Het analyseren van de effecten van stromale cellen op de recrutering van leukocyten van Flow

Het algemene doel van deze procedure is om te onderzoeken hoe cellen die in het weefsel resident zijn, de capaciteit van vasculaire endotheelcellen beïnvloeden om de rekrutering van leukocyten tijdens inflammatie te ondersteunen. Dit wordt bereikt door eerst coculturen van endotheelcellen met mesenchymale stamcellen vast te stellen met behulp van een van twee in vitro vasculaire modellen: het microslide-model en het filtermodel. Deze culturen worden vervolgens behandeld met cytokine voorafgaand aan de flow-assay.

Het stroomsysteem voor adhesie wordt vervolgens stapsgewijs geassembleerd, waarbij aanpassingen worden gedaan afhankelijk van het gebruikte modelsysteem. De laatste stap bestaat uit het perfunderen van leukocyten over de endotheelcellen en het observeren van hun rekrutering vanuit de stroom, alsmede hun daaropvolgende gedrag. Uiteindelijk hebben deze multicellulaire stroomgebaseerde adhesie-assays aangetoond dat crosstalk tussen mesenchymale stamcellen en endotheelcellen de rekrutering van neutrofielen tijdens inflammatie onderdrukt.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van leukocytenmigratie, zoals: hoe beïnvloeden weefselresidente cellen, bijvoorbeeld mesenchymale stamcellen, dit proces? Verandert dit bij ziekten zoals chronische ontsteking of kanker? Kunnen we deze kennis gebruiken om de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën te ondersteunen? Begin met het opzetten van cocultures van endotheelcellen met mesenchymale stamcellen met behulp van het microslide-model of het filtermodel, zoals beschreven in het tekstprotocol voor het assembleren van het flowsysteem.

Zet eerst de verwarming aan en stel deze in op 37 °C. Bevestig vervolgens een spuit van 20 mL zonder zuiger, evenals een spuit van 5 mL, aan een driewegkraan. Meet daarna een lang stuk slang van 2,4 mm af en knip dit op de geschatte afstand tussen de klep en de driewegkraan.

Snijd een stukje buisje van 1,3 millimeter met een lengte van 8 tot 10 millimeter af en plaats dit in één uiteinde van het dikke buisje. Bevestig de zijde van het dikke buisje aan de driewegkraan en verbind het uiteinde van het dunne buisje met een poort van de elektronische drieweg-microklep om het wasreservoir te vormen.

Bevestig vervolgens de kraan aan de perspexkamer met micropore-tape. Maak daarna een stukje dikke en dunne slang van zes tot acht millimeter lang en steek de dunne slang in één uiteinde van de dikke slang. Bevestig het uiteinde van de dikke slang aan een spuit van twee milliliter waarvan de zuiger is verwijderd.

Sluit nu het uiteinde van de dunne slang van de spuit van twee milliliter aan op een poort van de elektronische microklep om het monsterreservoir te vormen. Meet vervolgens een lang stuk dunne slang af en knip dit op de afstand tussen de microklep en het midden van de microscooptafel. Voor het model met microscoopglaasje bevestigt u een stuk dikke slang van acht tot 10 millimeter aan het uiteinde van de dunne slang.

Plaats vervolgens een L-vormige connector aan het uiteinde van de dikke slang. Deze wordt verbonden met de micro-slide of het filtermodel. Bevestig een stuk portex blauwe manometer-verbindingsslang van 8 tot 10 millimeter aan het uiteinde van de dunne slang.

Plaats vervolgens het uiteinde van de dunne slang op het microventiel. De slang dient nu als gemeenschappelijke uitgang voor de reservoirs voor de wasvloeistof en het monster. Vul de reservoirs met fosfaatgebufferde zoutoplossing die bovine serumalbumine bevat.

Prime de slang met afgebeelde PBSA door PBSA te laten stromen om eventuele luchtbellen te verwijderen, en bevestig vervolgens de manometer-slang aan een glazen spuit van 50 milliliter. Voor het micro-slide-model wordt er alleen een stuk dikke slang van 10 tot 12 millimeter aan het uiteinde van de manometer-slang bevestigd die naar de glazen spuit leidt. Plaats een L-vormige connector op het uiteinde van de dikke slang.

Bereid de spuit voor door deze te vullen met 10 milliliters PBSA. Keer de spuit om zodat het uiteinde dat verbonden is met de slang naar boven wijst en druk alle luchtbellen uit voordat u de spuit opnieuw vult met vijf milliliters PBSA. Plaats de glazen spuit tot slot in een spuitenpomp voor infusie en extractie.

Stel de vulingssnelheid en de diameter van de glazen spuit in om de micro-slides voor de flow klaar te maken. Plaats de micro-slide op de tafel van een inverted fasecontrastmicroscoop. Draai de driewegkraan zodat PBSA door de toevoerbuis kan stromen.

Sluit de L-vormige connector aan op de inlaatpoort van een microslide-kanaal. Plaats vervolgens de L-vormige connector van de spuitenpomp in de uitlaatpoort van het kanaal. Maak alle PBSA die op de microslide is gedruppeld schoon.

Als alternatief knipt u voor het filtermodel eerst een stuk parafilm op dezelfde maat als het glazen dekglas met behulp van een metalen mal. Snijd vervolgens met een metalen mal een gleuf van 20 bij 4 millimeter uit de parafilm om het stroomkanaal te creëren. Gebruik de parafilm-pakking om het stroomkanaal op het glazen dekglas te markeren.

