Zebravis Keratocyte Explantaten naar Collective Cel Migratie en reepithelialization in Cutane Wound Healing Bestudeer
25 februari 2015
Zebravis keratocyten migreren celvellen van explantaten en verschaffen een in vitro model voor de studie van de mechanismen van collectieve celmigratie in de context van epitheliale wondgenezing. Deze protocollen detail een effectieve manier om primaire explantkweken stellen voor gebruik in collectieve celmigratie assays.
Het algemene doel van deze procedure is om explant culturen van zebravis keratocyten te vestigen voor gebruik in collectieve celmigratie en epitheel wondgenezing studies. Dit wordt bereikt door eerst de schubben met aangehecht epitheelweefsel van de geanesthetiseerde volwassen zebravis te verwijderen. De schubben met aangehecht weefsel worden in een kweekschaal geplaatst om de cellen te laten hechten.
Vervolgens wordt het kweekmedium toegevoegd, samen met eventuele behandelingen zoals aangegeven door het experimentele ontwerp. Ten slotte worden de cellen geïncubeerd en gedurende de gewenste tijdsperiode waargenomen door middel van videomicroscopie. Uiteindelijk kunnen verschillende assays worden gebruikt om veranderingen in migratie of cellulaire morfologie te demonstreren, evenals expressie van eiwitten of andere markers in de loop van de tijd.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals de transformatie celkweekmethode, is dat explant culturen primair zijn, wat dicht bij de eigenschappen van cellen in vivo ligt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van epitheel wondgenezing, zoals de rol van collectieve migratie en epitheel naar mesenchymatische overgang. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat schubben zich mogelijk niet aan het groeivormoppervlak hechten of mogelijk niet in een willekeurige kweekschaal groeien.
Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Jose Rap PanIN medische student, Chana TI en Agnes Pasquale, beide senior onderzoeksmedewerkers in mijn laboratorium. Om je voor te bereiden op dit experiment, dechlorineer ongeveer 1,5 liter kraanwater met behulp van een commercieel ontchloringsmiddel of door het water 24 uur te laten staan, en gebruik vervolgens 500 milliliter om elk van de drie literbekers te vullen. Label één beker voor het houden van vissen voordat enige procedure wordt uitgevoerd, en een tweede voor herstel naar de derde beker.
Voeg 100 microgram per milliliter trica toe. Voor het anesthetiseren van vissen, vul een ondiepe bak met ijs. Verwarm het kweekmedium tot kamertemperatuur en verzamel schone juwelierstangen.
Reinig de tangen door de uiteinden onder te dompelen in 70%ethanol en ze door een Bunsenbrander te laten passeren, waardoor het ethanol kan verbranden. Vang het gewenste aantal vissen en plaats ze in een houder. Breng een enkele vis over naar de anesthesiebak.
Nadat de vis is geanesthetiseerd volgens het tekstprotocol, breng deze over naar ijs en plaats hem horizontaal met de staart naar de hand die de tangen vasthoudt. Om de schubben te verwijderen, plaats de tangen evenwijdig aan de vis. Met de punt aan de rand van een schub, drukt u de platte kant van de tangen lichtjes in de zijkant van de vis om de schub van het lichaam van de vis te laten stijgen.
Gebruik de tangen om de schub vast te grijpen, trek deze eruit en plaats hem zonder hem om te keren in de weefselkweekschaal. Herhaal de procedure en verwijder maximaal 12 schubben van een grote volwassen vis, vermijd het kieuwgebied, de laterale lijn en de vinnen. Plaats de vis in de herstelbeker en controleer om ervoor te zorgen dat deze herstelt van de effecten van anesthesie.
Breng vervolgens de vis over in een individuele tank en laat de vis 21 dagen herstellen om volledige schubregeneratie mogelijk te maken. Plaats, afhankelijk van het experiment, maximaal 20 schubben per plastic 35 millimeter weefselkweek behandelde schaal, of vier tot zes schubben per glas.
Onderste schaal, laat de schubben aan de schaal hechten voordat u voorzichtig 1,2 milliliter compleet medium toevoegt aan elke kweekschaal. Incubeer de X explant culturen gedurende de gewenste periode op 28 graden Celsius met of zonder behandeling om microscopie uit te voeren. Nadat u een schaal met cellagen uit de incubator hebt verwijderd, plaats deze in de microscoopstand.
