Name: Eiwitzuivering Techniek dat Detectie van sumoylation en Ubiquitinering van Budding gist kinetochoor Eiwitten Ndc10 en Ndc80 Maakt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Leer een eiwitzuiveringsmethode voor het detecteren van sumoylatie en ubiquitinering van kinetochore-eiwitten Ndc10 en Ndc80 in Saccharomyces cerevisiae. Deze techniek maakt gedetailleerde analyse van post-translatiemodificaties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dr. Oliver Kerscher voor ondersteuning en advies en leden van het Basrai-laboratorium voor hun ondersteuning en opmerkingen over het artikel. Dit werk werd ondersteund door het Intramurale Onderzoeksprogramma van de National Institutes of Health.

1. Groei van gistcellen <ol><li> Inoculeer gistcellen in 30 ml YPD (tabel 1) in een kolf. Incubeer bij 30 ° C geïncubeerd onder schudden. </li><li> Verdun de cellen tot een optische dichtheid van 0,2 bij 600 nm (OD 600 = 0,2) in 50 ml YPD en incubeer bij 30 ° C onder schudden. </li><li> Groeien de cultuur een optische dichtheid van 1,0 bij 600 nm (OD 600 = 1,0). </li><li> Centrifugeer cellen gedurende 5 minuten bij 2.000 xg en de supernatant weggegooid. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 40 ml steriel water en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 2000 xg om de cellen te wassen. Verwijder het supernatant en bewaar de celpellet bij -20 ° C. </li></ol> 2. Winning van Proteins <ol><li> Resuspendeer cellen in 0,5 ml ijskoude buffer guanidine (tabel 1) voor pull-down assay gebruik van Ni-NTA superflow korrels of buffer A (tabel 1) voor immunoprecipitatie. Blijf buizen op ijs te allen tijde. </li><li> Transfer naar 2 ml schroefdop buis. </li><li> Voeg hetzelfde volume van glazen kralen (Table of Materials). </li><li> Bead-winnen van de cellen in een mini bead beater (Table of Materials) gedurende 2 min bij kamertemperatuur en plaats op ijs gedurende 2-3 minuten. Herhaal dit drie maal. </li><li> Vortex op hoge snelheid bij 4 ° C gedurende 30-60 min. Controleer de cellen door visualisatie onder de microscoop dat de cellen zijn gelyseerd. Opmerking: gelyseerde cellen worden weergegeven als donkere geesten en het gebrek aan een grens of gedefinieerde vorm. Optimaal ten minste 80% van de cellen worden gelyseerd. </li><li> Prik een gat in de bodem van de buis met behulp van een punaise en plaats in een verzameling 15 ml conische buis (schroefdop moet los). </li><li> Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 1 min naar het lysaat te verzamelen. </li><li> Breng het lysaat naar een microcentrifuge buis. </li><li> Centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C om de geëxtraheerde eiwitten te verzamelen. </li><li> Meet de concentratie van de geëxtraheerde eiwitten met het eiwit ASSAy kit (Table of Materials) en normaliseren alle extracten dezelfde hoeveelheid eiwit. Breng het totale volume met geschikte buffer 1 ml. Opmerking: Ongeveer 5 mg totaal eiwit wordt verkregen uit 50 OD 600 cellen. </li><li> Opslaan 50 pl (250 ug eiwit wanneer de totale proteïne geëxtraheerd uit stap 2,10 is 5 mg) als geheel celextract (WCE). Voeg 50 ul van 2 x Laemmli monsterbuffer (Tabel 1) en incubeer bij 100 ° C in een verwarmingsblok gedurende 3-5 min. Belasting 10 pi van elk monster in een SDS-PAGE gel voor Western Blot analyse (hoofdstuk 5: Western blot analyse). </li></ol> 3. Zuivering van HF-Smt3 Conjugaten <ol><li> Het verkrijgen van de Ni-NTA superflow kralen (Table of Materials) die nodig zijn voor de experimenten (100 pi kralen per monster) door de lage snelheid te centrifugeren (800-1,500 xg) gedurende 1 min. Verwijder het supernatant. </li><li> Was kralen 5x met 1 ml PBS (tabel of Materials): Omkeren top-over-onderkant totdat de kralen worden gesuspendeerd, het verzamelen van kralen door lage snelheid centrifugeren, en verwijder het supernatant. </li><li> Suspendeer kralen in 1 ml van guanidine buffer (Tabel 1) en aliquot ze in het aantal buizen overeenkomt met monsters te verwerken. Verzamel parels door lage snelheid centrifugeren, en verwijder het supernatant. Meng de kralen goed door het omkeren van de top-over bodem. Opmerking: Mix kralen goed door omkeren top-over bodem. </li><li> Voor elk monster, voeg 950 ul van de resterende WCE (uit stap 2,11: extractie van eiwitten) aan 100 ui Ni-NTA superflow beads. </li><li> Incubeer op een schudapparaat bij 4 ° C gedurende ten minste 4 uur of &#39;s nachts. </li><li> Centrifugeer bij 800-1,500 xg gedurende 1 min bij 4 ° C. </li><li> Spaar 50 ul als supernatant (SUP). Voeg 50 ul van 2 x Laemmli monsterbuffer en incuberen bij 100 ° C in een verwarmingsblok gedurende 3-5 min. Belasting 10 pi van elk monster in een SDS-PAGE gel voor Western Blot analyse (hoofdstuk 5: Western blot analtion). </li><li> Was parels eenmaal met 1 ml van guanidine buffer gedurende 5-10 minuten op een schudplatform. </li><li> Was 5x kralen met 1 ml breken buffer (Tabel 1) gedurende 5-10 minuten op een schudplatform. </li><li> Resuspendeer kralen in 90 pl 2 x Laemmli monsterbuffer. </li><li> Voeg 10 ul van 1 M imidazool. Opmerking: Imidazool helpt de His-gemerkt eiwit uit de Ni-NTA-parels dissociëren vanwege concurrerende wisselwerking tussen imidazool en de kralen. </li><li> Incubeer bij 100 ° C in een verwarmingsblok gedurende 3-5 min. </li><li> Vortex, centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 30 sec. Breng het supernatant naar een nieuwe buis. </li><li> Load 10-20 ul van elk monster in een SDS-PAGE gel voor Western Blot analyse (hoofdstuk 5: Western blot analyse). Noot: 10-20 pl overeen met 0,5-1,0 mg input als 5 mg WCE gebruikt. </li></ol> 4. Immunoprecipitatie van de Myc-tagged eiwitten kinetochoor <ol><li> Verkrijgen van anti-c-Myc agarose gel een affiniteittibody (Table of Materials) die nodig zijn voor de experimenten (25 ul van hars per monster) door de lage snelheid te centrifugeren (800-1,500 xg). Verwijder het supernatant. </li><li> Was de hars 5x met 1 ml buffer A: Omkeren top-over-bottom totdat de hars wordt gesuspendeerd, het verzamelen van hars door lage snelheid centrifugeren, en verwijder het supernatant. </li><li> Suspendeer hars in 1 ml buffer A en aliquot ze in het aantal buizen overeenkomt met monsters te verwerken. Verzamel hars door lage snelheid centrifugeren, en verwijder het supernatant. Opmerking: Meng de hars goed door het omkeren van de top-over-bodem. </li><li> Voeg 950 pi van het resterende WCE (uit stap 2,11: extractie van eiwitten) tot 25 gl hars. </li><li> Incubeer op een schudapparaat bij 4 ° C overnacht. </li><li> Centrifugeer bij 800-1,500 xg gedurende 1 min bij 4 ° C. </li><li> Spaar 50 ul als supernatant (SUP). Voeg 50 ul van 2 x Laemmli monsterbuffer en incuberen bij 100 ° C in een verwarmingsblok gedurende 3-5 min. Ziead 10 ul van elk monster in een SDS-PAGE gel voor Western Blot analyse (hoofdstuk 5: Western blot analyse). </li><li> Was de hars 5x met 1 ml buffer A: Omkeren top-over-bottom totdat de hars wordt gesuspendeerd, het verzamelen van hars door lage snelheid centrifugeren, en verwijder het supernatant. </li><li> Resuspendeer de hars in 100 pl SUMEB monsterbuffer (Tabel 1). Opmerking: SUMEB sample buffer bevat 8 M ureum en 1% SDS (sterke denaturerende voorwaarde). </li><li> Incubeer bij 100 ° C in een verwarmingsblok gedurende 3-5 min. </li><li> Vortex, centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 30 sec. Breng het supernatant naar een nieuwe buis. </li><li> Load 10-20 ul van elk monster in een SDS-PAGE gel voor Western Blot analyse (hoofdstuk 5: Western blot analyse). Noot: 10-20 pl overeen met 0,5-1,0 mg input als 5 mg WCE gebruikt. </li></ol> 5. Western-blotanalyse <ol><li> Laad de eiwitextracten op 4-12% Bis-Tris gels (Table of Materials) en perform elektroforese bij 120 V gedurende 90 min (Hardlopen buffer: Table of Materials). </li><li> Breng de eiwitten van gel naar een nitrocellulosemembraan (Table of Materials) met een overbrenginrichting bij 30 V gedurende 90 min (transfer buffer: Table of Materials). </li><li> Blokkeer het membraan in 5% melk / TBST 1x (Tabel 1) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Incubeer het membraan met primair antilichaam (Table of Materials) in 5% melk / TBST 1x overnacht bij 4 ° C. Voor primaire antilichamen gebruikt een verdunning van 1: 1000 (anti-Flag en anti-Ub-antilichamen) of 1: 5000 (anti-Myc-antilichaam). </li><li> Was 3x membraan gedurende 10 minuten elk met 1x TBST. </li><li> Incubeer het membraan met secundair antilichaam (Table of Materials) in 5% melk / TBST 1x 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Met een 1: 5000 verdunning van secundaire antilichamen. </li><li> Was 3x membraan gedurende 10 minuten elk met 1x TBST. </li><li> Incubeer membraan met ECL working oplossing (Table of Materials) gedurende 5 min. </li><li> Expose het membraan naar blauw gevoelige X-Ray film (Table of Materials) en de ontwikkeling van het gebruik van een automatische ontwikkelaar (Table of Materials). </li></ol>

