Name: Voorwaardelijke Genetische transsynaptische Tracing in de embryonale hersenen van muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Verken voorwaardelijke genetische transsynaptische tracing in embryonale muizenhersenen. Deze methode visualiseert neurale circuitontwikkeling met enkele-celresolutie en helpt onderzoekers neuronconnectiviteit te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We danken Michael Candlish voor zijn kritische opmerkingen over het manuscript. Dit project werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft-subsidies BO1743/6 en SFB/TRR 152 P11 en Z02 aan Ulrich Boehm.

OPMERKING: Ethiek Verklaring: Procedures met dierlijke proefpersonen werden goedgekeurd door het dierenwelzijn commissie van de Universiteit van Hamburg en de Universiteit van Saarland. 1. Voorbereiding en Fixatie van embryonaal weefsel <ol><li> Schik alle apparatuur die nodig is om te ontleden uit de embryo&#39;s en oplossingen voor de daaropvolgende fixatie van het weefsel te bereiden voor het opofferen van de dieren. OPMERKING: bereid altijd vers 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing (4% PFA in 0,1 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH op 7,4). </li><li> Euthanaseren getimede zwangere vrouwelijke muis met een ethisch goedgekeurde procedure. </li><li> Overdracht van de muis op een platform. Bevochtig de ventrale zijde van de buik met 70% ethanol en maak een verticale incisie met behulp van een scherpe schaar om de buikholte bloot te leggen. </li><li> Identificeer de embryonale ketting en trek het voorzichtig uit het gebruik van stompe pincet en plaats deze in ijskoude PBS. </li><li> Verwijder de individuele embryo&#39;s uitde embryonale ketting met behulp van fijne schaar en pincet. Verwijder extra weefsel rond de embryo&#39;s en was ze in ijskoud PBS. </li><li> Neem een ​​kleine staart biopsie (vóór de overdracht van de embryo in PFA) en incubeer het in de staart lysebuffer voor de identificatie geslacht en tracer allel genotypering PCR. </li><li> Begin van het embryo in de meest laterale zijde en breng elke embryo afzonderlijk in een buis met daarin ijskoude 4% PFA op ijs op een shaker. </li><li> Geniet het embryo op leeftijd E13.5 of jonger 1,5 uur op ijs met constant schudden. Week de embryo&#39;s op de leeftijd van E14.5 en E15.5 voor 2,5 uur op ijs met constante schudden. </li><li> Voor embryo leeftijd E16.5 of ouder, onthoofden en verwijder de buitenste huid voor het weken de kop in PFA-oplossing. Hoofden van E16.5 embryo&#39;s kunnen worden geweekt voor 4,5 uur op ijs met constante schudden. </li><li> Na geschikte fixatie, was het embryo drie maal met ijskoude PBS. Breng de embryo&#39;s in 30% sucrose in PBS oplossing bij 4 ° C totdat ze zinkennaar de bodem. </li></ol> 2. Bevriezing <ol><li> Schik alle vereiste voordat het invriezen materialen: cryo-schimmel, cryo-handschoenen, vedergewicht entomologie tang, viltstift en optimale snijtemperatuur verbinding (oktober) </li><li> Label de cryo-vorm met een permanente alcohol-resistente marker (vermelden van de oriëntatie van het weefsel, datum en genotype). Bereid een slush van gemalen droog ijs en 100% ethanol in een ijsemmer. Plaats een glazen beker van binnen met isopentaan. Wacht 10 minuten voor de isopentaan afkoelen. </li><li> Ondertussen verwijder het weefsel van de sucrose oplossing, veeg het overtollige sucrose rond het weefsel met behulp van laboratorium doekjes. Breng het weefsel in een gelabelde cryo-vorm met voldoende oktober het weefsel bedekken. Vermijd eventuele luchtbellen in de LGO; vooral rond het weefsel. </li><li> Oriënteren het weefsel in oktober met behulp vedergewicht entomologie tang om weefselschade te voorkomen. Begin bevriezen door de overdracht van de cryo-mold in de pre-gekoelde isopentaan bad. Niet spetteren isopentaan in het LGO want het zal niet goed bevriezen. Wikkel de monsters in aluminiumfolie en bewaar bij -80 ° C. </li></ol> 3. cryosectioning <ol><li> Snijd 14 micrometer dunne seriecoupes in serie &#39;van vijf met behulp van een cryostaat en verzamelen over SuperFrost® Plus glasplaatjes voor immunofluorescentie (IF) analyse. Bewaar de slides bij -80 ° C tot gebruikt. </li></ol> 4. Tracer visualisatie Met de Tyramide signaalversterking (TSA) Protocol <ol><li> Bereid de buffers en reagentia nodig voor kleuring. Altijd vers bereiden Tris-NaCl-Tween (TNT) buffer op de dag van gebruik. <ol><li> Bereid TNT buffer