Name: Een gids voor het genereren en gebruiken iPSC Afgeleid NPCs voor de studie van neurologische aandoeningen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Leer hoe je neurale voorloper cellen genereert vanuit hiPSCs om neurologische ziekten te bestuderen. Dit protocol gebruikt dual SMAD remmers en lentivirale transductie voor onderzoek naar celmigratie en ziekte mechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Kristen Brennand is een New York Stem Cell Foundation - Robertson Onderzoeker. Het Brennand Laboratorium wordt ondersteund door een Brain and Behavior Young Investigator Grant, National Institute of Health (NIH) grant R01 MH101454 en de New York Stem Cell Foundation.

1. iPSC Differentiatie naar neurale progenitorcellen <ol><li> Groeien en uitbreiden hiPSCs in menselijke embryonale stamcellen (HES) media (tabel 1) samen gekweekt op een muis embryonale fibroblasten (MEF) voedingslaag tot grote (maar subconfluente) kolonies zijn klaar voor neurale differentiatie via een embryoid lichaam (EB) tussenliggende (Figuur 2). Routine iPSC kweekomstandigheden zijn goed elders 16,17 beschreven; kort, groeien hiPSCs in HES media op een MEF feeder laag tot samenvloeiing, vervolgens enzymatisch passage met collagenase (1 mg / ml in DMEM) en uitbreiden van ongeveer 1: 3 elke 7 dagen. </li><li> Poly-L-ornithine / laminine beklede platen, laag petrischaal met 10 g / ml Poly-L-Ornithine in steriel water voor kunststof oppervlakken (50 g / ml voor glasoppervlakken) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3-24 uur. Wassen ten minste een keer met steriel water en vervolgens jas met 5 g / ml Laminin in steriele PBS bij RT voor 3-24 uur. OPMERKING: Als verpakt in plastic, kunnen platen wordenbewaard gedurende zes maanden bij -20 ° C. </li><li> Op dag 1, enzymatisch lift subconfluente hiPSCs (meestal gekweekt op MEFs of hiPSCs gekweekt in gedefinieerde media zoals TeSR 18 op Matrigel) van de plaat als grote kolonies met 1 mg / ml collagenase IV in DMEM / F12. OPMERKING: Na 1-2 uur incubatie bij 37 ° C, wordt kolonies drijven in de schaal. </li><li> Voorzichtig wassen iPSC kolonies (door bezinking, niet centrifugeren) 1-2x met DMEM / F12, resuspendeer in 2 ml / putje van N2 / B27 medium (tabel 1) en overdracht naar niet-hechtende 6 putjes (combineer 3-putjes in 1 -goed) 19. OPMERKING: Overnachting, zullen kolonies zwevende bolvormige clusters te vormen aangeduid als &quot;embryoid lichamen&quot; (EBS). Verwachten aanzienlijke celdood. </li><li> Op dag 2, tilt platen en laat EBS om zich te vestigen. Verwijder voorzichtig de media en een keer wassen met DMEM / F12 om vuil te verwijderen. Voeden met N2 / B27 media aangevuld met dubbele SMAD remmers (0,1M LDN193189 en 10M SB431542) 12 </sup&gt;. </li><li> Op dagen 3-7, zal neuralization voordoen in de context van dubbele SMAD remming; controleer of EBS zijn rond, maar niet cystic. Voeden EBS elke tweede dag met N2 / B27 media, aangevuld met 0,1 M LDN193189 en 10M SB431542. </li><li> Op dagen 7-14, na plating van EBS te Poly-L-Ornithine / Laminin gecoate platen, te controleren met een helderveld microscoop die neurale rozetten beginnen te verschijnen binnen een paar dagen (gekarakteriseerd als ronde clusters van neuro-epitheliale cellen met apico-basale polariteit; Figuur 1). Doorgaan met aanhangend EBS elke tweede dag met N2 / B27 media, aangevuld met 0,1 M LDN193189, 10M SB431542 en 1 g / ml laminin voeden. </li></ol> 2. Oogst van Neural rozetten OPMERKING: Wij raden neurale rozetten enzymatisch worden geoogst met behulp van neurale Rosette Selectie Reagens 20 of soortgelijke selectie reagens. Hoewel neurale rozetten handmatig worden opgepikt in 6-well Poly-L-ornithine / laminine beklede platen, this methode houdt uitgebreide training te beheersen en, afhankelijk gebruiker vaardigheid kan een tweede plukken op dag 20 verder verrijken NPC en afbreken niet-neurale celtypen vereist. <ol><li> Voor enzymatische selectie van neurale rozetten op dag 14, aspireren media uit gehandeld EBS en voeg 1 ml van neurale rozet selectie reagens per goed voor een 6-wells plaat. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Met een P1000 Pipetman, verwijder voorzichtig enzym uit elk putje. Voeg 1 ml DMEM / F12 per putje te wassen. </li><li> Met een P1000, verzamel de 1 ml DMEM / F12 en snel verdrijven de DMEM / F12 weer in de put, waardoor losmaken van de rozetten van de plaat. Verzamel de rozetten in een valk buis. </li><li> Pipet nog eens 1 ml DMEM / F12 en snel te verdrijven in dezelfde put om de resterende rozetten los. (Niet vermaal. Probeer niet te breken rozet aggregaten). Verzamel de neurale rozetten in dezelfde falcon buis. </li><li> Herhaal stap 2.4 als nodig. Als rozetten niet gemakkelijk los te maken, voeg moopnieuw enzym en herhaal het proces (stappen 2.1-2.4) </li><li> Spin-cellen