<ol><li>Johnson, P. R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-1%3A+Ubiquitin+gains+weight%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SUMO-1: Ubiquitin gains weight.</a> Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).</li>
<li>Hewawasam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psh1+is+an+E3+ubiquitin+ligase+that+targets+the+centromeric+histone+variant+Cse4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4.</a> Mol Cell. 40, 444-454 (2010).</li>
<li>Ranjitkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+E3+ubiquitin+ligase+prevents+ectopic+localization+of+the+centromeric+histone+H3+variant+via+the+centromere+targeting+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain.</a> Mol Cell. 40, 455-464 (2010).</li>
<li>Au, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+the+N+terminus+of+budding+yeast+histone+H3+variant+Cse4+in+ubiquitin-mediated+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis.</a> Genetics. 194, 513-518 (2013).</li>
<li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mub1%2FUbr2+ubiquitin+ligase+complex+regulates+the+conserved+Dsn1+kinetochore+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein.</a> PLoS Genet. 9, e1003216(2013).</li>
<li>Biggins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+protein+kinase+Ipl1+regulates+microtubule+binding+to+kinetochores+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast.</a> Genes Dev. 13, 532-544 (1999).</li>
<li>Cheeseman, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+the+Aurora+kinase+Ipl1p%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p.</a> Cell. 111, 163-172 (2002).</li>
<li>Liu, D., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+kinetochore-microtubule+attachments+by+Aurora+B+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase.</a> Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).</li>
<li>Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumoylation+of+the+budding+yeast+kinetochore+protein+Ndc10+is+required+for+Ndc10+spindle+localization+and+regulation+of+anaphase+spindle+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation.</a> J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).</li>
<li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum%2Fnuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaphase-promoting+complex%2Fcyclosome+controls+HEC1+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability.</a> Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).</li>
<li>Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIZ1%2FSIZ2+control+of+chromosome+transmission+fidelity+is+mediated+by+the+sumoylation+of+topoisomerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II.</a> Genetics. 172, 783-794 (2006).</li>
<li>Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibition+in+wild-type+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Biotechniques. 42, 158(2007).</li>
<li>Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+microtubule+interaction+during+S+phase+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).</li>
<li>Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+assembly%3A+if+you+build+it%2C+they+will+come%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetochore assembly: if you build it, they will come.</a> Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Epitoopaanhangsels zoals HA, Myc, vlag, GST en worden veel gebruikt voor biochemische analyse van eiwitten. Constructie van stammen met HF-Smt3 en Myc-tagged kinetochore eiwitten, zoals Ndc10 en Ndc80, vergemakkelijkt de detectie van PTMs zoals sumoylation en ubiquitinering. HF-Smt3 afbreken assay maakt de detectie van sumoylated kinetochore eiwitten, Ndc10 en Ndc80 (figuur 1). De affiniteit zuivering protocol en western blot analyse met behulp van anti-Flag antilichaam te stellen de specificiteit van d...

