Isolatie, Cultuur en onderhoud op lange termijn van de Primary mesencefale dopaminerge neuronen uit embryonale knaagdieren Brains

Het doel van deze procedure is om op efficiënte wijze primaire neuronen te isoleren en te kweken uit de ventrale middenhersenen van knaagdieren. Dit wordt bereikt door eerst de middenhersenen van knaagdierembryo's te disseceren. De tweede stap is het zorgvuldig isoleren van de ventrale middenhersenen.

Vervolgens moet het neurale weefsel worden gedissocieerd om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen. De laatste stap is om de primaire neuronen in een klein volume op dekglasplaatjes uit te platen, voordat de gehechte cellen later naar een 24-wells plaat worden overgebracht. Tot slot worden antilichamen en immunofluorescentiemicroscopie gebruikt om de dopaminerge neuronen binnen de cultuur te identificeren.

De dopaminerge neuronen in de middenhersenen zijn betrokken bij diverse functies, waaronder de controle van beweging en emotie bij cognitie en het beloningssysteem van de hersenen. Ze zijn ook geïmpliceerd bij neurologische en neuropsychiatrische aandoeningen, waaronder de ziekte van Parkinson, verslaving en schizofrenie. De methode voor het herstel van de ventrale middenhersenen.

Neuronale culturen kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de fysiologie en cellulaire eigenschappen van dopaminerge neuronen, evenals voor het begrijpen van de oorzaak van hun degeneratie tijdens het verloop van aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson. Bereid eerst de dekglasjes voor.

Kook ze in 70% ethanol gedurende ten minste 30 minuten om eventuele vetresten te verwijderen. Autocلافeer vervolgens de dekglasjes. Breng de dekglasjes over naar 24-wells platen en voeg aan elk een halve milliliter polyol all athene toe.

Laat de plaatjes een uur incuberen bij kamertemperatuur. Houd er rekening mee dat de houdbaarheid van de werkende polyol- of Athene-oplossing één maand is. Was de dekglasjes vervolgens drie keer met een halve milliliter water per wasbeurt.

Zonder alle drie de wasstappen zouden de gekweekte cellen geen 24 uur overleven. Bereid vervolgens de laminine-oplossing. Zorg ervoor dat u deze eerst langzaam op ijs ontdooit.

Los vervolgens de laminine op in koud D-M-E-M-F 12 en gebruik dit onmiddellijk. Voeg nu een halve milliliter vers bereide werkoplossing van laminine toe aan elke put en laat de platen een nacht incuberen bij 37 °C. Ten slotte polijst ik, bij het voorbereiden van de glazen pipetten, de uiteinden tot de helft van hun normale grootte.

Maak een abdominale incisie om de uterushoorns bloot te leggen en snijd de uterus met een pincet vrij. Breng de uterus over naar ijskoud HBSS in een schaal van 100 millimeter en begin de embryo's met een pincet te verwijderen. Breng de geïsoleerde embryo's over naar een nieuwe schaal met koud HBSS.

Bereid nu onder een dissectiemicroscoop de toegang tot deze locatie van het ventrale middenbrein voor bij een 10 x vergroting. Disseceer het mesencephalon en de cephalische boog door het brein bij de isthmus en de grensregio tussen het mesencephalon en het cephalon door te snijden met behulp van bioschaartjes of een pincet. Maak na het verwijderen van het volledige middenbrein een snede in het mediale dorsale middenbrein.

Verwijder de hersenvliezen met een pincet. Deze stap is cruciaal voor het succes van de neuronale kweek. Niet-neuronale cellen zullen onder de kweekcondities afsterven en naburige neuronen negatief beïnvloeden via signalering.

Vlak nu het middenhersenweefsel af tot een vlindervorm. Snijd met een steriel mesje ongeveer de helft van elke vleugel weg, zodat het ventrale deel van de middenhersenen overblijft. Breng het ventrale deel van de middenhersenen over in ijskoud HBSS in een conische buis van 15 milliliter.

