Een gids voor het genereren en gebruiken iPSC Afgeleid NPC's voor de studie van neurologische aandoeningen
21 februari 2015
Dit protocol beschrijft hoe neurale stamcellen kunnen worden gedifferentieerd van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen, om een robuuste en replicerende neurale celpopulatie op te leveren, die kan worden gebruikt om de ontwikkelingspaden te identificeren die bijdragen aan ziekte-ontstaan bij vele neurologische aandoeningen.
Het algemene doel van deze procedure is om neuro progeniтор cellen of NPCs te genereren uit humane geïnduceerde pluripotente stamcellen of hoge PSC's als platform om de cellulaire en moleculaire mechanismen te bestuderen die bijdragen aan neurologische ziekten. Dit wordt bereikt door eerst hoge PSC's te differentiëren met behulp van dubbele smad-remmers tot neurale rosetten. De tweede stap is om deze neurale rosetten te oogsten en ze te laten groeien tot uitbreidbare NPC-populaties.
Vervolgens wordt lentivirale transductie met een spin-infectie gebruikt om de genexpressie te manipuleren. De laatste stap is om de NPC's in suspensie te laten groeien, zodat ze spontaan neurosferen vormen.
Uiteindelijk kan dit platform worden gebruikt om een verscheidenheid aan cellulaire fenomenen te meten. Bijvoorbeeld, het meten van het effect van genetische manipulatie op neuromigratie. Hoewel deze methode inzicht kan geven in cellulaire mechanismen zoals migratie.
Het kan ook worden toegepast om andere biologische processen te bestuderen, zoals replicatie, oxidatieve stress, apoptose en neurietuitgroei. Differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen of hoge PSC's leidt tot de vorming van zichtbare neurale rosetten, die worden gekenmerkt als ronde clusters van neuro-epitheelcellen met aico basale polariteit voor de enzymatische selectie van neurale rosetten op dag 14. Aspereer media van de gehechte embryolichamen of eb's en voeg een milliliter neurale roset selectiereagens toe per put van een zes putten plaat geïncubeerd bij 37 graden Celsius gedurende één uur.
Na een uur. Gebruik een P 1000 pipette man om voorzichtig het enzym uit elke put te verwijderen en voeg een milliliter D-M-E-M-F 12 toe per put. Om de rosetten te wassen, verzamel de één milliliter D-M-E-M-F 12 en verwijder deze snel terug in de put, waardoor de rosetten van de plaat worden losgemaakt.
Verzamel de rosetten in een falconbuis Pipetteer nog een milliliter D-M-E-M-F 12 en verwijder het snel in dezelfde put om de resterende rosetten los te maken. Probeer niet om de rosettenaggregaten te breken. Verzamel de neurale rosetten in dezelfde falconbuis.
Er kan meer enzym worden toegevoegd en deze procedure kan worden herhaald als de rosetten niet gemakkelijk loskomen wanneer alle neurale rosetten zijn verzameld. Draai de Falconbuis 300 G gedurende drie minuten. Aspereer de was en resus.
Suspendeer de rosetten in twee milliliter neurale progenitorcelmedia. Breng de cellen over naar een poly L ornithine gelamineerde zes wandplaat en laat ze groeien bij 37 graden Celsius gedurende één week. In dit laboratorium worden neurale progenitorcellen of NPCs gekweekt op matrigel platen, gevoed om de tweede dag en gehandhaafd op een zeer hoge dichtheid.
Om de NPC's te splitsen, aspereer eerst het media en voeg vervolgens een milliliter warme accutane toe per put van een zes putten plaat geïncubeerd bij 37 graden Celsius gedurende 10 tot 15 minuten. Breng de losgemaakte cellen voorzichtig over in een 15 milliliter buis met D-M-E-M-F 12 met zo min mogelijk mechanische stress. Tritreer de cellen niet terwijl ze in het enzympellet zitten, pellet de cellen door 1000 G gedurende vijf minuten te draaien na centrifugatie, aspereer het supernatant en resuspendeer de NPC's.
