Toepassing van een High-throughput

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van compositioneel representatieve, multi-species biofilms van tandplak. Voor parallelle analyse wordt dit bereikt door eerst een representatief medium en inoculum te maken. Nadat het inoculum een nacht is geïncubeerd, wordt het in de microfluïdische chip gebracht, waarna er een biofilm in het microkanaal wordt gevormd.

Ten slotte wordt de biofilm gewassen en gekleurd voor in situ confocale laserscanningsmicroscopie of epifluorescentiemicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals flowcellen, is dat het een high-throughput systeem is waarmee meerdere experimenten parallel kunnen worden uitgevoerd, terwijl er minder materialen worden gebruikt en er geen kunstmatige laboratoriummedia nodig zijn. Begin met het verzamelen van speekselmonsters van een cohort van vijf of meer vrijwilligers in individuele plastic buisjes van 50 milliliter.

Breng de speekselmonsters over naar één enkel plastic bekerglas dat op ijs is geplaatst. Vermijd het gebruik van glazen bekerglazen in deze opstelling, omdat speekselbiopolymeren de neiging hebben om aan glazen oppervlakken te hechten. Voeg vervolgens dithiothreïtol toe aan het monster tot de eindconcentratie 2,5 millimolair is.

Roer het mengsel 10 minuten lang in het ijs. Breng de volledige inhoud over naar verschillende plastic buisjes. Centrifugeer het monster 30 minuten lang op hoge snelheid in een gekoelde centrifuge bij 4 °C om de partikels van het monster te scheiden.

Breng de spekselfase over naar een schone, steriele container en verwijder de pelletfractie om een bacterievrij groeimedium uit het monster te bereiden. Verdun eerst het monster zonder celdebris met drie volumes gedioniseerd water. Filtreer dit vervolgens met een 0,22 µm membraanfilter met lage eiwitbinding.

Steriliseer het speeksel terwijl de gefilterde fractie op ijs gekoeld wordt gehouden. Aliquoteer de gesteriliseerde oplossing en bewaar deze bij -80 °C tot gebruik. Verzamel speekselmonsters van een cohort van vijf of meer vrijwilligers in steriele plastic buizen van 50 mL.

Breng de speekselmonsters over in een op kamertemperatuur gebracht, vooraf gesteriliseerd plastic bekerglas of een buis van 50 milliliter. Voeg gesteriliseerd glycerol toe totdat een mengsel van 25%glycerol en 75%speeksel is bereikt.

In tegenstelling tot het protocol voor het groeimedium, waarbij verontreinigingen via een filtratiestap werden verwijderd, is een steriele techniek hier essentieel om contaminatie door niet-orale bacteriën of schimmels te voorkomen. Meng de glyceroloplossing met speeksel. Verdeel het mengsel van speeksel en glycerol in gelijke aliquoten en bewaar de monsters bij -80 °C totdat ze nodig zijn voor aanvang.

Koop of vervaardig een microfluïdische chip met microkanalen vergelijkbaar met die hier getoond, voordat de monsters voor zowel het bacterievrije groeimedium als het bacteriële inoculum bij kamertemperatuur op de werkbank in de microchip worden geïnoculeerd. Vortex elke buis vijf seconden om te mengen voordat u verdergaat met het hoofdexperiment; begin met het toevoegen van 100 µL van het groeimedium aan het uitlaatreservoir van de microchips. Start met behulp van een computergestuurde pomp de schuifstroming van het medium door het microkanaal gedurende twee minuten.

Inspecteer bij kamertemperatuur visueel elk kanaal om te controleren of de vloeistofvulling correct is. Incubeer de microchip gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Hierdoor worden de zijwanden van het microkanaal gecoat met een biopolymeersteunstructuur waaraan de biofilm zich tijdens de groei kan verankeren.

Aspire vervolgens handmatig het resterende medium uit het uitlaatreservoir en breng deze fractie, die nu als hydrodynamische balanceringslast zal dienen, over naar het inlaatreservoir. Voeg na de depositie van het biopolymeer-steigerderivaat 100 µL van het positieve bacteriële inoculum toe aan het uitlaatreservoir. Plaats de microchip op een warmteplaat van 37 °C en start de medium shear reverse flow.

Laat de vloeistof precies zes seconden lang van het uitlaatreservoir naar het inlaatreservoir stromen. Zet vervolgens de pomp uit en incubeer de chip onder statische omstandigheden bij 37 °C gedurende 40 minuten om de aanhechting van bacteriën of schimmels aan de zijwanden van het microkanaal te faciliteren. Verwijder daarna al het inoculum uit het uitlaatreservoir met een pipet en vul hetzelfde reservoir opnieuw door één milliliter bacterievrij groeimedium toe te voegen.

Incubeer de microchip bij 37 °C gedurende ongeveer 20 uur onder een lage schuifspanning om de groei van de biofilm in het kanaal tijdens de nachtelijke kweek te bevorderen. Pipetteer alle oplossingen uit zowel de inlaat- als uitlaatreservoirs. Breng 100 µL PBS aan bij het inlaatreservoir en spoel het microkanaal gedurende 20 minuten.

Onder een lage afschuifkracht bij voorwaartse stroming van de inlaat naar de uitlaat is de biofilm nu klaar voor levend/dood-kleuring. Bereid vlak voor de kleuring van de biofilm 100 µL van het mengsel voor levensvatigheidssturing voor per te kleuren kanaal, zoals beschreven in het tekstprotocol. Bescherm deze oplossing tegen blootstelling aan licht totdat deze nodig is voor de kleuring van de biofilm. Aspireer alle resterende vloeistof uit de inlaat en vul hetzelfde reservoir opnieuw met 100 µL van het mengsel voor levensvatigheidssturing.

Duw vervolgens de kleuringsoplossing gedurende 45 minuten door het microkanaal. Zorg ervoor dat de chip wordt beschermd tegen blootstelling aan licht bij een lage afschuifstroom op kamertemperatuur. Aspireer alle resterende vloeistof uit het inlaatreservoir en vul dit opnieuw met 100 µL PBS.

Spoel het microkanaal 20 minuten lang bij een lage schuifstroom bij kamertemperatuur om overtollige ongebonden kleurstoffen te verwijderen. De gekleurde biofilm is nu klaar voor fluorescentiemicroscopie om de driedimensionale architectuur van de biofilm te analyseren. Digitale reconstructies met behulp van horizontale scans met een confocale microscoop kunnen worden gebruikt om de algemene filmstructuur vanuit elke schuine hoek te bekijken.

Bovendien kan live-dead staining-analyse worden toegepast op dezelfde dataset om de ruimtelijke afhankelijkheid van de celviabiliteit binnen de biofilm te bestuderen als functie van verschillende chemische behandelingen. Zodra de biofilm is afgebeeld, kunnen cellen uit de niet-gekleurde kanalen worden geëxtraheerd. Met behulp van gedestilleerd water onder hoge schuifspanning kan de biofilmflora vervolgens worden geïdentificeerd aan de hand van het genomische DNA via 4 5 4 pyrosequencing.

Volg deze procedure. Andere methoden, zoals het toevoegen van verschillende soorten of verbindingen, kunnen worden uitgevoerd om andere vragen te beantwoorden, zoals wat er gebeurt met de multi-species biofilms onder verschillende omstandigheden.