Ubiquitination en sumoylation laat de vervoeging van ubiquitine en Kleine Ubiquitine-achtige modifier (SUMO; Smt3 in S. cerevisiae 1) tot een doelwit eiwit, respectievelijk. PTMs van kinetochore eiwitten invloed op hun cellulair niveau en eiwit-eiwit interacties tijdens de verschillende fasen van de celcyclus trouw chromosoom segregatie te garanderen. Zo zijn cellulaire niveaus van Cse4 / CENP-A en buitenste kinetochoor eiwit Dsn1 geregeld door ubiquitine gemedieerde proteolyse te zorgen genoomstabiliteit 2-5. Destabilisatie van onjuiste kinetochoor-microtubule bijlagen vereist de IPL1 / Aurora B kinase, die Dam1 en Ndc80 complexen die rechtstreeks interageren met microtubules 6-8 fosforyleert. Ondanks de identificatie van meer dan zeventig kinetochore eiwitten, zijn er weinig studies die de wijzigingen van deze eiwitten met PTM&#39;s, bijvoorbeeld ubiquitine en SUMO onderzoeken. Een belangrijke beperking is de mogelijkheid om de PTM bewarens tijdens de zuivering en het gebrek aan aangepaste antilichamen voor detectie van PTMs zoals sumoylation, fosforylering, methylering, en anderen. Karakterisering van sumoylated kinetochoor eiwitten Ndc10, Cep3, Bir1 en Ndc80 gebruikt een aangepaste antilichaam 9. Daarnaast is Ndc10 geïmpliceerd als een substraat voor ubiquitinering 10. Human Hec1 (Ndc80 in S. cerevisiae) wordt ook substraat voor ubiquitinering, gereguleerd door APC / C-hCdh1 E3 ligase 11. Daarom Ndc10 en Ndc80 zijn goede kandidaten voor de optimalisatie van het protocol bij zowel sumoylation en ubiquitinering te detecteren in S. cerevisiae. Om de identificatie van sumoylation faciliteren, we geconstrueerd stammen die HF-Smt3 en Myc-gelabeld Ndc10 of Ndc80 uiten. Het gebruik van epitooplabels (HF: His6-vlag) minimaliseert de achtergrond door cross-reactiviteit die vaak wordt waargenomen bij polyklonaal serum opgewekt tegen een kandidaat eiwit. We bedachten een protocol affiniteitzuiveren HF-Smt3 conjugaten en vervolgens gebruikt commerciële anti-Flag en anti-Myc antilichamen om de aanwezigheid van sumolyated Ndc10 en Ndc80 in het gezuiverde preparaat Smt3 detecteren. Voor ubiquitination, we bedacht een aangepaste immunoprecipitatie protocol dat ubiquitinatie van de Myc-gelabelde kinetochoor eiwitten bewaart en uitgevoerd western blot analyse met commerciële anti-Ub antilichaam aan ubiquitinering van Ndc10 en Ndc80 detecteren.

<table><tbody><tr><td>Glass beads</td><td>BioSpec Products</td><td>11079105</td><td>0.5 mm diameter</td></tr><tr><td>Mini beadbeater</td><td>BioSpec Products</td><td>#693</td><td>8 cell disrupter</td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8215</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7470</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>Primary antibody, dilution 1:1,000</td></tr><tr><td>c-Myc antibody (A-14)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-789</td><td>Primary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>Purified mouse antibody monoclonal 9E10</td><td>Covance</td><td>MMS-150P</td><td>Primary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody</td><td>Covance</td><td>MMS-258R</td><td>Primary antibody, dilution 1:1,000</td></tr><tr><td>ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA934V</td><td>Secondary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA931V</td><td>Secondary antibody, dilution 1:5,000</td></tr><tr><td>DC protein assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>Novex</td><td>LC2001</td><td>0.45 mm pore size</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Novex</td><td>NP0321BOX</td><td>1.0 mm, 10 well</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Running Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0002</td><td>20x</td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer</td><td>Novex</td><td>NP0006-1</td><td>20x</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34078</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS pH7.4</td><td>GIBCO</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Blue sensitive X-Ray film</td><td>Dbio</td><td>DBOF30003</td><td></td></tr><tr><td>Automatic developer</td><td>Kodak</td><td>M35AX-OMAT</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td>50 mg</td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2619</td><td>25 mg</td></tr></tbody></table>

eiwitzuivering techniek dat detectie van sumoylation en ubiquitinering van budding gist kinetochoor eiwitten ndc10 en ndc80 maakt