bij 300 g gedurende 3 min. Zuig het wassen, en opnieuw op te schorten rozetten in 2 ml van NPC media (tabel 1). Overdracht cellen (1: 1) in een poly-L-ornithine / laminine beklede plaat met 6 putjes. </li><li> Van Dagen 15-21, zal de neurale rozetten uit te breiden; -feed rozetten elke tweede dag met NPC media. </li><li> Evalueer de kwaliteit van de neurale rozetten en zorgen dat platte fibroblast-achtige cellen niet uitbreiden in de kweek. OPMERKING: Als niet-rozetten aanhouden, kan de NPC cultuur soms worden geborgen door manuele picking, het selecteren van alleen de beste van de geplukte rozetten in Accutase. Distantiëren 15 min bij 37 ° C. Pellet, wassen en plaat in NPC media op 24-goed Poly-L-Ornithine / Laminin gecoate plaat. </li></ol> 3. Uitbreiding van neurale progenitorcellen OPMERKING: iPSC NPC kan worden gekweekt op beide Matrigel- of poly-L-ornithine / laminine beklede platen. We gebruiken meestal MATRIGEl-platen zij sneller kunnen worden bereid en goedkoper. <ol><li> Ter voorbereiding Matrigel beklede platen snel ontdooien en resuspendeer een 1 mg bevroren hoeveelheid van Matrigel in 24 ml koude DMEM / F12 en onmiddellijk distribueren 2 ml in elk putje van twee platen met zes putjes. Incubeer gedurende ten minste 1 uur bij 37 * C. OPMERKING: Matrigel alleen nodig afgezogen, gewassen, onmiddellijk voor gebruik. </li><li> Voeden NPC&#39;s om de dag en tegen zeer hoge dichtheid te behouden of ze zullen spontaan differentiëren tot neuronen. OPMERKING: Hoewel gevestigde NPC typisch gesplitst 1: 4 wekelijks, kan zeer lage passage NPC gesplitst 1: 2 zo weinig eenmaal per twee weken. </li><li> Te splitsen, eerste aspireren media en voeg 1 ml warm Accutase (1X) per putje van de 6-well plaat. Incubeer bij 37 ° C gedurende 10-15 min. </li><li> Zacht overdracht losgemaakte cellen in een 15 ml buis met DMEM / F12 met zo weinig mechanische belasting mogelijk. Niet cellen titreren terwijl in enzym. Pellet cellen door Spinning bij 1000 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Zuig het wassen, en opnieuw op te schorten NPCs in ~ 1 ml NPC media per originele waterput van 6-well. OPMERKING: Verwacht dat een samenvloeiing putje van een 6-well gerecht heeft 5-10.000.000 cellen; Dit kan worden bevestigd door het tellen van een 10 l monster van cellen met een hematocytometer voor opnieuw plating. </li><li> Volgende re-ophanging, re-plaat NPCs als NPC&#39;s, neuronen of neurosferen. Om NPC&#39;s te behouden, plaat ongeveer 1-2.000.000 cellen per putje van een 6-wells plaat. De efficiëntie van neurosphere vorming kan variëren experimenten en cellijnen, maar gebeurt meestal best als 200.000 tot 1.000.000 cellen per well van een niet-hechtende 6-well plaat; indien klonteren van de neurosferen optreedt, vermindering van het aantal cellen gezaaid. Om onderscheid te neuronen, plaat ongeveer 200.000 cellen per putje van een 6-wells plaat, ter vervanging van NPC media met Neuron media. </li><li> Immunohistochemisch valideren elke vastgestelde NPC lijn. Zodra voldoende celmateriaal is geweest expanded, label NPCs met antilichamen voor nestine en SOX2. Bevestigd NPC lijnen moet worden gedifferentieerd tot neuronen gedurende 4-6 weken, en gelabeld met antilichamen voor III-tubuline en MAP2AB. <ol><li> Fix cellen in 4% paraformaldehyde in PBS bij 4 ° C gedurende 10 min. Permeabilize NPC bij kamertemperatuur gedurende 15 min in 1,0% Triton in PBS en vervolgens geblokkeerd in 5% ezel serum met 0,1% Triton bij kamertemperatuur gedurende 30 min. </li><li> Incubeer met primaire antilichaam in 5% ezel serum met 0,1% Triton, overnachting in 4C. OPMERKING: Wij raden de volgende antilichamen: geit anti-Sox2, 1: 200; muis-anti-humaan Nestin, 1: 200; konijn anti-βIII-tubuline, 1: 500; muis anti-βIII-tubuline, 1: 500; muis anti-MAP2AB, 1: 200. (Figuur 2). </li><li> Na een wassing met PBS, geïncubeerd secundaire antilichamen cellen met het geschikte geconjugeerde tweede antilichaam aan geit, muis of konijn 1: 300, in in 5% ezel serum met 0,1% Triton gedurende 1-2 uur bij KT. Om kernen vlek cellen visualiseren met 0,5 ug / ml DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindool) en dan monteren met Vectashield. </li></ol></li></ol> 4. NPC Transduction <ol><li> Gebruik spinfection (centrifugeren van celkweek platen in aanwezigheid van virus bij 1000 xg gedurende 1 uur) tot het percentage getransfecteerde cellen 21 verhogen. Zuig media vervangen door het desbetreffende overexpressie (controle) lentivirussen (of retrovirussen), getitreerd tot de gewenste multipliciteit van infectie (MOI) (kenmerkend 1-10), verdund in NPC media. Gebruik 1,5 ml volume per putje van een 6-well plaat (of door een overeenkomstig geschaald volume voor andere vormen van weefselkweek platen). Spin op 1.000 xg en 37 ° C gedurende 1 uur in een plaat centrifuge. LET OP: In het ideale