Name: Generatie van de Mens Adipose stamcellen via dedifferentieëren Mature Adipocyten in Plafond Culturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Leer hoe je menselijke vetstamcellen genereert via dedifferentiatie van rijpe adipocyten in plafondculturen. Deze methode levert ongeveer 1 miljoen cellen per gram weefsel op.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (371697-2011, AT). De auteurs willen de hulp van bariatrische chirurgen Drs S. Biron, F-S. Hould, S. Lebel, O. Lescelleur, P. Marceau, evenals Christine Racine en Caroline Gagnon van de IUCPQ Tissue Bank, erkennen. We danken de heer Jacques Cadorette van de audiovisuele diensten van de IUCPQ voor het opnemen en bewerken van de video.

Ethische verklaring: Het project is goedgekeurd door Research Ethics Committee IUCPQ goedgekeurd voorafgaand aan de rekrutering van patiënten. Voor de toepassing van dit artikel / video, we verkregen weefsels van 2 patiënten: 1) een 62-jarige mannelijke patiënt met een BMI van 50,7 kg / m 2 en 2) een 35-jarige vrouwelijke patiënt met een BMI van 57 kg / m2. Experimenten kan met beide vetcompartimenten, maar zijn beperkt tot een vet compartiment voor de doeleinden van deze video. Technische aspecten van de video werden uitgevoerd met patiënten 1 en FABP4 immunofluorescentie werd uitgevoerd met gededifferentieerde cellen van patiënt 2. 1. monster verwerking <ol><li> Vraag chirurgen om vetweefsel te verzamelen van de omental en onderhuids vet compartimenten ten tijde van de laparoscopische bariatrische chirurgie. </li><li> Brengen snel vet monsters naar het laboratorium bij RT en direct te verwerken. </li><li> Voer vertering in het laboratorium, in een niet-steriele atmosfeer. Decellen zal uiteindelijk worden overgebracht naar de kweekkamer en gekweekt onder steriele omstandigheden. Om besmetting te voorkomen, te bereiden KRH buffer met gedistilleerd en gefilterd water en volgen door een filtratie (0,22 pm filter) voorafgaand aan de spijsvertering. Grondig reinigen buizen met ethanol voorafgaande overdracht in de celkweek kap voor kolf en plaat voorbereiding. </li><li> Plaats vetweefsel op een vooraf gewogen gerecht en opnemen gewicht. Bevestig een klein stukje van elk weefselmonster (minder dan 1 cm2) in 10% formaline buffer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 24 uur voor inbedden in paraffine. Gebruik deze ingebed monster voor immunohistochemie experimenten (techniek niet getoond). </li><li> Plaats een stuk in een 50 ml buis en kort vriezen in vloeibare stikstof voor opslag bij -80 ° C voor verdere studies in gehele vetweefsel (bv genexpressie - techniek niet getoond). </li></ol> 2. Collagenase Spijsvertering <ol><li> Leg de resterende vetweefsel stuk in een 50 ml tuvoor vertering. </li><li> Voeg 4 ml KRH-WB aangevuld met collagenase (350 U / ml) per gram monster in de destructiebuis. </li><li> Hak vetweefsel met een schaar. </li><li> Plaats gehakt vetweefsel suspensie in een shaker, 37 ° C, rpm maximaal 90, voor een 45 minuten durende incubatie (maximaal 1 uur). </li></ol> 3. Zuivering van Adipocyten en preadipocyten <ol><li> Giet de doorschijnende oplossing met