Name: Manipulatie en In Vitro Rijping van Xenopus laevis Eicellen, Gevolgd door intracytoplasmatische sperma-injectie, om embryonale ontwikkeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Leer hoe je Xenopus laevis oocyten manipuleert en rijpt voor intracytoplasmatische sperma-injectie. Deze methode maakt het mogelijk om moederlijke eiwitten af te breken en genen te overexpresseren tijdens bevruchting.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn de leden van het Gurdon-laboratorium dankbaar voor de nuttige discussie. K.M. is onderzoeksfellow aan Wolfson College en wordt ondersteund door de Herchel Smith Postdoctoral Fellowship en de Great Britain Sasakawa Foundation. Het Gurdon-laboratorium wordt ondersteund door subsidies van de Wellcome Trust (RG69899) en MRC aan J.B.G.

<ol><li>Miyamoto, K., Gurdon, J. B. Insights into the amphibian egg to understand the mammalian oocyte. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiyamoto%2C+K+%22Biology+and+Pathology+of+the+Oocyte%3A+Role+in+Fertility%2C+Medicine%2C+and+Nuclear+Reprogramming%22">Biology and Pathology of the Oocyte: Role in Fertility, Medicine, and Nuclear Reprogramming</a>. Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. , Second, Cambridge University Press. 1-11 (2013).</li>
<li>Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-catenin+signaling+activity+dissected+in+the+early+Xenopus+embryo%3A+a+novel+antisense+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach.</a> Developmental biology. 222 (1), 124-134 (2000).</li>
<li>Oelgeschlager, M., Kuroda, H., Reversade, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chordin+is+required+for+the+Spemann+organizer+transplantation+phenomenon+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">Chordin is required for the Spemann organizer transplantation phenomenon in Xenopus embryos.</a> Developmental cell. 4 (2), 219-230 (2003).</li>
<li>Szenker, E., Lacoste, N., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+requirement+for+HIRA-dependent+H3.3+deposition+revealed+at+gastrulation+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">A developmental requirement for HIRA-dependent H3.3 deposition revealed at gastrulation in Xenopus.</a> Cell reports. 1 (6), 730-740 (2012).</li>
<li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods in cell biology. 36, 213-230 (1991).</li>
<li>Heasman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+cadherins+and+underexpression+of+beta-catenin+inhibit+dorsal+mesoderm+induction+in+early+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Overexpression of cadherins and underexpression of beta-catenin inhibit dorsal mesoderm induction in early Xenopus embryos.</a> Cell. 79 (5), 791-803 (1994).</li>
<li>Hulstrand, A. M., Schneider, P. N., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+antisense+oligonucleotides+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The use of antisense oligonucleotides in Xenopus oocytes.</a> Methods. 51 (1), 75-81 (2010).</li>
<li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Wave1+is+required+for+reprogramming+transcription+in+oocytes+and+for+normal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nuclear Wave1 is required for reprogramming transcription in oocytes and for normal development.</a> Science. 341 (6149), 1002-1005 (2013).</li>
<li>Halley-Stott, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+nuclear+transplantation+to+Germinal+Vesicle+stage+Xenopus+oocytes+-+a+method+for+quantitative+transcriptional+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mammalian nuclear transplantation to Germinal Vesicle stage Xenopus oocytes - a method for quantitative transcriptional reprogramming.</a> Methods. 51 (1), 56-65 (2010).</li>
<li>Astrand, C., Belikov, S., Wrange, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+characterizes+chromatin+presetting+by+NF1+and+Oct1+and+enhances+glucocorticoid+receptor+binding+to+the+MMTV+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation characterizes chromatin presetting by NF1 and Oct1 and enhances glucocorticoid receptor binding to the MMTV promoter.</a> Experimental cell research. 315 (15), 2604-2615 (2009).</li>
<li>Amaya, E., Kroll, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+generating+transgenic+frog+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">A method for generating transgenic frog embryos.</a> Methods in molecular biology. 97, 393-414 (1999).</li>
<li>Kroll, K. L., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Xenopus+embryos+from+sperm+nuclear+transplantations+reveal+FGF+signaling+requirements+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenic Xenopus embryos from sperm nuclear transplantations reveal FGF signaling requirements during gastrulation.</a> Development. 122 (10), 3173-3183 (1996).</li>
<li>Smith, S. J., Fairclough, L., Latinkic, B. V., Sparrow, D. B., Mohun, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+transgenesis+by+sperm+nuclear+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis transgenesis by sperm nuclear injection.</a> Nature protocols. 1 (5), 2195-2203 (2006).</li>
