Name: Tracking muisbeenmerg Monocyten In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Leer monocytentrafficking visualiseren in het schedelbeenmerg van een levende muis met behulp van twee-fotonenmicroscopie. Deze methode onthult mobilisatiemechanismen in steady state en na chemotherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Anne Daron en Pierre Louis Loyher bedanken voor redactionele ondersteuning, het Plateforme Imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS) voor hulp bij de twee-foton microscoop en het dier faciliteit &quot;NAC&quot; en Camille BAUDESSON voor muizen fokken hulp. Het onderzoek leidde tot deze resultaten heeft de financiering van het zevende kaderprogramma van de Europese Gemeenschap ontvangen (FP7 / 2007-2013) onder subsidieovereenkomst n ° 304.810 - RAID&#39;s, en n ° 241440-Endostem, van INSERM aan de Université Pierre et Marie Curie &quot;Emergence &quot;, van la&quot; Ligue contre le cancer &quot;, van&quot; Association pour la Recherche sur le Cancer &quot;en van&quot; Agence Nationale de la Recherche &quot;Programma Emergence 2012 (ANR-EMMA-050). PH werd ondersteund door la &quot;Ligue contre le cancer&quot;.

OPMERKING: Alle experiment protocollen werden goedgekeurd door de Franse Dierproeven en ethische commissie en gevalideerd door de &quot;Service Protection et Santé Animales, Environnement&quot; met nummer A-75-2065. Steekproefomvang gekozen reproduceerbaarheid van de proeven te waarborgen, en volgens de 3R dieren ethische regelgeving. 1. Voorbereiding van de Muis <ol><li> Anesthesie <ol><li> Voor korte beeldvorming (minder dan 1 uur), verdoven de muis met een intraperitoneale injectie van 200 pl van een zoutoplossing met ketamine (100 mg / kg) en xylazine (10 mg / kg). </li><li> Alternatief, gedurende langere beeldvorming (maximaal 4 uur), verdoven de muis met een inhalatie van isofluraan 2.5% verdampt in een 70/30 mengsel van O2 / N2 O, via een aangepaste masker. </li><li> LET OP: Op deze manier zorgt voor meer stabiele bewusteloosheid en vermijdt seriële intraperitoneale injectie van drugs. </li&gt; <li> Zodra de muis wordt verdoofd, controleert bewusteloosheid door stimulatie van de voet pad met een kniptang. </li></ol></li><li> Vaatverkleuring / extra kleuring <ol><li> Voor vaatverkleuring: Injecteer intraveneus in de staartader, 200 ui Rhodamine-Dextran (2 MDa, 10 mg / ml in zoutoplossing buffer). </li><li> Voor neutrofiel kleuring: injecteer 2 ug Ly6G-PE (kloon 1A8) in 100 pl zoutoplossing intraveneus in de staartader. </li></ol></li><li> Immobilisatie <ol><li> Voor immobilisatie, gebruik dan een op maat gemaakte stereotactische houder aangepast aan de microscoop en de narcosegas inhalator. OPMERKING: De sterotactic houder is een metalen steun met twee metalen plaat beugels, een wordt vast en de andere verwijderbare en aanpasbaar, aan het hoofd van het dier vast te zetten. </li><li> Installeer het hoofd van de muis tussen de vasthoudplaten tot isolatie zorgen van de ademhaling bewegingen. Draai de oren tussen behoud van platen en ga naar het sk rekkenin. Controleer voor stabiliteit en ademhaling welzijn van het dier. </li></ol></li><li> Verwijder de hoofdhuid <ol><li> Zorgvuldig gebruik van ethanol 70% aan het haar van de hoofdhuid te bevochtigen met een steriele applicator, het vermijden van contact met de ogen. </li><li> Snijd de huid met een steriele schaar en tangen op de hoofdhuid van de achterlijke van de pariëtale bot volledig te verwijderen om de frontale bot. Weg te houden tot 3 mm van de ogen en oren om uitgebreide bloeden te voorkomen. Verwijder de losse bindweefsel die de schedel (periost). Spoel de resterende haren met warm PBS-doordrenkte papieren handdoek. </li></ol></li><li> Onderdompeling systeem opgezet <ol><li> Plak een rubberen ring van 18 mm diameter met chirurgische lijm direct op de schedel met een kleine naald om de distributie te beheersen. Lijm de gehele omtrek van de rubberen ring om lekkage te voorkomen (30 ui moet voldoende zijn). </li><li> Reinig de schedel onder de ring nog een laatste keer met PBS-doordrenkte papieren handdoek en voeg dan 37 ° C PBS voor een volledige onderdompeling van deschedel. Voeg een daling van 0,9% NaCl-oplossing of specifieke oogzalf op elk oog van de muis om droge ogen te voorkomen. Sleep de stereotactische houder onder de doelstelling. </li><li> Ongeveer positioneren het veld met behulp van de microscoop oculair door rechtstreekse toezending. </li></ol></li></ol> 2. Twee-foton Imaging Acquisition <ol><li> Gebruik een multifoton microscoop in combinatie met een Ti: Sapphire crystal laser, die 140fs pulsen van NIR licht geeft, selectief regelbaar van 680 tot 1080 nm, en een akoestisch-optische modulator voor laser power control. Gebruik een configuratie met 3 externe niet descanned detectoren (NDD) met een combinatie van 2 dichroïsche spiegels (565 nm en 690 nm), 565/610 en 500/550 banddoorlaatfilters (dat gelijktijdige opname van 3 fluorescerende kanalen inschakelen), en een 485 korte pass filter, met een plan apochromaat × 20 (NA = 1) water immersie objectief. </li><li> Zet de verwarming kamer om goede homeothermie van de ANAES toestaanthetized muis., LET OP: De temperatuur kan worden ingesteld 1 uur voor de beeldvorming sessie voor een betere stabiliteit. In ons geval is 32 ° C gekozen optimale lichaamstemperatuur van de verdoofde muizen (36-37 ° C) af en wordt gehandhaafd gedurende 4 uur. Deze temperatuur kan worden aangepast aan het gebruikte (digitale probe kan worden gebruikt om dit punt te controleren). Bovendien, de verwarmingskamer gebruikte donker / zwart en dekt een deel van het systeem (doelstellingen en gemotoriseerd plaat) externe licht te voorkomen. </li><li> Schakel het systeem <ol><li> Zet de Ti: Sapphire laser, dan is het hele microscoop systeem. Start de acquisitie software. Stel de laser golflengte tot 870 nm. Kies de juiste NDD voor opname. LET OP: In ons geval, tweede harmonische generatie (SHG) 19 en cyaan fluorescente eiwit (ECFP) worden gedetecteerd door de NDD na de 485 korte pass filter. ECFP wordt ook gedetecteerd door de NDD na 500/550 banddoorlaatfilter en rhodamine-dextran wordt gedetecteerd door thij NDD na de 565/610 bandfilter. </li></ol></li><li> Pas overname instellingen <ol><li> Gebruik de &quot;live-overname&quot; imaging bevel van de software en het gebruik van de microscoop directionele controle, past u de focus op een regio met ECFP en Rhodamine signaal. Stel het laservermogen aan de minimum beste signaal-ruisverhouding met minimale foto-schade vorderen. OPMERKING: De kracht instelling die wordt gebruikt is