weinig stukjes vet door een 400 uM nylon gaas in een plastic beker. </li><li> Met een pincet, wrijf de cel voorbereiding op het nylon gaas en was met 5 ml KRH-WB. </li><li> Fijn overdracht van de gefiltreerde celsuspensie in een 50 ml buis met de plastic buis erin en een 60 cc spuit bevestigd aan de slang uiteinde. </li><li> Laat de suspensie met volwassen adipocyten staan ​​voor ongeveer 10 minuten, waardoor de cellen aan de bovenzijde van de buffer bereiken flotatie. </li><li> Langzaam zuigen de buffer op de bodem van de buis met behulp 60cc syringe afzuiging. </li><li> Voeg 20 ml KRH-WB te wassen. Herhaal vanaf stap 3.4 voor 2 extra wasbeurten. </li><li> Verzamel de buffer de adipocyten suspensie tot een eindvolume van 5 of 10 ml te brengen, afhankelijk van hoeveelheid cellen. Na te streven met stappen in paragraaf 5. </li><li> Herstel de stromale vasculaire fractie uit de verzamelde met 60 cc spuit door centrifugatie (3000 rpm, kamertemperatuur, 5 minuten) voor primaire celkweek desgewenst buffer (techniek niet getoond). </li></ol> 4. Volwassen Adipocyte celgetal <ol><li> Load 10 ul van zacht geschud adipocyt suspensie in een telkamer (haemocytometer). Voeren celgetal in viervoud. </li><li> Bereken aantal geïsoleerde volwassen cellen. </li></ol> 5. Volwassen Adipocyte dedifferentiation in T-25 Kolf <ol><li> Vul een 25 cm 2 weefselkweek kolf tot ¾ van het volume met DMEM / F12-20% kalf serum. </li><li> Volgens celgetal, giet 500.000 volwassen cellen in de kolf. </li&gt; <li> Vul de kolf compleet met een 50 ml buis met medium en verwijder zo veel bubbels als mogelijk. </li><li> Schroef de ongeventileerde dop op de fles. </li><li> Reinig de kolf met ethanol voorafgaand aan de incubatie om besmetting te voorkomen. </li><li> Incubeer de fles op zijn kop voor een week zonder het aan te raken om beweging in de cultuur die cellulaire hechting kunnen verstoren te voorkomen. </li><li> Voorafgaand aan het omkeren van de kolf bij 7 dagen van omgekeerde cultuur, voorzichtig manipuleren van de kolf en verwijder alle medium in de kolf door aspiratie, het vermijden van abrupte bewegingen. </li><li> Voeg 12 ml van DMEM-F12-20% kalfsserum en cultiveren cellen met standaard technieken. Een gefiltreerd ontluchtingsdop worden toegevoegd aan de kolf. </li></ol> 6. Volwassen Adipocyte dedifferentiation in een 6-wells plaat <ol><li> Plaats een dekglaasje op de bodem van elk putje van een 6-well plaat </li><li> Voeg een ½ &quot;plastic bus op de top van elke dekglaasje. </li><li> Vul putjes met 8 ml 20% kalfsserum-DMEM medium. </li><li> Zet een dekglaasje op elke plastic bus. </li><li> Steek pipet tip tussen de glijbaan en de buis om cellen te injecteren onder de glijbaan (50.000 cellen per putje). </li><li> Incubeer de platen in een standaard celkweek incubator bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende een week. </li><li> Reverse dekglaasje met aangehechte cellen in elk putje met 2 ml medium aangevuld met 20% kalfsserum en nastreven cultuur. </li><li> Gebruik dekglaasje met cellen die dedifferentiatie voor verschillende doeleinden zoals immunofluorescentie (techniek niet getoond). </li></ol>

