Name: Driedimensionale Co-cultuur Model voor Tumor-stromale Interactie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Leer een driedimensionale co-cultuurmethode met longkankercellen en kankergeassocieerde fibroblasten in collageengels. Dit protocol modelleert het tumormicro-milieu realistischer dan 2D-kweken en ondersteunt onderzoek naar invasie en stromale interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door Grants-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek (KAKENHI) (26461185 en 25460137).

LET OP: Deze studie werd goedgekeurd door de bevoegde ethische commissies. 1. Primaire cultuur van de mens longfibroblasten <ol><li> Het verzamelen van longweefsel: <ol><li> Verkrijgen menselijk longweefsel monsters uit de chirurgische operatiekamer direct. Verzamel ongeveer 1 cm 3 blokken van kankerachtige en niet-kankerachtige longweefsel met de niet-kwaadaardige monster verzameld ver van de tumor mogelijk. </li><li> Suspendeer de monsters in Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) aangevuld met 100 eenheden / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine en 0,25 pg / ml amfotericine B (serumvrij medium). Handhaaf de monsters gesuspendeerd in steriele 50 ml buizen en overbrengen naar het laboratorium. OPMERKING: Fibroblasten zijn sterk migrerende en proliferatieve vergelijking met andere celtypen, zoals epitheel, endotheel en gladde spiercellen. De uitgroei methode maakt gebruik van deze functies van fibroblasten, en outgrowing cellen van weefsel secties zijn er in overvloed in fibroblasten. Na diverse overentingen andere celtypen niet overleven en voortplanten in DMEM met 10% foetaal runderserum (FBS), resulterend in gezuiverde fibroblast celkweken. De cellen kunnen worden gebruikt 3-7 passages na primaire cultuur. </li></ol></li><li> Explantaatkweek en conditionering voor mobiele uitgroei: <ol><li> Voeren primaire cultuur van fibroblasten met behulp van een eerder gemelde protocol met aanpassingen 5. </li><li> In het laboratorium, plaats het weefselmonster op een 10 cm weefselkweekschaal zonder kweekmedium en in kleine secties ~ 2-3 mm groot met steriele pincet en een scalpel. Daarbij vermijdt de sectie droge, anders de efficiëntie van de cel uitgroei wordt aangetast. </li></ol></li><li> Scheiding van de epitheliale cellaag en bindweefsel: <ol><li> Week de cut weefselcoupes in kweekmedium bevattende 2000 PU / ml Dispase I en kweek gedurende 16 uur bij 4 ° C. &lt;/ Li&gt; <li> Breng de weefselcoupes een schotel, en scheiden de epitheliale cellaag van het aangrenzende bindweefsel. Verwerk de secties in een schone werkbank om verontreiniging van micro-organismen te voorkomen. OPMERKING: Als de primaire cultuur van epitheelcellen nodig is, stap 1.3 uit te voeren. Als alleen fibroblasten zijn om geïsoleerd te worden, wordt punt 1.3, omdat de daaropvolgende explantaatkweek en celpassages zijn ongunstig voor de epitheelcellen, die gezuiverd fibroblast populatie opleveren. </li></ol></li><li> Aanhechting van weefsel secties: <ol><li> Hak de weefsels tot 1 mm gesneden met twee scalpels. Als de stukken zijn niet klein genoeg, dat MOET gemakkelijker uit de schaal en de cellen niet ontgroeien op de schotel oppervlak. </li><li> Plaats kleine longweefsel secties van elkaar naar een leeg gebied rond elk stuk handhaven. Maak krassen op het oppervlak van de weefselkweekschaal met een scalpel om hechting van weefselcoupes vergemakkelijken. OPMERKING: KrassenOok lijkt