<li>Drury, K. C., Schorderet-Slatkine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cycloheximide+on+the+%27autocatalytic%27+nature+of+the+maturation+promoting+factor+%28MPF%29+in+oocytes+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Effects of cycloheximide on the 'autocatalytic' nature of the maturation promoting factor (MPF) in oocytes of Xenopus laevis.</a> Cell. 4 (3), 269-274 (1975).</li>
<li>Smith, L. D., Ecker, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+oocyte+nucleus+in+physiological+maturation+in+Rana+pipiens%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Role of the oocyte nucleus in physiological maturation in Rana pipiens.</a> Developmental biology. 19 (3), 281-309 (1969).</li>
<li>Miyamoto, K., Pasque, V., Jullien, J., Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+actin+polymerization+is+required+for+transcriptional+reprogramming+of+Oct4+by+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Nuclear actin polymerization is required for transcriptional reprogramming of Oct4 by oocytes.</a> Genes & development. 25 (9), 946-958 (2011).</li>
<li>Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+Xenopus+oocytes+using+the+host+transfer+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fertilization of Xenopus oocytes using the host transfer method.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li>
<li>Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+bi-allelic+mutation+rates+using+TALENs+in+Xenopus+tropicalis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+open%22%5BJournal%5D)">Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis).</a> Biology open. 1 (12), 1273-1276 (2012).</li>
<li>Sakane, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+of+multiple+and+paralogous+genes+in+Xenopus+laevis+using+two+pairs+of+transcription+activator-like+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of transcription activator-like effector nucleases.</a> Development, growth & differentiation. 56 (1), 108-114 (2014).</li>
<li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+CRISPR%2FCas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+RNA%2FCas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Wij hier in detail een nieuwe methode om de moeder factoren afbrekende of exogene factoren overexpressie vóór de bevruchting. Dit systeem vereist twee micro-injecties, maar slaat de operatie kikkers, die in de ontvangende overdrachtsmethode 7,17. Het is optimaal om de kikker operatie stap op het gebied van de verzorging van dieren te verwijderen. Bovendien hebben we geen rekening houden met de kwaliteit van de gastheer vrouwelijke kikkers voor de overdracht experimenten, wat betekent dat we kunnen ontdoen van een biologische factor die het succes van experimenten beïnvloedt. Daarom wordt in dit systeem de kwaliteit van de oöcyten verkregen PMSG geprimede kikkers een belangrijke biologische factor die essentieel voor een succesvolle experimenten. De kwaliteit van eicellen kan worden beoordeeld na afname van de eierstokken of na defolliculation. Indien een afwijking wordt waargenomen bij deze fasen is het optimaal om een ​​eierstok halen in een nieuwe kikker. Een ander punt als je de eicel kwaliteit kan controleren is na eicelrijping. Indien minder dan 80% van progesteron-e behandeld eicellen vertonen tekenen van rijping, mag u niet in staat zijn om het voldoende aantal embryo&#39;s te verkrijgen voor verdere analyses. Het gebruik van enzymatische defolliculation plaats van handmatige defolliculation is ook een ander voordeel van deze regeling aan de arbeid nodig defolliculation verminderen. Het is echter nog steeds mogelijk dat handmatige defolliculation een betere ontwikkeling dan de enzymatische behandeling geven. Zoals getoond in figuur 3, bijna 10% van in vitro gerijpte oöcyten kan het zwembad kikkervisje stadium te bereiken. Deze gegevens worden verzameld uit 13 onafhankelijke experimenten waaronder gerapporteerd in 8 en nieuwe injectie experimenten. Host overdracht methode moet 75-150 eicellen in elke behandeling voor het verkrijgen van zinvolle gegevens sinds 30-60% van de overgedragen eicellen de neurula stadium 17 kan bereiken. Onze methode begint normaal met 200-300 eicellen in elke experimentele groep sinds ongeveer 40-60% van gesplitst embryo&#39;s kan bereiken despierreactie podium. Deze gegevens suggereren dat beide methoden ondersteunen een redelijke ontwikkelingssnelheid. We hebben tot nu toe verkregen 10 levend vorsen van controle-mRNA geïnjecteerd en controle antisense-oligo geïnjecteerde eicellen met behulp van deze techniek, wat aangeeft dat deze aanpak steunt ontwikkeling door metamorfose. De eicel manipulatie-ICSI methode biedt een mogelijkheid om de rol maternale factoren te testen gedurende zeer vroege embryonale ontwikkeling, kort na de bevruchting. Bovendien kan overexpressie van chromatine modificerende factoren voor de bevruchting mogelijk maken maternale chromatine verbouwen voor de bevruchting te begrijpen maternale chromatine staten nodig is voor ontwikkeling. Deze strategie kan ook goed werken met de huidige gen-editing systemen zoals transcriptie activator-achtige effector nuclease (TALEN) 18,19 en CRISPR / CAS9 20,21, omdat deze kan worden uitgedrukt zelfs vóór de bevruchting. Daarom is onze nieuwe aanpak heeft een potential worden voor veel toepassingen in de toekomst.