afhankelijk van de diepte van de regio van belang. Typisch de AOM-instellingen zijn ingesteld rond de 20%, wat een laservermogen dan de doelstelling rond 15 mW vertegenwoordigt. Het is beter om winst macht te vergroten op de PMT&#39;s voor elke NDD om foto-bleken en foto-schade te beperken. Typische overname instellingen zijn enkel scannen met een pixelverblijftijd van 1,58 microseconden, en een resolutie van 512 x 512 pixels met een 1,5 vergroting. </li></ol></li><li> Kies een regio van belang <ol><li> Zodra de opname parameters worden ingesteld, gebruik opnieuw de &quot;live&quot; overname commando,en enquête het weefsel tot een gewenste (x, y, z) veld worden gevolgd in real time te kiezen. OPMERKING: Typisch, kozen we voor een gebied met inbegrip van zowel vasculaire en parenchymatisch gebieden. </li><li> Registreer het veld met de &quot;positie&quot; programmatuur. LET OP: Dit commando onthoudt x, y, z-coördinaten van verschillende verafgelegen gebieden. </li><li> Selecteer en registreer extra velden van belang (maximaal 3) volgens dezelfde procedure. </li><li> Stel een 3D z-stack met de &quot;z-stack&quot; programmatuur op de eerste opgeslagen positie volgens het gewenste volume met de gekozen vergroting. Onthoud diepere positie, en dan de hoogste stand. Normaliseren laservermogen met de diepte. OPMERKING: Voor meerdere gelijktijdige beeldveld, verkrijgen we 5 segmenten gescheiden door 3 urn z-stappen voor elk veld tot een volume van 12 urn dikte te verkrijgen. Deze instellingen kunnen worden aangepast aan het type cel bestudeerd. </li></ol></li><li> Overname lancering <ol><li> Selecteer220; tijdreeksen &quot;software commando en kies de duur van de tijd interval en het aantal cycli. Begin time-lapse imaging volgens de time lapse en de duur vereist door het selecteren van de &quot;start experiment&quot; programmatuur. LET OP: In ons geval hebben we een volume van elke 30 sec verwerven tijdens 60 cycli vertegenwoordigt 30 min real time. Kleinere time lapse kan worden uitgevoerd om snel cel proefbaan in het bloedvat. In dit geval dunnere z-stack en niet meer dan 2 verschillende velden worden geregistreerd op hetzelfde moment. </li><li> Regelmatige controle van de set-up. <ol><li> Let altijd op het dier om ervoor te zorgen dat het onbewuste. LET OP: Het schudden van de snorharen of benen van het dier zijn indicatoren van opwekking. Indien de ademhaling van het dier schokkerig, kan de hoeveelheid isofluraan iets afneemt. Sterke weefsel drift tijdens acquisitie is een indicator van de muis revival. </li><li> Zorg ervoor dat het doel goed is ondergedompeld. Renew 37 ° C PBS between twee overnames (30 min). OPMERKING: Progressieve verdwijnen van het signaal tijdens de overname is de aanduiding van PBS lekkage. </li></ol></li></ol></li><li> Einde van de procedure <ol><li> Zodra de benodigde video&#39;s worden opgenomen, euthanaseren het dier door cervicale dislocatie snel voordat reanimatie. OPMERKING: wondgenezing leidt tot de vorming van een korst in 24 tot 48 uur die de mogelijkheid longitudinale beeldvorming voeren beperkt. </li></ol></li></ol> 3. Data Analysis <ol><li> Drift correctie <ol><li> Gebruik Imaris Bitplane software voor 3D-automatische tracking. </li><li> Open het 3D-beeld volgorde op Imaris. Selecteer &quot;spot&quot; commando, en genereert handmatig volgen (muisklik + shift) voor alle tijdstippen gedurende ten minste 4 verschillende ankerpunten zo mogelijk homogeen verdeeld in het veld. </li><li> Breng de drift correctie met behulp van &quot;juiste drift&quot; opdracht in het tabblad &quot;edit track&quot;. </li><li> Controleer voor tHij kwaliteit van de correctie in x, y en z name om artefact wankelen voorkomen. OPMERKING: Als de correctie niet bevredigend is, probeer dan andere ankerpunten of de video te sluiten van de analyse. </li></ol></li><li> Cell tracking <ol><li> Gebruik &quot;add new spots&quot; commando en selecteer &quot;spoor vlekken na verloop van tijd&quot; algoritme setting. Ga naar de volgende stap. </li><li> Solliciteer automatische cell tracking procedure, hetzij op de hele kanaal van belang het gebruik van &quot;bron kanaal&quot; commando. Set voorwerpen (dwz cellen) diameter 10 urn. Ga naar de volgende stap. OPMERKING: De keuze hangt af van het onderscheid tussen objecten en specificiteit van het gemeten signaal. Kortom, automatisch volgen van het gehele kanaal is alleen mogelijk als gedetecteerde signaal specifiek is voor het object of interest. Omdat zowel SHG en ECFP worden gedetecteerd door de NDD na 485 korte pass filter, zal volgen specifieker en efficiënter gebruik van de ECFP signaal opgenomen door de NDD na 5 zijn00/550 banddoorlaatfilters. Geclusterd of dichte verpakt voorwerpen zullen handmatige selectie van individuele objecten vergelijkbaar met stap 3.1.2 nodig. </li><li> Selecteer &quot;kwaliteit&quot; type filter, zet de drempel tot het volgen van niet-specifieke objecten uit te sluiten. Ga naar de volgende stap. </li><li> Kies &quot;Brownse Algorithm Motion&quot; met nauwkeurige parameters van &quot;Maximale afstand&quot; en &quot;Spleetgrootte&quot; tussen twee plekken. Valideren spoor generatie. </li><li> Zodra tracks automatisch worden berekend, selecteer &quot;Tijdsduur&quot; type filter, zet de drempel om tracks te elimineren korter dan 120 sec (die 4 keer punten). </li><li> Verplichte: Na het automatische volgen, controleren de kwaliteit van de tracks. <ol><li> Rol de tijdbalk om te controleren of de objecten volgen het spoor paden. Zo niet, gebruik maken van de mogelijkheden van het spoor punt correctie beschikbaar op het tabblad &quot;edit&quot;: Verwijder valse of onjuiste tracks met &quot;delete&quot; commando (schrappen een track point individueel met behulp van &quot;disconnect&quot; commando). Als pad van de track is discontinu, voeg ontbrekende tijdstippen (muisklik + shift), selecteert u alle punten op een bepaalde baan, en gebruik &quot;connect&quot; opdracht in het tabblad &quot;edit track&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Kwantificering parameters <ol><li> Selecteer het tabblad &quot;Statistiek&quot; in &quot;Preferences&quot; commando, kies de dynamische parameters die van belang in de lijst. Selecteer &quot;Exporteer alle statistieken naar bestand&quot; commando en sla het Excel-bestand gegenereerd. OPMERKING: Verscheidene dynamische parameters worden direct uit de software verkregen zoals trajectlengte, instantane snelheid, gemiddelde snelheid, en volgen rechtheid. Motiliteit coëfficiënt 6, 20 kan worden bepaald, maar is niet rechtstreeks door de software. </li><li> Voor elke cel, berekent het gemiddelde van de verplaatsingen voor elke tijdsperiode (AT) (voor een 30 sec time lapse film, zal AT zijn 30, 60, 90 sec, etc).Zet de gemiddelde kwadraat van de verplaatsing als een functie van de tijd interval. Verkrijgen motiliteit coëfficiënt door het berekenen van de helling van het lineaire gedeelte van de curve. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Ovchinnikov, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Gal4-dependent+transgenes+in+cells+of+the+mononuclear+phagocyte+system+labeled+with+enhanced+cyan+fluorescent+protein+using+Csf1r-Gal4VP16%2FUAS-ECFP+double-transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice.</a> J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).</li>
