Voorwaardelijke Genetische transsynaptische Tracing in de embryonale hersenen van muizen
22 december 2014
Door gebruik te maken van een binaire genetische strategie bieden we een gedetailleerd protocol voor het traceren van neurale circuits bij muizen die complementaire transsynaptische tracers tot expressie brengen na Cre-gemedieerde recombinatie. Omdat celspecifieke tracerproductie genetisch is gecodeerd, is onze experimentele aanpak geschikt om de vorming en rijping van neurale circuitreeksen te bestuderen tijdens de muis-embryonale hersenontwikkeling met een resolutie van één enkele cel.
Het doel van het volgende experiment is om de ontwikkeling van neurale circuits in de embryonale muizenhersenen te visualiseren met behulp van drie verschillende cellabelingsystemen door gebruik te maken van een transsynaptische tracer die bidirectioneel reist, een tweede tracer die alleen retrograde reist en een derde label dat niet vanuit de doelcel reist. Het is mogelijk om de doelneuron stroomopwaartse neuronen en stroomafwaartse neuronen te identificeren. De resultaten tonen aan dat dit experimentele protocol kan worden gebruikt om de vorming van neurale circuits in de embryonale vrouwelijke muizenhersenen met een resolutie van één cel te analyseren.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van ontwikkelingsneurowetenschap, zoals wanneer specifieke neurale circuits worden gevormd en hoe ze worden georganiseerd tijdens de embryonale ontwikkeling. Deze methode kan ook worden gebruikt om neurale circuits in volwassen muizen te traceren. Specifiek kan het worden gebruikt om synaptische activiteit tussen genetisch geïdentificeerde neuronen te analyseren, en het kan worden gebruikt om te analyseren hoe verschillende experimentele omstandigheden een neurale circuit in de loop van de tijd kunnen moduleren.
Begin met een net geëuthanasieerde zwangere muis. Reinig de ventrale zijde van haar buik met 70%ethanol en maak vervolgens een verticale incisie om de embryo's bloot te leggen. Verwijder de keten van embryo's en breng ze over naar een schaal met ijskoud PBS in de schaal.
Verwijder de individuele embryo's met stompe pincetten. Scheid de individuele embryo's in oplossing met behulp van fijne schaar en pincetten, verwijder extra weefsel in het proces wanneer de embryo's volledig zijn schoongemaakt. Neem een kleine staartbiopsie van elk embryo en doe deze in een buis met lysisbuffer om DNA te verzamelen voor geslachtsidentificatie en genotypering.
Breng vervolgens het embryo over naar vers gemaakt ijskoud, 4% PFA op ijs. Laat ze na verwerking van elk embryo in de PFA met agitatie incuberen gedurende minimaal 1,5 uur, afhankelijk van hun grootte. Wanneer de incubatie voltooid is.
Was de gefixeerde weefsels drie keer met ijskoud PBS gedurende minimaal vijf minuten per wasbeurt. Breng vervolgens de embryo's over naar een 30% sucroseoplossing, bewaard bij vier graden Celsius. Wanneer de weefsels volledig in de oplossing zijn gezonken, gaat u verder met cryosectie.
Begin eerst door een cryomal te labelen met een permanente alcoholbestendige marker. Bereid vervolgens een slurrie van gemalen droog ijs in 100% Ethanol in een ijskoud emmer met de slurrie om een glazen beker met iso pentaan ongeveer 10 minuten af te koelen. Terwijl u wacht, verwijdert u het weefsel van de sucroseoplossing en veegt u het overtollige sucrose af met een standaard laboratoriumdoek.
Breng vervolgens het weefsel over naar een vooraf gelabelde cryomal. Met voldoende OCT om het weefsel te bedekken. Vorm geen luchtbellen in de OCT, vooral niet rond het weefsel.
Richt vervolgens het weefsel uit met behulp van lichtgewicht entomologie pincetten om minimale schade te veroorzaken. Vries de cryomalen in het gekoelde iso pentaanbad in zonder eventueel sproeisel te veroorzaken. De bevroren mallen kunnen worden verpakt en opgeslagen bij min 80 graden Celsius om de mallen te snijden.
Snijd ze in serieuze secties van 14 micron dik in reeksen van vijf. Verzamel elke reeks van vijf plakken op een super frost plus glazen plaat. Zorg er bij het voorbereiden van de oplossing voor dit protocol voor dat u de tween 20 langzaam toevoegt aan de TNT buffer, die vers moet worden bereid.
Spoel vervolgens de oplossing langzaam omhoog en omlaag om te mengen. Bij het bereiden van de TNB buffer, voegt u het blokkeringsreagens langzaam toe in kleine incrementen terwijl u roert. Verwarm vervolgens de oplossing tot 55 graden Celsius met behulp van een waterbad.