met 100 ml van 1 M Tris-HCl pH 7,5, 30 ml van 5 M NaCl en DDH 2 O tot een eindvolume van 1 L. Voeg 500 ul Tween 20 met een pipet 1 ml. Voeg Tween 20 langzaam en spoel de pipet op en neer herhaaldelijk dat alle Tween 20 inoplossing. </li><li> Bereid Tris-NaCl-Blocking (TNB) buffer met 100 ml van 1 M Tris-HCl pH 7,5, 30 ml van 5 M NaCl en DDH 2 O tot een eindvolume van 1 L. toevoegen 5 g Blocking Reagent (bij de kit) langzaam geleidelijk bij om de buffer onder roeren. Verwarm de oplossing langzaam tot 55 ° C onder voortdurend roeren tot volledig op te lossen Blocking Reagent (dit mag niet langer dan 30-60 min). Om dit te bereiken homogene verwarming gebruik maken van een waterbad bij 55 ° C. De oplossing zal verschijnen melkachtig. Breng de oplossing op kamertemperatuur voor gebruik. Aliquot en bewaar bij -20 ° C voor langdurige opslag. </li><li> Reconstitueren biotine tyramide reagens (geleverd bij de kit) in Molecular Biology / HPLC-kwaliteit DMSO. Afhankelijk van welke kit wordt gebruikt de juiste hoeveelheid DMSO kan variëren. Bewaar de voorraad oplossing bij 4 ° C. Opmerking secties van dieren die heterozygoot zijn voor de respectievelijke Cre en R26 allelen kan worden gebruikt voor circuit analyse. Gebruik sbespiegelingen van nestgenoten die één Cre of één R26 allel, respectievelijk als negatieve controles. Behandel negatieve controle dia&#39;s precies zoals dia&#39;s van dubbel heterozygote dieren. Daarnaast bestaan ​​uit één dia uit een dubbel heterozygote dieren, maar laat de TSA reagens (onversterkte controle). </li></ol></li><li> Met behulp van een scherpe verse scalpel verwijderen overtollige oktober rond het weefsel secties en markeer de grens rond de secties met een PAP pen. </li><li> Droog de objectglaasjes gedurende 2-3 min bij kamertemperatuur (RT). Was de dia&#39;s bij RT 3x met TNT gedurende 5 minuten elk. Incubeer de glaasjes bij RT gedurende 30 min in 0,3% H 2 O 2 oplossing ijskoude methanol om endogene peroxidase activiteit te blussen. </li><li> Was 3x met PBS gedurende 5 min elk bij kamertemperatuur. Incubeer gedurende 10 minuten in 0,5% Triton X-100 in PBS voor tissue permeabilisatie. Was de dia&#39;s bij RT 3x met TNT gedurende 5 minuten elk. </li><li> Blok met TNB (blokkeeroplossing, 200-300 ul per dia) voor 30min bij RT in een vochtige kamer. Zorg ervoor dat alle onderdelen zijn volledig bedekt door TNB. Laat niet de dia&#39;s uitdrogen tussen de stappen. </li><li> Giet overtollige blokkeerbuffer en het primaire antiserum herkennen van de tracer toepassen (1: 1,000 geit anti-WGA BL, 1: 15,000 konijn anti-GFP voor GTT) verdund in TNB 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. Zorg ervoor dat u voldoende volume te gebruiken om volledig te bedekken de sectie weefsel (200-300 ul per dia). OPMERKING: De primaire antisera verdunningen hier aangeraden eventueel moeten worden aangepast. </li><li> Was de dia&#39;s bij KT 3x met TNT gedurende 5 minuten elk met roeren. </li><li> Incubeer de secties met gebiotinyleerde secundaire antiserum herkennen de gastheer van de eerste antiserum (1: 500 paard anti-geit IgG anti-WGA, 1: 5000 geit anti-konijn IgG van anti-GFP in TNB gedurende 1 uur bij RT). </li><li> Was 3x met TNT bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten elk met roeren. Incubeer in 1: 100 streptavidine (SA) geconjugeerd mierikswortelperoxidase (SA-HRP, mits with de kit) in TNB gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een vochtige kamer. Was de dia&#39;s bij RT 3x met TNT gedurende 5 minuten elk. Ondertussen ontdooien de TSA. </li><li> Verdun 1:50 in TSA TSA amplificatie oplosmiddel (bij de kit, gebruik TSA kit voor de visualisatie van BL en de TSA + kit voor GTT). Incubeer het weefsel secties in verdunde TSA voor precies 10 min bij kamertemperatuur. Verdunnen TSA vlak voor gebruik, ideaal tijdens de vorige wasstap, hoeft de resterende verdund TSA reagens voor toekomstige experimenten niet te gebruiken; altijd vers bereid. </li><li> Was de dia&#39;s bij KT 3x met TNT gedurende 5 minuten elk met roeren. Incubeer met 1: 500 Alexa Fluor® 546 streptavidine conjugaat in TNB gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de dia&#39;s bij KT 3x met TNT gedurende 5 minuten elk met roeren. </li><li> Incubeer gedurende 10 min in 5% bisbenzimide oplossing in PBS bij kamertemperatuur nucleaire kleuring. Was de dia&#39;s bij KT 3x met TNT gedurende 5 minuten elk met roeren. Monteer met Fluromount