<li>Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+and+macrophages+regulate+immunity+through+dynamic+networks+of+survival+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Monocytes and macrophages regulate immunity through dynamic networks of survival and cell death.</a> J Innate Immun. 2, 204-215 (2010).</li>
<li>Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+monocytes+consist+of+two+principal+subsets+with+distinct+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties.</a> Immunity. 19, 71-82 (2003).</li>
<li>Robbins, C. S., Swirski, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiple+roles+of+monocyte+subsets+in+steady+state+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The multiple roles of monocyte subsets in steady state and inflammation.</a> Cell Mol Life Sci. 67, 2685-2693 (2010).</li>
<li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+mesenchymal+stem+and+progenitor+cells+induce+monocyte+emigration+in+response+to+circulating+toll-like+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bone marrow mesenchymal stem and progenitor cells induce monocyte emigration in response to circulating toll-like receptor ligands.</a> Immunity. 34, 590-601 (2011).</li>
<li>Jacquelin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1+reduces+Ly6Chigh-monocyte+motility+within+and+release+from+the+bone+marrow+after+chemotherapy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CX3CR1 reduces Ly6Chigh-monocyte motility within and release from the bone marrow after chemotherapy in mice.</a> Blood. 122, 674-683 (2013).</li>
<li>Swirski, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+splenic+reservoir+monocytes+and+their+deployment+to+inflammatory+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites.</a> Science. 325, 612-616 (2009).</li>
<li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+the+immune+system%3A+progress%2C+pitfalls+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li>
<li>Charo, I. F., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+roles+of+chemokines+and+chemokine+receptors+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation.</a> N Engl J Med. 354, 610-621 (2006).</li>
<li>Milo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+reveals+promiscuous+crosspresentation+of+blood-borne+antigens+to+naive+CD8%2B+T+cells+in+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging reveals promiscuous crosspresentation of blood-borne antigens to naive CD8+ T cells in the bone marrow.</a> 122, 193-208 (2013).</li>
<li>Cavanagh, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+bone+marrow-resident+memory+T+cells+by+circulating%2C+antigen-bearing+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation of bone marrow-resident memory T cells by circulating, antigen-bearing dendritic cells.</a> Nat Immunol. 6, 1029-1037 (2005).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+is+a+major+reservoir+and+site+of+recruitment+for+central+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells.</a> Immunity. 22, 259-270 (2005).</li>
<li>Travlos, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+structure%2C+function%2C+and+histology+of+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Normal structure, function, and histology of the bone marrow.</a> Toxicol Pathol. 34, 548-565 (2006).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels%3A+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> J Exp Med. 188, 465-474 (1998).</li>
<li>Rashidi, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+of+mouse+bone+marrow+reveals+differential+niche+engagement+by+quiescent+and+naturally+activated+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging of mouse bone marrow reveals differential niche engagement by quiescent and naturally activated hematopoietic stem cells.</a> Blood. , (2014).</li>
<li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435, 969-973 (2005).</li>
<li>Cariappa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perisinusoidal+B+cells+in+the+bone+marrow+participate+in+T-independent+responses+to+blood-borne+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes.</a> Immunity. 23, 397-407 (2005).</li>
<li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317, 1767-1770 (2007).</li>
<li>Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+and+extracellular+matrix+in+vivo+by+using+second-harmonic+generation+and+two-photon+excited+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 11014-11019 (2002).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+cell+motility+and+interaction+dynamics+imaged+by+two-photon+microscopy+in+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs.</a> Annu Rev Immunol. 26, 585-626 (2008).</li>
<li>Yost, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+neutrophil+extracellular+trap+%28NET%29+formation%3A+a+novel+innate+immune+deficiency+of+human+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Impaired neutrophil extracellular trap (NET) formation: a novel innate immune deficiency of human neonates.</a> Blood. 113, 6419-6427 (2009).</li>
<li>Devi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+reveals+a+new+leukocyte+recruitment+paradigm+in+the+glomerulus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus.</a> Nat Med. 19, 107-112 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De kritische punten in vivo beeldvorming methodologie stabiliteit van de focus, teneinde de duur van beeldvorming maximaliseren en het risico van bacteriële besmetting en ontsteking, die de dynamiek van de ontstekingscellen kan van invloed minimaliseren. Beeldvorming van de schedel beenmerg volgt deze doelstellingen als de operatie uitgevoerd om toegang tot het beenmerg krijgen is minimaal. Het gebruik van steriel materiaal en antiseptica is essentieel om het risico van infectie die storing kunnen veroor...