De oplossing zal melkachtig worden. Gebruik nu om met de weefsels te beginnen een scalpel om het overtollige OCT rond de weefselsecties te verwijderen. Markeer vervolgens de grenzen van elke sectie met een pap pen.
Laat de plaatjes op kamertemperatuur komen. Was ze vervolgens in een XPBS-buffer bij kamertemperatuur, drie keer waarbij elke wasbeurt vijf minuten lang moet zijn. Kwets vervolgens de endogene peroxidase-activiteit door de plaatjes gedurende een half uur te incuberen in ijskoud 0,3% waterstofperoxide in methanol.
Volg dit met drie wasbeurten in PBS bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten per wasbeurt. Incubeer vervolgens de plaatjes gedurende 10 minuten in PBST om de weefsels te doordrenken. Was de plaatjes deze keer drie keer met TNT.
Blokeer vervolgens het weefsel in voldoende TNB om elke plaat te bedekken in een bevochtigde kamer. Laat het blok een half uur op kamertemperatuur staan. Laat de plaatjes niet uitdrogen.
Nadat de blokkeringsbuffer volledig is afgevoerd, bedekt u de plaat met het primaire antilichaam in TNB om de tracer te binden. Incubeer gedurende twee uur bij RT of een nacht bij vier graden Celsius. Om het primaire antilichaam te verwijderen, was de plaat met TNT drie keer bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten per wasbeurt.
Gedurende deze wasbeurten, gebruik wat zachte agitatie. Incubeer vervolgens de secties een uur in de secundaire antilichaamoplossing. Gebruik later bij kamertemperatuur drie TNT-wasbeurten om het ongebonden secundaire antilichaam te verwijderen.
Breng vervolgens in een bevochtigde kamer de weefsels in één tot 100 gestreept havein geconjugeerd paardenradijs peroxidase in TNB gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur terwijl u de plaatjes in TNT wast. Maak na de incubatie een verse verdunning van TSA-oplossing. Breng nu de vers gemaakte TSA-verdunning aan op de weefsels gedurende exact 10 minuten bij kamertemperatuur.
De precieze timing van TSA-incubatie is cruciaal. Probeer daarom niet te veel plaatjes tegelijkertijd te verwerken in onze hand. Maximaal 10 plaatjes kunnen in één stap worden verwerkt.
Aanvullende plaatjes kunnen in TNT-wasbuffer wachten totdat ze worden verwerkt. Volg een andere ronde wasb
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het in kaart brengen van neurale circuits in het embryonale muizenbrein met behulp van genetisch gecodeerde transsynaptische tracers. De methode maakt de visualisatie van de ontwikkeling van neurale circuits op enkelcelresolutie mogelijk.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Neurale circuits
Achtergrond
- Het begrijpen van de vorming van neurale circuits is essentieel voor de ontwikkelingsneurowetenschap.
- Transsynaptische tracers maken het mogelijk om de connectiviteit van neuronen te bestuderen.
- Het embryonale muizenbrein dient als model voor het bestuderen van de neurale ontwikkeling.
- Cel-specifieke productie van tracers maakt gerichte analyse mogelijk.
Doel van de studie
- Om de ontwikkeling van neurale circuits in het embryonale muizenbrein te visualiseren.
- Om de organisatie van specifieke neurale circuits tijdens de ontwikkeling te analyseren.
- Om een protocol te bieden dat toepasbaar is op zowel embryonale als volwassen muizen.
Gebruikte methoden
- Gebruik van drie verschillende celmarkeringssystemen.
- Toepassing van een bidirectionele transsynaptische tracer.
- Gebruik van een retrograde tracer en een niet-migrerende label.
- Analyse van neurale circuits met resolutie op enkelcelniveau.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol identificeert succesvol upstream- en downstream-neuronen.
- Resultaten tonen de vorming van neurale circuits in het embryonale brein van vrouwelijke muizen aan.
- De methode kan de synaptische activiteit in genetisch geïdentificeerde neuronen analyseren.
- Het maakt het mogelijk om te onderzoeken hoe experimentele condities neurale circuits in de loop van de tijd beïnvloeden.
Conclusies
- Dit experimentele protocol is effectief voor het bestuderen van de ontwikkeling van neurale circuits.
- Het biedt inzicht in de timing en organisatie van neurale circuits.