cel uitgroei bevorderen, waardoor sporen waarlangs cellen kunnen migreren. <ol><li> Als alternatief, plaats gehakt weefsel stukken individueel in elk putje van een 6-wells plaat, en bedek ze met een dekglas. Bevestig het deksel slip aan het oppervlak van de plaat met behulp van siliconenvet. </li><li> Plaats siliconenvet op twee punten van 1,5 cm van elkaar in elk putje met behulp van een steriele pin. Dekking van het weefsel stukken verhoogt de effectiviteit van de cel uitgroei en cel voortplanting na verscheidene passages. </li></ol></li></ol></li><li> Daaropvolgende explantaatkweek: <ol><li> Voeg voorzichtig kweekmedium de schaal voor de weefselcoupes uitdrogen zo efficiënt cel uitgroei verloren grotendeels indien de monsters uitdrogen. Wees niet te snel als het weefsel secties zou losmaken giet het medium. </li><li> Kweekcellen in DMEM met 10% FBS. Gebruik voldoende medium om alleen het weefsel omvatten, maar niet zo veel dat het mogelijk maakt drijven, als extra drijfvermogen bevordert onthechting van degerecht. </li></ol></li><li> Passage van de cellen: <ol><li> Behandel het kweekmedium met zorg te allen tijde als herhaalde bewegingen van de cultuur schotel kan leiden tot onthechting van het weefsel secties. </li><li> Plaats de kweekschalen in een incubator bij 37 ° C gedurende 5-7 dagen. Vernieuw het medium om de andere dag, en omgaan met de cultuur gerechten minimaal tijdens het medium verandert. Fibroblasten ontgroeien van de rand van het weefsel secties in de komende weken. OPMERKING: Na ~ 2-3 weken uitgroeiende fibroblasten bijna confluentie bereiken, afhankelijk van de hoeveelheid oppervlak. </li><li> Was de cellen met 1x PBS, en voeg 1 ml trypsine ik aan de plaat. </li><li> Na trypsinisatie, los de cellen met 9 ml DMEM aangevuld met 10% FBS. Verzamel cellen gesuspendeerd in het medium in een 10 ml buis, samen met de weefselcoupes. Na centrifugatie naar cel pellets, resuspendeer de verkregen pellets in het nieuwe medium. </li><li> Zaad de cellen en weefselcoupes op een nieuw cultuur schotel, waarna het weefsel niet hechten aan de schotel, terwijl de cellen hechten en te groeien. De volgende dag, verwijder de drijvende stukken weefsel door aspiratie, en verander het medium. Bijgevoegde fibroblasten propageren met latere culturen. </li></ol></li></ol> 2. Driedimensionale Co-cultuur van de Mens longfibroblasten en kankercellen <ol><li> Bereiding van cellen en reagentia: <ol><li> Ongeveer gebruik 2 x 10 5 epitheelcellen en 2,5 x 10 5 fibroblasten per putje. Bereid collageen type IA (3 mg / ml, pH 3), FBS (100%), reconstitutie buffer (50 mM NaOH, 260 mM NaHCO3, 200 mM HEPES), 5x DMEM, DMEM aangevuld met 10% FBS voor fibroblast cultuur, en een 3D co-kweekmedium (een 1: 1 mengsel van fibroblast kweekmedium en kweekmedium voor kankercellen). </li><li> Cultuur A549 long adenocarcinoom cellen, fibroblasten en A549 3D co-cultuur in DMEM aangevuld met 10% FBS. </li></ol></li><li> Collageen gel formatie: <ol><li> Was fibroblasten gekweekt op 10 cm schotel met 1x PBS, en voeg 1 ml trypsine ik aan de plaat. Na behandeling met trypsine gedurende ~ 5 min bij 37 ° C, los de cellen met 9 ml DMEM aangevuld met 10% FBS. Verzamel cellen gesuspendeerd in het medium in een 10 ml buis en centrifugeer ze op 200-300 xg naar cel pellets. </li><li> Resuspendeer de verkregen pellets 100% FBS bij een dichtheid van 5 x 10 5 / ml. </li><li> Bereid de collageen-gel op ijs. Koel de reagentia, pipetten en buizen in