G en epifluorescentie of confocale microscopie. <em&gt; Problemen: Werkzaamheid van tracer overdracht zal afhangen van het expressieniveau van de ROSA26 locus in de cellen (bepaald door het Cre pilotenteam gebruikt) en het neurale circuit geanalyseerd (bijv aantal neuronen produceren van de tracer, convergentie etc.). Daarom is de primaire antisera verdunningen hier aangeraden eventueel moeten worden aangepast aan de lage of overtollige signaal te voorkomen. Achtergrond moeten altijd worden geanalyseerd met geschikte controleglaasjes (zie hierboven). </li></ol> 5. τlacZ kleuring voor Embryonale secties <ol><li> Bereid de buffers en reagentia nodig voor kleuring. Altijd vers bereiden de LacZ- buffer C voor gebruik. <ol><li> Bereid 5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) voorraadoplossing (40 mg / ml) door toevoeging van 40 g van X-gal aan 1 ml 70% dimethylformamide (DMF). Dek af met aluminiumfolie en bewaar bij -20 ° C voor langdurige opslag. </li><li> Bereid nitroblauwtetrazolium (NBT) stock oplossing (50 mg / ml) door toevoeging van 50 g NBT tot 1 ml 70% DMF. Dek af met aluminiumfolie en bewaar bij -20 ° C voor langdurige opslag. </li><li> Bereid LacZ fixeermiddel met 80 pl 25% glutaaraldehyde, 5 ml 4% PFA, 20 pl 1 M MgCl2, 100 ul 500 mM EGTA, 1 ml 1 M fosfaatbuffer pH 7,4 en DDH 2 O tot een uiteindelijke volume van 10 ml. </li><li> Bereid LacZ buffer A met 1 ml 1 M MgCl2, 5 ml 500 mM EGTA, 50 ml 1 M fosfaatbuffer pH 7,4 en DDH 2 O tot een eindvolume van 500 ml. </li><li> Bereid LacZ buffer B met 1 ml 1 M MgCl2, 5 ml 500 mM EGTA, 5 ml 1% natriumdeoxycholaat, 100 ml van 10% NP-40, 50 ml 1 M fosfaatbuffer pH 7,4 en DDH 2 O tot een eindvolume van 500 ml. </li><li> Bereid LacZ- buffer C door het toevoegen van 10 ul van NBT stockoplossing en 12,5 ul van X-gal stockoplossing aan 1 ml LacZ- buffer B. Maak verse vlak voor gebruik en dek af met aluminiumfolie. </li></ol&gt; </li><li> Droog de glaasjes bij RT in ieder geval voor 10-15 min (ondertussen de dia&#39;s met een PAP pen te bereiden). </li><li> Bevestig de sectie LacZ fixeermiddel gedurende 2 min bij kamertemperatuur in een vochtige kamer in een chemische damp-kap. Was 3 maal met PBS aangevuld met 2 mM MgCl2. </li><li> Spoel de objectglaasjes LacZ buffer A. Was de dia&#39;s met LacZ buffer A 3 maal gedurende 10 min elk bij kamertemperatuur. Was 2 maal met LacZ buffer B gedurende 5 minuten elk. Incubeer de glaasjes in LacZ buffer C bij 30-37 ° C gedurende 6 uur of overnacht in een vochtige kamer. OPMERKING: Voeg voldoende volume van LacZ- buffer C; dia&#39;s mag niet uitdrogen tijdens de incubatie. </li><li> Na geschikte incubatie Was de dia&#39;s met PBS aangevuld met 2 mM MgCl2. Spoel secties kort met DDH 2 O. Dekglaasje met Mayer&#39;s glycine gelatine. Geschikt voor een lichtmicroscoop uitgerust met een differentieel interferentie contrast (DIC) beeldvorming set-up. </li></ol> 6. GendER en Tracer Genotyping <ol><li> Bereid staart lysis buffer met 1 ml van 1 M Tris-HCl pH 8,5, 100 ul 500 mM EGTA, 200 pl 10% SDS, 400 pl van 5 M NaCl en DDH 2 O om een eindvolume van 10 ml. </li><li> Voeg 500 ul van de staart lysebuffer aan elke Eppendorf buis met een staart biopsie. Voeg proteinase K tot een uiteindelijke concentratie van 100 mg / ml. Incubeer overnacht op een schudder bij 55 ° C. </li><li> Centrifugeer de monsters bij 17.000 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Breng het supernatant naar een nieuwe centrifugebuis. Voeg 500 ul isopropanol aan het supernatant. Meng gedurende ten minste 5 minuten door het omkeren van de buizen op en neer. </li><li> Spin in centrifuge bij 17.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Giet het supernatant. Voeg 200 ui 70% ethanol. Schud gedurende tenminste 5 min. </li><li> Centrifugeer bij 17.000 xg gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant met een Pipetman (niet afgieten). Droog de pellet in een warme kamer (37 ° C) gedurende 15-30 min. </li><li> Resuspendeer pellet in 100 plvan lage TE pH 8,0 of water met behulp van wide-bore gefilterd tips. Installeer 55 ° C gedurende 1 uur en bij 37 ° C gedurende de nacht voor een goede oplossen. Bewaar bij 4 ° C. </li><li> Met 1 pl DNA voor PCR-reactie (50 ui reactiemengsel dat 1 pl staart DNA, 2,5 pl DMSO, 10:00 van elke primer, 25 uM van elk dNTP, 1 M en betaïne). PCR-primers voor genotypering en gender identificatie zijn vermeld in de tabel Materials. </li></ol>