Het beenmerg speelt een centrale rol in hematopoëse en vertegenwoordigt het belangrijkste reservoir van monocyten die constitutief circuleren tussen het bloed en het medullaire parenchym, de pool van circulerende monocyten met een korte levensduur vernieuwen 2,3 en deelnemen aan de reconstitutie van de steady state weefsel-macrofagen en dendritische cellen 4. Tijdens ontsteking of na tijdelijke aplasie worden monocyten actief gemobiliseerd uit het beenmerg of de milt 5, 6, 7 en koloniseren ontstoken organen. Verschillende chemoattractant-assen zijn betrokken bij het proces van mobilisatie van myeloïde cellen uit het beenmerg 8, 5, 6,9. Voorbij het myeloïde compartiment is het beenmerg ook een belangrijke plaats voor T-lymfocyten priming 10 en een niche van immunologische herinnering 11,12. Dus, dit weefsel is centraal voor talrijke onderzoeken op het gebied van hematologie en immunologie. Onze kennis over de structurele organisatie van medullaire myeloïde cellen komt voornamelijk voort uit de analyse van histologische secties van gefixeerde weefsels 13. Deze statische weergave staat geen studie toe van de dynamische uitwisseling van cellen tussen de verschillende compartimenten van het beenmerg, wat de basis is van zijn functionele activiteit.
Intravitale beeldvorming vormt een belangrijke biologische input in de studie van celmobiliteit, celadhesie en cel-tot-cel interacties, die eerder alleen werden beschreven uit in vitro systemen. Technische uitdagingen voor goede intravitale beeldvorming omvatten de mogelijkheid om het weefsel van belang in een optisch punt van gezicht te bereiken, en om zijn isolatie te maximaliseren van fysiologische (ademhaling, spier- of peristaltiekcontracties) of mechanische driften (weefselverstoring en uitbreiding na chirurgie, en blootstelling aan microscoopobjectief evenals temperatuur- en vasculaire/oxygenatieverstoringen). Microscopische driften kunnen de mogelijkheid beperken om de focus langdurig te houden en kunnen artefacten introduceren in de kwantificering van celmotiliteit. Een alternatief, gevalideerd voor verschillende weefsels om deze technische moeilijkheden te verminderen, is om te werken op geëxplanteerd weefsel geïncubeerd in een gethermostateerde en geoxygeneerde medium; echter, volledige verstoring van de lymfatische en vasculaire circulatie kan problematisch zijn. Intravitale beeldvorming van het beenmerg van de schedel heeft verschillende voordelen met betrekking tot deze problemen. Ten eerste vereist het minimale chirurgische actie. Ten tweede maakt de dikte van het bot in dit gebied directe visualisatie van beenmergniches mogelijk zonder slijpwerking, waardoor fysiologische verstoringen worden verminderd. Het medullaire netwerk kan worden afgebeeld in de parasagittale regio van het bot; echter zijn de sinusoïden meer zichtbaar in het fronto-parietale gebied waar de botmatrix dunner is12,14.
Intravitale beeldvorming is gebaseerd op de beschikbaarheid van de meest nauwkeurige fluorescente reporter die de populatie van belang markeert. In vitro markering van gezuiverde celpopulatie vóór adoptieve overdracht leidde tot belangrijke karakterisering van hematopoëtische stamcel niches 15 of beenmerg-endotheel microdomeinen die tumoraanplanting bevorderen 16, en leverde verschillende fundamentele inzichten op belangrijke concepten in immunologie 17. Deze benadering vereist echter meestal honderdduizenden cellen om een kans te krijgen om ze achteraf in vivo te detecteren. Dit kan worden verklaard door de hoge sterfteratio na kleuring, de verdunning in het hele lichaam en de verandering in de activeringstoestand, wat kan leiden tot bevooroordeelde homing. Endogeen markeren van transgenische muizensystemen overwint deze beperkingen enorm en heeft het mogelijk gemaakt om het gedrag van endogene osteoblast 8, megakaryocyten 18 of myeloide-lijn subsets 6 te beeldvormen. Niettemin moet men voorzichtig zijn bij het overwegen van de specificiteit van de fluorescente reporter onder de bestudeerde subset.
De Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP, genoemd MacBlue muis 1, is een waardevol transgeen systeem om medullaire monocyten te bestuderen met real time beeldvorming 6. Intraveneuze injectie van hoog moleculair gewicht rhodamine-dextran onderscheidt het medullaire parenchym van het vasculaire sinusoïdennetwerk van het beenmerg. Met behulp van deze benadering is het mogelijk om het monocytengedrag in de verschillende medullaire compartimenten te volgen in een specifiek fysiologisch pathologisch context van belang. Bovendien stellen we een aanvullende strategie voor om monocytendynamiek te vergelijken met die van neutrofielen door in vivo markering met behulp van een specifiek antilichaam.