een koelkast voor de volgende procedure. Zelfs op ijs, het mengsel stolt enigszins, en het totale volume kleiner is dan de som van alle bestanddelen. </li><li> In elk putje, de voorbereiding van de collageen-gel door het mengen van 0,5 ml van fibroblast suspensie (2,5 x 10 5 cellen) in FBS, 2,3 ml type IA collageen, 670 ul 5x DMEM, en 330 ul reconstitutie buffer. Laat de gels gemakkelijk ingesteld op kamertemperatuur. <ol><li> Krachtig pipet om een ​​homogene mi zorgenxture. Vermijd het creëren van bubbels tijdens het pipetteren proces. </li></ol></li><li> Voeg het mengsel (3 ml) aan elk putje van een 6-wells plaat en laat gelatineren in de incubator bij 37 ° C ongestoord gedurende 30-60 min. </li></ol></li><li> Kankercel cultuur op het collageen gel: <ol><li> Voer driedimensionaal co-cultuur met een eerder beschreven protocol met 6 modificaties. </li><li> Resuspendeer kankercellen in de 3D ​​co-kweekmedium (of DMEM met 10% FBS bij A549 cellen) in een dichtheid van 1 x 10 5 / ml. </li><li> Giet 2 ml van de geresuspendeerde cellen (2 x 10 5 cellen) op het oppervlak van elke gel. Wijzig cel aantal kankercellen of fibroblasten in co-kweek afhankelijk van experimentele omstandigheden. </li></ol></li><li> Gel samentrekking: <ol><li> Incubeer gels overnacht bij 37 ° C zodat de kankercellen kan hechten aan de collageengel. Losmaken elke gel, en het genereren van een &#39;zwevende cultuur&#39; in elk putje of 6-wells plaat. Opmerking: Door een zwevende cultuur, zijn verschillende veranderingen in gel omvang veroorzaakt door mechanische spanning en collageen afbraak, die worden gemedieerd door cellulaire interactie tussen co-gekweekte kankercellen en fibroblasten. </li><li> Gebruik een schuine 21 G naald of kleine spatel elke gel scheiden van de rand van de put. Elke 2-3 dagen, ververs de putjes met 2 ml 3D co-kweekmedium. Meet de grootte van elke gel elke dag gedurende 5 dagen. </li></ol></li><li> Analyse van collageen gels: <ol><li> Meet het collageengehalte van elke gel met collageen kwantificatie werkwijzen, zoals Sircol assay. Voer transcriptoom analyse of kwantitatieve RT-PCR na het verzamelen van RNA uit de gels 5. </li></ol></li></ol> 3. Air-vloeistof Interface Cultuur en Invasion Assay <ol><li> Na het kweken van de collageen gel bij 37 ° C gedurende 5 dagen, bloot de gecontracteerde gels lucht door ze op een mesh (70 um poriegrootte) in nieuwe 6-well platen. Maak het gaas uit commercieel beschikbare mobiele filters gebruikt voor flowcytometrie. </li><li> Vullen zachtjes elk putje met 11 ml van 3D co-kweekmedium. </li><li> Plaats de gels op het gaas met een steriele lepel, en verwijder alle resterende medium uit de gels. Op deze voorwaarde, onderdompelen gels in het medium terwijl het bovenoppervlak van de gel bloot aan de lucht. Definieer deze cultuur staat als lucht-water grensvlak. OPMERKING: Na 5-7 dagen handhaven lucht-water grensvlak kweek bij 37 ° C in de incubator, invasieve kankercellen migreren in de gel. Afhankelijk van het celtype en als gevolg van cellulaire interacties, wordt een variabele mate van cel morfologische veranderingen in de kankercellen geïnduceerd door de lucht-vloeistof grensvlak kweek. </li><li> Voor histologische evaluatie, bevestig de gel in formaline oplossing overnacht bij kamertemperatuur en inbedden in paraffine. Vlek verticale secties (4 micrometer) met hematoxyline en eosine (H &amp; E). Voeren immunohistochemische analyse on de hoofdstukken 4. </li></ol>