In ongeveer één milliliter NPC media per originele put van een zes putten plaat, worden vijf tot tien miljoen cellen verwacht per confluente put van een zes putten plaat na resuspensie en celtelling. Repl de NPC's plaat ongeveer een tot twee miljoen cellen per put van een zes putten plaat om de NPC's te handhaven. De efficiëntie van neurosferenvorming varieert tussen experimenten en cellijnen, maar komt meestal het best voor als tussen 200.000 en een miljoen cellen per put van een zes wand niet-adherente plaat worden geplaatst. Als er clumping optreedt, verlaag dan het aantal cellen dat wordt geplaatst. Ideaal binnen een tot twee dagen na splitsing.
De NP NPC's moeten worden getransduceerd met lentivirale of retrovirale vectoren om het percentage getransfecteerde cellen te verhogen. Gebruik spin-infectie. Aspereer het media uit elke put en vervang het door de relevante overexpressie of controle lentivirus of retrovirus getiteerd tot de gewenste infectiemultipliciteit verdund.
In NPC media Gebruik 1,5 milliliter per put van een zes putten plaat, draai bij 1000 G en kamertemperatuur gedurende één uur in een plaatcentrifuge. Plaats de plaat na de draai terug in de incubator om cellulaire dood te verminderen. Vervang het media binnen acht uur na spin-infectie.
Begin deze procedure door de NPC-afgeleide NEUROSPHEREN eenmaal in NPC-media te wassen om cellulaire deeltjes te verwijderen. Kantel de plaat onder een hoek van 45 graden en laat de neurosferen bezinken en verwijder vervolgens zoveel mogelijk media zonder de neurosferen te aspereren. Vervang met vers media.
Vervolgens pikt u handmatig de NPC-afgeleide NEUROSPHEREN onder een microscoop met behulp van een P 200 pipetteer een neurosferen naar elke put van een matrigel-gecoate 96-putten plaat. Het is belangrijk om neurosferen van vergelijkbare groottes te kiezen om variabiliteit in de resultaten te verminderen. Voeg een extra 0,5 milligram matrigel toe, verdund in koud NPC-media, aan de neurosferen in elke 96-putten plaat.
Gebruik een pipettetip om handmatig elk individueel neurosferen in het midden van de put te centreren. Laat migratie van neurosferen gedurende 48 uur plaatsvinden. Na fixatie en kleuring van de cellen met de gewenste immunohistologische markers, fotografeert u de neurosferen in hun geheel met behulp van een Forex microscoopobjectief. Om radiale migratie te meten, gebruikt u image J-software.
Gebruik het freehand-selectiegereedschap om handmatig de rand van de verst migreren cellen te traceren. Zorg ervoor dat het gebied is gecontroleerd in het venster met ingestelde metingen dat onder het analysetabblad wordt gevonden. Gebruik vervolgens de meetfunctie om het gebied van de resulterende vorm te berekenen.
Gebruik de waarde van de gebiedsmeting en de vergelijking voor het gebied van een cirkel om de buitenste
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de differentiatie van neurale progenitorcellen (NPC's) uit menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) om neurologische ziekten te bestuderen. Het proces omvat het genereren van NPC's die kunnen worden uitgebreid en gemanipuleerd voor onderzoeksdoeleinden.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Stamceldonderzoek
- Neurologische stoornissen
Achtergrond
- Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) kunnen differentiëren in verschillende celtypen.
- Neural progenitorcellen (NPC's) zijn cruciaal voor het bestuderen van hersenontwikkeling en ziekten.
- Het begrijpen van NPC-differentiatiepaden kan inzichten opleveren in neurologische stoornissen.
- Dit protocol heeft tot doel een betrouwbare bron van NPC's voor onderzoek te creëren.
Doel van het onderzoek
- Om NPC's uit hiPSC's te genereren voor het bestuderen van neurologische ziekten.
- Om cellulaire en moleculaire mechanismen te verkennen die betrokken zijn bij ziektepathogenese.