<table><tbody><tr><td>Ketamin</td><td>Merial</td><td></td><td>100 mg/ml, anesthetisch middel</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Bayer HealthCare</td><td></td><td>10 mg/ml, anesthetisch middel</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td></td><td>2,5%, anesthetisch middel</td></tr><tr><td>O2/NO2</td><td></td><td></td><td>70/30 mengsel, anesthetisch middel</td></tr><tr><td>Rhodamin-Dextran</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>2 MDa, 10 mg/ml, vasculaire kleuring</td></tr><tr><td>Ly6G-PE</td><td>Becton-Dickinson</td><td></td><td>clone 1A8, neutrofielen kleuring</td></tr><tr><td>Stereotactische houder</td><td>Zelf gemaakt</td><td></td><td>chirurgie</td></tr><tr><td>Ethanol 70%</td><td></td><td></td><td>chirurgie</td></tr><tr><td>Steriele schaar en pincet</td><td></td><td></td><td>chirurgie</td></tr><tr><td>Rubberen ring</td><td></td><td></td><td>18 mm diameter, chirurgie</td></tr><tr><td>Glubran 2</td><td>Queryo Medical</td><td></td><td>Chirurgische lijm, rubberen ring bevestiging</td></tr><tr><td>Kleine naalden</td><td>Terumo</td><td></td><td>chirurgie</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710 NLO multifotonmicroscoop&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Microscoop</td></tr><tr><td>Ti:Saffier kristal laser&nbsp;</td><td>Coherent Chameleon Ultra</td><td></td><td>140 fsec pulsen van NIR licht</td></tr><tr><td>Zen 2010</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Acquisitie Software</td></tr><tr><td>Imaris Bitplane&nbsp;</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Analyse Software, 3D automatische tracking</td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>D. Dutscher</td><td></td><td>chirurgie</td></tr><tr><td>Thermostaatkamer</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>intravitale beeldvorming</td></tr></tbody></table>