<ol><li>Strell, C., Rundqvist, H., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts-a+key+host+cell+type+in+tumor+initiation%2C+progression%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Ups.+J.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts-a key host cell type in tumor initiation, progression, and metastasis.</a> Ups. J. Med. Sci. 117 (2), 187-195 (2012).</li>
<li>Augsten, M., Hägglöf, C., Peña, C., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digest+on+the+role+of+the+tumor+microenvironment+in+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenviron%22%5BJournal%5D)">A digest on the role of the tumor microenvironment in gastrointestinal cancers.</a> Cancer Microenviron. 3 (1), 167-176 (2010).</li>
<li>Augsten, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Associated+Fibroblasts+as+Another+Polarized+Cell+Type+of+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cancer-Associated Fibroblasts as Another Polarized Cell Type of the Tumor Microenvironment.</a> Front. Oncol. 4, 62(2014).</li>
<li>Horie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+lung+cancer-associated+fibroblasts+in+three-dimensional+in+vitro+co-culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Characterization of human lung cancer-associated fibroblasts in three-dimensional in vitro co-culture model.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (1), 158-163 (2012).</li>
<li>Ohshima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling+in+gingival+fibroblast-epithelial+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dent.+Res%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling in gingival fibroblast-epithelial interaction.</a> J. Dent. Res. 89 (11), 1315-1321 (2010).</li>
<li>Ikebe, D., Wang, B., Suzuki, H., Kato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+keratinocyte+stratification+by+a+dominant+negative+JunB+mutant+without+blocking+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Suppression of keratinocyte stratification by a dominant negative JunB mutant without blocking cell proliferation.</a> Genes Cells. 12 (2), 197-207 (2007).</li>
<li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer%3A+a+novel+tumor-promoting+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type.</a> Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).</li>
<li>Paulsson, J., Micke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+cancer-associated+fibroblasts+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer.</a> Semin. Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).</li>
<li>Navab, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+gene-expression+signature+of+carcinoma-associated+fibroblasts+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108 (17), 7160-7165 (2011).</li>
<li>Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+cancer-associated+fibroblasts+from+human+colon+tumors+shows+specific+prognostic+gene+expression+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of cancer-associated fibroblasts from human colon tumors shows specific prognostic gene expression signature.</a> Clin. Cancer Res. 19 (21), 5914-5926 (2013).</li>
<li>Hägglöf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+PDGFRbeta+expression+in+prostate+tumors+and+non-malignant+prostate+tissue+predicts+prostate+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Stromal PDGFRbeta expression in prostate tumors and non-malignant prostate tissue predicts prostate cancer survival.</a> PLoS One. 5 (5), e10747(2010).</li>
<li>Saito, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forkhead+box+F1+regulates+tumor-promoting+properties+of+cancer-associated+fibroblasts+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Forkhead box F1 regulates tumor-promoting properties of cancer-associated fibroblasts in lung cancer.</a> Cancer Res. 70 (7), 2644-2654 (2010).</li>
<li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 6 (5), 392-401 (2006).</li>
<li>Calvo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+YAP-dependent+matrix+remodelling+is+required+for+the+generation+and+maintenance+of+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and YAP-dependent matrix remodelling is required for the generation and maintenance of cancer-associated fibroblasts.</a> Nat. Cell Biol. 15 (6), 637-646 (2013).</li>
<li>Horie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+induces+human+lung+fibroblast-mediated+collagen+gel+contraction+via+histamine+H1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor.</a> Exp. Lung Res. 40 (5), 222-236 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

