Generatie van de Mens Adipose stamcellen via dedifferentieëren Mature Adipocyten in Plafond Culturen
7 maart 2015
Volwassen adipocyten kunnen een overvloedige bron van stamcellen vertegenwoordigen door dedifferentiatie, wat leidt tot een homogene populatie van fibroblast-achtige cellen. Collagenase-digestie wordt gebruikt om volwassen adipocyten uit menselijk vet te isoleren. Het doel van ons protocol is om multipotente, dedifferentieerde vetcellen te verkrijgen uit menselijke volwassen adipocyten.
Rijpe adipocyten hebben het vermogen om in vitro te differentiëren tot precursorcellen. Dit wordt bereikt via seal-cultuur, een techniek waarbij rijpe cellen worden gekweekt in een kolf die volledig met medium is gevuld en ondersteboven wordt gecultiveerd. De drijvende cellen hechten zich aan de kolf en veranderen hun morfologie van een ronde cel gevuld met lipiden naar een langwerpige fibroblastachtige cel. Homogeen.
Populaties van langwerpige cellen kunnen worden verkregen en gezuiverd na ontvangst van weefselmonsters in het laboratorium. Weeg het vetweefsel en plaats, afhankelijk van het benodigde aantal adipocyten, een geschikt volume van het monster in een 50 ml buis voor digestie; u kunt ongeveer 1 miljoen cellen per gram weefsel verwachten te verkrijgen.
Plafondculturen worden uitgevoerd met 500.000 cellen per fles van 25 centimeter en 50.000 cellen per putje van een plaat met zes putjes. Voeg KRH-werkbuffer aan, aangevuld met collagenase, snipper het weefsel met een schaar en incubeer het preparaat bij 37 °C gedurende 45 minuten. Bereid tijdens de incubatie de opstelling van slangetjes en spuit voor. Giet de doorschijnende oplossing door een nylon gaas in een plastic bekerglas met behulp van een pincet.
Wrijf de celpreparatie voorzichtig door het gaas en was deze met 5 ml KRH-werkbuffer. Breng de gefiltreerde celsuspensie met een spuit over in een buis van 50 ml. Laat de mature adipocyten ongeveer 10 minuten staan.
De cellen zullen door flotatie naar de bovenkant van de buffer drijven. Aspireer de buffer langzaam vanaf de bodem. Voeg met een injectiespuit en slangetjes 20 ml KRH-werkbuffer toe om te wassen.
Herhaal de wasstappen twee keer. Verzamel de buffer om de adipocyten-suspensie tot een eindvolume van 5 ml te brengen en bepaal vervolgens het celgetal met een hemocytometer. Vul een T25-fles voor driekwart met DMEM/F12 aangevuld met 20% kalfsserum en breng 500.000 volwassen adipocyten over naar de fles. Vul de fles aan met medium en verwijder luchtbellen van het oppervlak.
Draai een dop op de kolf. Incubeer de kolf een week lang ondersteboven in een celkweekincubator met 5% carbon dioxide. Vermijd beweging van de kolf, aangezien resterende luchtbellen de celadhesie kunnen verstoren.
Plaats een dekglas op de bodem van de wells. Plaats de plastic bushing in de well en vul de well met 8 ml medium. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.
Plaats een dekglas op de bushing, waarbij voldoende ruimte wordt gelaten om de pipetpunt in te brengen. Neem een monster van 50.000 cellen en injecteer deze door de punt tussen het dekglas en de bushing te plaatsen. Incubeer de plaat gedurende een week of korter in een celkweekincubator met 5% koolstofdioxide.
Afhankelijk van het experimentele ontwerp zijn er ten minste drie dagen nodig om de cellen te laten hechten aan het dekglas in een andere plaat. Keer de dekglazen om in 2 ml medium. In continue culturen kunnen de dekglazen vervolgens worden gefixeerd in formaline voor immunofluorescentie-experimenten of voor DNA-RNA- en eiwitextracties.
De-differentiatie van volwassen adipocyten veroorzaakt grote veranderingen in de celmorfologie. Tijdens dit proces verliezen adipocyten hun fenotype en neemt de expressie van transcripten die gewoonlijk geassocieerd worden met hun vetopslagfunctie af. Deze immunofluorescentie-afbeelding toont adipocyten in verschillende stadia van de-differentiatie.
De cellen met de ronde morfologie brengen nog steeds FABP4 uit, een marker voor mature adipocyten, terwijl de langgerekte cellen dit op basis van de literatuur niet meer doen. Gedifferentieerde vetcellen, vaak D-vetcellen genoemd, kunnen worden verkregen van jonge, oudere, slanke of obese patiënten. Hun capaciteit voor langetermijnkweek en hun aangetoonde multipotentie.
Ik zie ook potentie voor weefselengineering en celtherapie. Ze kunnen een nieuw model vormen voor het post-specifieke onderzoek naar de adipocytenfysiologie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de dedifferentiatie van volwassen adipocyten tot multipotente stamcellen. Door gebruik te maken van collagenase-digestie en seal culture-technieken kunnen onderzoekers deze cellen isoleren en kweken om een homogene populatie fibroblast-achtige cellen te verkrijgen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Stamcelonderzoek
- Adipocytbiologie
- Celkweektechnieken
Achtergrond
- Rijpe adipocyten kunnen dedifferentiëren tot precursorcellen.