- Om een platform te bieden voor toekomstig onderzoek naar neurodevelopmentele stoornissen.
Gebruikte methoden
- Differentiatie van hiPSC's met behulp van dubbele SMAD-remmers in neurale rosetten.
- Oogsten van neurale rosetten om uitbreidbare NPC-populaties te laten groeien.
- Lentivirale transductie met spin-infectie om genexpressie te manipuleren.
- Groei van NPC's in suspensie om neurosferen te vormen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle differentiatie van NPC's uit hiPSC's.
- Etablissement van uitbreidbare NPC-populaties voor onderzoek.
- Aantoonbaar effect van lentivirale transductie.
- NPC's vormden neurosferen in suspensiecultuur.
Conclusies
- Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor het genereren van NPC's uit hiPSC's.
- NPC's kunnen worden gebruikt om de mechanismen van neurologische ziekten te onderzoeken.
- De aanpak kan verder onderzoek naar therapeutische strategieën faciliteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D to model early neurodevelopmental events in human cells, providing a scalable platform to interrogate disease mechanisms prior to symptom onset. By generating expandable, genetically tractable NPCs from patient-derived hiPSCs, teams can de-risk target hypotheses through empirical testing of gene manipulation effects on cellular phenotypes such as migration, replication, oxidative stress, and apoptosis. This supports predictive confidence in target validation and informs go/no-go decisions in preclinical neuroscience programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by assessing molecular consequences of gene expression changes in a human-derived neural system.
- Operational Value: Provides a renewable NPC source for consistent phenotypic screening across genetic perturbations.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking genetic manipulation to quantifiable cellular outcomes relevant to neurological disease pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates neurosphere-forming NPC populations suitable for high-content migration and stress-response assays.
- Operational Value: Enables standardized, scalable neurosphere production for reproducible compound or genetic screening campaigns.
- Assay Readiness: Produces expandable NPCs that can be cryopreserved, passaged, and transitioned to suspension culture for longitudinal phenotypic monitoring.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical validation by modeling human neurodevelopmental processes in a dish.
- Disease-Relevant System: Uses patient-derived NPCs to capture genetic background effects on cellular phenotypes, enhancing clinical relevance.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables early assessment of target modulation effects on neuronal differentiation and glial fate, informing safety and efficacy profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, providing a human cellular system to validate targets before committing to medicinal chemistry campaigns.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target de-risking by enabling controlled manipulation of gene expression in NPCs and measurement of downstream phenotypic effects.
- Screening: Delivers assay-ready NPCs and neurospheres for quantifying impacts on migration, replication, oxidative stress, and apoptosis following genetic or pharmacological perturbation.
- Analytics: Generates imaging-based migration metrics (e.g., radial distance via ImageJ) and fluorescent reporter readouts to assess transduction efficiency and phenotypic changes.
- Translational Research: Maintains developmental and disease relevance by using patient-derived cells to model early pathogenic events in neurological disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable NPC platform that can be reused across multiple targets, genetic backgrounds, and phenotypic assays within a neuroscience discovery portfolio.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing reliance on post-mortem or non-human models through direct empirical testing in human neural progenitors.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized NPC expansion, cryopreservation, and neurosphere formation protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets, reducing late-stage failure due to unanticipated biological mechanisms in human neurons.
- Portfolio Impact: Facilitates data-driven prioritization of targets based on phenotypic rescue or exacerbation in a clinically relevant human cellular system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, neural differentiation, and lentiviral transduction techniques.
- Depends on access to poly-L-ornithine/laminin or Matrigel-coated surfaces, neural progenitor media, and centrifugation equipment for rosette harvesting and NPC splitting.
- Necessitates standardized protocols for neurosphere formation and migration assays to minimize variability across experiments and cell lines.
- Requires biosafety level 2-plus conditions when working with lentiviral or retroviral vectors to ensure safe handling.
- Success depends on careful handling to avoid rosette breakage during harvesting and maintaining optimal seeding densities for neurosphere formation.