<ol><li>Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+techniques+for+tracing+pathways+in+the+central+nervous+system+of+developing+and+adult+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals.</a> Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).</li>
<li>Huang, Z. J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approaches+to+neural+circuits+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic approaches to neural circuits in the mouse.</a> Annu. Rev. Neurosci. 36, 183-215 (2013).</li>
<li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+half+century+of+experimental+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">A half century of experimental neuroanatomical tracing.</a> J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).</li>
<li>DeFalco, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-assisted+mapping+of+neural+inputs+to+a+feeding+center+in+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus.</a> Science. 291, 2608-2613 (2001).</li>
<li>Kumar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+arcuate+nucleus+kisspeptin+neurons+communicate+with+GnRH+neurons+in+utero%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Murine arcuate nucleus kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in utero.</a> J. Neurosci. 34, 3756-3766 (2014).</li>
<li>Horowitz, L. F., Montmayeur, J. P., Echelard, Y., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+approach+to+trace+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A genetic approach to trace neural circuits.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3194-3199 (1999).</li>
<li>Maskos, U., Kissa, K., ST Cloment, C., Brulet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+trans-synaptic+transfer+of+green+fluorescent+protein+allows+the+genetic+mapping+of+neuronal+circuits+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Retrograde trans-synaptic transfer of green fluorescent protein allows the genetic mapping of neuronal circuits in transgenic mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10120-10125 (2002).</li>
<li>De Roux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypogonadotropic+hypogonadism+due+to+loss+of+function+of+the+KiSS1-derived+peptide+receptor+GPR54%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function of the KiSS1-derived peptide receptor GPR54.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10972-10976 (2003).</li>
<li>Seminara, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GPR54+gene+as+a+regulator+of+puberty%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">The GPR54 gene as a regulator of puberty.</a> N. Engl. J. Med. 349, 1614-1627 (2003).</li>
<li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+completion+of+puberty+in+female+mice+depend+on+estrogen+receptor+alpha-signaling+in+kisspeptin+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor alpha-signaling in kisspeptin neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 22693-22698 (2010).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat. Genet. 21, 70-71 (1999).</li>
<li>Seibler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+copy+shRNA+configuration+for+ubiquitous+gene+knockdown+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Single copy shRNA configuration for ubiquitous gene knockdown in mice.</a> Nucleic Acids Res. 33, e67(2005).</li>
<li>Semaan, S. J., Kauffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+on+the+epigenetic+and+transcriptional+regulation+of+the+Kiss1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts on the epigenetic and transcriptional regulation of the Kiss1 gene.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 31, 452-462 (2013).</li>
<li>Feil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-activated+site-specific+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ligand-activated site-specific recombination in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10887-10890 (1996).</li>
</ol>