geval transduceren NPCs met lentivirale of retrovirale vectoren binnen 1-2 dagen te splitsen. Of het gebruik van commerciële of-laboratorium vervaardigde virussen, kan het nuttig zijn om adequaat te titreren batches van virus vooraf door seriële verdunning zijn. (Figuur 3). </li><li> Om cel te verminderenlaire dood, vervang media binnen de 8 uur van spinfection. OPMERKING: Virale integratie en transgene expressie moet aantoonbaar binnen 24 uur met de reporter gen fluorescentie zijn. (Als het virus ontbreekt een fluorescerende reporter, dit is moeilijker te beoordelen succesvolle transfectie kan het best worden gevalideerd door immunoblot, immunohistochemie of qPCR voor overexpressie producten.) Vol expressie kan 3-7 dagen; herhaalde spinfections extra virus nodig zijn om het percentage getransfecteerde cellen verhogen. Terugkerende spinfections kunnen dagelijks plaatsvinden, maar hoeft niet zo frequent zijn. Idealiter, bij gebruik van een fluorescerende reporter,&gt; 80% van de cellen worden gemerkt. </li></ol> 5. Neurosphere Migratie Assay OPMERKING: Neurosferen vorm spontaan, na de enzymatische dissociatie van NPC&#39;s (door een wijze identiek aan die in NPC expansie - stappen 3,3-3,6), als cellen worden gekweekt in suspensie in NPC media. <ol><li> Kortom, groeien distantiërend NPCs in NPC media voor 48 uur in nonadherent platen om neurosferen genereren. (Figuur 4). </li><li> Voor neurosphere migratie, vers bereid Matrigel platen met koud NPC media plaats DMEM, in een 96-well plaat, 1-2 uur voorafgaand aan neurosfeer plukken. Niet aspireren Matrigel van de putten. </li><li> Zoals oorspronkelijk gepubliceerd voor embryonale stamcellen afgeleide neurosferen 22, handmatig pick NPC-afgeleid neurosferen onder een microscoop, na één keer wassen in NPC media om cellulaire vuil te verwijderen. Breng een neurosfeer aan elk putje van een Matrigel gecoate 96-well plaat. </li><li> Voeg een extra 0,5 mg Matrigel, verdund in koude NPC media, de neurosferen in elke 96-well plaat. </li><li> Handmatig te centreren elke individuele neurosphere in het midden van de put met behulp van een pipet tip. OPMERKING: Het is belangrijk om neurosferen van vergelijkbare grootte te plukken, om de variabiliteit te verminderen in de resultaten. </li><li> Laat migratie optreden voor 48 uur en dan fix cellen wi 4% paraformaldehyde en vlek met gewenste immunohistochemische markers. </li><li> Als radiale migratie te bepalen, foto neurosferen in hun geheel met een 4x microscoopobjectief. Exclusief eventuele neurosferen contact opnemen met de rand van de put of een tweede neurosphere uit de analyse. OPMERKING: Als de migratie plaatsvindt langer dan 48 uur, zal de resulterende radiale migratie waarschijnlijk te groot om de afbeelding te zijn met behulp van een 4x objectief. </li><li> Meet gemiddelde migratie van elkaar neurosphere gebruik NIH ImageJ software (figuur 5). Dit kan worden gedaan met behulp van een van de analysemethoden die hieronder worden beschreven: <ol><li> Radial migratie: <ol><li> Handmatig traceren van de rand van het verst migrerende cellen met behulp van de vrije hand selectie gereedschap en gebruik dan de Measure (Ctrl + M) functie om de oppervlakte van de resulterende vorm te berekenen. Voordat het meten van het gebied zorgen ervoor dat de omgeving wordt gecontroleerd in de Set Metingen raam te vinden onder het tabblad Analyseren. Gebruik dewaarde van het gebied meting en de vergelijking voor de oppervlakte van een cirkel (A = πr 2) aan de radius (buitenste) te bepalen. </li><li> Trace de rand van het origineel neurosphere, meet het gebied en het berekenen van de radius (innerlijke) op dezelfde manier. Bereken de totale radiale migratie als het verschil tussen de buitenste en binnenste stralen. </li></ol></li><li> Grootste cellulaire migratie: <ol><li> Meet de afstand verplaatst van de vijf verst cellen van de rand van de binnenste neurosphere met behulp van de lineaire selectie-instrument, gevolgd door de Measure (Ctrl + M) functie. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Brennand, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+differences+in+hiPSC+NPCs+derived+from+patients+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia.</a> Mol Psychiatry. , (2014).</li>
<li>Nicholas, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+of+hPSC-derived+forebrain+interneurons+requires+an+extended+timeline+and+mimics+human+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development.</a> Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).</li>
<li>Mariani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+cortical+development+in+vitro+using+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).</li>
<li>Hashimoto-Torii, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+heat+shock+factor+1+in+neuronal+response+to+fetal+environmental+risks+and+its+relevance+to+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders.</a> Neuron. 82, 560-572 (2014).</li>