- Dit proces kan in vitro worden uitgevoerd met behulp van specifieke kweekmethoden.
- De isolatie van adipocyten is cruciaal voor het verkrijgen van stamcellen.
- Collagenase-digestie is een standaardmethode voor celisolatie.
Doel van de studie
- Om multipotente, dedifferentieerde vetcellen te verkrijgen uit volwassen menselijke adipocyten.
- Om een protocol vast te stellen voor het isoleren en kweken van deze cellen.
- Om de morfologische veranderingen tijdens de dedifferentiatie te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Collagenase-digestie voor het isoleren van mature adipocyten.
- Seal-cultuurtechniek om dedifferentiatie te bevorderen.
- Beoordeling van de celmorfologie om dedifferentiatie te bevestigen.
- Kwantificering van de celopbrengst op basis van het weefselgewicht.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van ongeveer 1 miljoen cellen per gram vetweefsel.
- Gededifferentieerde cellen vertoonden een langwerpige fibroblast-achtige morfologie.
- Homogene celpopulaties werden verkregen via de beschreven methoden.
- Aantoonde het potentieel van mature adipocyten als bron van stamcellen.
Conclusies
- Rijpe adipocyten kunnen effectief worden omgezet in multipotente stamcellen.
- De beschreven methoden bieden een betrouwbare aanpak voor stamcelonderzoek.
- Deze studie draagt bij aan het begrip van de plasticiteit van adipocyten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Dedifferentiatie van volwassen adipocyten tot multipotente stamcellen biedt een nieuwe bron voor toepassingen in de regeneratieve geneeskunde en tissue engineering. Deze benadering maakt depot-specifieke karakterisering van de adipocytenfunctie en metabole eigenschappen mogelijk, wat targetvalidatie in onderzoek naar metabole ziekten ondersteunt. De methode biedt een schaalbaar platform voor het genereren van fibroblast-achtige cellen met aangetoonde multipotentie, wat de ontwikkeling van preklinische modellen en mechanistische de-risking bij therapeutische ontdekking gericht op adipocyten faciliteert.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de plasticiteit van adipocyten en het testen van therapeutische hypothesen in metabole ziektepaden mogelijk.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbaar systeem voor functionele validatie van targets via depot-specifieke isolatie van adipocyten.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid door het genereren van homogene populaties gededifferentieerde cellen voor de verduidelijking van signaalpaden.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows via gestandaardiseerde collagenase-digestie en ceiling culture-technieken.
- Operationele waarde: Waarborgt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid via een gecontroleerde adipocytenopbrengst (ongeveer 1 miljoen cellen per gram weefsel).
- Wetenschappelijke waarde: Maakt betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk met behulp van fibroblast-achtige cellen met een bevestigde FABP4-downregulatie als marker voor dedifferentiatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de ontwikkeling van ziekterelevente systemen voor post-specifiek onderzoek naar de adipocytenfysiologie.
- Operationele waarde: Waarborgt translationele continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie via de langetermijnkweekcapaciteit van gededifferentieerde vetcellen.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door de multipotentie en het potentieel voor weefseltechniek van D-vetcellen aan te tonen.
Pipeline- & workflowintegratie
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische studies, in het bijzonder voor programma's op het gebied van metabole ziekten en regeneratieve geneeskunde.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetests en biologische risicoreductie door de dedifferentiatie van adipocyten in vitro te modelleren.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid en kwantitatieve resultaten via gestandaardiseerde celisolatie en morfologische beoordeling.
- Analytics: Biedt meetbare uitkomsten, zoals veranderingen in de FABP4-expressie, om dedifferentiatietoestanden onder verschillende condities te vergelijken.
- Translationeel Onderzoek: Legt de verbinding met preklinische continuïteit door aangetoonde langetermijnkweek en multipotentie van gededifferentieerde adipocyten.
- Enterprise Hergebruik: Creëert een herbruikbare capaciteit voor het genereren van uit adipocyten afgeleide stamcellen voor diverse depot-specifieke onderzoeken.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid door vermindering van mechanistische ambiguïteit bij het fenotype-schakelen van adipocyten.
- Operationele waarde: Standaardisatie en schaalbaarheid via gedefinieerde collagenase-digestie- en geïnverteerde kweekprotocollen.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen door het mogelijk maken van depot-specifieke metabole eigenschappenkarakterisering voorafgaand aan de lead-optimalisatie.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering door gevalideerde beoordeling van de stamcelopbrengst en het differentiatiepotentieel.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in technieken voor de isolatie van primaire adipocyten en collagenase-digestie.
- Vereist een celkweekinfrastructuur die in staat is om ceiling-culturen in omgekeerde flessen of 6-wells platen te onderhouden.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor een consistente opbrengst aan adipocyten en een uniforme beoordeling van de dedifferentiatie over verschillende laboratoria heen.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen bij het toepassen van het protocol op vetweefsel uit verschillende depots of met verschillende donorcaracteristieken.
- Bevat praktische beperkingen, zoals de noodzaak voor een nauwkeurige vulling van het medium om verstoring door luchtbellen tijdens de omgekeerde kweek te voorkomen.