Ga vervolgens over tot het dissekeren van het volgende embryo en herhaal dit proces voor zoveel mogelijk embryo's binnen een uur. Embryo's die langer dan een uur op ijs worden bewaard, vertonen een slechte celviabiliteit. Om een hoge viabiliteit van de dopaminerge neuronen te waarborgen, mag de tijd tussen de dissectie en het uitplaten één uur niet overschrijden.

Daarnaast is het verwijderen van de hersenvliezen cruciaal voor het overleven van de neuronen onder een stolp. Verwijder de HBSS uit de verzameling van het ventrale middenbrein. Voeg vervolgens een milliliter warme 0,05% trypsin A DTA toe, wat voldoende oplossing is voor 12 stukjes weefsel.

Incubeer het weefsel bij 37 °C gedurende vijf tot 10 minuten. Vervang onder de zuurkast de tripsine A DTA door 1 mL deaktivatie-medium. Schud voorzichtig om te mengen en verwijder vervolgens het deaktivatie-medium, maar laat voldoende medium achter zodat de gedissocieerde cellen niet worden weggegooid.

Was daarna de weefsels twee keer met compleet medium zonder de cellen te verliezen. Voeg nu één milliliter compleet medium toe. Tritureer vervolgens het weefsel met de vuurgepolijste pipet zonder bellen te vormen, totdat een suspensie van enkelvoudige cellen is verkregen.

Ongeveer acht tot 10 passages zouden voldoende moeten zijn. Centrifugeer na deze periode de cellen bij 400 Gs gedurende vijf minuten. Verwijder het medium en resuspendeer de cellen in één milliliter compleet medium.

Pipetteer de cellen tot vier keer om een suspensie te verkrijgen. Begin met het tellen en beoordelen van de gezondheid van de cellen in de suspensie. Gebruik hiervoor trypaanblauw-uitsluiting met een hemocytometer.

Pas nu de celsuspensie aan naar 1500 cellen per microliter. Breng vervolgens de gesteriliseerde dopjes van de microcentrifugebuisjes over naar 100 millimeter petrischalen. Plaats de voorbereide dekglasjes met een pincet op de dopjes.

Was de dekglasjes niet en probeer te voorkomen dat ze uitdrogen. Breng 100 µL suspensie aan op elk dekglasje. Deze enigszins ongebruikelijke methode zorgt voor een kweekviabiliteit van 90% en is een cruciale stap voor het succes.

Sluit vervolgens de Petrischaal en plaats deze een uur lang in de incubator. Na de incubatie worden de dekglasjes met het medium voorzichtig overgebracht naar 24-wells platen, waarbij elke well 400 µL volledig medium bevat dat is voorverwarmd tot 37 °C; incubeer de cellen vervolgens gedurende de nacht. De eerste paar uur zijn het meest kritiek voor de overleving van de cellen binnen 24 uur. Voeg voorzichtig een halve milliliter volledig medium toe aan elke well.

Om de twee weken. Vervang de helft van het medium. Als de cultuur geel wordt, kan de gedeeltelijke mediumverversing eerder worden uitgevoerd, maar de verversingen moeten nog steeds onregelmatig gebeuren.

Dopaminerge neuronen zullen onder deze omstandigheden meer dan zes weken overleven. Na twee weken cultuur laat immunohistochemie tegen tyrosinehydroxylase en neuronale markers zien dat 1% van de cellen dopaminerg is. Neuronale projecties verschijnen binnen twee uur na het uitplaten.

Aan het einde van de eerste dag in cultuur zijn axonen en dendrieten te onderscheiden. Uiteindelijk overleven de neuronen meer dan zes weken en vertonen ze een uitgebreide uitgroei na deze procedure. Andere methoden, zoals virale transductie, immunofluorescentie of elektrofysiologie, kunnen worden uitgevoerd om mechanistische vragen over dopaminerge neuronen te beantwoorden.