<li>Robicsek, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+neuronal+differentiation+and+mitochondrial+dysfunction+in+hair+follicle-derived+induced+pluripotent+stem+cells+of+schizophrenia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients.</a> Mol Psychiatry. 18 (10), 1067-1076 (2013).</li>
<li>Paulsen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+oxygen+metabolism+associated+to+neurogenesis+of+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+a+schizophrenic+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient.</a> Cell Transplant. 21 (7), 1547-1559 (2012).</li>
<li>Yu, D. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+hippocampal+neurogenesis+using+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).</li>
<li>Brennand, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+schizophrenia+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).</li>
<li>Wen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+dysregulation+in+a+human+iPS+cell+model+of+mental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders.</a> Nature. , (2014).</li>
<li>Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+pf+Inflammation+and+Tumor+Microenvironment+in+the+Development+of+Gastrointestinal+Cancers%3A+What+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Can+Do%5BTitle%5D)+AND+%22Current+stem+cell+research+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do.</a> Current stem cell research & therapy. , (2014).</li>
<li>An, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Correction+of+Huntington%27s+Disease+Phenotypes+in+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic Correction of Huntington's Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 11 (2), 253-263 (2012).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li>
<li>Pankratz, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+via+an+obligated+primitive+anterior+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage.</a> Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).</li>
<li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+neural+development+and+treatment+of+rett+syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143, 527-539 (2010).</li>
<li>Sareen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+7+and+19+trisomy+in+cultured+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells.</a> PLoS One. 4, e7630(2009).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Cowan, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+embryonic+stem-cell+lines+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts.</a> N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).</li>
<li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+embryonic+stem+cells+in+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions.</a> Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).</li>
<li>Coufal, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+in+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition in human neural progenitor cells.</a> Nature. 460, 1127-1131 (2009).</li>
<li>Xia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+to+model+spinocerebellar+ataxia+type+2+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+neuroscience+%3A+MN%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro.</a> Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Delaloy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-9+coordinates+proliferation+and+migration+of+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors.</a> Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).</li>
<li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480, 547-551 (2011).</li>
<li>Maroof, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+and+functional+maturation+of+cortical+interneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).</li>
<li>Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+cortex+development+from+pluripotent+stem+cells+to+functional+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses.</a> Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).</li>
<li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77, 440-456 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We hebben beschreven methoden om te differentiëren hiPSCs in NPCs, een neuraal celtype waarin een aanzienlijk deel van het gen handtekening van iPSC-afgeleide neuronen wordt behouden en dat kan dienen als een proxy voor de ontwikkelingstrajecten potentieel bijdragen aan de ziekte pathogenese 8, 11. Bovendien, zoals we hebben beschreven, NPC&#39;s zijn een robuust replicatief en gemakkelijk getransduceerde neurale bevolking, die naar onze mening kan geschikt zijn voor moleculaire en biochemische studies van de...