Gebruik een vier x objectief om aanvankelijk te focussen om het nemen van beelden over tijd te vergemakkelijken. Markeer de locatie van elke celplaat en/of de oriëntatie van de schaal op de stand. Fotografieer de cellagen op verschillende tijdstippen volgens het experimentele protocol, en als alleen stilstaande beelden nodig zijn voor het experiment, plaats ze terug in de incubator.
Om monsters voor immunofluorescentie microscopie te fixeren, bereid en voorverwarm oplossingen bij kamertemperatuur. Om OSE-sites onder fluorescentie te bekijken, gebruik glasbodem 35 millimeter kweekschalen om aubergines te laten groeien zoals eerder in deze video beschreven, zonder het kweekmedium te verwijderen, voeg 0,8 milliliter 4%paraldehyde in 1,1 XPBS toe aan elke schaal. Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.
Aspibeer vervolgens de oplossing. Voeg een extra 0,8 milliliter fixeermiddel toe aan elke schaal, en aspibeer na een tweede incubatie van vijf minuten de oplossing. Tenzij externe liganden of epitopen worden gebruikt, permeëer de cellen door 0,5 milliliter 0,2%TRITTON X 100 in één XPBS toe te voegen en gedurende vijf minuten te incuberen.
Voordat de oplossing wordt verwijderd, voeg 0,5 milliliter 1%BSA in één XPBS toe en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur of gedurende de nacht bij vier graden Celsius na de incubatie, aspibeer de oplossing en ga verder met antilichaamkleuring. Alternatief, voeg een tot twee milliliter 1%BSA in één XPBS toe en bewaar bij vier graden Celsius gedurende drie tot vier weken. Voer immunofluorescentie uit.
Volgens het tekstprotocol zoals hier geïllustreerd, kunnen vellen keratocyten worden waargenomen die binnen enkele uren na het vestigen van de EXPLAN-kweek migreren van onder de schub. Af en toe kan een afzonderlijk migrerende keratinocyt, die zich heeft losgemaakt van het collectief migrerende blad, worden waargenomen. De aanvankelijke snelheid van bladvooruitgang is extreem snel, maar deze snelheid vertraagt snel naarmate cellen zich verspreiden tijdens de eerste 48 uur van de kweek.
De snelle toename is niet geassocieerd met celproliferatie, aangezien na het labelen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het opzetten van explantaatculturen van zebravis-keratocyten, die dienen als in vitro model voor het bestuderen van collectieve celmigratie en epitheliale wondgenezing. De procedure omvat het verwijderen van schubben met vastgehecht epitheelweefsel van volwassen zebravissen en het cultiveren daarvan om het celgedrag te observeren.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Celmigratie
- Epitheliale wondgenezing
- Zebravismodellen
Achtergrond
- Keratocyten van zebravis kunnen collectief migreren.
- Het begrijpen van collectieve migratie is cruciaal voor onderzoek naar wondgenezing.
- In vitro-modellen bieden gecontroleerde omgevingen voor experimenten.
- Videomicroscopie maakt gedetailleerde observatie van het celgedrag mogelijk.
Doel van de studie
- Het opzetten van primaire explantaatculturen van keratocyten van de zebravis.
- Het onderzoeken van mechanismen van collectieve celmigratie.
- Het beoordelen van de cellulaire morfologie en eiwitexpressie in de loop van de tijd.
Gebruikte methoden
- Verwijdering van schubben met vastgehecht epitheliaal weefsel van zebravisjes.
- Plaatsen van de schubben in kweekschalen voor celadhesie.
- Toevoeging van kweekmedium en experimentele behandelingen.
- Incubatie en observatie via videomicroscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vestiging van explantaatculturen.
- Observatie van de dynamiek van collectieve celmigratie.
- Beoordeling van veranderingen in de cellulaire morfologie over tijd.
- Evaluatie van eiwitexpressie gerelateerd aan migratie.
Conclusies
- De explantaatcultuurmethode is effectief voor het bestuderen van het gedrag van keratocyten.