<ol><li>Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ceiling+culture+of+mature+human+adipocytes%3A+use+in+studies+of+adipocyte+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions.</a> J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).</li>
<li>Matsumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+adipocyte-derived+dedifferentiated+fat+cells+exhibit+multilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential.</a> J Cell Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).</li>
<li>Poloni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dedifferentiated+adipocytes+show+similar+properties+to+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).</li>
<li>Perrini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+gene+expression+and+cytokine+release+profiles+highlight+the+heterogeneity+of+distinct+subsets+of+adipose+tissue-derived+stem+cells+in+the+subcutaneous+and+visceral+adipose+tissue+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differences in gene expression and cytokine release profiles highlight the heterogeneity of distinct subsets of adipose tissue-derived stem cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue in humans.</a> PLoS One. 8 (3), e57892(2013).</li>
<li>Kishimoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteoblastic+differentiation+ability+of+human+dedifferentiated+fat+cells+is+higher+than+that+of+adipose+stem+cells+from+the+buccal+fat+pad%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Oral+Investig%22%5BJournal%5D)">The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad.</a> Clin Oral Investig. , (2013).</li>
<li>Kou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phenotype+and+tissue-specific+nature+of+multipotent+cells+derived+from+human+mature+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The phenotype and tissue-specific nature of multipotent cells derived from human mature adipocytes.</a> Biochem Biophys Res Commun. 444 (4), 543-548 (2014).</li>
<li>Jumabay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+derived+from+mouse+and+human+white+mature+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells derived from mouse and human white mature adipocytes.</a> Stem Cells Transl Med. 3 (2), 161-171 (2014).</li>
<li>Sugawara, A., Sato, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+dedifferentiated+fat+cells+for+periodontal+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Application of dedifferentiated fat cells for periodontal tissue regeneration.</a> Hum Cell. 27 (1), 12-21 (2014).</li>
<li>Kikuta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+effects+of+dedifferentiated+fat+cell+transplantation+in+rabbit+models+of+bone+defect+and+ovariectomy-induced+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Osteogenic effects of dedifferentiated fat cell transplantation in rabbit models of bone defect and ovariectomy-induced osteoporosis.</a> Tissue Eng Part A. 19 (15-16), 1792-1802 (2013).</li>
<li>Obinata, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+mature+adipocyte-derived+dedifferentiated+fat+%28DFAT%29+cells+improves+urethral+sphincter+contractility+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Urol%22%5BJournal%5D)">Transplantation of mature adipocyte-derived dedifferentiated fat (DFAT) cells improves urethral sphincter contractility in a rat model.</a> Int J Urol. 18 (12), 827-834 (2011).</li>
<li>Jumabay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiated+fat+cells+convert+to+cardiomyocyte+phenotype+and+repair+infarcted+cardiac+tissue+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiated fat cells convert to cardiomyocyte phenotype and repair infarcted cardiac tissue in rats.</a> J Mol Cell Cardiol. 47 (5), 565-575 (2009).</li>
<li>Ohta, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+adipocyte-derived+cells%2C+dedifferentiated+fat+cells+%28DFAT%29%2C+promoted+functional+recovery+from+spinal+cord+injury-induced+motor+dysfunction+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Mature adipocyte-derived cells, dedifferentiated fat cells (DFAT), promoted functional recovery from spinal cord injury-induced motor dysfunction in rats.</a> Cell Transplant. 17 (8), 877-886 (2008).</li>
<li>Moreno-Navarrete, J. M. F. -r Ch. 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoreno-Navarrete%2C+JMF-r+%22Adipose+Tissue+Biology%22">Adipose Tissue Biology</a>. Symonds, M. E. , Springer. 17-38 (2012).</li>
<li>Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+models+for+differentiation%3A+preadipocytes+and+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med+%28Maywood%22%5BJournal%5D)">Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes.</a> Exp Biol Med (Maywood. 235 (10), 1185-1193 (2010).</li>
<li>Casteilla, L., Penicaud, L., Cousin, B., Calise, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+an+adipose+tissue+depot+for+sampling%3A+factors+in+selection+and+depot+specificity%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity).</a> Methods Mol Biol. 456, 23-38 (2008).</li>
<li>Tchernof, A., Despres, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+human+visceral+obesity%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of human visceral obesity: an update.</a> Physiol Rev. 93 (1), 359-404 (2013).</li>
<li>Rodbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+Isolated+Fat+Cells.+I.+Effects+of+Hormones+on+Glucose+Metabolism+and+Lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis.</a> J Biol Chem. 239, 375-380 (1964).</li>
<li>Watson, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Markers+and+Functional+Attributes+of+Human+Adipose-Derived+Stem+Cells+and+Dedifferentiated+Adipocyte+Cells+from+Subcutaneous+Fat+of+an+Obese+Diabetic+Donor%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Comparison of Markers and Functional Attributes of Human Adipose-Derived Stem Cells and Dedifferentiated Adipocyte Cells from Subcutaneous Fat of an Obese Diabetic Donor.</a> Adv Wound Care. 3 (3), 219-228 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dedifferentiatie van rijpe adipocyten het plafond cultuur techniek is een nieuwe benadering adipose stamcellen verkregen uit een klein monster van natief vetweefsel. Gebaseerd op onze ervaring en die van anderen 2, een gram weefsel is voldoende om een 25-cm2 kolf plaat en een populatie van cellen DFAT waarvoor homogeniteit is aangetoond door Poloni en medewerkers 3 verkrijgen. Adipocyten dedifferentiation lijkt mogelijk met cellen uit een donor, onafhankelijk van hun leeftijd, geslacht e...