Genexpressiestudies van neuronen onderscheiden in vitro van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) door ons 1 en anderen 2,3 geven aan dat iPSC neuronen lijken foetale eerder dan volwassen hersenweefsel. Momenteel kan iPSC-gebaseerde modellen geschikter voor de studie van aanleg voor, dan laat kenmerken van neurologische ziekte. We hebben eerder gemeld dat een aanzienlijke fractie van de genen profiel van schizofrenie-iPSC afgeleide neuronen is geconserveerd in schizofrenie-iPSC afgeleide neurale progenitorcellen (NPC), wat aangeeft dat NPC nuttig celtype kan worden voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die bijdragen tot schizofrenie 1 . Wij en anderen hebben afwijkende migratie, verhoogde oxidatieve stress en reactieve zuurstofverbindingen, gevoeligheid voor sub-threshold milieu stress en verminderde mitochondriale functie bij schizofrenie iPSC NPCs 1,4-6, evenals een verminderde neuronale c gemeldaansluitmogelijkheden en synaptische functie bij schizofrenie iPSC neuronen 5,7-10. Als de moleculaire factoren die bijdragen tot afwijkende migratie en / of oxidatieve stress bij schizofrenie iPSC NPC liggen ook aan de verminderde neuronale connectiviteit schizofrenie-iPSC afgeleide neuronen kan NPC een robuust en zeer replicatieve neurale populatie waarmee de mechanismen verantwoordelijk voor de ziekte te bestuderen. Bovendien, omdat men snel kan genereren grote aantallen cellen en behoeft niet weken of maanden wachten neuronale rijping, NPC-gebaseerde assays zijn geschikt voor de studie van grotere patientencohorten en zijn meer vatbaar voor high throughput screening. Wij geloven dat iPSC NPC kan dienen als een proxy voor de ontwikkelingspaden potentieel bijdragen aan pathogenese, zoals reeds aangetoond in diverse stoornissen schizofrenie 1 en Huntington&#39;s ziekte 11. Om NPC&#39;s te onderscheiden van hiPSCs, eerste neurale inproductie wordt bereikt door het dual-SMAD inhibitie (0,1 mM LDN193189 en 10 mM SB431542) 12. Door antagoniseren van BMP en TGF signalering met deze kleine moleculen is endoderm en mesoderm specificatie geblokkeerd versnellen neuronale differentiatie en leidt tot de vorming van zichtbare neurale rozetten binnen een week van plating. Neurale patroonvorming optreedt vroeg in dit proces, vermoedelijk tijdens de neurale rozet vorming en onmiddellijk daarna. In afwezigheid van andere signalen, deze primitieve neurale cellen gaan uit van een anterieure voorhersenen-achtige lot 13. Onmiddellijk na neurale rozet vorming, en de lopende hele NPC expansie, voorhersenen NPC&#39;s zijn gekweekt met FGF2 8,14. Zij hebben een dubbele lijn potentieel en kan worden gedifferentieerd tot neurale populaties van 70-80% III-tubuline-positieve neuronen en 20-30% gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) -positieve astrocyten (figuur 1). De meeste voorhersenen iPSC neuronen VGLUT1 positieveEn dus zijn vermoedelijk glutamaat, hoewel ongeveer 30% van neuronen zijn GAD67-positief (GABAerge) 8. NPC routinematig gepasseerd meer dan tien keer in vitro, met behoud differentiatie profielen zonder accumuleren karyotype afwijkingen. Groepen hebben passage NPCs meer dan 40 maal 15, vinden we echter dat voorbij tien passages, NPC&#39;s tonen verhoogde neiging tot astrocyten differentiatie gemeld. NPC goed verdragen meerdere vries-dooi en kan worden overgezet groeien als neurospheres door simpelweg kweken in niet-hechtende platen. NPC&#39;s worden efficiënt getransduceerd door virale vectoren, waardoor een snelle evaluatie van de moleculaire