Een gids voor het genereren en gebruiken iPSC Afgeleid NPC's voor de studie van neurologische aandoeningen

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van neurale progenitorcellen of NPC's uit menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen of hiPSCs als platform om de cellulaire en moleculaire mechanismen die bijdragen aan neurologische ziekten te bestuderen. Dit wordt bereikt door hiPSCs eerst te differentiëren tot neurale rozetten met behulp van dubbele smad-remmers. De tweede stap is het oogsten van deze neurale rozetten en deze te laten uitgroeien tot expandeerbare NPC-populaties.

Vervolgens volgt lentivirale transductie middels een spin-infectie. Deze stap om de efficiëntie te verhogen wordt gebruikt om de genexpressie te manipuleren. De laatste stap is om de NPC's in suspensie te kweken, zodat zij spontaan neurosferen vormen.

Uiteindelijk kan dit platform worden gebruikt om diverse cellulaire fenotypes te analyseren. Bijvoorbeeld door het effect van genetische manipulatie op neurale migratie te meten. Deze methode kan inzicht bieden in cellulaire mechanismen zoals migratie.

Het kan ook worden toegepast om andere biologische processen te bestuderen, zoals replicatie, oxidatieve stress, apoptose en neurietuitgroei. Differentiatie van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen of hoge PSC's leidt tot de vorming van zichtbare neurale rozetten, die worden gekenmerkt als ronde clusters van neuro-epitheliale cellen met apicaal-basale polariteit voor de enzymatische selectie van neurale rozetten op dag 14. Aspireer het medium van de geadhereerde embryo-bodies of ebs en voeg één milliliter neurale rozet-selectiereagens per well van een six-well plaat toe; incubeer bij 37 °C gedurende één uur.

Na één uur. Gebruik een P 1000 pipetteermachine om het enzym voorzichtig uit elke put te verwijderen en voeg één milliliter D-M-E-M-F 12 per put toe. Om de rozetten te wassen, verzamelt u de ene milliliter D-M-E-M-F 12 en spuit u deze snel terug in de put, waardoor de rozetten van de plaat worden losgemaakt.

Verzamel de rozetten in een falcon-buis. Pipetteer nog één milliliter D-M-E-M-F 12 en spuit dit snel in dezelfde put om de resterende rozetten los te maken. Tritoneer niet en probeer de rozetaggregaten niet op te breken. Verzamel de neurale rozetten in dezelfde falcon-buis.

Er kan meer van het enzym worden toegevoegd en deze procedure kan worden herhaald als de rosetten niet gemakkelijk loslaten wanneer alle neurale rosetten zijn verzameld. Centrifugeer de Falcon-buis bij 300 G gedurende drie minuten. Aspireer het wasmiddel en resuspendeer.

Suspendeer de rozetten in twee milliliters neuraal progenitorcelmedium. Breng de cellen over naar een zeswells plaat gecoat met poly-L-ornithine laminaat en kweek deze gedurende één week bij 37 °C. In dit laboratorium worden neurale progenitorcellen of NPC's gekweekt op matrigel-platen, om de dag gevoed en in stand gehouden bij een zeer hoge dichtheid.

Om de NPC's te splitsen, aspireer dan eerst het medium en voeg vervolgens één milliliter warm accutane per well van een six well plate toe; incubeer dit bij 37 °C gedurende 10 tot 15 minuten. Draag de losgekomen cellen voorzichtig over naar een 15 ml buis met DMEM/F12, waarbij mechanische stress tot een minimum wordt beperkt. Tritreer de cellen niet. Pelleteer de cellen door te centrifugeren bij 1000 ×g gedurende vijf minuten terwijl ze zich in het enzym bevinden. Aspireer na centrifugatie het supernatant en resuspendeer de NPC's.

In ongeveer één milliliter NPC-medium per oorspronkelijke put van een zes-putjesplaat worden vijf tot 10 miljoen cellen verwacht per confluente put van een zes-putjesplaat na resuspensie en celtelling. Vul de NPC-plaat met ongeveer één tot 2 miljoen cellen per put van een zes-putjesplaat om de NPC's in stand te houden. De efficiëntie van neurosfeer-vorming varieert per experiment en cellijn, maar is doorgaans het hoogst als er tussen de 200.000 en een miljoen cellen per put van een zes-putjes niet-adherente plaat worden geplaatst; indien er klontering optreedt, dient het aantal geplaatste cellen te worden verminderd. Idealiter gebeurt dit binnen één tot twee dagen na het splitten.

De NP NPC's moeten worden getransduceerd met lentivirale of retrovirale vectoren om het percentage getransfecteerde cellen te verhogen. Gebruik spin-infectie. Aspireer het medium uit elke put en vervang dit door de relevante overexpressie- of controle-lentivirussen of retrovirussen, getitreerd naar de gewenste verdunde multiplicity of infection.