In vitro dedifferentiatie van volwassen adipocyten wordt bereikt door een techniek die plafondcultuur wordt genoemd1. Vanwege hun natuurlijke neiging om te zweven in waterige oplossingen, hechten geïsoleerde volwassen adipocyten zich aan het oppervlak van een omgekeerde kolf die volledig gevuld is met kweekmedium. Na een paar dagen wijzigen cellen hun sferische morfologie en worden ze fibroblast-achtige cellen. De resulterende cellen, genaamd gededifferentieerde vet (DFAT) cellen, zijn multipotent2. Onderzoeksartikelen over dedifferentiatie van adipocyten, vooral over menselijke cellen, zijn beperkt. Ze hebben echter al interessante informatie opgeleverd over multipotentie, celfenotype en replicatieve capaciteit van DFAT-cellen2. Volwassen adipocyten afkomstig van verschillende vetcompartimenten zijn met succes gededifferentieerd, inclusief die afkomstig van menselijk visceraal en subcutaan vetweefsel2-4. Naast deze depots hebben Kishimoto en medewerkers vetweefsel uit de buccale vetkussens genomen en adipocyten gededifferentieerd tot DFAT-cellen5. Matsumoto en medewerkers hebben met succes subcutane DFAT-cellen gegenereerd van patiënten die een breed leeftijdsbereik dekken, en de meerderheid van de cellen had een hoge proliferatiesnelheid en minder dan 6% senescentie, zelfs na 10 passages in cultuur2.
DFAT-cellen zijn met succes opnieuw gedifferentieerd in verschillende lijnen, waaronder adipogene, osteogene, chondrogene en neurogene lijnen2,3,6. Deze cellen drukken verschillende embryonale stamcelmarkers uit, zoals Nanog en de vier geïdentificeerde pluripotente factoren Oct4, c-myc, Klf4 en Sox23. Ze drukken ook markers uit die specifiek zijn voor elk van de drie kiembanden7. Bovendien zijn DFAT-cellen vergelijkbaar met beenmerg-afgeleide mesenchymale stamcellen (BM-afgeleide MSC) op basis van hun epigenetische signatuur3. Door de stamcelcapaciteit van DFAT-cellen te benutten, hebben veel groepen hun potentieel onderzocht om verschillende ziekten te behandelen of te verbeteren8,9. Verbeteringen van pathologische toestanden, zoals infarct cardiaal weefsel, ruggenmergletsel en urethrale sfincterdisfunctie, zijn waargenomen bij injecties met DFAT-cellen in rattenmodellen van ziekten10-12.
Naast de stamceleigenschappen van DFAT-cellen, kunnen ze een nieuw cellulair model vertegenwoordigen voor studies naar adipocytenfysiologie. De 3T3-L1-cellijn wordt vaak voor dit doel gebruikt, aangezien deze cellen differentiëren tot adhesieve, lipide-opslaande adipocyten onder adipogene stimulatie13. Deze cellen zijn echter afkomstig van muis embryoweefsel13. Ook kan depot-specificiteit niet worden onderzocht met dit model en het geeft mogelijk niet volledig de menselijke adipocytenfysiologie weer14. Andere laboratoria werken met geïsoleerde vetcellen uit muis vetdepots, maar vetverdeling is niet dimorf bij muizen en de anatomische configuratie van de buikholte van de knaagdieren verhindert directe extrapolatie naar mensen15. Om adipocyten te bestuderen in de context van de fysiopathologie van menselijke obesitas, is het noodzakelijk om rekening te houden met de verdeling van lichaamsvet en depot-specifieke verschillen16. Sommige beperkingen van primaire preadipocytenculturen, inclusief de hoeveelheid cellen verkregen uit vetweefselbiopsiemonsters en hun senescentie na een paar passages in cultuur, hebben de behoefte aan alternatieve modellen gecreëerd. Perrini en medewerkers onderzochten depot-specificiteit in genexpressie van DFAT-cellen afkomstig van visceraal en subcutaan vet en vergeleken ze met adipogene stamcellen (ASC) uit hetzelfde vetdepot. Ze toonden aan dat verschillen in genexpressie en functie voornamelijk tussen depots werden gevonden in plaats van tussen celtypen, wat suggereert dat DFAT-cellen fysiologisch dicht bij ASC uit hetzelfde depot zijn. DFAT-cellen kunnen een interessante alternatieve optie vertegenwoordigen voor beschikbare modellen voor studies over vetverdeling in de fysiopathologie van menselijke obesitas. Bovendien is plafondcultuur een veelbelovende methode om volwassen stamcellen te verkrijgen voor weefselengineeringdoeleinden.
Hier beschrijven we collagenase-digestie, een veelgebruikte techniek om volwassen adipocyten te isoleren uit subcutane en/of viscerale vetmonsters17, en de daaropvolgende stappen om plafondcultuur uit te voeren en deze cellen te dedifferentiëren in multipotente, fibroblast-achtige cellen.