en cellulaire gevolgen van genetische verstoring, en eenvoudig uit te breiden om voldoende materiaal opleveren voor biochemische studies. Bovendien, omdat virale vectoren toe robuuste overexpressie en / of knockdown van ziekte-relevante genen in beide control of patiënt afgeleide NeurAl cellen, kan men dit platform gebruiken om het effect van genetische achtergrond van deze manipulaties testen. Hoewel niet geschikt voor synaptische of activity based assays die volwassen neuronen, kan NPC&#39;s een praktisch alternatief voor veel ongecompliceerd moleculaire of biochemische analyses van de patiënt afgeleide neurale cellen zijn.

```html
<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>#11330</td><td>voor HES-media</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>#10565</td><td>voor neurale media</td></tr><tr><td>KO-Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>#10828</td><td>Moet worden getest op partij</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>#35050</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp;#11140</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp;#17502-048</td><td>Moet worden getest op partij</td></tr><tr><td>B27-RA</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp;#12587-010</td><td>Moet worden getest op partij</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Life Technologies</td><td>#13256-029</td><td>Opnieuw suspenderen in PBS + 1% BSA</td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>#04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>#04-0010</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>#450-02</td><td>Opnieuw suspenderen in PBS + 0.1% BSA</td></tr><tr><td>GDNF&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp;#450-10</td><td>Opnieuw suspenderen in PBS + 0.1% BSA</td></tr><tr><td>Dibutyryl cyclic-AMP</td><td>Sigma</td><td>&nbsp;#D0627</td><td>Opnieuw suspenderen in PBS + 0.1% BSA</td></tr><tr><td>L-ascorbinezuur</td><td>Sigma</td><td>#A0278</td><td>Opnieuw suspenderen in H20</td></tr><tr><td>STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent</td><td>Stemcell Technologies</td><td>&nbsp;#05832</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>Collageenase IV</td><td>Life Technologies</td><td>#17104019</td><td></td></tr><tr><td>CF1 mEFs</td><td>Millipore</td><td>#PMEF-CF</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Laminin, Natural Mouse 1 mg</td><td>Life Technologies</td><td>#23017-015</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel</td><td>BD</td><td>#354230</td><td>Opnieuw suspenderen op ijs in koud DMEM bij 10 mg/ml, gebruik 1 mg per twee 6-well platen equivalent</td></tr><tr><td>Weefselkweekbehandelde 6-well platen</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Ultra laag hechting 6-well platen</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>geit anti-Sox2&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc&shy;17320</td><td>gebruiken bij 1:200</td></tr><tr><td>muis anti-human Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>gebruiken bij 1:200</td></tr><tr><td>konijn anti-&beta;III-tubulin</td><td>Covance</td><td>PRB&shy;435P</td><td>gebruiken bij 1:500</td></tr><tr><td>muis anti-&beta;III-tubulin</td><td>Covance</td><td>MMS&shy;435P</td><td>gebruiken bij 1:500</td></tr><tr><td>muis anti-MAP2AB</td><td>Sigma</td><td>M1406</td><td>gebruiken bij 1:200</td></tr><tr><td>Centrifuge voor platen</td><td>Beckman Coulter</td><td>Beckman Coulter Allegra X-14 (met SX4750 platendrager)</td><td></td></tr></tbody></table>
```