Lijn de randen van het filter uit met de zes putjes op het dekglas. Zorg ervoor dat het filter de markeringen van het stroomkanaal bedekt. Snijd het filter vervolgens voorzichtig uit met een scalpel type 10.

Bedek vervolgens het filter voorzichtig met een paraform-pakking, waarbij u erop let dat de sleuf van het stroomkanaal zich in het midden van het filter bevindt. Gebruik een stukje schoon vloeipapier om eventuele luchtbellen weg te drukken. Plaats nu het dekglas in de uitsparing van de bodemplaat van de Perspex-stroomkamer.

Plaats de bovenste perspex plaat over de bovenkant van de pakking en schroef de platen aan elkaar. Draai de driewegkraan zodat de PBSA-wasbuffer door het ventiel kan stromen. Sluit vervolgens de manometerslang aan op de inlaatpoort van de bovenste perspex plaat.

laat PBSA door het stroomkanaal lopen om eventuele luchtbellen te laten passeren. Sluit vervolgens de manometerslang van de spuitpomp aan op de uitlaatpoort van de perspexplaat. Veeg alle PBSA weg die op de bovenplaat van de kamer is gedruppeld.

Plaats ten slotte de kamer op de tafel van een geïnverteerde fasecontrastmicroscoop en stel de focus in om de endotheelcellen boven de filters te visualiseren om leukocyten over de endotheelcellen te perfunderen. Stel de spuitenpomp in op vullen en druk op run zodra de focus is ingesteld. Om de monolaag van endotheelcellen te visualiseren, voegt u twee milliliters gezuiverde neutrofielen toe aan het monsterreservoir en laat u dit twee minuten opwarmen.

Was daarna het endotheel gedurende twee minuten met PBSA. Zet de klep open om neutrofielen over het endotheel te perfunderen. Dien de bolus neutrofielen gedurende vier minuten toe.

Sluit de klep en perfuseer PBSA vanuit het spoelreservoir voor de rest van het experiment. Zorg bij het uitvoeren van het experiment dat er op geen enkel moment tijdens de assay luchtbellen passeren, aangezien dit de monolaag van endotheelcellen zal verstoren en zal leiden tot loslating van adherente neutrofielen. Registreer de rekrutering van neutrofielen, ofwel tijdens de neutrofielenstroom of na de perfusie, met behulp van software voor digitale beeldacquisitie.

Identificeer het centrum van het kanaal door het objectief naar de rand van het kanaal bij de inlaatpoort te bewegen en het midden van de poort te bepalen. Maak alle digitale opnames van ten minste vijf tot 10 velden in het centrum van het stroomkanaal of tijdens de neutrofielenstroom. Neem gedurende één minuut elke 10 seconden beelden van één enkel veld, verplaats u vervolgens langs het kanaal en neem een ander veld gedurende één minuut op.

Herhaal dit proces gedurende de duur van de bolus om de postperfusie vast te leggen. Maak een opname van tien seconden van vijf tot 10 velden in het midden van het stroomkanaal om het gedrag van de leukocyten te beoordelen. Neem elke seconde beelden op binnen het interval van tien seconden.

Dit biedt voldoende tijd voor de vangst uit de stroom en om het gedrag van adherente neutrofielen te analyseren. Neem gedurende vijf minuten een enkel gezichtsveld op dat minstens 10 getransmigreerde neutrofielen bevat, waarbij elke 30 seconden beelden worden gemaakt. Dit kan worden gebruikt om de snelheid van de gemigreerde cellen te berekenen; neem vervolgens een andere reeks beelden op van velden van tien seconden.

Dit geeft de neutrofielen de tijd om door de endotheliale monolaag te migreren. Stop tot slot de spuitpomp en verwijder de uitlaatleiding en vervolgens de inlaatleiding; demonteer de stroomkamer en spoel het monsterreservoir met PBSA. Herhaal dit voor volgende filters en micro-slidekanalen voordat u overgaat tot de analyse van de rekrutering en het gedrag van leukocyten, zoals beschreven in het tekstprotocol. In het micro-slidemodel zorgde cytokine-stimulatie met tumornecrosefactor alfa voor een significante, dosisafhankelijke toename van de adhesie van neutrofielen aan het endotheel.

Bovendien werd een TNF alpha-dosisafhankelijke afname waargenomen in het percentage neutrofielen dat over het endotheelioppervlak rolde. Dit vertaalde zich in een dosisafhankelijke toename van het percentage neutrofielen dat door de endotheliale monolaag migreerde en dus een transendotheliale migratie onderging. Vergelijkbare resultaten werden waargenomen met de filtergebaseerde flow-assay.

Bijvoorbeeld verhoogde stimulatie met TNF alpha de adhesie van neutrofielen op een dosisafhankelijke wijze. Co-cultuur van endotheelcellen met mesenchymale stamcellen uit het beenmerg verminderde de adhesie van neutrofielen significant in vergelijking met endotheelcellen. Alleen gecultiveerd zoals verwacht voor het microslide-model.

Opnieuw werden vergelijkbare effecten waargenomen wanneer het filtergebaseerde model werd gebruikt, waarbij minder adhesie werd gezien bij de co-cultuur in vergelijking met de monocultuur. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u kunt onderzoeken hoe stromale cellen communiceren met endotheelcellen om de rekrutering van leukocyten tijdens inflammatie te beïnvloeden.