tracking muisbeenmerg monocyten<em&gt; in vivo</em

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real-time multifoton-beeldvorming biedt een geweldige gelegenheid om celverkeer en cel-tot-cel interacties in hun fysiologische 3-dimensionale omgeving te bestuderen. Biologische activiteiten van immuuncellen zijn voornamelijk gebaseerd op hun beweeglijkheid. Bloedmonocyten hebben een korte halfwaardetijd in de bloedbaan; ze ontstaan in het beenmerg en worden er voortdurend uit vrijgegeven. In inflammatoire omstandigheden wordt dit proces versterkt, wat leidt tot monocytose in het bloed en vervolgens tot infiltratie van de perifere inflammatoire weefsels. Het identificeren van de biomechanische gebeurtenissen die het verkeer van monocyten van het beenmerg naar het vasculaire netwerk controleren, is een belangrijke stap om de fysiologisch-pathologische relevantie van monocyten te begrijpen. We voerden in vivo time-lapse beeldvorming uit door middel van twee-foton microscopie van het schedelbeenmerg van de Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) muis. De MacBlue muis drukt de fluorescente verslaggevers verbeterd cyaan fluorescent eiwit (ECFP) uit onder controle van een myeloid-specifiek promotor 1, in combinatie met markering van het vasculaire netwerk. We beschrijven hoe deze benadering het mogelijk maakt om individuele medullaire monocyten in real time te volgen om verder het migratiegedrag binnen het beenmergparenchym en de vasculaire structuur te kwantificeren, evenals cel-tot-cel interacties. Deze benadering biedt nieuwe inzichten in de biologie van de beenmergmonocytensubsets en maakt het mogelijk om verder te onderzoeken hoe deze cellen in specifieke pathologische omstandigheden kunnen worden beïnvloed.