Xenopus laevis is een veel gebruikte, krachtige modelorganisme ontwikkeling 1 te bestuderen. Dit komt omdat Xenopus eieren zijn ongewoon groot (ongeveer 1,2-1,4 mm, in vergelijking met zoogdiertegenhangers zijn ongeveer 0,1 mm) en overvloedig. Eieren bevatten moeder gesynthetiseerd en opgeslagen componenten, die genoeg om de embryonale ontwikkeling te rijden tot medio blastula overgang zijn (MBT, die zich in het stadium 8-8,5 met 4000-8000 cellen). MBT wordt vergezeld zygote genoomactivatie maakt vervolgens het embryonale genproducten die verdere ontwikkeling leiden. Talrijke studies gericht op het moederlijke factoren belangrijk voor de ontwikkeling identificeren. Veel studies vertrouwen op de injectie van antisense oligonucleotiden (oligo&#39;s), waaronder morfolino oligonucleotiden in bevruchte embryo, waarbij afbraak van maternale eiwitten worden waargenomen in de gastrulastadium 2-4. Als alternatief worden mRNA geïnjecteerd om bevruchte embryos om gen functies verstoren of om lot van overexpressie eiwitten op te sporen. De injectie in de één-cel embryo&#39;s gewoonlijk geen invloed op expressie van maternale eiwitten in de zeer vroege embryonale stadium vóór MBT. Heasman en Wylie opgericht de host overdracht methode om dit probleem 5 overwinnen. In de werkwijze worden handmatig defolliculated oocyten geïnjecteerd met antisense oligo en overgebracht naar ontvangende vrouwtjes 6. Eiwitten zijn gedownreguleerd vóór de bevruchting, zodat rollen van downregulated eiwitten in de vroege embryonale ontwikkeling kan worden onderzocht. Deze maternale verarmingswerkwijze geleid tot de identificatie van verschillende unieke ontwikkelende rol van maternale proteïnen, zoals besproken in 7. In dit rapport hebben we detail onze recent ontwikkelde methode, waarbij de moeder uitputting of overexpressie van mRNA vóór de bevruchting wordt bereikt zonder handmatige defolliculation en gastheer overdracht8. Handmatig defolliculation vergt veel tijd en gastheer overdracht moet vaak bekwame technieken en de specifieke licentie voor dier operatie, waardoor het veelvuldig gebruik van maternale uitputting methode belemmeren. Defolliculation en gastheer overdracht gesubstitueerd door enzymatische defolliculation 9,10 en intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI) 11-13, respectievelijk. ICSI eieren werd oorspronkelijk gebruikt om transgene kikkers 12 produceren. Sperma en embryo kernen werden ook getransplanteerd in in vitro gerijpt amfibie eicellen 11,14,15. Hier tonen we stap voor stap methode sperma in vitro gerijpte oöcyten die werden geïnjecteerd vooraf geïnjecteerd met antisense oligo&#39;s of mRNA.