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translationele modificaties (PTM), zoals fosforylering, methylering, acetylering, ubiquitinatie en sumoylation, regelen de cellulaire functie van verschillende proteïnen. PTMs van kinetochore eiwitten die associëren met centromere DNA bemiddelen trouw chromosoom segregatie naar genoom stabiliteit te handhaven. Biochemische benaderingen zoals massaspectrometrie en Western blot-analyse worden meestal gebruikt voor de identificatie van PTMs. Hier wordt een eiwitzuivering werkwijze beschreven die de detectie van zowel sumoylation en ubiquitinering van het kinetochore eiwitten, Ndc10 en Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae toelaat. Een stam die uitdrukt polyhistidine-Flag-gelabeld Smt3 (HF-Smt3) en Myc-gelabeld Ndc10 of Ndc80 werd gebouwd en gebruikt voor onze studies. Voor detectie van sumoylation, we bedacht een protocol om affiniteit te zuiveren His-tag sumoylated eiwitten met behulp van nikkel kralen en gebruikt western blot analyse met anti-Myc antilichaam aan sumoylated Ndc10 een detecterennd Ndc80. Voor detectie van ubiquitinatie, ontwierpen we een protocol voor immunoprecipitatie van Myc-tagged eiwitten en gebruikt western blot-analyse met anti-Ub-antilichaam aan te tonen dat Ndc10 en Ndc80 worden ubiquitinated. Onze resultaten tonen dat epitoop-gelabeld eiwit van belang in de His-vlag hebben Smt3 stam vergemakkelijkt de detectie van meerdere PTMs. Toekomstige studies moeten toelaten benutting van deze techniek eiwit interacties die afhankelijk zijn van een specifieke PTM identificeren en te karakteriseren.

Om sumoylation van kinetochore eiwitten Ndc80 en Ndc10 detecteren stammen met HF-Smt3 en Myc-gelabeld kinetochoor eiwitten (Ndc80 of Ndc10) werden geconstrueerd (Tabel 2), zoals eerder beschreven 9,12. HF-Smt3 conjugaten werden affiniteit gezuiverd onder toepassing van Ni-NTA korrels. Western blot analyse van gezuiverde HF-Smt3 met anti-Flag-antilichaam liet detectie van sumoylated vormen van SUMO substraten die in de controlestam zonder HF-Smt3 (Figuur 1A en 1B,</str...

Dit manuscript beschrijft de detectie van sumoylation en ubiquitinering van kinetochoor eiwitten, Ndc10 en Ndc80, in de gist Saccharomyces cerevisiae.

Eiwitzuivering Techniek dat Detectie van sumoylation en Ubiquitinering van Budding gist kinetochoor Eiwitten Ndc10 en Ndc80 Maakt