Muis schedel structuur biedt een goede gelegenheid om het beenmerg fysiologie te bestuderen door intravitale beeldvorming. Het bot dun rond de voorkant-parietale gebied, is het mogelijk om toegang tot medullaire niches slijtvaste van het bot krijgen. Figuur 1 een breed 2D gebied van de schedel van een MacBlue transgene muis. Het bot matrix bestaat hoofdzakelijk uit collageen I gemakkelijk door SHG 19. Injectie van rhodamine-dextran kleurt het vasculaire netwerk van het beenmerg en maakt de id...

Monocyten zijn belangrijke regulatoren van aangeboren immuniteit en spelen een cruciale rol bij de vernieuwing van het perifere mononucleaire fagocytische systeem en in geval van ontsteking. Dit manuscript beschrijft de procedure van realtime beeldvorming van het muiscalvaria beenmerg om het mechanisme van monocytmobilisatie te bestuderen.

Tracking muisbeenmerg Monocyten<em&gt; In Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Het algemene doel van deze procedure is om de migratie van monocyten in het schedelbeenmerg van een levende muis te visualiseren met behulp van tweefoton-imaging. Eerst wordt de muis onder narcose gebracht en geïnjecteerd met een oplossing van rhodamine dextran om de vaten te labelen. De muis wordt vervolgens in een op maat gemaakte metalen houder geplaatst en de hoofdhuid van de achterzijde van het pariëtaalbeen tot aan het frontaalbeen wordt verwijderd.Een rubberen ring wordt vervolgens met chirurgische lijm direct op de schedel aangebracht en de reservoirs worden gevuld met vloeibare zoutoplossing. Ten slotte wordt multifotonmicroscopie gebruikt om de ontwikkeling van fluorescente cellen in het tijdverloop binnen het schedelbeenmerg te volgen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van een kernvraag in het veld van de immunohematologie, zoals het mechanisme van monocytenmobilisatie in rusttoestand of na chemotherapie.Deze methode kan dus inzicht bieden in het gedrag van modulaire monocyten. Afhankelijk van de specificiteit van de gebruikte fluorescente reporter kan deze ook worden toegepast om andere subpopulaties van beenmergcellen te bestuderen. Het volgende protocol maakt gebruik van een multifotonmicroscoop gekoppeld aan een titanium-saffierkristallaser en een OP-modulator voor de controle van het laservermogen.Om gelijktijdige registratie van drie fluorescentiekanalen mogelijk te maken, moet de configuratie drie externe non-DS scan-detectoren of nds bevatten met een combinatie van dichroïsche spiegels van 565 nanometer en 690 nanometer, banddoorlaatfilters van 565, 610 nanometer en 500 550 nanometer, en een short-pass filter van 485 nanometer. Let erop dat in deze opstelling tweede harmonische generatie (SHG) en cyan fluorescent protein (CFP) worden gedetecteerd door de NDD na het short-pass filter van 485 nanometer. CFP wordt eveneens gedetecteerd door de NDD.Na het 500 550 banddoorlaatfilter wordt Rhodamine Dextran gedetecteerd door de NDD. Stel, enkele uren voor de beeldvorming, de verwarmingskamer in op 32 °C na het 565 610 banddoorlaatfilter. Deze temperatuur houdt de muis gedurende het hele experiment op een optimale lichaamstemperatuur.Let op dat de hier gebruikte verwarmingskamer donker is en de objectieven en de gemotoriseerde plaat van het systeem afdekt. Dit helpt om externe lichtcontaminatie te voorkomen. Om het systeem in te schakelen, zet u eerst de titanium saffierlaser aan en schakelt u daarna de rest van het microscoopsysteem in.Start de acquisitiesoftware. In dit geval wordt Zeiss Zen-software gebruikt. Stel het golflengtebereik van de laser in op 870 nanometer.Select vervolgens de juiste NDD voor de opname. De muis die in dit experiment wordt gebruikt is een transgene muis genaamd Mac blue, die cyaan fluorescent proteïne tot expressie brengt onder controle van de CSF one receptor promoter. De aanbevolen anesthesiemethode hangt af van de duur van de beeldvorming; raadpleeg daarom het bijbehorende document voor meer details.Een lastig aspect van deze procedure is de injectie in de T-ader, aangezien het vrij eenvoudig is om de ader te missen. Als dit gebeurt, voer dan in plaats daarvan een retro-orbitale injectie uit. Zodra de muis is geanestheseerd, gebruik dan een pincet om het bewustzijnsverlies te controleren door de voetzool te stimuleren.Volgende.Om de vaten te kleuren, injecteer 200 µL rhodamine dextran in de staartvenen, of voor neutrofielenkleuring: injecteer 100 µL zoutoplossing met LY6G PE. Plaats na de injectie de kop van de muis tussen de klemplaten van een op maat gemaakte stereotactische houder die is aangepast aan de microscoop en de anesthesiegas-inhalator.Dit zorgt ervoor dat ademhalingsbewegingen de beeldvorming niet beïnvloeden. Draai de klemplaten aan om de huid tussen de oren en de kop te spannen. Controleer de stabiliteit.Door de kop voorzichtig met een pincet aan te drukken, mag de kop niet bewegen. Controleer vervolgens of het dier normaal ademt. Om de muis voor twee-fotonen-imaging voor te bereiden, brengt u met een vinger 70% ethanol aan op de haren van de hoofdhuid, waarbij u er zorg voor draagt dat de ogen worden vermeden.Plaats vervolgens een afdekdoek met een uitsparing om de hoofdhuid bloot te leggen. Snijd daarna met steriele scharen en tangetjes de huid door en verwijder de hoofdhuid volledig, vanaf de achterzijde van het pariëtale bot tot aan het frontale bot. Houd een afstand van drie millimeter aan vanaf de ogen en oren om uitgebreide bloedingen te voorkomen.Verwijder het losse bindweefsel of periosteum dat de schedel bedekt. Was vervolgens het resterende haar weg met een in warme PBS gedrenkte papieren handdoek, zoals hier wordt getoond. Breng met een naald met een klein kaliber chirurgische lijm aan op de gehele periferie van een rubberen ring met een diameter van 10 millimeter.Plaats vervolgens de rubberen ring direct op de schedel met een andere in PBS gedrenkte papieren handdoek. Maak de binnenkant van de ring voor de laatste keer schoon. Voeg warme PBS toe om de schedel volledig onder te dompelen.Plaats vervolgens de stereotactische houder onder het objectief. Zodra de muis op zijn plaats is, gebruikt u het oculair van de microscoop met directe transmissie om de schedel te bekijken en deze ruwweg in het gezichtsveld van de microscoop te positioneren. Klik in de linkerbovenhoek van het venster van de imagingsoftware op live acquisitie.Een live-scan van het weefsel verschijnt in het midden van het venster door gebruik te maken van de directionele microscoopbesturing in de software. Lokaliseer een gebied met CFP- en rod domine-signaal om de focus af te stellen. Stel vervolgens het laservermogen in op het minimum om de beste signaal-ruisverhouding te verkrijgen met minimale fotobeschadiging.Klik vervolgens in de software op het kanaaltabblad en verhoog de gain-instelling van de PMT's voor elke NDD om fotobleken en fotobeschadiging te verminderen. Klik daarna op het betreffende tabblad om de acquisitie-instellingen in te stellen op enkelvoudig scannen met een pixelverblijftijd van 1,58 microseconden en een resolutie van 512 bij 512 pixels met een vergroting van 1,5. Zodra de opnameparameters zijn ingesteld, klikt u op het commando voor live-acquisitie en inspecteert u het weefsel om een gewenst x, y, Z-veld te kiezen dat in real-time moet worden gevolgd. In dit geval wordt een veld gekozen dat zowel vasculaire als parenchymale gebieden bevat.Sla vervolgens de X, Y, Z-coördinaten op van het veld dat in het tabblad 'positions' wordt getoond door op 'add' te klikken. Herhaal dit proces voor maximaal drie extra velden om alle relevante coördinaten te registreren.De coördinaten verschijnen op het tabblad 'positions' naast de instructies van de software. Om een Z-stack van drie beelden vast te leggen, klikt u in het tabblad 'positions' in de software op 'move to' om naar de eerste geregistreerde positie te gaan en selecteert u 'Zack' in het vak linksboven in de software. Hiermee wordt het tabblad 'Z stack' geopend, wordt naar de hoogste Z-positie gegaan en wordt de laserintensiteit dienovereenkomstig aangeppast.Klik op 'set last' en ga vervolgens naar de diepste positie. Stel het laservermogen in. Klik daarna op 'set first'.De dikte van de te analyseren stack moet worden aangepast aan de snelheid van de bestudeerde cel. Snelbewegende cellen zullen het beeldveld snel verlaten, waardoor het nodig is om een dikkere stack vast te leggen. Voor langzaam bewegende cellen volstaat een minder dikke stack.Selecteer in het vak linksboven het commando voor tijdreeksen om het tabblad tijdreeksen te openen. Stel het aantal cycli en het tijdsinterval in. In dit voorbeeld wordt elke 30 seconden één volume verkregen gedurende 60 cycli.Dit komt overeen met 30 minuten in reële tijd. Om te beginnen met time-lapse imaging in het hoofdwindow, selecteert u 'start experiment'; blijf het dier gedurende de procedure monitoren om er zeker van te zijn dat het bewusteloos is. Controleer daarnaast of het objectief correct is ondergedompeld.Nadat de sequentie is vastgelegd, wordt met een pipet warme PBS toegevoegd. Begin vervolgens aan een tweede acquisitie van 30 minuten. Indien er tijdens de acquisitie een progressieve afname van het signaal wordt waargenomen, dient er te worden gecontroleerd op PBS-lekkage.Zodra alle benodigde video's zijn opgenomen, werd de data-analyse uitgevoerd zoals beschreven in het bijbehorende document om de fysiologie van het beenmerg te bestuderen via intravitale beeldvorming; een Mac blue transgene muis werd geïnjecteerd met 2 miljoen Dalton rod domine dextran en afgebeeld met twee-foton laser scanning microscopie. Zoals in deze video wordt aangetoond, is in de resulterende micrografie de vatenstructuur die is gekleurd met 2 miljoen Dalton rod domine dextran in rood weergegeven; bot, getoond in blauw, is gevisualiseerd via second harmonic generation. ECFP-positieve monocyten, getoond in cyaan, bevinden zich in parenchymale niches, die zichtbaar zijn als donkere gebieden tussen de vaten en het bot, en binnen de vaten.Om de trajecten van individuele cellen te berekenen, werd time-lapse imaging uitgevoerd. Deze video toont het migratiegedrag van parenchymale monocyten. Het ECFP-signaal is cyaan en de migratiepaden voor elke rode stip verschijnen in het groen.Hier kan het migratiegedrag van vasculaire monocyten worden waargenomen. Deze gegevens kunnen worden gebruikt om zowel de gemiddelde snelheid als de gemiddelde kwadratische verplaatsing van de cellen te berekenen. Let op dat de vasculaire monocyten zowel een toegenomen verplaatsing als een toegenomen snelheid vertonen in vergelijking met parenchymale monocyten.Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u monocyten uit het beenmerg van muizen in vivo kunt volgen met behulp van twee foto-imagingtechnieken na hun ontwikkeling. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de immunologie om celmigratie en interactie in het beenmerg te verkennen, wat een zeer belangrijke locatie is voor hematopoiese, maar ook voor andere fundamentele functies zoals antigeenpriming en immunologisch geheugen.