<table><tbody><tr><td>Bovine serum albumine</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine</td><td>Sigma</td><td>A4036</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma</td><td>A0278</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>Elke merk kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>Elke merk kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td>Elke merk kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td></td><td></td><td>Elke merk kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td>Elke merk kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td>Elke merk kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Glucose</td><td></td><td></td><td>Elke merk kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Type I collagenase</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>LS-004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES, geen fenolrood</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11039-021</td><td>Aan het medium toevoegen: 20% calf serum, gentamicine (50 &micro;g/ml) en fungizone (2,5 &micro;g/ml)</td></tr><tr><td>Calf Serum, met ijzer aangevuld, van formule-gevoede kalveren</td><td>Sigma</td><td>C8056-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>1/2 In plastic bushing</td><td>Iberville</td><td>2704-CP</td><td>SKU:1000120918 (Home Depot)</td></tr><tr><td>Vloeibare stikstof</td><td>Linde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaline oplossing, neutraal gebufferd, 10%</td><td>SIGMA</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Steriele pincetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steriele schaar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 cc spuiten</td><td>BD Syringe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kunststof buis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH)</td><td></td><td></td><td>Bereid stock buffer als volgt: 25 mM HEPES pH 7,6, 125 mM NaCl, 3,73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2,5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Pas pH aan tot 7,4.</td></tr><tr><td>Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB)</td><td></td><td></td><td>Voeg de volgende componenten vers toe aan KRH buffer: 4% bovien serum albumine, 5 mM glucose, 0,1 &micro;M adenosine, 560 &micro;M ascorbinezuur</td></tr><tr><td>KRH-WB aangevuld met Type I collagenase</td><td></td><td></td><td>Voeg 350 U/ml Type I collagenase toe</td></tr><tr><td>T25 ongeventileerde dop weefselkweekkolf</td><td>Sarsted of andere merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-well weefselkweekplaat</td><td>BD Falcon of andere merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscoop dekglas 22x22</td><td>Fisherbrand</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Steriele bekers</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generatie van de mens adipose stamcellen via dedifferentieëren mature adipocyten in plafond culturen