Geen belangenconflict gedeclareerd.

Uitdrukken transsynaptische tracers als transgenen naar de neurale circuits van genetisch bepaalde neuronale populatie traceren heeft een aantal voordelen ten opzichte van de stereotactische injectie van tracers of neurotopic virussen. Eerst wordt de tracer geproduceerd als een endogeen eiwit en dus geen immuunrespons opwekken en een selectieve neurale weg kan verschillende dieren met een hoge reproduceerbaarheid geanalyseerd. Ten tweede, aangezien dit een niet-invasieve methode kan worden gebruikt om de circuits tracer...

Anatomische pad tracing is een van de meest gebruikte middelen om de relatie tussen hersenen en gedrag 1 ontcijferen. Vooruitgang in de neurale circuit tracing technologieën heeft neurowetenschappers geschonken met de mogelijkheid om neurale circuits sporen van genetisch geïdentificeerd neuron bevolking in muizen 2. Ondanks deze technische vooruitgang blijft een uitdaging om de vorming van neurale circuits ontrafelen vooral tijdens embryonale ontwikkeling. Dit is omdat de meeste van de tracering worden ontwikkeld tijd berusten op stereotaxische injectie van transsynaptische tracers of genetisch gemodificeerde neurotrope virussen (figuur 1) 2,3. Hoewel deze technieken te bereiken ruimtelijke en temporele resolutie van connectiviteit, een aantal inherente beperkingen, zoals technisch uitdagende tracer injecties in de ontwikkeling van de hersenen, de reproduceerbaarheid van de plaats van injectie, potentiële ontsteking op de injectieplaats en de meeste belang-tantly cytotoxiciteit veroorzaakt door neurotrope virussen beperken hun gebruik 4. Een alternatieve methode is het transsynaptische tracers als transgenen in genetisch gemanipuleerde muizen tot expressie. We hebben recent gewijzigde deze techniek en ontwikkelde een binaire genetische transsynaptische tracing systeem om de neurale circuits van elk genetisch geïdentificeerd neuronale populatie 5 in kaart. Onze experimentele strategie is gebaseerd op twee nieuwe knock-in muizen stammen, die ofwel de bidirectionele merker gerst lectine (BL) 6 of retrograde tracer tetanustoxinefragment C gefuseerd aan GFP (GTT) 7 van de ROSA 26 locus kenbaar na Cre gemedieerde recombinatie. Hier gebruiken we deze muis stammen om selectief te uiten BL en GTT in neuronen die kisspeptin produceren, een neuropeptide dat betrokken is bij het ​​reguleren van de rijping van de reproductieve as 8,9. We tonen aan dat deze techniek geschikt is voor de ontwikkeling en rijping van kiss visualiserenpeptin neurale circuits tijdens de embryonale ontwikkeling van de vrouwelijke hersenen van muizen 5. Kweekstrategie De R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) en de R26-GFP-TTC (GTT) tracer lijnen zijn knock-in stammen 5 dat recombinant ROSA26 allelen dragen. De R26-BIZ en R26-GTT allelen transcriptioneel stil door de aanwezigheid van een sterk transcriptie stopsignaal, die wordt geflankeerd door twee loxP plaatsen 5. Expressie van de BIZ en GTT transgen wordt geactiveerd door Cre gemedieerde verwijdering van de transcriptie stopsignaal. De R26-BIZ en R26-GTT allelen kunnen onafhankelijk door simpelweg kruising met een Cre bestuurder lijn worden gebruikt. Voor analyse dieren heterozygoot voor de respectievelijke Cre en R26 allelen kunnen worden gebruikt. Nestgenoten die één Cre of een allel R26, respectievelijk, worden gebruikt als controles. Als alternatief is het ook mogelijk om t genererenriple knock-in dieren die het Cre, R26-BIZ en R26-GTT allelen, maar dit zal een extra kruis nodig.