een gids voor het genereren en gebruiken ipsc afgeleid npc&#39;s voor de studie van neurologische aandoeningen

A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases

Post-mortem onderzoek naar neurologische ziekten is niet ideaal voor het identificeren van de onderliggende oorzaken van ziekte-initiatie, omdat veel ziekten een lange periode van ziekteprogressie omvatten voorafgaand aan het begin van symptomen. Omdat fibroblasten van patiënten en gezonde controles efficiënt kunnen worden gereprogrammeerd tot humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) en vervolgens kunnen worden gedifferentieerd in neurale stamcellen (NPC's) en neuronen voor de studie van deze ziekten, is het nu mogelijk om de ontwikkelingsgebeurtenissen na te bootsen die zich voorafgingen aan het begin van symptomen bij patiënten. We presenteren een methode waarmee hiPSC's efficiënt kunnen worden gedifferentieerd in NPC's, die niet alleen in staat zijn tot verdere differentiatie in functionele neuronen, maar ook robuust kunnen worden gepasseerd, ingevroren en ontdooid of omgezet om te groeien als neurosferen, waardoor snelle genetische screening mogelijk is om de moleculaire factoren te identificeren die invloed hebben op cellulaire fenotypes, waaronder replicatie, migratie, oxidatieve stress en/of apoptose. Van patiënten afgeleide hiPSC NPC's zijn een unieke platform, ideaal geschikt voor het empirisch testen van de cellulaire of moleculaire gevolgen van het manipuleren van genexpressie.

Neurale rozetten kunnen morfologisch worden geïdentificeerd met een helderveld microscoop, door hun karakteristieke uiterlijk als ronde clusters van neuro-epitheelcellen met apico-basale polariteit (figuur 1). Hoewel NPC zijn meestal gekweekt bij zeer hoge celdichtheid, onmiddellijk na passage, enigszins piramidale vorm soma en neurieten bipolaire structuur zichtbaar (figuur 1D). Gevalideerde NPC express nestine en SOX2 in de meeste cellen, maar III tubuline kleuring zichtbaar in alle N...

Dit protocol beschrijft hoe neurale stamcellen kunnen worden gedifferentieerd van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen, om een robuuste en replicerende neurale celpopulatie op te leveren, die kan worden gebruikt om de ontwikkelingspaden te identificeren die bijdragen aan ziekte-ontstaan bij vele neurologische aandoeningen.

Een gids voor het genereren en gebruiken iPSC Afgeleid NPC&#39;s voor de studie van neurologische aandoeningen

Post-mortem studies of neurological diseases are not ideal for identifying the underlying causes of disease initiation, as many diseases include a long ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van neurale progenitorcellen of NPC's uit menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen of hiPSCs als platform om de cellulaire en moleculaire mechanismen die bijdragen aan neurologische ziekten te bestuderen. Dit wordt bereikt door hiPSCs eerst te differentiëren tot neurale rozetten met behulp van dubbele smad-remmers. De tweede stap is het oogsten van deze neurale rozetten en deze te laten uitgroeien tot expandeerbare NPC-populaties.Vervolgens volgt lentivirale transductie middels een spin-infectie. Deze stap om de efficiëntie te verhogen wordt gebruikt om de genexpressie te manipuleren. De laatste stap is om de NPC's in suspensie te kweken, zodat zij spontaan neurosferen vormen.Uiteindelijk kan dit platform worden gebruikt om diverse cellulaire fenotypes te analyseren. Bijvoorbeeld door het effect van genetische manipulatie op neurale migratie te meten. Deze methode kan inzicht bieden in cellulaire mechanismen zoals migratie.Het kan ook worden toegepast om andere biologische processen te bestuderen, zoals replicatie, oxidatieve stress, apoptose en neurietuitgroei. Differentiatie van menselijke geïnduceerde pluripotente stam

a-guide-to-generating-using-hipsc-derived-npcs-for-study-neurological

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

We beschrijven een methodiek combineert geautomatiseerde cel kweken met een hoog-content imaging te visualiseren en te kwantificeren meerdere cellulaire processen en structuren, in een high-throughput manier. Dergelijke methoden kunnen helpen bij de verdere functionele annotatie van genomen en te identificeren ziektegen netwerken en potentiële drug targets.