<table><tbody><tr><td>Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)&nbsp;</td><td>MSD Animal Health</td><td>Vm 01708/4309</td><td>PMSG-Intervet 5000iu poeder en oplosmiddel voor oplossing voor injectie</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methaansulfonaat zout (MS222)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>Voor anesthesie</td></tr><tr><td>Liberase TM Research Grade</td><td>Roche</td><td>05 401 127 001</td><td>Voor oöcytdefolliculatie. Bewaren bij -20&nbsp;&#176;C.</td></tr><tr><td>Drummond Nanoject</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-205/206</td><td>Voor micro-injectie</td></tr><tr><td>glas capillair&nbsp;</td><td>Alpha laboratories</td><td>7&rdquo; Drummond #3-000-203-G/XL</td><td>Voor micro-injectie</td></tr><tr><td>Micropipet Puller&nbsp;</td><td>SUTTER Instrument</td><td>Model D-97</td><td>Voor micro-injectie</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>Voor in vitro rijping en ICSI</td></tr><tr><td>14 ml ultra-heldere centrifugebuis&nbsp;</td><td>Beckman Coulter United Kingdom Ltd</td><td>344060</td><td>Voor spermapurificatie</td></tr><tr><td>OptiPrep Dichtheidsgradiënt Medium (Iodixanol)</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>Voor spermapurificatie</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Reagens voor celpermeabilisatie</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Hybaid&nbsp;</td><td>HB-SHK-1</td><td>Voor oöcytdefolliculatie</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop (Stereo zoom microscoop)</td><td>ZEISS</td><td>Semi SV6</td><td>Voor oöcytopname en micro-injectie</td></tr><tr><td>50 &mu;m poriefilter</td><td>CellTrics</td><td>04-0042-2317</td><td>Voor spermapurificatie</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima L-100XP</td><td>Voor spermapurificatie</td></tr><tr><td>50 ml centrifugebuis</td><td>Cellstar Greiner Bio-One</td><td>227261 of 210261</td><td>Oöcytopname en defolliculatiereactie</td></tr><tr><td>15 ml centrifugebuis</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td>Voor spermapurificatie</td></tr><tr><td>90 mm Petri-schaal&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>101VR20/C</td><td></td></tr><tr><td>Easy-Grip Celcultuur Schaal, 60&nbsp;x&nbsp;15 mm</td><td>FALCON</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Easy-Grip Celcultuur Schaal, 35&nbsp;x&nbsp;15 mm</td><td>FALCON</td><td>351008</td><td></td></tr></tbody></table>

manipulatie en<em&gt; in vitro</em&gt; rijping van<em&gt; xenopus laevis</em&gt; eicellen, gevolgd door intracytoplasmatische sperma-injectie, om embryonale ontwikkeling

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amfibische eieren zijn veel gebruikt om embryonale ontwikkeling te bestuderen. Vroege embryonale ontwikkeling wordt aangedreven door maternale factoren die tijdens de oogenese zijn opgeslagen. Om de rollen van dergelijke maternale factoren in de vroege embryonale ontwikkeling te bestuderen, is het wenselijk om hun functies vanaf het allereerste begin van de embryonale ontwikkeling te manipuleren. Conventionele methoden van geninterferentie worden bereikt door injectie van antisense oligonucleotiden (oligo's) of mRNA in bevruchte eieren, waardoor respectievelijk onderdrukking of overexpressie van specifieke eiwitten mogelijk is. Deze methoden vereisen echter normaal gesproken meer dan enkele uren voordat de expressie van eiwitten wordt beïnvloed, en daarom is de interferentie van genfuncties niet effectief tijdens de vroege embryonale stadia. Hier introduceren we een experimenteel systeem waarin de expressieniveaus van maternale eiwitten kunnen worden gewijzigd vóór de bevruchting. Xenopus laevis eicellen verkregen uit eierstokken worden gedefolieculeerd door incubatie met enzymen. Antisense oligo's of mRNA's worden geïnjecteerd in degefolieculeerde eicellen in het germinale vesikel (GV) stadium. Deze eicellen worden in vitro gerijpt tot eieren in het metafase II (MII) stadium, gevolgd door intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI). Op deze manier kan tot 10% van de ICSI-embryo's de zwemmende kikkervisjesfase bereiken, waardoor functionele tests van specifieke genknockdown of overexpressie mogelijk zijn. Deze benadering kan een nuttige manier zijn om de rollen van maternale factoren in de vroege embryonale ontwikkeling te bestuderen.