<table><tbody><tr><td>Bisbenzimide (Hoechst 33258 dye)</td><td>Sigma</td><td>14530-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>32205-1L</td><td></td></tr><tr><td>Cryo mold (Peel-a-way)</td><td>Polyscience Inc.</td><td>18646A-1</td><td>22 x 22 x 20mm</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Formamide (DMF)</td><td>VWR Chemicals</td><td>23470,293</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ROTH</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma</td><td>G5882-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Sigma</td><td>34988-7</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane (Methyl 2-butane)</td><td>Sigma</td><td>M32631-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser's glycine gelatin</td><td>Merck</td><td>1092420100</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>494437-1L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ROTH</td><td>HN00.2</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Sigma</td><td>298-83-9</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 substitute</td><td>Fluka</td><td>743.85</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Leica</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Parafarmaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>FT4981GLPLUS</td><td></td></tr><tr><td>TSA kit</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL700</td><td></td></tr><tr><td>TSA plus kit</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL749A001KT</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>ROTH</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>ROTH</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>ROTH</td><td>2315.1</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope equipped with DIC imaging</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 equipped with Axio Vision software</td><td></td></tr><tr><td>Fluroscence microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 equipped with Axio Vision software</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>PS6</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-WGA (recognizes BL)</td><td>Vector Laboatories</td><td>AS-2024</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylayted horse anti-goat IgG</td><td>Vector Laboatories</td><td>BA-9500</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated goat anti-rabbit IgG</td><td>Vector Laboatories</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP (recognizes GTT)</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GnRH</td><td>Affinity Bio Reagent</td><td>PA1-121</td><td></td></tr><tr><td>Dylight488-donkey anti-rabbit IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>SA5-10038</td><td></td></tr><tr><td>SA-Alexa Fluor 546</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Primers</td></tr><tr><td>BL Fwd (for BIZ genotyping)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>ATGAAGATGATGAGCACCAGGGC</td></tr><tr><td>BL Rev (for BIZ genotyping)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCCCTCGCCGCAGAACTC</td></tr><tr><td>Cre Fwd (for Cre genotyping)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG</td></tr><tr><td>Cre Rev (for Cre genotyping)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC</td></tr><tr><td>TTC Fwd (for GTT genotyping)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCAAGGGCGAGGAGCTGTT</td></tr><tr><td>TTC Rev (for GTT genotyping)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA</td></tr><tr><td>XY Fwd (for gender genotyping)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>TGAAGCTTTTGGCTTTGA</td></tr><tr><td>XY Rev (for gender genotyping)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CCGCTGCCAAATTCTTTG</td></tr><tr><td>ROSA26 Fwd</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td></tr><tr><td>ROSA26 Rev</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GCAGATGGAGCGGGAGAAAT</td></tr><tr><td>SA Rev</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td></tr></tbody></table>

voorwaardelijke genetische transsynaptische tracing in de embryonale hersenen van muizen