- Dit model kan het begrip van epitheliale wondgenezing verbeteren.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze bevindingen om therapeutische toepassingen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Keratocyt-explantaten van zebravis bieden een primair in vitro-model voor het bestuderen van collectieve celmigratie en de epitheliale-mesenchymale transitie, processen die direct relevant zijn voor de genezing van huidwonden en weefselherstel. Dit systeem maakt mechanistische risicobeheersing van therapeutische targets mogelijk door celmigratiedynamiek te koppelen aan gedefinieerde veranderingen in genexpressie, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid van targetvalidatie. De compatibiliteit van het model met mutante en transgene zebravislijnen maakt een nauwkeurige analyse van eiwitfuncties in migratiepaden mogelijk, wat vroege beslissingen in het ontdekkingsproces ondersteunt.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroegtijdige Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoek therapeutische hypothesen door cel-celadhesiemechanismen te koppelen aan het overschakelen van migratie modi in een genetisch hanteerbaar systeem.
- Operationele waarde: Gebruik primaire explantaatkweken die nauwgezet het in vivo gedrag van keratocyten nabootsen, waardoor translationele ambiguïteit bij targetvalidatie wordt verminderd.
- Wetenschappelijke waarde: Beoordeel hoe genetische perturbaties de collectieve migratie en de epitheliale-mesenchymale transitie beïnvloeden, ter ondersteuning van functionele target-risicoreductie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Het vestigen van gestandaardiseerde, reproduceerbare explantaatculturen voor kwantitatieve beoordeling van migratiedynamiek en morfologische veranderingen in de loop van de tijd.
- Operationele waarde: Het mogelijk maken van screening van verbindingen die migratie moduleren, zoals MMP-remmers of adhesie-verstorende peptiden, met waarneembare effecten op de integriteit van het weefselvel en de dynamiek van de leidende rand.
- Wetenschappelijke waarde: Gebruik van time-lapse videomicroscopie en immunofluorescentie om multiparametrische read-outs te genereren voor assay-standaardisatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Modelleer re-epithealisatieprocessen bij cutane wondgenezing, wat een ziekterelevant systeem biedt voor preconische evaluatie van targets.
- Operationele waarde: Monitor de expressie van genen die geassocieerd zijn met wondgenezing en inflammatie tijdens de epitheliale-mesenchymale transitie, ter ondersteuning van de afstemming van biomarkers.
- Wetenschappelijke waarde: Bestudeer hoe explantaten na verloop van tijd hun collectieve migratiecapaciteit verliezen, wat in vivo transities weerspiegelt en risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere voortgang informeert.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische evaluatie, in het bijzonder voor indicaties zoals wondgenezing en fibrose, waarbij collectieve migratie een belangrijk pathogeen mechanisme is.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten over de rol van cel-celadhesies bij het bepalen van de migratiemodus en verduidelijkt moleculaire verbanden tussen individuele en collectieve migratie.
- Screening: Levert assay-klare primaire culturen met kwantitatieve resultaten over migratiesnelheid, richting, velkoppervlak en stabiliteit van de leidende rand onder diverse behandelingen.
- Analytiek: Maakt meting mogelijk van cellulaire morfologie, eiwitlokalisatie en veranderingen in genexpressie over tijd, ter ondersteuning van datagedreven vergelijkingen van condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt vroege migratie-fenotypes met preklinische continuïteit via wondgenezings-geassocieerde genexpressie, wat translationele biomarkerstrategieën informeert.
- Bedrijfbrede herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar platform voor het onderzoeken van migratiemechanismen over verschillende genetische achtergronden, waardoor redundante modelontwikkeling wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in migratiepaden te verminderen.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar primair culturesysteem met schaalbare toepassing over mutante en transgene lijnen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege beoordeling van targeteffecten op collectieve migratie en epitheliale plasticiteit mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van functionele validatie in een model dat relevant is voor wondgenezing.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in het hanteren van zebravis, het explanteren van schubben en steriele kweektechnieken voor weefsels.
- Afhankelijk van toegang tot een zebravisfaciliteit, kweekincubatoren, videomicroscopie en infrastructuur voor immunofluorescentie.
- Vereist standaardisatie van de timing van schubadhesie en kweekcondities tussen gebruikers en laboratoria voor reproduceerbare resultaten.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten het optimaliseren van de schubdichtheid en het type schaaltje (plastic vs. glas) op basis van de vereisten van de migratie-assay.
- Praktische beperkingen omvatten het falen van de schubdetachement en een variabele uitgroeisuccesratio, welke afhankelijk zijn van de gezondheid van de vis en de beheersing van de techniek.
