Eiwitzuivering Techniek dat Detectie van sumoylation en Ubiquitinering van Budding gist kinetochoor Eiwitten Ndc10 en Ndc80 Maakt

Het algemene doel van deze procedure is om simulatie en ubiquitinatie van knopvormingsgistachtige kernproteinen, NDC 10 en NDC 80 te detecteren. Dit wordt bereikt door eerst gistachtige cellen te verzamelen die hiss flag-getagde SMT drie en MT-getagde NDC 10 of NDC 80 tot expressie brengen, en eiwitextracten van deze cellen te maken. De tweede stap is om zijn flag-getagde SMT drie-conjugaten te zuiveren voor de detectie van sommatie of om mik-tag-getagde kernproteinen te immunoprecipiteren voor de detectie van ubiquitinatie.

Vervolgens wordt sommatie of ubiquitinatie gedetecteerd door western blot-analyse. Uiteindelijk bevestigt het voorkomen van een ladderingpatroon voor NDC 10 en NDC 80 dat deze eiwitten worden gesimuleerd en geubiquitineerd. De beschreven eiwitzuiveringsmethode maakt de detectie mogelijk van zowel simulatie als ubiquitinatie van de connico-eiwitten ND C 10 en NDC 80 in de knopvormingsgistsacro.

Mijn cci. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de stam die we hebben gecreëerd twee epitopeaanvallen heeft, een op het testeiwit en de andere die detectie van simulatie mogelijk maakt. Het gebruik van deze tags vermindert de achtergrond vanwege de kruisreactiviteit die vaak wordt waargenomen wanneer polyklonaal serum wordt gebruikt.

De demonstratie van deze procedure wordt uitgevoerd door Canero Uni, een onderzoeksassistent in mijn laboratorium. Eiwitten van belang worden geëxtraheerd uit gistcelpellets die eerder zijn bereid en bewaard bij min 20 graden Celsius. Resus, suspendeer de cellen in 0,5 milliliter ijskoud buffer.

Gebruik guine-buffer als het extract voor een pull-down-assay is met behulp van nikkelnitril, tri-azijnzuur of nikkel NTA superflow-kralen. Gebruik buffer A als het extract is voor immunoprecipitatie. Houd de buisjes altijd op ijs.

Breng de celsuspensies over naar twee milliliter. Schroef de doppen op elke buis. Voeg een volume glaskralen toe dat gelijk is aan het volume van de celsuspensiekralen.

Sla de cellen in een mini-beadbeater gedurende twee minuten bij kamertemperatuur en plaats de buisjes vervolgens twee tot drie minuten op ijs. Herhaal het beadbeaten en ijskoelen drie keer. Vortex met hoge snelheid bij vier graden Celsius gedurende 30 tot 60 minuten.

Controleer de cellen door visualisatie onder de microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen zijn gelyseerd. Gelyseerd cellen zullen eruitzien als donkere schimmen en zullen geen rand of gedefinieerde vorm hebben. Optimaal gezien moeten minstens 80% van de cellen worden gelyseerd.

Gebruik vervolgens een priem om een gat in de bodem van de buis te prikken. Plaats de schroefdop losjes op en plaats de buis in een 15 milliliter conische buis. Centrifugeer gedurende één minuut bij 1000 keer G.

Om het lysaal te verzamelen, breng het lysaal over naar een microcentrifugebuis en centrifugeer bij 15.000 keer G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius om de geëxtraheerde eiwitten te verzamelen. Na het meten van de concentratie van de geëxtraheerde eiwitten met behulp van een eiwitassaykit, normaliseer alle extracten zodat elke dezelfde hoeveelheid eiwit bevat. Breng het totale volume naar één milliliter met de juiste buffer.

Ongeveer vijf milligram totaal eiwit wordt verkregen uit 50 OD 600 van cellen. Bewaar 50 microliter van het geëxtraheerde eiwit als de gehele cel-extract. De resterende 950 microliter eiwitextract wordt later gebruikt voor eiwitzuivering of immunoprecipitatie van MT-getagde eiwitten.

Voeg 50 microliter van twee x laly-monsterbuffer toe aan de 50 microliter van het gehele cel-extract. Incubeer de monsters gedurende drie tot vijf minuten bij 100 graden Celsius in een hitteblok voordat u ze analyseert door middel van western blot. Begin deze procedure door de noodzakelijke nikkel NTA superflow-kralen voor de zuivering te bereiden.

Verkrijg de benodigde hoeveelheid kralen door middel van lage snelheid centrifugatie gedurende één minuut. Verwijder het supernatant en was de kralen met PBS. Voeg één milliliter PBS toe en draai de bovenkant van de buis omlaag totdat de kralen weer worden gesuspendeerd.

Verzamel de kralen door middel van lage snelheid centrifugatie en verwijder het supernatant. Was de kralen op deze manier in totaal vijf keer. Suspendeer de kralen in één milliliter guine-buffer en verdeel ze in de hoeveelheid buisjes die overeenkomt met de te verwerken monsters.

Verzamel de kralen door middel van lage snelheid centrifugatie en verwijder het supernatant voor elk monster. Voeg 950 microliter van het gehele cel-extract toe dat eerder is bereid tot 100 microliter van de kralen.

Incubeer gedurende ten minste vier uur of een nacht op een schuddende platform bij vier graden Celsius. Centrifugeer gedurende één minuut bij 800 tot 1500 keer G bij vier graden Celsius. Bewaar 50 microliter van het supernatant.

Voeg 50 microliter van twee x laly-monsterbuffer toe aan dit supernatant en incubeer gedurende drie tot vijf minuten bij 100 graden Celsius in een hitteblok. Tien microliter van elk monster zal later worden geanalyseerd door middel van western blot. Was de nikkel NTA superflow-kralen eenmaal met één milliliter guine-buffer gedurende vijf tot 10 minuten op een schuddende platform bij kamertemperatuur.

Was vervolgens de kralen vijf keer met één milliliter breekbuffer. Na de laatste wassing met breekbuffer, resuspendeer de kralen in 90 microliter van twee x laly-monsterbuffer. Voeg 10 microliter van één molair iole toe om de dissociatie van het his-getagde eiwit van de nikkel NT.A-kralen te helpen. Incubeer gedurende drie tot vijf minuten bij 100 graden Celsius in een hitteblok. Vortex vervolgens en centrifugeer gedurende 30 seconden bij 13.000 keer G.

Breng het supernatant over naar een nieuwe buis. Om deze procedure te beginnen, verkrijg de benodigde hoeveelheid anti-cmic aero-affiniteitsgelantilichaam door middel van lage snelheid centrifugatie. Verwijder het supernatant, was de hars met buffer A. Voeg één milliliter van buffer A toe en draai