Embryonale ontwikkeling van ICSI embryo middels in vitro gerijpte oöcyten werd onderzocht (Figuur 3A). Rijping percentages GV oöcyten het MII stadium variabel en hangt grotendeels af van de kwaliteit van de oöcyten. In goede experimenten, bijna 100% van GV oöcyten reageren op progesteron en vertonen tekenen van eicelrijping, begint eindelijk eieren op de MII stadium. Alle volgroeide eicellen werden onderworpen aan ICSI en ongeveer 25% van de geïnjecteerde eieren gesplitst (figuur 3A, n = 13 voor besturing gecodeerde oligo-geïnjecteerde oöcyten en n = 7 voor niet-oligo geïnjecteerde oöcyten). Ongeveer 60% of 80% van gesplitst embryo&#39;s geproduceerd controle-oligo geïnjecteerde oöcyten of niet-geïnjecteerde eicel respectievelijk bereikte de blastula / gastrulastadium. Onder de blastula / gastrula embryo, ongeveer de helft van embryo-oligo geïnjecteerde monsters waren van goede kwaliteit (bijna geen tekenen van abnormale splitsing en apoptose), terwijl 82% van de blastula / gastrula embryo&#39;s van goede kwaliteit in non-geïnjecteerde monsters (Figuur 3A). Tenslotte, 41% en 11% van gesplitst embryo-oligo geïnjecteerde monsters bereikt de spierreactie en zwemmen kikkervisje fasen, respectievelijk, terwijl 60% en 29% van de embryo gesplitst in niet-geïnjecteerde monsters deed (Figuur 3A). Deze ICSI embryo&#39;s het mengsel van normale en abnormale embryo&#39;s (Figuur 3B). Sommigen van hen ondergaan metamorfose en ontwikkelen om kikkers 8 rijpen. Deze resultaten suggereren dat injectie van antisense oligonucleotiden in GV oöcyten, gevolgd door IVM en ICSI, maakt een efficiënte vroege embryonale ontwikkeling. Hoewel de injectie van antisense oligo zelf afneemt embryonale ontwikkeling, we toch voldoende embryo vele experimentele doeleinden te verkrijgen zoals het controleren van ontwikkelings- prijzen, RT-PCR, western blot enzovoort. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig1highres.jpg" /> Vijg<html> ure 1: Typische voorbeelden van Xenopus laevis oöcyten van goede kwaliteit of slechte kwaliteit voor de in vitro maturatie experimenten. (A) Een voorbeeld van slechte kwaliteit eicellen. Zo worden oöcyten weergegeven fragmentarisch pigmentatie niet gebruikt voor daaropvolgende experimenten. Elke Xenopus laevis oöcyten ongeveer 1,2-1,4 mm. (B) een gedeeltelijk defolliculated eicel. De rechterhelft van de eicel onder follikel cellen, die kunnen worden onderscheiden door de aanwezigheid van bloedvaten. Een pijl toont een gebied dat vrij is van follikel cellen en waarin de injectienaald wordt geïnjecteerd. (C) Een voorbeeld van een goede kwaliteit eicellen, die zijn even groot en toon gelijkmatig gepigmenteerde dier hemisferen met duidelijke contrast tussen het dier halfrond en de plantaardige halfrond. 2496 / 52496fig2highres.jpg &quot;/&gt; Figuur 2:. Xenopus laevis oöcyten voor en na rijping na maturatie, stralend witte vlekken bovenaan dier hemisferen en follikel cellen worden afgepeld. Elke Xenopus laevis oöcyten ongeveer 1 mm in diameter. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52496/52496fig3highres.jpg" /> Figuur 3: Ontwikkeling van ICSI embryo&#39;s, geproduceerd uit in vitro gerijpte eicellen. (A) De ontwikkeling van ICSI embryo&#39;s voor elk stadium wordt samengevat. Oocyten werden geïnjecteerd met controle scrambled antisense oligonucleotiden (controle oligo injectie) of zonder injectie (niet injectie), gevolgd door IVM en ICSI. Het overeenkomstige aantal embryo in elke fase boven de balken. Gemiddelde ± SEM wordt getoond. N = 4-13 onafhankelijke experimenten / verschillende females. (B) Voorbeelden van overleven ICSI embryo&#39;s. Deze tailbud embryo&#39;s werden in één experiment, waarbij ongeveer 200 eicellen werden gebruikt als uitgangsmateriaal.