tracking-mouse-bone-marrow-monocytes-in-vivo

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video describes a detailed protocol to isolate fresh whole bone marrow from the mouse's hind limbs to investigate whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia.

Bone Marrow Harvest from Mouse Hind Limb

Dit protocol beschrijft een procedure voor seriële bemonstering van femur beenmerg (BM) zonder dat muizen hiervoor worden geofferd. Deze procedure vergemakkelijkt longitudinale studies van de samenstelling van beenmerg van muizen in de loop van de tijd en biedt seriële toegang tot cellen binnen het beenmerg voor ex vivo en transplantatiestudies.

Femorale beenmergaspiratie in levende muizen

Combinatorische 5 fluorescerende eiwitten markering van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen maakt in vivo klonale volgen via confocale en twee-foton microscopie, het verstrekken van inzicht in het beenmerg hematopoietische architectuur tijdens de regeneratie. Deze methode maakt het mogelijk niet-invasieve lot in kaart brengen van spectraal-gecodeerde HSPCs-afgeleide cellen in intacte weefsels voor langere perioden na de transplantatie.

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

De aard van de interactie tussen hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPCs) en beenmerg nissen wordt slecht begrepen. Aangepaste hardware wijzigingen en een meerstaps overname protocol maken het gebruik van twee-foton en confocale microscopie beeld ex vivo gemerkte HSPCs geadopteerd in beenmerg gebieden volgen interacties en beweging.

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

We beschrijven een protocol om het gedrag van neutrofielen en monocyten in mesenteriale aderen onder stabiele en inflammatoire omstandigheden te monitoren met behulp van intravitale confocale microscopie op geanesthetiseerde muizen.

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

Het protocol beschrijft een nieuw model voor een muis dijbeenraamkamer dat kan worden gebruikt om de beweging van cellen in het beenmerg in vivo te volgen. Intravitale multifotonfluorescentiemicroscopie wordt gebruikt om drie componenten van het dijbeenmerg (vaatstelsel, collageenmatrix en neutrofielen) in de tijd te beeldvormen.

Dijbeen Window Chamber Model voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Tracking in het Muizen Bone Marrow

Hier presenteren we een protocol voor de in vivo bepaling van naïeve CD4 T cel (T-cel) activering, proliferatie en differentiatie van de Th1 geïnduceerd door GM-CSF beenmerg (BM)-afgeleide dendritische cellen (DC's). Dit protocol beschrijft Daarnaast BM en T-cel isolatie, DC generatie en DC en T-cel adoptief overdracht.

Een muismodel In Vivo maatregel naïef CD4 T-cel activatie, proliferatie en differentiatie van de Th1 geïnduceerd door het beenmerg-afgeleide dendritische cellen

Hier presenteren we een protocol voor het verwerken van vers beenmerg (BM) geïsoleerd van muis of mens voor High-dimensionale massa Cytometry (Cytometry door time-of-Flight, CyTOF) analyse van neutrofiele-Lineage cellen.

Voorbereiding van het hele beenmerg voor massa Cytometry analyse van neutrofiele-Lineage cellen

Hier presenteren we een protocol om de ultrastructuur van de megakaryocyten in situ te analyseren met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Murine beenmerg wordt verzameld, gefixeerd, ingebed in epoxyhars en gesneden in ultradunne secties. Na contrastkleuring wordt het beenmerg waargenomen onder een TEM-microscoop bij 120 kV.

In situ Exploratie van Murine Megakaryopoiesis met behulp van Transmissie ElektronenMicroscopie

Dit protocol beschrijft de intrafemorale injectie van enkele hematopoëtische of leukemische stamcellen, waaronder gen-bewerkte cellen, in muizenxenotransplantaatmodellen, die niet alleen de snelle en veilige transplantatie van cellen mogelijk maken, maar ook seriële analyses van het beenmerg.

Vereenvoudigde intrafemorale injecties met levende muizen maken continue beenmerganalyse mogelijk

Dit protocol beschrijft een niet-enzymatische en eenvoudige methode voor het isoleren van 7-9 dagen oude neonatale beenmergcellen van muizen en het genereren van gedifferentieerde macrofagen met behulp van een supernatans van L929-cellen als bron van granulocytkoloniestimulerende factor (M-CSF). De van beenmerg afgeleide macrofagen werden verder geanalyseerd op oppervlakteantigenen F4/80, CD206, CD11b en functionele competentie.

Neonatale beenmergisolatie bij muizen en bereiding van van beenmerg afgeleide macrofagen

Leer monocytentrafficking visualiseren in het schedelbeenmerg van een levende muis met behulp van twee-fotonenmicroscopie. Deze methode onthult mobilisatiemechanismen in steady state en na chemotherapie.

Tracking muisbeenmerg Monocyten

Meer video's verkennen