CAF vormen een belangrijke component van de ECM omringende kankercellen en niet alleen een ondersteuning voor de tumor, maar ook actief deelnemen aan tumorontwikkeling 7. Accumuleren bewijs ontrafelt de impact van CAF of hun verwante moleculen op de uiteindelijke prognose, aandacht voor de cruciale rol van de CAF-gemedieerde tumorprogressie 8. In eerder onderzoek gebruikten we uitgroei methode long CAF 4 isoleren. In dit experiment, de handhaving van weefsels...

Kankerweefsel kan worden gezien als een soort orgaan, dat zich ontwikkelt door nauwe interacties tussen de kanker en de tumor-stromale micro-omgeving, bestaande uit kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF's), immuuncellen, tumorvaten en de extracellulaire matrix (ECM). CAF's zijn de belangrijkste bron van oplosbare factoren (cytokinen, groeifactoren en chemokinen) die mitogene, pro-migratoire en pro-invasieve effecten hebben op kankercellen. Ze stimuleren ook de vorming van tumorvaten en rekruteren precursorcellen, zoals beenmerg-afgeleide cellen (BMDC). Geactiveerde CAF's zijn betrokken bij de productie en remodellering van de ECM, waardoor de groei en verspreiding van kankercellen wordt bevorderd1. CAF's bieden ook een niche die tumorcellen kolonisatie en metastase vergemakkelijkt en in staat zijn om stamcelfenotypen over te brengen op naburige kankercellen. Pathologische waarnemingen suggereren dat stromareacties of fibrotische veranderingen in kankerweefsel indicatief zijn voor een slechte prognose. Recente studies hebben ook aangetoond dat tumor-stroma kenmerken, zoals het genpatroon, de prognose van patiënten kunnen voorspellen. Verder kunnen door CAF's afgegeven factoren de gevoeligheid voor chemotherapie moduleren, wat de rol van CAF's in het bepalen van geneesmiddelgevoeligheid en resistentie benadrukt2.
Aangezien CAF's een veelzijdige rol spelen bij het bevorderen van tumorprogressie via signaalroutes die interacties tussen CAF's en verschillende celtypen binnen de tumormicro-omgeving mediëren, hebben ze steeds meer aandacht gekregen als nieuwe doelen voor kankertherapieën. De heterogeniteit van de celpopulaties binnen de kankermicro-omgeving vormt een obstakel voor het targeten van CAF's. Er zijn verschillende markeringen voor CAF's voorgesteld, zoals α-smooth muscle actin (α-SMA), fibroblast activatie-eiwit (FAP) en fibroblast specifiek proteïne-1 (FSP-1: ook wel S100A4 genoemd); echter, deze moleculaire markers zijn niet specifiek voor het onderscheid van CAF's van andere cellen die aanwezig zijn in niet-kankerweefsel3. Daarom zijn verdere studies nodig om meer kennis te vergaren over de specifieke eigenschappen van CAF's. Om dit te bereiken, is het informatief om primair gekweekte CAF's te karakteriseren in vergelijking met patiënt-gematchte normale fibroblasten.
Onlangs zijn analyses van patiënt-afgeleide CAF's gerapporteerd in verschillende kankertypen, waarbij unieke genexpressiepatronen en celgedragingen zijn onthuld in vergelijking met fibroblasten afgeleid van niet-kankerweefsel. Met behulp van geïsoleerde CAF's uit menselijk longkankerweefsel hebben we een driedimensionale co-cultuurmethode ontwikkeld, waarmee we de eigenschappen van long-CAF's kunnen evalueren. In dit model onderzochten we de effecten van de CAF's op longkankercel-invasie, proliferatie en collageengelcontractie, wat experimenteel de tumor-bevorderende rollen van long-CAF's nabootste4.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>Collagen type IA</td><td>Nitta gelatin Inc.</td><td>CELL-1A</td><td></td></tr><tr><td>Reconstitution buffer</td><td>Nitta gelatin Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cover slip</td><td>NUNC</td><td>174934</td><td></td></tr><tr><td>Silicone grease</td><td>Dow Corning Toray</td><td>High vacuum grease</td><td></td></tr><tr><td>Dispase I</td><td>WAKO</td><td>386-02271</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer (70 &mu;m)</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr></tbody></table>

driedimensionale co-cultuur model voor tumor-stromale interactie

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Kankerprogressie (initiatie, groei, invasie en metastase) vindt plaats door interacties tussen maligne cellen en de omringende tumorstromacellen. Het tumormicro-omgeving bestaat uit verschillende celtypen, zoals fibroblasten, immuuncellen, vasculaire endotheelcellen, periccyten en beenmerg-afgeleide cellen, ingebed in de extracellulaire matrix (ECM). Kanker-geassocieerde fibroblasten (CAF's) hebben een pro-tumorigene rol door de secretie van oplosbare factoren, angiogenese en ECM-remodellering. De experimentele modellen voor kankerceloverleving, proliferatie, migratie en invasie zijn voornamelijk gebaseerd op twee-dimensionale monocellulaire en monolaag-weefselculturen of Boyden-kamer-assays. Deze experimenten weerspiegelen echter niet precies de fysiologische of pathologische omstandigheden in een aangetaste orgaan. Om een beter begrip te krijgen van tumorstroma of tumormatrixinteracties, bieden meercellige en driedimensionale culturen krachtigere hulpmiddelen voor het onderzoeken van intercellulaire communicatie en ECM-afhankelijke modulatie van het gedrag van kankercellen. Als platform voor dit type studie presenteren we een experimenteel model waarin kankercellen worden gekweekt op collageengels ingebed met primaire culturen van CAF's.

