Toepassing van een High-throughput In Vitro Microfluïdische System op mondelinge Multi-species biofilms Ontwikkel
December 1st, 2014
Het doel van deze methoden papier is het gebruik van een microfluïdische systeem te beschrijven voor de ontwikkeling van multi-species biofilms dat soort gewoonlijk geïdentificeerd in humaan supragingivale tandplaque bevatten. Methoden om biofilm architectuur, biofilm levensvatbaarheid, en een aanpak om te oogsten biofilm voor cultuur-afhankelijke of cultuur-onafhankelijke analyses zijn gemarkeerd beschrijven.
Het algemene doel van deze procedure is om samenstellingsgewijs representatieve, meerder soorten bevattende tandplak biofilms te creëren. Parallel voor analyse wordt dit bereikt door eerst een representatief medium en inoculum te maken. Het inoculum wordt dan na een overnachte incubatie geïntroduceerd in de microfluïdische chip, waarna een biofilm zich binnen de microkanaal vormt.
Ten slotte wordt de biofilm gewassen en gekleurd voor in situ twee confocale laser scanning microscopie of epi-fluorescentiemicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals flow cellen is dat het een hoge doorvoersnelheid heeft en toelaat om meerdere experimenten parallel uit te voeren met minder materiaal en zonder gebruik van kunstmatige laboratoriummedia. Om te beginnen verzamel speeksellasten van een cohort van vijf of meer vrijwilligers in afzonderlijke plastic buisjes van 50 milliliter.
Trek de speekselmonsters naar een enkele plastic beker op ijs. Vermijd het gebruik van glazen bekers in deze setup omdat speeksel biopolymeren de neiging hebben om aan glazen oppervlakken te hechten. Voeg vervolgens di thio drie gaten toe aan het monster totdat de uiteindelijke concentratie 2,5 millimolair is.
Roer het mengsel gedurende 10 minuten op ijs. Trek alle inhoud in verschillende plastic buisjes. Voer een hoge snelheidsspin gedurende 30 minuten uit in een met vier graden Celsius gekoelde centrifuge om deeltjes te scheiden van het monster.
Breng het speekselmonster over naar een nieuw, steriel vat en gooi de pelletfractie weg om een bacterievrij groeimedium uit het monster te bereiden. Verdun eerst het dagdebris vrije monster met drie volumes gedeïoniseerd water. Gebruik vervolgens een 0,22 micro laag eiwitbindende membraanfilter.
Steriliseer het speeksel terwijl de post-gefilterde fractie gekoeld op ijs wordt gehouden. Bewaar de gesteriliseerde oplossing en bewaar bij minus 80 graden Celsius tot het nodig is. Verzamel speekselmonsters van een cohort van vijf of meer vrijwilligers in steriele plastic buisjes van 50 milliliter.
Trek de speekselmonsters naar een op kamertemperatuur voorgesteriliseerde plastic beker of 50 milliliter buisje. Voeg gesteriliseerd glycerol toe totdat een 25% glycerol 75% speeksel mengsel is bereikt.
In tegenstelling tot het groeimediumprotocol waar verontreinigingen werden verwijderd met een filtratiestap, is steriele techniek hier belangrijk om besmetting door niet-oraal specifieke bacteriën of schimmels te voorkomen. Meng de speekselglycerol oplossing. Verdeel de speekselglycerol mengsel goed in aliquots en bewaar de monsters bij minus 80 graden Celsius tot ze nodig zijn om te beginnen.
Koop of fabriceer een microfluïdische chip met microkanaal vergelijkbaar met die hier getoond voordat u monsters in de microchip inoculeert voor zowel het bacteriën negatieve groeimedium als bacteriën positieve inoculum op de werkbank bij kamertemperatuur. Vorm elke buis gedurende vijf seconden om te mengen voordat u doorgaat naar het hoofdexperiment, begin met het toevoegen van 100 microliter van het groeimedium bij de uitlaat reservoir van de microchip. Gebruik een computergestuurde pomp om de mediumdoorstroming door het microkanaal gedurende twee minuten te starten.
Bij kamertemperatuur, inspecteer visueel elk kanaal om ervoor te zorgen dat de vloeistof correct is gevuld. Incubeer de microchip bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Dit zal de microkanaal zijwanden coaten met een biopolymeer scaffold waaraan de biofilm tijdens de groei zal ankeren.
Zuig vervolgens handmatig of resterend medium uit het uitlaat reservoir en breng deze fractie over, die nu als hydrodynamische balanceringslading naar het inlaat reservoir zal fungeren. Na afzetting van de biopolymeer scaffold, voeg 100 microliter van het bacteriën positieve inoculum toe aan het uitlaat reservoir. Plaats de microchip op een hotplate van 37 graden Celsius en start de mediumschuifomkeerstroming.
Reis van het uitlaat naar het inlaat Reservoir gedurende exact zes seconden. Schakel vervolgens de pomp uit en incubeer de chip onder statische omstandigheden bij 37 graden Celsius gedurende 40 minuten om de hechting van bacteriën of schimmels aan de microkanaal zijwanden te vergemakkelijken. Verwijder en gooi vervolgens al het inoculum uit het uitlaat reservoir met een pipet en vul hetzelfde reservoir bij met een milliliter bacterievrij groeimedium.
Incubeer de microchip bij 37 graden Celsius gedurende ongeveer 20 uur onder lage scheurstroming om intrakanaal biofilmgroei te bevorderen na overnacht groei. Pipet alle oplossingen uit beide inlaat- en uitlaat reservoirs. Breng 100 microliter PBS aan bij het inlaat Reservoir en was het microkanaal gedurende 20 minuten.