- De methode is veelzijdig voor zowel embryonale als adulte analyse van neurale circuits.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het begrijpen van de vorming van neurale circuits tijdens de embryonale ontwikkeling biedt mechanistische inzichten in neuro-ontwikkelingsstoornissen en ondersteunt de validatie van targets bij de ontdekking van geneesmiddelen voor het centrale zenuwstelsel. Deze genetisch gecodeerde transsynaptische traceermethode maakt activiteitsafhankelijke mapping van synaptische verbindingen op enkelcelresolutie mogelijk, wat een reproduceerbaar systeem biedt voor het verminderen van risico's bij therapeutische hypothesen met betrekking tot neurale connectiviteit. Door de noodzaak van stereotactische injectie te elimineren, verbetert de methode de standaardisatie en schaalbaarheid over verschillende ontwikkelingstijdstippen en genetische achtergronden, wat bijdraagt aan een consistente assay-voorbereiding voor target-engagementstudies.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege Ontdekking & Target Validatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door de synaptische connectiviteit tussen genetisch gedefinieerde neuronale populaties te visualiseren tijdens kritieke ontwikkelingsperioden.
- Operationele waarde: Biedt een genetisch gecodeerd, injectievrij systeem dat een consistente expressie van tracers waarborgt en de variabiliteit in experimenten voor circuitmapping vermindert.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, activiteitsafhankelijke transsynaptische signaalmetingen die de functionele synaptische communicatie tussen upstream- en downstream-neuronen weerspiegelen.
- Operationele waarde: Ondersteunt de standaardisatie van assays via Cre-afhankelijke, locus-specifieke expressie vanuit de ROSA26-locus, wat reproduceerbare preparatie van neuraal weefsel voor downstream-analyse mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert mechanische risicoreductie door onderzoekers in staat te stellen te traceren hoe genetische of farmacologische verstoringen de vorming van neurale circuits in de loop van de tijd beïnvloeden in embryonale modellen die relevant zijn voor ziekten.
- Operationele waarde: Biedt een platformcompatibele workflow die kan worden geïntegreerd met immunofluorescentie, genotypering en imaging-pipelines voor multi-parametrische validatie van target engagement.
Integratie van pipeline en workflow
De methode ondersteunt workflows voor vroege ontdekking door hypothese-gestuurde circuitmapping mogelijk te maken voorafgaand aan de identificatie van leads, waarbij de resultaten informatie verschaffen over de betrouwbaarheid van targets en de gereedheid voor fenotypische screening in neurodevelopmentale programma's.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt biologische risicoreductie door de vorming en rijping van specifieke neurale circuits, zoals die welke de reproductie-as reguleren, te visualiseren met een resolutie op enkelcelniveau.
- Screening: Maakt de voorbereiding mogelijk van gestandaardiseerde, genetisch traceerbare neurale systemen die geschikt zijn voor het evalueren van compound-effecten op de synaptische connectiviteit in embryonale of volwassen hersenen.
- Analytica: Produceert kwantitatieve fluorescentiegebaseerde readouts (bijv. BL, GTT signaaloverdracht) die vergelijking van synaptische activiteit tussen condities, genotypen of ontwikkelingsstadia mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt embryonale circuitvorming met postnatale functie door longitudinale analyse mogelijk te maken van hoe vroege ontwikkelingsverstoringen de neurale connectiviteit van volwassenen beïnvloeden.
- Herbruikbaarheid op bedrijfsniveau: De dubbele ROSA26 knock-in stammen vormen een herbruikbaar genetisch platform dat toepasbaar is op meerdere CNS-doelen en ziektemodellen zonder dat herhaalde chirurgische interventie vereist is.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie door direct, activiteitsafhankelijk bewijs te leveren voor synaptische connectiviteit tussen genetisch gedefinieerde neuronpopulaties.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid en vermindert technische variabiliteit via Cre-afhankelijke, locus-gecontroleerde expressie, waardoor inconsistenties door injecties worden geëlimineerd.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go-besluitvorming bij de selectie van targets in het centraal zenuwstelsel (CNS) door vroege visualisatie mogelijk te maken van effecten op circuitniveau bij genetische of farmacologische modulatie.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door mechanistische gegevens te genereren over neurale circuitvorming, wat de prioritering van targets bij neurodevelopmentele en psychiatrische indicaties informeert.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in muisembryologie, genotypering en fluorescentiemicroscopie voor een correcte behandeling van embryo's, sectiebehandeling en signaaldetectie.
- Afhankelijk van de beschikbaarheid van Cre-driverlijnen en fluorescerende reportersystemen voor cel-specifieke labeling en multimodale validatie.
- Vereist gestandaardiseerde fixatie-, cryosectie- en immunohistochemische protocollen om het tracersignaal te behouden en een reproduceerbare sectiekwaliteit te garanderen.
- Aanpassing aan verschillende modelsystemen is afhankelijk van de conservering van de transsynaptische tracerfunctionaliteit en promoterspecificiteit in niet-murine soorten.
- Praktische beperkingen omvatten de afhankelijkheid van synaptische activiteit voor traceroverdracht, wat de gevoeligheid in circuits met een lage activiteit of onrijpe circuits kan beïnvloeden.