Deze samenwerking kweekmethode nabootsen van de tumor micro-omgeving is een nuttig hulpmiddel om de interacties tussen kankercellen en fibroblasten ingebed in collageen gels onderzoeken. In de vorige studie werden drie parameters geëvalueerd in dit experimentele model: collageengel contractie, kankercel invasie en morfologische verandering. Kankercelproliferatie werd ook geschat met behulp van Ki67 immunostaining 4. Lung weefselmonsters werden verzameld van kankerachtige en niet-kankerachtige gedeelten van ee...

Hier presenteren we een protocol voor co-cultuur in drie dimensies, wat nuttig is voor het onderzoeken van interacties tussen meerdere cellen en het beïnvloeden van het gedrag van kankercellen door de extracellulaire matrix. In dit experimentele model worden kankercellen gekweekt op collageengels ingebed met humane kanker-geassocieerde fibroblasten.

Driedimensionale Co-cultuur Model voor Tumor-stromale Interactie

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Het algemene doel van deze procedure is het onderzoeken van celinteracties tussen longkankercellen en kankerassocieerde fibroblasten middels een driedimensionale co-kweekmethode. Dit wordt bereikt via de primaire kweek van menselijke longkankerassocieerde fibroblasten uit verzameld longweefsel dat is fijngehakt in stukjes van één millimeter. De tweede stap is het bereiden van collageengel met ingebedde fibroblasten door een collageenoplossing onder gebruik van de trypsine-behandelde cellen te mengen en deze over te brengen naar een zeswellplaat om te gelatiniseren.Vervolgens worden longadenocarcinoomcellen op het oppervlak van elke gel geplaatst om een dimensionale cocultuur van kankercellen en fibroblasten voor te bereiden, waarna de gel van de rand van het putje wordt gescheiden om een zwevende cultuur te creëren. De laatste stap is het uitvoeren van de lucht-vloeistofgrensvlakcultuur en de invasie-assay door de gecontracteerde gels aan lucht bloot te stellen door ze op een gaas in een zes-putsplaat te plaatsen. Ten slotte worden histologische onderzoeken gebruikt om de invasie van kankercellen en morfologische veranderingen te evalueren.Het belangrijkste voordeel van deze proced

three-dimensional-co-culture-model-for-tumor-stromal-interaction

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Heterotypische Driedimensionale<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellering van Stroma-epitheliale interacties tijdens eierstokkanker initiatie en progressie

This video demonstrates a method to establish a three-dimensional tumor spheroid and T cell co-culture. An agarose cast with microwells containing tumor spheroids is prepared, followed by the addition of T cells. After incubation, this setup allows studying the interaction of T cells with tumor spheroids in a controlled three-dimensional environment.

A Three-Dimensional Co-culture Model of Infiltrating T Cells in Tumor Spheroids

Het organotypische co-kweek met hersenplakjes carcinoomcellen kunnen visualiseren morfologische veranderingen van fluorescentie en helderveld (video) microscopie gedurende het proces van cel carcinoom invasie van hersenweefsel. Dit model systeem maakt het ook mogelijk voor mobiele uitwisseling en replenishment benaderingen en biedt een breed scala van manipulaties en analyses.

Coculture systeem met een Organotypische Brain Slice en 3D Sferoïde van carcinomacellen

Drie dimensionale cultuur van mammaire epitheelcellen op een gereconstitueerde basaalmembraan is een handige methode om de in vivo architectuur van de goedaardige borst herhalen, en het maligne fenotype onderscheiden van goedaardige borst fenotype. Belangrijk is dat dit systeem worden toegepast invasieve carcinomen studie in weefsels.

