en adrenerge uitdagingen in een menselijk relevant surrogaatsysteem.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode past binnen vroege discovery-workflows, waardoor targetvalidatie en lead-identificatie mogelijk zijn via functionele assays van pacemakercellen voorafgaand aan de preclinical commitment.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert hypothesetoetsing van sinusnoodeigen genregulatie en elektrofysiologische mechanismen.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare celpreparaten voor profilering van ionkanaal- en GPCR-modulatoren.
- Analytiek: Biedt de slaggFrequentie als een dynamische real-time readout voor het beoordelen van de chronotropie van verbindingen en autonome modulatie.
- Translationeel onderzoek: Demonstreert ex vivo myocardiale pacing-capaciteit, wat extrapolatie naar functies op weefselniveau ondersteunt.
- Bedrijfmatige hergebruik: Vestigt een schaalbaar, op differentiatie gebaseerd platform voor voortdurende screeningcampagnes voor cardiale veiligheid en effectiviteit.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in de functie van pacemakercellen door een model te bieden met een hoge zuiverheid dat fysiologisch relevant is.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door gedefinieerde differentiatie- en selectiestappen, wat standaardisatie tussen laboratoria mogelijk maakt.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroegtijdig functioneel inzicht te bieden in verbindingen die het hartritme moduleren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van leads mogelijk op basis van de veiligheids- en effectiviteitsprofielen van de sinoatriale knoop.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stamcelkweek, de vorming van embryonale lichamen en antibiotica-gebaseerde selectie.
- Is afhankelijk van met gelatine gecoate oppervlakken, hanging-drop systemen en infrastructuur voor live-cell imaging.
- Necessiteert standaardisatie van het differentiatiemedium, de G418-concentratie en de timing voor een consistente opbrengst aan pacemakercellen.
- Houdt rekening met adaptaties bij de vertaling van muisprotocollen naar menselijke stamcelmodellen.
- Wordt beperkt door de noodzaak van ex vivo validatie om de pacingcapaciteit op weefselniveau te bevestigen voorbij enkelvoudige cel-fenotypes.