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Volwassen adipocyten hebben aangetoond dat ze hun fenotype kunnen omkeren in fibroblast-achtige cellen in vitro door middel van een techniek genaamd plafondcultuur. Volwassen adipocyten kunnen ook worden geïsoleerd uit vers vetweefsel voor depot-specifieke karakterisering van hun functie en metabole eigenschappen. Hier beschrijven we een goed gevestigd protocol om volwassen adipocyten uit vetweefsels te isoleren door middel van collagenase-digestie, en daaropvolgende stappen om plafondculturen uit te voeren. Kort samengevat, worden vetweefsels geïncubeerd in een Krebs-Ringer-Henseleit buffer die collagenase bevat om de weefselmatrix te verstoren. Drijvende volwassen adipocyten worden verzameld op het bovenste oppervlak van de buffer. Volwassen cellen worden geplaatst in een T25-kolf die volledig is gevuld met media en omgekeerd geïncubeerd gedurende een week. Een alternatieve 6-well plaat cultuur benadering maakt de karakterisering van adipocyten mogelijk die dedifferentiatie ondergaan. Adipocytmorfologie verandert drastisch gedurende de cultuurtijd. Immunofluorescence kan eenvoudig worden uitgevoerd op slides gekweekt in 6-well platen, zoals gedemonstreerd door FABP4 immunofluorescence kleuring. FABP4 eiwit is aanwezig in volwassen adipocyten maar wordt onderdrukt tijdens dedifferentiatie van vetcellen. Dedifferentiatie van volwassen adipocyten kan een nieuwe weg vertegenwoordigen voor celtherapie en weefsel engineering.

