Driedimensionale Co-cultuur Model voor Tumor-stromale Interactie

Het algemene doel van deze procedure is het onderzoeken van celinteracties tussen longkankercellen en kankerassocieerde fibroblasten middels een driedimensionale co-kweekmethode. Dit wordt bereikt via de primaire kweek van menselijke longkankerassocieerde fibroblasten uit verzameld longweefsel dat is fijngehakt in stukjes van één millimeter. De tweede stap is het bereiden van collageengel met ingebedde fibroblasten door een collageenoplossing onder gebruik van de trypsine-behandelde cellen te mengen en deze over te brengen naar een zeswellplaat om te gelatiniseren.

Vervolgens worden longadenocarcinoomcellen op het oppervlak van elke gel geplaatst om een dimensionale cocultuur van kankercellen en fibroblasten voor te bereiden, waarna de gel van de rand van het putje wordt gescheiden om een zwevende cultuur te creëren. De laatste stap is het uitvoeren van de lucht-vloeistofgrensvlakcultuur en de invasie-assay door de gecontracteerde gels aan lucht bloot te stellen door ze op een gaas in een zes-putsplaat te plaatsen. Ten slotte worden histologische onderzoeken gebruikt om de invasie van kankercellen en morfologische veranderingen te evalueren.

Het belangrijkste voordeel van deze procedure ten opzichte van bestaande methoden, zoals tweedimensionale monolaagcultuur, is dat multicellulaire interacties kunnen worden onderzocht in een driedimensionale culturomgeving. Deze procedure begint met de primaire cultuur van fibroblasten uit verzameld longweefsel, zoals beschreven en vermeld in het tekstprotocol. In deze video worden muizenlongen gebruikt in plaats van menselijk longkankerweefsel.

Plaats het longweefselmonster in een weefselkweekschaal van 10 centimeter zonder kweekmedium. Snijd het weefsel met steriele pincetten en een scalpel in kleine secties van ongeveer één millimeter groot. Vermijd tijdens dit proces dat de sectie uitdroogt, omdat dit de efficiëntie van de celuitgroei bemmert. Plaats de kleine longweefselsecties apart van elkaar, zodat er rond elk stukje een lege ruimte blijft.

Maak met een scalpelblad krasjes in het oppervlak van de weefkweekschaal. Alternatief kan het bedekken van weefselstukjes de effectiviteit van de celuitgroei en celpropagatie na verschillende passages verbeteren. Breng eerst op twee punten, met een afstand van 1,5 centimeter, siliconenvet aan in elke put.

Plaats vervolgens de fijngehakte weefselstukjes individueel in het midden van elke well. Bevestig daarna het dekglas aan het oppervlak van de plaat met behulp van siliconenvet. Voeg voorzichtig kweekmedium toe aan de schaal of zes-wells plaat voordat de weefselsecties uitdrogen.

De efficiënte celuitgroei is voor het grootste deel verloren gegaan. Als de monsters zijn uitgedroogd, mag het medium niet te snel worden ingeschonken om detachement van de weefselcoupes voor de vorming van het collageengel te voorkomen. Was de fibroblasten met een eenvoudige fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS en voeg trypsine toe om de uitgroeiende cellen los te maken na trypsinisatie gedurende ongeveer vijf minuten.

Los de cellen bij 37 °C los met negen milliliter DMEM aangevuld met 10% FBS, verzamel de in het medium gesuspendeerde cellen in een buis van 10 milliliter en centrifugeer deze bij 200 tot 300 ×g om celpellets te vormen. Suspendeer de resulterende pellets in 100% FBS met een dichtheid van een half miljoen cellen per milliliter. Koel de reagentia, pipetten en buizen voor de bereiding van de collageengel vooraf in een koelkast.

Bereid vervolgens de collageengel voor door de fibroblastensuspensie in FBS Type one A collagen five X-D-M-E-M en reconstitutiebuffer krachtig te mengen; pipetteer goed om een homogeen mengsel te garanderen en voorkom de vorming van luchtbellen tijdens het pipetteren. Voeg daarna drie milliliters van het mengsel toe aan elke well van een six well plate en laat dit 30 tot 60 minuten ongestoord geleren in de incubator bij 37 °C. Voor de kankercelcultuur op de collageengel worden de kankercellen resuspendeerd in het 3D-cocultuurmedium bij een dichtheid van 1 × 10⁵ cellen per milliliter.

Giet twee milliliters van de resuspendeerde A549-longadenocarcinoomceloplossing op het oppervlak van elke gel. Pas het aantal kankercellen of fibroblasten in de co-cultuur aan, afhankelijk van de experimentele condities, om gelcontractie uit te voeren. Incubeer de gels gedurende de nacht bij 37 °C zodat de kankercellen aan de collageengel kunnen hechten.

Koppel ze vervolgens los en creëer een zwevende cultuur in elke put. Gebruik in de zes-putsplaat een schuin gestelde 21 gauge naald of een kleine spatel om elke gel elke twee tot drie dagen van de rand van de put te scheiden. Vernieuw het medium in de putten met twee milliliters 3D co-kweekmedium.

Meet elke dag gedurende vijf dagen de grootte van elke gel. Raadpleeg ten slotte het tekstprotocol voor de analyse van collageengels. Nadat de collageengels vijf dagen lang bij 37 °C zijn gekweekt.

Stel de gekrompen gels bloot aan de lucht door ze op een gaasje te plaatsen. Maak voor nieuwe platen met zes putjes het gaasje van commercieel verkrijgbare celzeefjes die worden gebruikt voor flowcytometrie. Vul elk putje voorzichtig met 11 milliliters 3D co-culture.Medium.

Plaats de gels met een steriele lepel op het gaas en verwijder alle resterende medium van de gels onder deze conditie. De gels zijn ondergedompeld in het medium, terwijl het bovenste oppervlak van de gel is blootgesteld aan lucht. Definieer deze kweekconditie als de lucht-vloeistofinterface.

Deze co-culturemethode, die de tumor-micro-omgeving nabootst, is een nuttig instrument om de interacties tussen kankercellen en fibroblasten ingebed in collageengelgels te onderzoeken. A 5 49-cellen werden samen gekweekt op een collageengel waarin fibroblasten waren ingebed, en de laag A 5 49-cellen werd aan lucht blootgesteld door de gel op een gaasje in medium te plaatsen. Hier wordt een representatieve afbeelding getoond van de gel die op het gaasje in een well van een zes-wellplaat is geplaatst, gevolgd door histologische analyses met hematoxyline en eosine.

Kleuring van dwarsdoorsneden van een driedimensionaal gekweekte gel onthulde invasie van 5 49 cellen in de collageengel waarin longkanker-geassocieerde fibroblasten waren ingebed. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals genexpressie of knockdown, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de specifieke genfunctie bij de interactie tussen tumor en stroma.