Tracking muisbeenmerg Monocyten In Vivo

Het algemene doel van deze procedure is om monocytenverkeer in het botmerg van de schedel van een levende muis te visualiseren met behulp van tweefotonbeeldvorming. Eerst wordt de muis verdoofd en geïnjecteerd met een oplossing van rot, rumine dextran om het vaatstelsel te labelen. De muis wordt vervolgens in een aangepaste metalen steun geplaatst en de huid van de achterkant van het schedeldak tot het voorhoofdsbeen wordt verwijderd.

Vervolgens wordt een rubberen ring rechtstreeks op de schedel aangebracht met chirurgische lijm en worden de reservoirs gevuld met vloeibaar zoutoplossing. Ten slotte wordt multifotonmicroscopie gebruikt om de ontwikkeling van fluorescente cellen in de tijd binnen het botmerg van de schedel te volgen. Dit kan helpen bij het beantwoorden van een sleutelvraag op het gebied van immunohematologie, zoals het mechanisme van monocytenmobilisatie in een stabiele toestand of na chemotherapie.

Deze methode kan dus inzicht geven in het gedrag van modulaire monocyten. Het kan ook worden toegepast om andere beenmergcellensubpopulaties te bestuderen, afhankelijk van de specificiteit van de gebruikte fluorescente reporter. Het volgende protocol maakt gebruik van een multifotonmicroscoop gekoppeld aan een titaniumsaffierkristallaser en een op modulator voor laservermogenscontrole.

Om gelijktijdige opname van drie fluorescente kanalen mogelijk te maken, moet de configuratie drie externe niet-DS-scandetectoren of nds omvatten met een combinatie van 565 nanometer en 690 nanometer dichroische spiegels 565, 610 nanometer en 500 550 nanometer bandpassfilters en een 485 short pass-filter. Merk op dat in deze setup tweede harmonische generatie of SHG en cyaan fluorescente proteïne of CFP worden gedetecteerd door de NDD na de 485 short pass-filter. CFP wordt ook door de NDD gedetecteerd.

Na de 500 550 bandpass-filter en Rod Domine Dextran wordt gedetecteerd door de NDD. Na de 565 610 bandpass-filter, enkele uren vóór het beeldvormen, stelt u de verwarmingskamer in op 32 graden Celsius. Deze temperatuur zal de muis gedurende het hele experiment op een optimale lichaamstemperatuur houden.

Merk op dat de verwarmingskamer die hier wordt gebruikt donker is en de objectieven en gemotoriseerde plaat van het systeem bedekt. Dit helpt om externe lichtbesmetting te voorkomen. Om het systeem in te schakelen, schakelt u eerst de titaniumsaffierlaser in en vervolgens de rest van het microscoopsysteem.

Start de acquisitiesoftware. Hier wordt Zeiss Zen-software gebruikt. Stel het lasergolflengtebereik in op 870 nanometer.

Selecteer vervolgens de geschikte NDD voor opname. De muis die in dit experiment wordt gebruikt, is een transgene muis genaamd Mac blue, die cyaan fluorescente proteïne tot expressie brengt onder controle van de CSF one receptor-promotor. De aanbevolen anesthesiemethode hangt af van de lengte van de beeldvorming, dus het is het beste om het bijbehorende document te raadplegen voor details.

Een moeilijk aspect van deze procedure is de injectie in de T-vene, omdat het vrij gemakkelijk is om de ader te missen. Als dit gebeurt, voer dan een retroorbitale injectie uit. Zodra de muis verdoofd is, gebruikt u een pincet om te controleren op bewusteloosheid door de voetzool te stimuleren.Volgende.

Om het vaatstelsel te kleuren, injecteert u 200 microliters rod domine dextran in de staarvene, of voor neutrofielenkleuring. Injecteer 100 microliters zoutoplossing die LY zes GPE bevat. Na de injectie plaatst u het hoofd van de muis tussen de houderplaten van een op maat gemaakte stereotactische houder die is aangepast aan de microscoop en aan de anesthesiegasinhalator.

Dit zorgt ervoor dat ademhalingsbewegingen de beeldvorming niet beïnvloeden. Draai de houderplaten vast om de huid tussen de oren en het hoofd te strekken. Controleer op stabiliteit.

Door voorzichtig met het hoofd te drukken met behulp van een pincet, mag het hoofd niet bewegen. Zorg er vervolgens voor dat het dier normaal ademt. Om de muis voor te bereiden op tweefotonbeeldvorming, gebruikt u een vinger om 70%ethanol op het haar van de hoofdhuid aan te brengen, waarbij u voorzichtig de ogen vermijdt.

Plaats vervolgens een doek met een uitsparing om de hoofdhuid bloot te leggen. Vervolgens snijdt u met behulp van steriele schaar en pincet de huid door en verwijdert u de hoofdhuid volledig van de achterkant van het schedeldak tot het voorhoofdsbeen. Houd een afstand van drie millimeter aan van ogen en oren om uitgebreid bloeden te voorkomen.

Verwijder het losse bindweefsel of periost dat de schedel bedekt. Vervolgens gebruikt u een warm PBS-gedrenkt papieren handdoek om de resterende haren te wassen zoals hier wordt getoond. Gebruik een naald met een kleine diameter om chirurgische lijm aan te brengen op de gehele rand van een rubberen ring met een diameter van 10 millimeter.

Plaats vervolgens de rubberen ring direct op de schedel met een andere met PBS gedrenkte papieren handdoek. Maak het binnenste van de ring nog een keer schoon. Voeg warm PBS toe om de schedel volledig te onderdompelen.

Plaats vervolgens de stereotactische houder onder het objectief. Zodra de muis op zijn plaats ligt, gebruikt u het microscoopoculaire met directe transmissie om de schedel te bekijken en deze grof in het microscoopbeeldveld te plaatsen. Klik in het bovenste linkergedeelte van het venster van de beeldvormingssoftware op live-acquisitie.

Er verschijnt een livescan van het weefsel in het midden van het venster met behulp van de microscooprichtingsbesturing in de software. Lokaliseer een gebied met CFP en rod domine-signaal om de focus aan te passen. Stel vervolgens de laservermogen in op het minimum om de beste signaal-ruisverhouding te verkrijgen met minimale fotobeschadiging.

Klik vervolgens in de software op het kanaaltab en verhoog de versterkingskracht op de PMT's voor elke NDD om fotobleking en fotobeschadiging te verminderen, klik vervolgens op het juiste tabblad om de acquisitie-instellingen in te stellen op enkelvoudige scannen met een pixeldwelltijd van 1,58 microseconden en een resolutie van 512 bij 5