We beschrijven methoden om onrijpe eicellen van Xenopus laevis te manipuleren, in vitro rijping van eicellen tot eieren, en intracytoplasmatische sperma-injectie. Dit protocol maakt degradatie van sommige maternale eiwitten en overexpressie van interessante genen bij bevruchting mogelijk, en is daarom waardevol om de rollen van specifieke factoren in de vroege embryonale ontwikkeling te bestuderen.

Manipulatie en<em&gt; In Vitro</em&gt; Rijping van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eicellen, Gevolgd door intracytoplasmatische sperma-injectie, om embryonale ontwikkeling

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Het doel van het volgende experiment is om maternale eiwitten die in oocyten zijn opgeslagen uit te schakelen (knock down) of om eiwitten van belang te overexpresseren op het moment van bevruchting van kikkereieren. Dit wordt bereikt door antisense-oligo's of mRNA te injecteren in enzymatisch gedereguleerde onrijpe oocyten om een specifiek eiwit af te breken of te overexpresseren. Als tweede stap worden de oocyten overgebracht naar een medium met progesterone, wat de rijping van de oocyten tot eieren induceert.Vervolgens wordt sperma geïnjecteerd in de in vitro gerijpte eicellen om het effect van knockdown of overexpressie op de embryonale ontwikkeling te observeren. Uiteindelijk is de ontwikkeling van oligo-geïnjecteerde oocyten tot zwemmende kikkervisjes de functionele test voor gen-knockdown of overexpressie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals gast-transfer, is dat we het chirurgische proces bij de kikker kunnen overslaan met behulp van standaardprotocollen.Verzamel een fragment van het SAC met gezonde cellen in een petrischaal van negen centimeter met MBS plus ps. Scheid vervolgens het ovarium in vierkante stukjes van één tot twee centimeter breed. Verzamel ongeveer vijf milliliter van het gescheiden ovarium met cellen in een nieuwe buis van 50 milliliter.Spoel de weefsels vervolgens een paar keer af met MBS plus PS en verzamel de eitjes in 15 milliliters vers MBS plus ps. Voeg nu zeven units defoliatie-enzym toe aan de suspensie en incubeer de suspensie met zachte agitatie totdat ze ten minste gedeeltelijk gedefolieerd zijn. Dit zal na de incubatie ten minste een uur duren.Vul de buis met MBS plus Ps om de reactie te stoppen. Trek de oplossing tegen de wand van de buis aan en niet direct op de cellen. Laat de weefsels bezinken en verwijder het supernatant en het reagens.Kleine, onrijpe cytes zullen drijven en moeten ook worden weggegooid. Herhaal deze wasstap in totaal 10 keer na de wasbeurten. Breng de cytes over naar een schaal van negen centimeter met MBS plus ps.Plaats de schaal onder een dissectiemicroscoop en houd de cytes vanaf dit punt zoveel mogelijk op 16 tot 18 °C. Selecteer cytes van goede kwaliteit in stadium zes volgens de Dumont-classificatie met behulp van een glazen pipet en breng deze over naar een nieuwe schaal met MBS plus ps. Een cyte van goede kwaliteit moet een gelijkmatige pigmentatie in de animale hemisfeer hebben en een duidelijke scheiding vertonen tussen de animale en vegetale hemisfeer.Ze moeten ook allemaal ongeveer dezelfde grootte hebben, wat neerkomt op een diameter tussen 1,2 en 1,4 millimeter. Verzamel ongeveer tweehonderd tot 300 cytes voor elke injectie, wat in totaal ongeveer 1000 cytes per experiment vormt. De kwaliteit van de O-plaats is essentieel voor het succes.Als de eicel tijdens de preparatie afwijkingen vertoont, raad ik aan om een eierstok van een andere koppel te selecteren en opnieuw te beginnen. Ter voorbereiding op de injectie van het antisense-oligo stelt u de metalen zuiger van een micro-injector in op de laagste positie en plaatst u een met olie gevulde glazen capillair op de metalen zuiger. Knip onder een dissectiemicroscoop de punt van de naald af met een klein chirurgisch schaartje.Maak de punt zo klein mogelijk. Volgende laser. Plaats een strip parafilm op de microscopietafel en breng daarop drie µL nucleïnezuuroplossing aan met een concentratie