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren van sumoylatie en ubiquitineren van de kinetische kernproteïnen NDC 10 en NDC 80 van budding yeast. Dit wordt bereikt door eerst gistcellen te oogsten die hiss flag-getagde SMT3 en Myc-getagde NDC 10 of NDC 80 tot expressie brengen, en vervolgens proteïne-extracten van deze cellen te maken. De tweede stap is het zuiveren van hiss flag-getagde SMT3-conjugaten voor de detectie van sumoylatie, of het immunoprecipiteren van Myc-getagde kinetische kernproteïnen voor de detectie van ubiquitineren.Vervolgens wordt summatie of ubiquitinitie gedetecteerd via western blot-analyse. Uiteindelijk bevestigt de aanwezigheid van een ladderpatroon voor NDC 10 en NDC 80 dat deze eiwitten gesimuleerd en geubiquitineerd zijn. De beschreven methode voor eiwitzuivering maakt de detectie mogelijk van zowel simulatie als ubiquitinitie van de connico-eiwitten NDC 10 en NDC 80 in de buddinggist sacro.Mijn cci. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de stam die we hebben gecreëerd twee epitopen bevat, één op het testeiwit en een andere die detectie van simulatie mogelijk maakt. Het gebruik van deze tags vermindert de achtergrond door kruisreactiviteit, die vaak wordt waargenomen bij het gebruik van polyklonaal serum.De demonstratie van deze procedure zal worden uitgevoerd door Canero Uni, een research fellow in mijn laboratorium. Eiwitten van belang zullen worden geëxtraheerd uit gistcelpellets die eerder zijn voorbereid en bewaard bij minus 20 graden Celsius. Resuspendeer de cellen in 0,5 milliliters ijskoude buffer.Gebruik guine-buffer als het extract bedoeld is voor een pull-down assay met nikkelnitril, triacetatzuur of nikkel-NTA superflow-beads. Gebruik buffer A als het extract bedoeld is voor immunoprecipitatie. Houd de buisjes te allen tijde op ijs.Overbreng de celsuspensies naar twee milliliter. Draai de schroefdoppen op elke buis. Voeg een volume glasparels toe dat gelijk is aan het volume van de celsuspensie.Behandel de cellen in een mini-beadbeater gedurende twee minuten bij kamertemperatuur en plaats de buizen vervolgens twee tot drie minuten op ijs. Herhaal het beadbeaten en het koelen op ijs drie keer. Vortex op hoge snelheid bij 4 °C gedurende 30 tot 60 minuten.Controleer de cellen door middel van visualisatie onder de microscoop om te bevestigen dat de cellen zijn gelyseerd. Gelyseerde cellen verschijnen als donkere schimmen en missen een grens of een gedefinieerde vorm. Optimaal zouden ten minste 80% van de cellen gelyseerd moeten zijn.Gebruik vervolgens een punaise om een gaatje in de bodem van de buis te prikken. Draai de schroefdop er losjes op en plaats de buis in een conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer gedurende één minuut bij 1000 ×g.Om het lysaat te verzamelen, brengt u het lysaat over in een microcentrifugebuisje en centrifugeert u dit 30 minuten bij 15.000 ×g bij vier graden Celsius om de geëxtraheerde eiwitten te verzamelen. Nadat de concentratie van de geëxtraheerde eiwitten is gemeten met een eiwitassay-kit, normaliseert u alle extracten zodat elk extract dezelfde hoeveelheid eiwit bevat. Breng het totale volume aan met de passende buffer aan tot één milliliter.Ongeveer vijf milligram totaal eiwit wordt verkregen uit 50 OD 600 cellen. Bewaar 50 µL van het geëxtraheerde eiwit als het hele-cel-extract. De resterende 950 µL eiwitextract zal later worden gebruikt voor eiwitzuivering of immunoprecipitatie van MT-getagde eiwitten.Voeg 50 µL van tweevoudige Laemmli-monsterbuffer toe aan de 50 µL cellysaat. Incubeer de monsters drie tot vijf minuten bij 100 °C in een heatblock voordat ze via western blot worden geanalyseerd. Begin deze procedure met het voorbereiden van de nikkel-NTA Superflow-beads die nodig zijn voor de zuivering.Verkrijg de benodigde hoeveelheid beads door middel van centrifugatie bij lage snelheid gedurende één minuut. Verwijder het supernatant en was de beads met PBS. Voeg één milliliter PBS toe en keer de buis om tot de beads opnieuw zijn gesuspendeerd.Verzamel de kraaltjes door middel van centrifugatie op lage snelheid en verwijder het supernatant. Was de kraaltjes op deze manier in totaal vijf keer. Suspendeer de kraaltjes in één milliliter guine-buffer en verdeel deze in het aantal buisjes dat overeenkomt met de te verwerken monsters.Verzamel de kraaltjes door middel van centrifugatie bij een lage snelheid en verwijder het supernatant van elk monster. Voeg 950 µL van het eerder bereide totale celextract toe aan de 100 µL kraaltjes.Incubeer op een schudplatform bij 4 °C gedurende ten minste vier uur of overnacht. Centrifugeer bij 800 tot 1500 ×g gedurende één minuut bij 4 °C. Bewaar 50 µL van het supernatant.Voeg 50 µL twee x laly monsterbuffer toe aan dit supernatant en incubeer dit gedurende drie tot vijf minuten bij 100 °C in een heatblock. 