Belangrijke morfologische wijzigingen opkomen bij adipocyten vervaldatum binnen dedifferentiatie (figuur 1). Zoals getoond in Figuur 2, werden cellen die dedifferentiatie gekleurd met een anti-FABP4 antilichaam voor fluorescentieanalyse. Cellen met een ronde morfologie sprak de FABP4 eiwit, terwijl de meerderheid van de fibroblast-achtige cellen niet. Na dedifferentiation, kan DFAT cellen worden gekweekt met standaard procedures voor de verschillende passages. We zijn in staat om meer d...

Volwassen adipocyten kunnen een overvloedige bron van stamcellen vertegenwoordigen door dedifferentiatie, wat leidt tot een homogene populatie van fibroblast-achtige cellen. Collagenase-digestie wordt gebruikt om volwassen adipocyten uit menselijk vet te isoleren. Het doel van ons protocol is om multipotente, dedifferentieerde vetcellen te verkrijgen uit menselijke volwassen adipocyten.

Generatie van de Mens Adipose stamcellen via dedifferentieëren Mature Adipocyten in Plafond Culturen

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Rijpe adipocyten hebben het vermogen om in vitro te differentiëren tot precursorcellen. Dit wordt bereikt via seal-cultuur, een techniek waarbij rijpe cellen worden gekweekt in een kolf die volledig met medium is gevuld en ondersteboven wordt gecultiveerd. De drijvende cellen hechten zich aan de kolf en veranderen hun morfologie van een ronde cel gevuld met lipiden naar een langwerpige fibroblastachtige cel. Homogeen.Populaties van langwerpige cellen kunnen worden verkregen en gezuiverd na ontvangst van weefselmonsters in het laboratorium. Weeg het vetweefsel en plaats, afhankelijk van het benodigde aantal adipocyten, een geschikt volume van het monster in een 50 ml buis voor digestie; u kunt ongeveer 1 miljoen cellen per gram weefsel verwachten te verkrijgen.Plafondculturen worden uitgevoerd met 500.000 cellen per fles van 25 centimeter en 50.000 cellen per putje van een plaat met zes putjes. Voeg KRH-werkbuffer aan, aangevuld met collagenase, snipper het weefsel met een schaar en incubeer het preparaat bij 37 °C gedurende 45 minuten. Bereid tijdens de incubatie de opstelling van slangetjes en spuit voor. Giet de doorschijnende oplossing door een nylon gaas in een plastic bekerglas met behulp van een pincet.Wrijf de celpreparatie voorzichtig door het gaas en was deze met 5 ml KRH-werkbuffer. Breng de gefiltreerde celsuspensie met een spuit over in een buis van 50 ml. Laat de mature adipocyten ongeveer 10 minuten staan.De cellen zullen door flotatie naar de bovenkant van de buffer drijven. Aspireer de buffer langzaam vanaf de bodem. Voeg met een injectiespuit en slangetjes 20 ml KRH-werkbuffer toe om te wassen.Herhaal de wasstappen twee keer. Verzamel de buffer om de adipocyten-suspensie tot een eindvolume van 5 ml te brengen en bepaal vervolgens het celgetal met een hemocytometer. Vul een T25-fles voor driekwart met DMEM/F12 aangevuld met 20% kalfsserum en breng 500.000 volwassen adipocyten over naar de fles. Vul de fles aan met medium en verwijder luchtbellen van het oppervlak.Draai een dop op de kolf. Incubeer de kolf een week lang ondersteboven in een celkweekincubator met 5% carbon dioxide. Vermijd beweging van de kolf, aangezien resterende luchtbellen de celadhesie kunnen verstoren.Plaats een dekglas op de bodem van de wells. Plaats de plastic bushing in de well en vul de well met 8 ml medium. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.Plaats een dekglas op de bushing, waarbij voldoende ruimte wordt gelaten om de pipetpunt in te brengen. Neem een monster van 50.000 cellen en injecteer deze door de punt tussen het dekglas en de bushing te plaatsen. Incubeer de plaat gedurende een week of korter in een celkweekincubator met 5% koolstofdioxide.Afhankelijk van het experimentele ontwerp zijn er ten minste drie dagen nodig om de cellen te laten hechten aan het dekglas in een andere plaat. Keer de dekglazen om in 2 ml medium. In continue culturen kunnen de dekglazen vervolgens worden gefixeerd in formaline voor immunofluorescentie-experimenten of voor DNA-RNA- en eiwitextracties.De-differentiatie van volwassen adipocyten veroorzaakt grote veranderingen in de celmorfologie. Tijdens dit proces verliezen adipocyten hun fenotype en neemt de expressie van transcripten die gewoonlijk geassocieerd worden met hun vetopslagfunctie af. Deze immunofluorescentie-afbeelding toont adipocyten in verschillende stadia van de-differentiatie.De cellen met de ronde morfologie brengen nog steeds FABP4 uit, een marker voor mature adipocyten, terwijl de langgerekte cellen dit op basis van de literatuur niet meer doen. Gedifferentieerde vetcellen, vaak D-vetcellen genoemd, kunnen worden verkregen van jonge, oudere, slanke of obese patiënten. Hun capaciteit voor langetermijnkweek en hun aangetoonde multipotentie.Ik zie ook potentie voor weefselengineering en celtherapie. Ze kunnen een nieuw model vormen voor het post-specifieke onderzoek naar de adipocytenfysiologie.

generation-human-adipose-stem-cells-through-dedifferentiation-mature

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit protocol beschrijft de isolatie van vet-afgeleide stromale cellen van lipoaspirate en de oprichting van een 4 mm kritische grootte calvarial defect aan het skelet regeneratie te evalueren.

Reparatie van een kritische grootte Calvarial Defect Model Met behulp van Adipose-afgeleide stromale cellen geoogst uit Lipoaspirate

Dit protocol beschrijft de isolatie van varkens-vetafkomstige stamcellen (pADSC) uit subcutaan vetweefsel met onderzoek van multipotentie. De multipotente pADSC worden gebruikt om processen van adipocytendifferentiatie te bepalen en transdifferentiatie in meerdere cellijnen van mesodermaal mesenchym of verdere lijnen van ectoderm en endoderm te bestuderen voor regeneratieve onderzoeken.