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomisch padtracing is van cruciaal belang om de relatie tussen hersenen en gedrag te ontcijferen. Het ontrafelen van de vorming van neurale circuits tijdens embryonale ontwikkeling van de hersenen is echter technisch uitdagend omdat de meeste transsynaptische traceermethoden die tot nu toe zijn ontwikkeld, afhankelijk zijn van stereotactische tracerinjectie. Om dit probleem op te lossen, hebben we een binaire genetische strategie ontwikkeld voor conditionele genetische transsynaptische tracering in de muizenhersenen. Hiervoor hebben we twee complementaire knock-in muisstammen gegenereerd om selectief de bidirectionele transsynaptische tracer barley lectin (BL) en de retrograde transsynaptische tracer Tetanus Toxin fragment C vanuit het ROSA26-locus uit te drukken na Cre-gemedieerde recombinatie. Celspecifieke tracerproductie in deze muizen is genetisch gecodeerd en is niet afhankelijk van mechanische tracerinjectie. Daarom is onze experimentele aanpak geschikt om neurale circuitvorming in de embryonale muisencefalon te bestuderen. Bovendien, omdat traceroverdracht over synapsen afhankelijk is van synaptische activiteit, kunnen deze muisstammen worden gebruikt om de communicatie tussen genetisch gedefinieerde neuronale populaties tijdens hersenontwikkeling met een enkele celresolutie te analyseren. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor transsynaptische tracering in muisembryo's met behulp van de nieuwe recombinante ROSA26 allelen. We hebben deze experimentele techniek gebruikt om de neurale circuiterie te bepalen die ten grondslag ligt aan de maturatie van de reproductieve as in de zich ontwikkelende vrouwelijke muizenhersenen.

Deze sectie toont representatieve resultaten die kunnen worden verkregen werken met de R26-BIZ (B L I RES-τlac Z) en de R26-GTT (G FP TT C) allelen. Hier gebruiken we de R26-BIZ en de R26-GTT allelen op de rijping van de neurale circuits reguleren van de reproductieve as analyseren. Reproductie in gewervelde dieren wordt centraal geregeld door een kleine subset van neuronen in de hypothalamus, die gonadotrofine-releasing hormoon (GnRH) afscheiden. Kisspepti...

Door gebruik te maken van een binaire genetische strategie bieden we een gedetailleerd protocol voor het traceren van neurale circuits bij muizen die complementaire transsynaptische tracers tot expressie brengen na Cre-gemedieerde recombinatie. Omdat celspecifieke tracerproductie genetisch is gecodeerd, is onze experimentele aanpak geschikt om de vorming en rijping van neurale circuitreeksen te bestuderen tijdens de muis-embryonale hersenontwikkeling met een resolutie van één enkele cel.

Voorwaardelijke Genetische transsynaptische Tracing in de embryonale hersenen van muizen

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Het doel van het volgende experiment is om de ontwikkeling van neurale circuits in het embryonale brein van de muis te visualiseren met behulp van drie verschillende celmarkeringssystemen: een transsynaptische tracer die bidirectioneel transporteert, een tweede tracer die uitsluitend retrograd하게 transporteert en een derde label dat niet vanuit de doelcel transporteert. Het is hiermee mogelijk om het doelneuron, de upstream neuronen en de downstream neuronen te identificeren. De resultaten tonen aan dat dit experimentele protocol kan worden gebruikt om de vorming van neurale circuits in het embryonale brein van een vrouwelijke muis te analyseren met een resolutie op enkelcelniveau.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de ontwikkelingsneurowetenschappen, zoals wanneer specifieke neurale circuits worden gevormd en hoe deze georganiseerd zijn tijdens de embryonale ontwikkeling. Deze methode kan ook worden gebruikt om neurale circuits in volwassen muizen te traceren. In het bijzonder kan het worden ingezet om de synaptische activiteit tussen genetisch geïdentificeerde neuronen te analyseren, en om te onderzoeken hoe verschillende experimentele condities een

conditional-genetic-transsynaptic-tracing-in-the-embryonic-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Mozaïek Analyse van Gene Functie in Postnatale Mouse ontwikkeling van de hersenen met behulp van Virus-based Cre recombinatie

Een genoverdracht methode in de zich ontwikkelende hersenen van muizen wordt beschreven door middel van een unieke chirurgische methode en de speciale vorm van de elektroden. Deze unieke techniek maakt het mogelijk transfectie van plasmide DNA tijdelijk en ruimtelijk, die veel neurowetenschappers zullen helpen bij het bestuderen van ontwikkeling van de hersenen.