10 µL van elk monster zal later via western blot worden geanalyseerd. Was de nikkel-NTA superflow-beads eenmaal met 1 mL guine-buffer gedurende vijf tot 10 minuten op een schudplatform bij kamertemperatuur.Was de beads vervolgens vijf keer met één milliliter breekbuffer. Resuspendeer de beads na de laatste wasbeurt met breekbuffer in 90 µL 2x Laemmli-monsterbuffer. Voeg 10 µL 1 M imidazole toe om te helpen het His-getagde eiwit te dissociëren van de nikkel-NTA-beads. Incubeer drie tot vijf minuten bij 100 °C in een heatblock. Vortex vervolgens en centrifugeer 30 seconden bij 13.000 ×g.Overbreng de supernatant naar een nieuwe buis. Om deze procedure te starten, verkrijg de benodigde hoeveelheid anti cmic aero affiniteitsgel-antilichaam door middel van centrifugatie op lage snelheid. Verwijder de supernatant en was de hars met buffer A. Voeg één milliliter buffer A toe en keer de buis herhaaldelijk om totdat de hars opnieuw is gesuspendeerd.Verzamel de hars door middel van centrifugatie bij lage snelheid en verwijder het supernatant. Was de hars in totaal vijf keer. Suspendeer de hars in één milliliter buffer A en verdeel dit over het aantal buisjes dat overeenkomt met de te verwerken monsters.Verzamel de hars door middel van centrifugatie bij lage snelheid en verwijder het supernatant. Voeg 950 µL cellysaat toe aan 25 µL hars. Incubeer dit overnight op een schudplatform bij 4 °C. Centrifugeer de volgende dag gedurende één minuut bij 800 tot 1500 ×g bij 4 °C.Bewaar 50 µL van het supernatant. Voeg 50 µL van 2x LAM samplebuffer toe aan dit supernatant en incubeer dit gedurende drie tot vijf minuten op 100 °C in een heatblock. Was de hars met buffer A; voeg één ml buffer A toe en keer het buisje herhaaldelijk om tot de hars opnieuw is gesuspendeerd.Verzamel de hars door middel van centrifugatie bij lage snelheid en verwijder het supernatant nadat het supernatant van de laatste wasstap is verwijderd. Resuspendeer de hars in 100 µL monsterbuffer en incubeer dit gedurende drie tot vijf minuten bij 100 °C in een heating block. Vortex vervolgens en centrifugeer 30 seconden bij 13.000 ×g.Breng de supernatant over naar een nieuwe buis. Laad tot slot alle monsters die met dit protocol zijn verzameld. Voor een SDS-page gel voor Western blot-analyse werden giststammen gebruikt die polyhistidine-flag-getagd SMT3 of HF-SMT3 en MT-getagd NDC80 en NDC10 tot expressie brengen om de colocalisatie van kinetochore-eiwitten te detecteren.HF SMT drie substraten werden affiniteitsgezuiverd met nikkelbolletjes en gedetecteerd met een Anti-Flag-antilichaam. Sumoyleren NDC 80 werd gedetecteerd in de HF SMT drie substraten wanneer deze werden gesondeerd met een anti-SUMO-antilichaam. De afwezigheid van gemodificeerde eiwitten in de controlestammen zonder HF SMT drie wijst op de specificiteit van de interactie tussen HF SMT drie en de doelwit-eiwitten.Bovendien is de sommatie van NDC 80 en NDC 10 verminderd in met NOCO desole behandelde cellen om de ubiquitinitering van NDC 80 en NDC 10 te detecteren. MIC-getagde NDC 80 of NDC 10 werd immunoprecipiteerd en er werd een western blot-analyse uitgevoerd met anti-MIC en anti-ubiquitine antilichamen; analyse van het hele cel-extract en het supernatant bevestigde de expressie van NDC 80 M en NDC 10 M. Immunoprecipiteerde monsters die werden gesondeerd met anti-MIC vertoonden meerdere banden met een hoog moleculair gewicht, wat suggereert dat NDC 80 en NDC 10 posttranslationele modificaties bevatten. Een ladderpatroon van immunoprecipiteerde monsters die werden gesondeerd met anti-ubiquitine toonde aan dat NDC 80 en NDC 10 geubiquitineerd zijn.De ladderpatronen van NDC 80 en NDC 10 werden versterkt door behandeling met de proteasoomremmer MG 1 32. Dit bevestigt verder dat deze poly-ubiquitinering vertegenwoordigen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van de eiwitzuiveringstechniek die detectie van mation en vaccinatie van vleermuis NN mogelijk maakt.