Drie dimensionaal culturen: Een hulpmiddel om te studeren Normaal Acinaire Architectuur versus maligne transformatie van cellen borst

We demonstreren een methode om 3D-surrogaten voor borstkanker te genereren, die kunnen worden gekweekt met behulp van een perfusiebioreactorsysteem om zuurstof en voedingsstoffen af te geven. Na de groei worden surrogaten gefixeerd en verwerkt tot paraffine voor evaluatie van parameters van belang. De evaluatie van één van deze parameters, celdichtheid, wordt uitgelegd.

Voorbereiding en analyse van<em&gt; In Vitro</em&gt; Three Dimensional mammacarcinoom Surrogates

Kankercellen worden ingebed in een collageengel en vervolgens tussen een acellulair fibrinegel gedaan om een 3D-kweeksysteem te genereren waarin de invasiviteit en vorming van satelliettumoren kunnen worden gemonitord.

Driedimensionale Culture Assay te ontdekken Cancer Cell Invasiviteit en Satellite tumorvorming

Een in vitro model systeem werd ontwikkeld om weefsel architectonische veranderingen vast te leggen tijdens long plaveisel carcinoom (LUSC) progressie in een 3-dimensionale (3D) co-cultuur met kanker-geassocieerde fibroblasten (CAFs). Dit organoïde systeem biedt een uniek platform om de rollen van diverse tumorcel-intrinsieke en extrinsieke veranderingen te onderzoeken die het tumorfenotype moduleren.

Multidimensionaal Coculture System model Long Plaveisel Carcinoom Progressie

Een nieuwe drie-dimensionale sferoïde model gebaseerd op de heterotypische interactie van tumorcellen en stromal fibroblasten wordt vastgesteld. Hier presenteren we cocultuur van tumorcellen en stromalfibroblasten, time-lapse beeldvorming en confocale microscopie om de vorming van sferoïden te visualiseren. Dit driedimensionale model biedt een relevant platform om tumor-stroma interacties te bestuderen en kankertherapieën te testen.

Een nieuwe Stromal Fibroblast-Gemoduleerde 3D Tumor Sferoïde Model voor het bestuderen van Tumor-Stroma Interactie en Drug Discovery

De gepresenteerde aanpak evalueert tegelijkertijd kankercelinvasie in 3D-sferoïde testen en T-celcytotoxiciteit. Sferoïden worden gegenereerd in een steiger-vrije agarose multi-microwell gegoten. Co-cultuur en inbedding in type I collageen matrix worden uitgevoerd in hetzelfde apparaat dat het mogelijk maakt om kankercel invasie en T-cel gemedited cytotoxiciteit te controleren.

Monitoring Cancer Cell Invasion en T-Cell Cytotoxicity in 3D Cultuur

Uitgebreide in vitro modellen die de relevante menselijke ziekte getrouw samenvatten, ontbreken. De huidige studie presenteert driedimensionale (3D) tumor sferoïde creatie en cultuur, een betrouwbaar in vitro hulpmiddel om de tumor-stromale interactie in humaan hepatocellulair carcinoom te bestuderen.

Een driedimensionaal sferoïde model om de tumor-stromale interactie bij hepatocellulair carcinoom te onderzoeken

Er is een kritieke behoefte aan 3D-kankermodellen die heterocellulaire overspraak vastleggen om kankermetastasen te bestuderen. Onze studie presenteert de generatie van heteromulticellulair stromaal-epitheel in een steiger- en steigervrije omgeving die kan worden gebruikt om invasie en cellulaire ruimtelijke verdelingen te bestuderen.

Heteromulticellulaire stromale cellen in steigervrije 3D-culturen van epitheelkankercellen om invasie te stimuleren

Leer een driedimensionale co-cultuurmethode met longkankercellen en kankergeassocieerde fibroblasten in collageengels. Dit protocol modelleert het tumormicro-milieu realistischer dan 2D-kweken en ondersteunt onderzoek naar invasie en stromale interacties.

Driedimensionale Co-cultuur Model voor Tumor-stromale Interactie

Meer video's verkennen