Onder lage scheurvoorwaartse stroming van het inlaat naar het uitlaat, is de biofilm nu klaar voor levend dood kleuring. Net voor het kleuren van de biofilm, bereid 100 microliter van de levensvatbaarheidskleuringsmix voor elke kanaal die moet worden gekleurd, zoals gevonden in het tekstprotocol. Bescherm deze oplossing tegen lichtblootstelling tot het nodig is om de biofilm te kleuren, zuig al het resterende vloeistof uit het inlaat en vul hetzelfde reservoir bij met 100 microliter van de levensvatbaarheidskleuringsmix.
Duw vervolgens de kleuringsoplossing gedurende 45 minuten door het microkanaal. Onder lage share stroming bij kamertemperatuur, zorg ervoor dat het chip beschermd wordt tegen lichtblootstelling. Zuig al het resterende vloeistof uit het inlaat reservoir en vul bij met 100 microliter PBS.
Was het microkanaal gedurende 20 minuten onder lage share stroming bij kamertemperatuur om overtollige ongebonden kleurstoffen te verwijderen. De gekleurde biofilm is nu klaar voor fluorescentiemicroscopie om de driedimensionale architectuur van de biofilm te bepalen. Digitale reconstructies met horizontale scans met een confocale microscoop kunnen worden gebruikt om de algehele filmstructuur vanuit elke schuine hoek te bekijken.
Bovendien kan levend dood kleuringsanalyse worden toegepast op dezelfde dataset om de ruimtelijke afhankelijkheid van cellevensvatbaarheid binnen de biofilm te bestuderen als functie van verschillende chemische behandelingen. Zodra de biofilm is afgebeeld, kunnen cellen uit on
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit methodendocument beschrijft een microfluïdisch systeem dat is ontworpen voor de ontwikkeling van multi-soort biofilms die humane supragingivale dentale plaque nabootsen. De studie benadrukt technieken voor het analyseren van biofilmarchitectuur, levensvatbaarheid en oogsten voor verdere analyses.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Microfluïdica
- Biofilmonderzoek
- Tandheelkundige microbiologie
Achtergrond
- Biofilms zijn complexe gemeenschappen van micro-organismen.
- Menselijke dentale plaque is een veelvoorkomend voorbeeld van een biofilm.
- Het begrijpen van biofilmvorming is cruciaal voor de tandgezondheid.
- Huidige methoden voor het bestuderen van biofilms hebben beperkingen.
Doel van het onderzoek
- Om representatieve multi-soort dentale plaque biofilms te creëren.
- Om een high-throughput systeem voor biofilmanalyse te ontwikkelen.
- Om methoden voor het bestuderen van biofilmlevensvatbaarheid en architectuur te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Verzameling van speekselmonsters van vrijwilligers.
- Bereiding van representatieve media en inoculum.
- Introductie van inoculum in een microfluïdische chip.
- Kleuring en beeldvorming van biofilms met behulp van microscopietechnieken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vorming van biofilms binnen microkanalen.
- High-throughput mogelijkheid staat meerdere experimenten toe.
- Verminderd materiaalgebruik in vergelijking met traditionele methoden.
- In situ beeldvorming biedt inzichten in de biofilmstructuur.
Conclusies
- Het microfluïdische systeem is een effectief hulpmiddel voor biofilmonderzoek.
- Deze methode verbetert het begrip van dentale plaque biofilms.
- Toekomstige studies kunnen deze aanpak gebruiken voor verschillende toepassingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-throughput microfluidic systems for multi-species oral biofilm development enable pharmaceutical R&D teams to model complex, disease-relevant microbial communities under physiologically relevant conditions. This approach supports predictive confidence in early-stage anti-biofilm compound screening and informs target validation for oral health therapeutics. The system's scalability and use of natural human saliva enhance translational continuity from discovery to preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microbial community dynamics and therapeutic hypothesis testing in a controlled, human-relevant environment.
- Supports biological de-risking by modeling in vivo-like biofilm complexity for functional target validation.
- Facilitates predictive confidence in identifying anti-biofilm targets and mechanisms relevant to oral disease.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multi-species biofilm systems for robust compound screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative outputs through confocal imaging and viability assays.
- Enables high-throughput, parallel experimentation with reduced material requirements and increased assay scalability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro biofilm models with disease-relevant oral microbiota for translational biomarker studies.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation by supporting genomic and architectural analyses.
- Reduces mechanistic ambiguity in preclinical candidate selection for oral health interventions.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic biofilm system integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting lead identification and mechanistic de-risking for oral therapeutics.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing and pathway clarification by modeling native oral biofilm communities.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible biofilm systems with quantitative imaging and viability readouts.
- Analytics: Provides 3D architectural and viability data to compare compound effects across conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and disease relevance through use of pooled human saliva and multi-species communities.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for repeated use across diverse oral biofilm research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and target validation for anti-biofilm strategies.
- Operational Value: Standardizes workflows, enhances reproducibility, and enables high-throughput scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and reduces late-stage biological risk in oral health portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oral biofilm-targeted candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, oral microbiology, and advanced imaging techniques.
- Needs access to confocal microscopy and genomic analysis infrastructure for comprehensive outputs.
- Demands rigorous cross-team standardization for saliva collection, biofilm growth, and data analysis.
- Adaptation across different microbial communities or disease models may require protocol optimization.
- Limitations include current throughput of imaging and the complexity of multi-species data interpretation.