protein-purification-technique-that-allows-detection-sumoylation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ubiquitinatie is een belangrijke posttranslationele modificatie uitgevoerd door een set van drie enzymen. Mutaties van genen die betrokken zijn in deze wijziging worden geassocieerd met vele verschillende ziekten bij de mens. We beschrijven hier protocollen aan eiwit ubiquitinatie te detecteren in gekweekte...

Detectie van eiwit ubiquitinering

Verontreiniging van de voorbereidingen van eukaryotische ribosomen gezuiverd door middel van traditionele methoden door co-zuiveren nucleasen en proteasen negatief effect op de downstream-biochemische en structurele analyses. Een snelle en eenvoudige chromatografische zuivering methode wordt gebruikt om dit probleem op met behulp van gist ribosomen als een modelsysteem op te lossen.

Chromatografische zuivering van sterk actieve gist Ribosomen

This video describes a method to extract and purify ubiquitinylated peptides containing remnant di-glycine peptides from a complex peptide mixture. The presented method may help in identifying original ubiquitination sites in the protein.

Immunoaffinity Based Extraction of Ubiquitinylated Peptides: A Technique to Selectively Extract Ubiquitin Tagged Peptides from Purified Peptide Fractions

This video demonstrates the in vitro method for SUMOylation of substrate proteins using a sequential enzyme cascade. Further, the SUMOylated status of the protein is identified using the electrophoresis and immunoblotting technique.

SUMOylation Assay: An In Vitro Technique to Detect the SUMOylation Status of Substrate Proteins by Immunoblotting

De bereiding van hoogwaardige gist celextracten is een noodzakelijke eerste stap in de analyse van afzonderlijke eiwitten of hele proteomen. Hier een snelle, efficiënte en betrouwbare homogeniseren protocol voor gist cellen die is geoptimaliseerd om proteïnefuncties, interacties, en post-translationele modificaties behouden beschrijven we.

Ontluikende Gist Protein extractie en zuivering voor de Studie van de functie, interacties, en post-translationele modificaties

In tegenstelling tot ubiquitin ligases, zijn paar E3 SUMO ligases geïdentificeerd. Deze gewijzigde in vitro SUMOylation protocol vermag roman SUMO E3 ligases identificeren door een reconstructie in vitro assay.

In Vitro SUMOylation Assay te studeren SUMO E3 Ligase activiteit

Dit protocol is gericht op het opzetten van ubiquitine (UB) en ubiquitine-likes (Ubls) specifieke proteomes om veranderingen van dit soort post-translationele modificaties (Ptm's) te identificeren, geassocieerd met een specifieke aandoening zoals een behandeling of een fenotype.

Profilering van Ubiquitin en Ubiquitin-achtige afhankelijke post-translationele modificaties en identificatie van belangrijke veranderingen

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Hier beschrijven we massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) eiwit te identificeren.

Massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) te identificeren

Het protocol beschrijft een stapsgewijze methode om ubiquitinated eiwitten uit zoogdiercellen te zuiveren met behulp van het p53 tumor suppressor-eiwit als voorbeeld. Ubiquitinated p53-eiwitten werden gezuiverd uit cellen onder strenge niet-condenserende en denaturerende omstandigheden.

Zuivering van ubiquitinated p53-eiwitten uit zoogdiercellen

Het huidige protocol belicht een gemodificeerde methode voor het detecteren en kwantificeren van DNA-eiwit crosslinks (DPC's) en hun posttranslationele modificaties (PTM's), waaronder ubiquitylering, SUMOylation en ADP-ribosylatie geïnduceerd door topoisomeraseremmers en door formaldehyde, waardoor de vorming en reparatie van DPC's en hun PTM's kan worden bestudeerd.

Kwantitatieve detectie van DNA-eiwit crosslinks en hun posttranslationele modificaties

Ubiquitinatie is een cruciale regulator van de functies van intracellulaire eiwitten. Hier beschrijven we twee cellysemethoden om substraatproteïneniveaus te detecteren in zoogdiercellen en vergelijken we hun effectiviteit bij het analyseren van ubiquitinatieniveaus. Eiwitoverexpressie in HEK293T cellen werd geïnduceerd door tijdelijke transfectie, en ubiquitinatieve eiwitten werden gedetecteerd door western blot-analyse.

Vergelijkende strategieën voor ubiquitinatiedetectie in zoogdiercellysaten met SMAD2/SMURF2 als model

Leer een eiwitzuiveringsmethode voor het detecteren van sumoylatie en ubiquitinering van kinetochore-eiwitten Ndc10 en Ndc80 in Saccharomyces cerevisiae. Deze techniek maakt gedetailleerde analyse van post-translatiemodificaties mogelijk.

Eiwitzuivering Techniek dat Detectie van sumoylation en Ubiquitinering van Budding gist kinetochoor Eiwitten Ndc10 en Ndc80 Maakt (Video) | JoVE Journal

Eiwitzuivering Techniek dat Detectie van sumoylation en Ubiquitinering van Budding gist kinetochoor Eiwitten Ndc10 en Ndc80 Maakt

Meer video's verkennen