Gebruik in NPC-medium 1,5 milliliters per well van een zeswellsplaat en centrifugeer dit gedurende één uur bij 1000 G en kamertemperatuur in een plaatcentrifuge. Plaats de plaat na het centrifugeren terug in de incubator om celsterfte te verminderen. Vervang het medium binnen acht uur na de spin-infectie.

Begin deze procedure door de uit NPC afgeleide NEUROSFEREN eenmaal te wassen in NPC-medium om celresten te verwijderen. Kantel de plaat in een hoek van 45 graden, laat de neurosferen bezinken en verwijder vervolgens zoveel mogelijk medium zonder de neurosferen weg te aspireren. Vervang dit door vers medium.

Select vervolgens handmatig de uit NPC's afgeleide NEUROSFEREN onder een microscoop met een P 200 pipette en breng één neurosfeer over naar elke put van een met Matrigel gecoate 96-well plaat. Het is belangrijk om neurosferen van vergelijkbare grootte te selecteren om de variabiliteit in de resultaten te verminderen. Voeg 0,5 mg Matrigel, verdund in koud NPC-medium, toe aan de neurosferen in elke 96-well plaat.

Centreer elke individuele neurosphere handmatig in het midden van de put met behulp van een pipetpunt. Laat de migratie van de neurospheres 48 uur lang plaatsvinden. Nadat de cellen zijn gefixeerd en gekleurd met de gewenste immunohistochemische markers, worden de neurospheres in hun geheel gefotografeerd met een Forex-microscoopobjectief. Gebruik Image J-software om de radiale migratie te meten.

Gebruik de tool voor vrije selectie om handmatig de rand van de cellen die het verst zijn gemigreerd te omtrekken. Zorg ervoor dat 'area' is aangevinkt in het venster 'set measurements' onder het tabblad 'analyze'. Gebruik vervolgens de meetfunctie om de oppervlakte van de resulterende vorm te berekenen.

Gebruik de waarde van de oppervlaktemeting en de formule voor de oppervlakte van een cirkel om op dezelfde manier de buitenstraal te bepalen; trek de rand van de oorspronkelijke neurosfeer na. Meet de oppervlakte en bereken de binnenstraal. Bereken de totale radiale migratie als het verschil tussen de buiten- en binnenstraal.

Deze afbeeldingen tonen de stadia van neurale differentiatie van pluripotente stamcellen (PSC's) van PSC's naar embryo-lichamen, neurale rozetten, neurale progenitorcellen (NPC's) en neuronen; gevalideerde NPC's vertonen expressie van de NPC-marker nestine en de neurale stamcel-transcriptiefactor SOX2 in de meeste cellen. Beta-III-tubuline-kleuring is ook zichtbaar in alle NPC-populaties. NPC's vertonen daarnaast expressie van de neurale stamcel-transcriptiefactor PAX6 en de hersenvoorlopermarker FOUR brainin.

TBR2, maar geen markers van het middenbrein zoals LMX1A en FOXA2. NPCs kunnen differentiëren tot 70 tot 80% bèta 3 tubuline-positieve neuronen (in het groen weergegeven) en 20 tot 30% gliaal fibrillair zuur eiwit-positieve astrocyten (in het rood weergegeven) bij hoogwaardige PSC-NPCs. Hoogwaardige NPCs brengen nestine en SOX2 tot expressie in de meeste cellen, terwijl laagwaardige NPCs slechts plekken met SOX2-negatieve en nestine-negatieve cellen vertonen. De vier weken oude neuronen die gedifferentieerd zijn uit hoogwaardige NPCs brengen map2 AB en bèta 3 tubuline tot expressie.

Na een succesvolle transductie met een lentivirale of retrovirale vector met een hoge titer zijn meer dan 80% van de cellen gelabeld door de fluorescente reporter. De generatie van neurosferen met de meegeleverde vector levert een populatie neurosferen van relatief homogene grootte op, die gedurende ongeveer een week gezond in cultuur kunnen blijven.

Bij regelmatige voeding vindt de migratie van neurosferen robuust plaats in gezonde neurosferen, zoals geïllustreerd door deze brightfield-beelden vóór en na 48 uur migratie in matrigel na de ontwikkeling ervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van schizofrenie om neurale migratie te onderzoeken in menselijke iPS-cel-afgeleide NPC's. Vergeet niet dat het werken met een retrovirus potentieel gevaarlijk kan zijn en al het weefselkweekwerk moet worden uitgevoerd onder BSL-2+ condities wanneer het virus potentieel aanwezig is.