van 1 µg/µL.Vul hiermee de punt van de naald. Als er luchtbellen ontstaan, moet de opening worden vergroot. Maak nu een zichtbaar streepje op de injectienaald op ongeveer een halve millimeter van de punt.Ga vervolgens over tot het injecteren van de cytes. Om er eerst één te injecteren, zoekt u een gebied zonder follikelcellen waar de naald kan binnendringen. Steek de punt langs de equatoriale grens in door te richten op het middelpunt onder de kiemblaasje. Houd tegelijkertijd de cyte met een pincet aan de tegenovergestelde zijde vast.Gebruik nu de voetschakelaar om de oplossing uit te stoten, waarbij tussen de 4,6 en 9,2 nanogram antisense-oligos of tussen de 250 picogram en 13,8 nanogram messenger-RNA wordt geïnjecteerd. Na het injecteren van alle cyten worden deze overgebracht naar incubatiemedium en enkele dagen geïncubeerd, zodat er veranderingen in het proteasoom kunnen optreden.Breng de cytes vervolgens met een minimale hoeveelheid medium over naar agros-coated schaaltjes van zes centimeter die vijf tot acht milliliter rijppingsmedium bevatten. Laat de cytes daarna 16 uur in dit medium ontwikkelen voordat ze worden geïnjecteerd met sperma. Voor dit protocol moet een voorraad bevroren sperma worden klaargemaakt.Raadpleeg het tekstprotocol na 16 uur incubatie voor rijping. Draag de cytes zeer voorzichtig over naar een schaal van zes centimeter met een egg gross-coating met MBS plus PS om ze af te wassen. Als de cytes onjuist worden behandeld, kunnen ze spontaan activeren vóór de ixy.Tel nu de volgroeide cyten en zoek naar witte vlekken die erop wijzen dat de kiemblaasje van de cyt is afgebroken. Als minder dan 80% goed is, zijn ze collectief niet gezond genoeg om de ixy-procedure te overleven. Om verder te gaan.Vul een nieuw schaaltje met injectiemedium en breng na een half uur alle cytes voorzichtig over naar het schaaltje. Ga over tot het injecteren van de mature cytes met spermavloeistof met behulp van dezelfde injectorvoorbereiding als beschreven voor oligos. Ideaal gezien moet er één of twee spermacellen per 4.6 nanoliters in de injectieoplossing aanwezig zijn.Om deze injectie-oplossing te testen, maakt u druppels van DPI-oplossing met 0,3 microgram DPI per milliliter en injecteert u 4,6 nanoliter in deze druppels. Tel vervolgens het aantal spermatocellen in elke druppel met fluorescentiemicroscopie. Na bevestiging van de spermaconcentratie injecteert u de cytes met 4,6 nanoliter van de sperma-oplossing.Zorg ervoor dat de tijd die nodig is voor het injecteren van de oplossingen consistent blijft en injecteer de oocyten gestaag met minimale pauzes tussen de injecties. Vervang de spermapreparaat na elke 100 injecties. Nadat alle gerijpte oocyten zijn geïnjecteerd, moet de schaal vier tot vijf uur worden geïncubeerd en vervolgens worden geïnspecteerd.Voor embryo's die reeds zijn gedeeld, zijn de klievingsgroeven mogelijk minder duidelijk dan die van normale bevruchte embryo's; overdraag alle gedeelde embryo's naar incubatiemedium en laat deze een nacht incuberen. De volgende dag moeten de overlevende embryo'en worden overgebracht naar 0,1 XMMR voor de embryonale ontwikkeling van ixy-embryo'en. Bij het gebruik van in vitro gerijpte oocyten werd in goede experimenten vastgesteld dat bijna 100% van de kiemblaas-oocyten reageerde op progesteron en tekenen van rijping vertoonde.Ongeveer 25% onderging splitsing. 60 tot 80% van de gesplitste embryo's bereikte het blastulastadium, en ongeveer een derde daarvan bereikte het stadium van de zwemmende kikkervisje. De geïnjecteerde embryo's waren een mengeling van zowel normale als abnormale embryo's, wat aantoont dat injectie van antisense sogo in kiemblaasjes, gevolgd door IVM en bevruchting, vroege embryonale ontwikkeling mogelijk maakte.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe maternale eiwitten worden gemanipuleerd vóór de factorisatie.

manipulation-vitro-maturation-xenopus-laevis-oocytes-followed

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier laten we zien cytoplasmatische micro-injectie...