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

Dit artikel beschrijft in detail een protocol bij electroporate in utero de cerebrale cortex en de hippocampus bij E14.5 bij muizen. We tonen ook aan dat dit een waardevolle methode om dendrieten en stekels te bestuderen in deze twee cerebrale regio's.

Visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis Cerebral cortex en de hippocampus met behulp van<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

Werkwijze voor het traceren van synaptisch verbonden neuronen beschreven. We maken gebruik van TVA specificiteit van een upstream cel te peilen of een cel populatie van belang synaptische input van genetische gedefinieerde celtypes ontvangt.

Virale Tracing van genetische gedefinieerde neurale circuits

Source: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the procedure for injecting a plasmid vector carrying the gene of interest into interneuron progenitors in an embryonic brain slice, followed by electroporation for plasmid entry and gene expression. These modified progenitors can later be used for treating brain disorders.

Agarose-Embedded Electroporation-Assisted Gene Transfer in Mouse Cortical Interneuron Progenitors

Hoe neuronale netwerken zijn in de embryonale hersenen opgericht is een fundamentele vraag in ontwikkelingsstoornissen neurobiologie. Hier combineerden we een electroporatietechniek met nieuwe genetische hulpmiddelen, zoals Cre / Lox-plasmiden en piggyBac-gemedieerde DNA omzetting systeem in de aviaire hindbrain om dorsale interneurons labelen en volgen hun axonale projecties en synaptische doelen op verschillende ontwikkelingsstadia.

Elektroporatie van de hindbrain om Axonale Trajectories en Synaptic Doelen Trace in de Chick Embryo

Ondanks de functionele en medische belang van de...

Genetische Manipulatie van de muis Ontwikkelen Hypothalamus via<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

We beschrijven een techniek voor neuronen en hun processen label via anterograde of retrograde tracer injecties in de hersenen kernen met een in vitro bereiding. We pasten een bestaande methode i n vitro tracer elektroporatie door gebruik te maken van fluorescent gelabelde muis mutanten en eenvoudige optische apparatuur om de nauwkeurigheid etikettering te verhogen.

Lasergestuurde Neuronal Tracing In Brain Explantaten

Dit protocol geeft instructies voor directe observatie van radiaal migrerende corticale neuronen. Bij utero- elektroporatie, organotypische snijcultuur en tijdverlopen confocal beeldvorming worden gecombineerd om de effecten van overexpressie of downregulatie van genen die geïnteresseerd zijn in migrerende neuronen direct en dynamisch te bestuderen en hun differentiatie tijdens de ontwikkeling te analyseren.

Time-lapse Confocal Imaging van Migreren Neuronen in Organotypische Slice Cultuur van Embryonale Muishersenen Met behulp van<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie

Hier bieden we een goedkope en betrouwbare methode voor het genereren van electroporated brein organotypic segment culturen van muis embryo's geschikt voor confocale microscopie en live-imaging technieken.

Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren

Tijdens de ontwikkeling van de hersenschors ontstaan neuronen en gliacellen in de ventriculaire zone die het ventrikel bekleedt en migreren ze naar het hersenoppervlak. Bij dit proces zijn veel genen betrokken. Dit protocol introduceert de techniek voor de time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen.

Time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen in embryonale hersenplakjes van muizen

Verken voorwaardelijke genetische transsynaptische tracing in embryonale muizenhersenen. Deze methode visualiseert neurale circuitontwikkeling met enkele-celresolutie en helpt onderzoekers neuronconnectiviteit te analyseren.

Voorwaardelijke Genetische transsynaptische Tracing in de embryonale hersenen van muizen

Meer video's verkennen