Isolatie en differentiatie van vetcellen afgeleide stamcellen uit Porcine Onderhuids vetweefsel

We hebben de omstandigheden voor de DFAT-celgeneratie aangepast en geven hierbij informatie over het gebruik van een verbeterd groeimedium voor de productie van deze cellen.

Een efficiënte methode om gededifferentieerde Fat cellen te verkrijgen

De differentiatie van wit en beige adipocytes uit vetweefsel vasculaire progenitoren beren mogelijkheden voor metabole verbetering in obesitas. We beschrijven protocollen voor een CD34 + CD31 + endothelial cel los van menselijk vet en voor een latere in vitro expansie en de differentiatie in wit en beige adipocytes. Verschillende downstream toepassingen worden besproken.

Isolatie, uitbreiding en Adipogenic inductie van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van menselijke Omental en onderhuids vetweefsel

Het doel van dit protocol is voor het testen van de mogelijkheid van voorlopercellen afgeleid van menselijke gerelateerde adipeus weefsel te differentiëren in meerdere cel geslachten. Differentiatie werd vergeleken met mesenchymale stamcellen, afgeleid van menselijke beenmerg, waarvan bekend is dat het differentiëren in adipocyte, Osteocyt en chondrocyten geslachten.

Differentiatie capaciteit van menselijke aorta gerelateerde adipeus voorlopercellen

Membraan volwassen adipocyte aggregaat cultuur (MAAC) is een nieuwe methode om de cultuur volwassen menselijke adipocyten. Hier beschrijven we hoe adipocyten te isoleren van menselijke veten en hoe maac op te zetten.

Isolatie en cultuur van menselijke volwassen adipocyten met behulp van membraan volwassen adipocyte aggregaat culturen (MAAC)

We beschrijven een 3D menselijke extracellulaire matrix-adipocyte in vitro cultuur systeem dat het mogelijk maakt dissectie van de rollen van de matrix en adipocytes in bij te dragen tot vetweefsel metabole fenotype.

Een menselijke 3D-extracellulaire matrix-Adipocyte cultuur model voor het bestuderen van matrix-cel metabole Overspraak

We presenteren een protocol voor de isolatie, cultuur en adipogene inductie van neurale kam afgeleide vet-afgeleide stamcellen (NCADSCs) uit de periaortische vetweefsel van Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ muizen. De NCADSCs kunnen een gemakkelijk toegankelijke bron van ADSCs voor het modelleren van adipogenese of lipogenese in vitro.

Isolatie, cultuur en adipogene inductie van neurale crest originele vet-afgeleide stamcellen uit periaortic vetweefsel

Het protocol maakt het mogelijk om een zuivere adipocytenpopulatie te genereren uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Retinoïnezuur wordt gebruikt om iPSC's te differentiëren in mesenchymale stamcellen (MSC's) die worden gebruikt voor de productie van adipocyten. Vervolgens wordt een sorteerbenadering op basis van Nijlrode kleuring gebruikt om zuivere adipocyten te verkrijgen.

Robuuste differentiatie van menselijke iPSC's in een zuivere populatie van adipocyten om adipocyten-geassocieerde aandoeningen te bestuderen

Xenogene (chemische of dierlijke afgeleide) producten die worden geïntroduceerd in de voorbereidings-/manipulatiestappen voor celtherapie zijn geassocieerd met een verhoogd risico op immuunreactiviteit en pathogene overdracht bij gastheerpatiënten. Hier wordt een volledig xenogeneïsche vrije methode beschreven voor de isolatie en in vitro expansie van menselijke vet-afgeleide stamcellen.

Isolatie en kweek van menselijke vetstamcellen met een innovatieve xenogene-vrije methode voor menselijke therapie

Leer hoe je menselijke vetstamcellen genereert via dedifferentiatie van rijpe adipocyten in plafondculturen. Deze methode levert ongeveer 1 miljoen cellen per gram weefsel op.

Generatie van de Mens Adipose stamcellen via dedifferentieëren Mature Adipocyten in Plafond Culturen

Meer video's verkennen