Micro-injectie van de Xenopus laevis Eicellen

Bemesting van Xenopus oöcyten Het gebruik van de Host Transfer Methode

Xenopus embryonale epitheel is een ideaal modelsysteem om cel gedrag, zoals polariteit ontwikkeling en vorm veranderen tijdens epitheliale morfogenese bestuderen. Traditionele histologie van vaste monsters wordt in toenemende mate aangevuld door live-cell imaging confocale. Hier laten we zien methoden om de kikker weefsel te isoleren en te visualiseren live-epitheliale cellen en hun cytoskelet met behulp van live-cell confocale microscopie.

Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in Xenopus laevis</em

Wij rapporteren hier de robuuste en efficiënte expressie van fluorescerende eiwitten na mRNA injectie in onbevruchte eicellen van Branchiostoma lanceolatum. De ontwikkeling van de micro-injectie techniek in deze basale chordate zal de weg voor vergaande technische innovaties in deze opkomende model systeem, met inbegrip van in vivo beeldvorming en gen-specifieke manipulaties effenen.

Expressie van fluorescerende eiwitten in Branchiostoma lanceolatum Door mRNA Injectie in onbevruchte eicellen

Het manuscript hier een eenvoudige set van methoden voor het analyseren van de afscheiding en de verspreiding van fluorescent gelabelde liganden in Xenopus. Dit verschaft een context voor het testen van het vermogen van andere eiwitten ligand distributie passen en waardoor experimenten inzicht in mechanismen reguleren morfogeen gradiënten kunnen leiden.

Met behulp van confocale Analyse<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Om Modulators van Wnt en Shh Morfogen Verlopen Onderzoek

In Xenopus embryo's, cellen van het dak van de blastocoel zijn pluripotent en kunnen worden geprogrammeerd om verschillende weefsels te genereren. Hier beschrijven we protocollen om uitstrijkjes van de amfibische blastocoel-dak als een assaysysteem te gebruiken om belangrijke in vivo en in vitro kenmerken van vroege neurale ontwikkeling te onderzoeken.

Stamcelachtige<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantaten om te studeren Early Neural Developmental Kenmerken<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

We beschrijven een Xenopus eicel en dierlijk kapsysteem voor de expressie-klonering van genen die in staat zijn om een respons te induceren in competent ectoderm, en bespreken technieken voor de daaropvolgende analyse van dergelijke genen. Dit systeem is nuttig bij de functionele identificatie van een breed scala aan genproducten.

Functionele klonen behulp van een<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicel Expression System

Een geoptimaliseerd protocol voor de in vitro rijping van oöcyten zebravis gebruikt voor het manipuleren van moederlijke genproducten wordt hier gepresenteerd.

Functionele Manipulatie van Maternal Gene producten met behulp van<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturatie van zebravis

Dit protocol toont een fluorescentie gebaseerde methode om de vasculatuur te visualiseren en de complexiteit ervan te kwantificeren in Xenopus tropicalis . Bloedvaten kunnen na de injectie van een fluorescerende kleurstof in het kloppende hart van een embryo worden gedetecteerd na genetische en / of farmacologische manipulaties om in vivo cardiovasculaire ontwikkeling te bestuderen.

Visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

We beschrijven een fysieke constrictiemethode om mini-embryo's te maken van Xenopus laevis 1-cel embryo's.

Fysieke manipulatie om Xenopus mini-embryo's te genereren

Dit protocol beschrijft procedures voor in-vitro rijping van muis-oocyten, in-vitrofertilisatie en daaropvolgende embryokweek tot het blastocyststadium.

Muize-oocyt in vitro rijping, bevruchting en kweek van pre-implantatie embryo's

Leer hoe je Xenopus laevis oocyten manipuleert en rijpt voor intracytoplasmatische sperma-injectie. Deze methode maakt het mogelijk om moederlijke eiwitten af te breken en genen te overexpresseren tijdens bevruchting.

Manipulatie en In Vitro Rijping van Xenopus laevis Eicellen, Gevolgd door intracytoplasmatische sperma-injectie, om embryonale ontwikkeling (Video) | JoVE Journal

Manipulatie en

Meer video's verkennen