Oprichting van Human Epithelial Enteroids en Colonoids van Whole Tissue en Biopsie

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van menselijke enterocyten uit darmweefsels. Dit wordt bereikt door eerst de darmmucosa te dissekeren van het onderliggende submucosale weefsel. De tweede stap is het incuberen van de mucosa met EDTA om de dissociatie van het epitheel van het bindweefsel te bevorderen.

Vervolgens worden de intestinale crypten gescheiden van het gedissocieerde epitheel. Ten slotte worden de intestinale crypten gekweekt in een basement membraan matrix. Uiteindelijk worden immunohistochemische technieken gebruikt om zowel de epitheliale organisatie als specifieke epitheliale markers van de gekweekte OID's aan te tonen.

De implicaties van deze methode zijn dat we nu OID's kunnen genereren uit patiëntspecifieke biopsieën, wat betekent dat we dat weefsel nu in het laboratorium kunnen gebruiken om intestinale ziekten en diagnoses te bestuderen, iets wat voorheen nooit mogelijk was. Nadat de buffers en reagentia volgens het tekstprotocol zijn voorbereid, wordt het basaalmembraan op ijs ontdooid en wordt een 24-wells plaat gepre-incubeerd in een kooldioxide-incubator bij 37 °C zodra het weefsel is ontvangen. Gebruik KO's PBS zonder calcium en magnesium of DPBS om het weefsel te wassen totdat de DPBS helder is.

Plaats het weefsel in een met siliconen gecoate glazen petrischaal gevuld met ijskoud DPBS, met de mucosazijde naar boven gericht, en zet het weefsel vast door het uit te rekken en vast te pinnen met minuchpinnetjes. Gebruik vervolgens onder een dissectiemicroscoop microdissectiescharen en fijne gebogen pincetten om de onderliggende mucosa te scheiden van de submucosa en het bindweefsel. Rek vervolgens de gedissecteerde mucosa uit en pin deze plat op de met siliconen gecoate glazen petrischaal, met de mucosazijde naar boven gericht.

Schraap voorzichtig het oppervlak van het slijmvlies met een gebogen pincet. Deze stap is noodzakelijk om de kwaliteit van de preparatie te verbeteren. Bedek het slijmvlies met vers bereide twee millimolar EDTA-chelatiebuffer.

Was daarna het weefsel op ijs, drie tot vier keer volgens het tekstprotocol onder een dissectiemicroscoop, en gebruik gebogen pincetten om de mucosa voorzichtig af te schrapen om de intestinale crypten met een pipet vrij te maken. Verwijder de cryptensuspensie voorzichtig uit de Petrischaal en breng deze over in een conische buis van 50 milliliter. Controleer vervolgens het weefsel om er zeker van te zijn dat bijna alle crypten uit de mucosa zijn verwijderd.

Filter de cryptsuspensie twee keer door een 150 micrometer filter en controleer met een microscoop of de suspensie goed doorstroomt. Nadat de cryptsuspensie is gewassen en het benodigde aantal crypten is overgebracht naar een ronde bodembuis van vijf milliliter, volgens het tekstprotocol, centrifugeert u de cryptfractie gedurende 10 minuten bij 150 Gs en vier graden Celsius. Verwijder vervolgens het supernatant met voorkoelde pipetpunten en resuspendeer de cryptpellet in basement membrane matrix.

Breng 50 microliters cryptsuspensie in basement membrane matrix per well aan op de voorverwarmde plaat door de basement membrane matrix langzaam in het centrum van de well uit te stoten. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten in een incubator bij 37 degree Celsius en 5%carbon dioxide om een volledige polymerisatie van de basement membrane matrix mogelijk te maken. Bedek de basement membrane matrix vervolgens met 500 microliters compleet medium voor humane mini-darmen, gesupplementeerd met elk 2,5 micromolar CHIR 9 0 2 2 1.

En Thien incuberen het weefsel waarbij het medium na twee dagen wordt vervangen, en daarna om de dag. Deze figuur toont een typisch voorbeeld van vers geïsoleerde crypten uit volledig weefsel. Het aantal crypten dat uit een biopsie wordt geïsoleerd, is kleiner dan in volledig weefsel.

Meestal worden er twee biopsie-hapjes genomen tijdens één enkele passage. Elk biopsie-hapje resulteert in een oppervlakte van 10 vierkante millimeter met gemiddeld 50 tot 100 crypten per biopsie. Na kweek in een keldermembraanmatrix gedurende vijf tot zes dagen, groeien de crypten uit tot enterosferen voor de dunne darm en colonosferen voor de dikke darm, en worden deze na zeven dagen gepasseerd.

De organoïden of OID's die hier zijn ontwikkeld uit biopten, ondergaan dezelfde ontwikkeling bij een lagere dichtheid tijdens het uitplaten. Daarom vindt de inkapseling meestal plaats na 10 tot 12 dagen in cultuur. Zoals hier wordt getoond, vertonen zowel OID's als OID's een luminale zijde en zijn ze bekleed met een epitheel.

Prolifererende cellen kunnen worden waargenomen binnen de OID's en bevinden zich in de knoptoppen. Confocale beeldvorming van OID's gekleurd met e-catrine, hier in het groen, toont de epitheelcellen. Deze figuur toont enterocyten die zijn gegroeid uit een patiënt met cystic fibrosis en een tufting enteropathie als gevolg van een congenitale mutatie in het gen voor het epitheelcel-adhesiemolecuul.

Deze procedure of methoden zoals real-time PCR of Western blot kunnen worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden over een gen of probe van belang. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u consistent menselijke CRISPR kunt isoleren om efficiënt constructen te genereren in uw laboratorium om uw patiëntspecifieke vragen te beantwoorden.