Hoog gehalte Screening bij neurodegeneratieve ziekten

This video demonstrates the neural precursor cell neurosphere migration assay—an in vitro assay to study the migratory response of neural precursor cells from the neurosphere—via microscopic analysis.

NPC Neurosphere Assay: An In Vitro Assay to Assess the Migratory Response of Neural Precursor Cells from the Neurosphere

This video demonstrates a protocol to isolate cells from rat hippocampi, including neurons, astrocytes, and microglia.

Obtaining Various Neural Cell Populations from a Rat Hippocampus

Het modelleren van de ontwikkeling van de menselijke hersenen is belemmerd door de ongekende complexiteit van neurologisch epitheelweefsel. Hier wordt een methode beschreven voor de robuuste generatie van hersenorganoïden om vroege gebeurtenissen van de menselijke hersenontwikkeling af te bakenen en om microcefalie in vitro te modelleren.

Genereren van iPSC afgeleide Human Brain Organoids naar Early Neurodevelopmental Disorders Model

Neurologische processen zoals proliferatie, migratie en neurite uitvloeisel zijn vaak verstoord in neuropsychiatrische ziekten. Dus presenteren we protocollen om te snel en reproducibly beoordelen deze neurologische processen in menselijke iPSC afkomstige NPC's. Deze protocollen toestaan ook de beoordeling van de gevolgen van relevante factoren die de groei en therapeutics NPC ontwikkelingssamenwerking.

Snelle detectie van neurologische fenotypen in menselijke neurale voorlopercellen (NPC)

Deze studie introduceert en beschrijft protocollen voor het afleiden van twee specifieke menselijke neurale organoïden als een relevant en nauwkeurig model voor het bestuderen van 1) menselijke multiform glioblastoom ontwikkeling binnen menselijke neurale organoïden uitsluitend bij de mens en 2) neuron Dopaminerge differentiatie die een driedimensionale organoïde genereert.

Menselijke neurale Organoïden voor het bestuderen van hersenkanker en neurodegeneratieve ziekten

Het gepresenteerde protocol beschrijft een methode voor een neuriet ontgroeiingstest en neurotoxiciteitsbeoordeling van kleine moleculen.

Een Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment met Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons

We beschrijven een protocol om menselijke huid-afgeleide fibroblasten te herprogrammeren in geïnduceerde Neuronal Progenitor Cells (iNPC's), en hun daaropvolgende differentiatie in geïnduceerde Astrocyten (iA's). Deze methode leidt tot een snelle en reproduceerbare generatie van iNPC's en iA's in grote hoeveelheden.

In vitro modellering voor neurologische ziekten met behulp van directe conversie van fibroblasten naar neuronale voorlopercellen en differentiatie in astrocyten

We presenteren gedetailleerde protocollen voor de generatie en karakterisering van 2D en 3D human induced pluripotent stamcel (hIPSC)-gebaseerde modellen van neocorticale ontwikkeling, evenals complementaire methodologieën die kwalitatieve en kwantitatieve analyse van primaire cilium (PC) biogenese en functie mogelijk maken.

2D en 3D humane geïnduceerde pluripotente stamcelgebaseerde modellen om primaire ciliumbetrokkenheid tijdens neocorticale ontwikkeling te ontleden

Dit protocol toont aan hoe fysica-gebaseerde neurale simulaties kunnen worden gebruikt om elektrofysiologische biomarkers van neurotherapeutica te interpreteren en hun effect op neurale circuits te ontdekken, waardoor een mechanistisch onderbouwde benadering van neurotherapeutische ontwikkeling wordt geboden.

Een protocol voor het ontdekken van neurale mechanismen van neurotherapeutische effecten op elektro-encefalografie met behulp van de humane neocorticale neurosolver

Leer hoe je neurale voorloper cellen genereert vanuit hiPSCs om neurologische ziekten te bestuderen. Dit protocol gebruikt dual SMAD remmers en lentivirale transductie voor onderzoek naar celmigratie en ziekte mechanismen.

Een gids voor het genereren en gebruiken iPSC Afgeleid NPC's voor de studie van neurologische aandoeningen

Meer video's verkennen