Massaspectrometrische benaderingen tot Protein Structure en interacties te bestuderen in gevriesdroogde Poeders

Het algemene doel van deze procedure is om de structuur van een eiwit met hoge resolutie te bewaken met behulp van emissie waterstof-deuterium-uitwisseling en zijketen lytische markering gekoppeld aan massaspectrometrie. Dit wordt bereikt door eerst het eiwit te lyofiliseren in aanwezigheid van verschillende hulpstoffen. Bij waterstof-deuterium-uitwisseling in vaste toestand wordt het gelyofiliseerd eiwit blootgesteld aan deuteriumoxidedamp in een verzegeld droogijs onder gecontroleerde relatieve luchtvochtigheid en temperatuur.

Voor lytische markering wordt het eiwit gelyofiliseerd met hulpstoffen en een fotoreactieve stof. De flacon wordt vervolgens bestraald met UV-licht om de stof covalent aan het eiwit te hechten. Voor elke methode worden de monsters gereconstitueerd en geanalyseerd met behulp van een massaspectrometer op zowel intact eiwit als peptideniveauresolutie.

Deze twee methoden bieden complementaire informatie. Formuleringen waarin de eiwitstructuur sterk behouden blijft, vertonen verminderde deuteriumopname en verhoogde lytische markering, terwijl die met een verstoorde structuur verhoogde deuteriumopname en verminderde lytische markering vertonen. Chemische markering, zoals waterstof-deuterium-uitwisseling en foto-kruisverbinding gekoppeld aan massaspectrometrische analyse, is recent aangepast om eiwitstructuur en interacties in levendige ondersteuningen te bestuderen.

Het belangrijkste voordeel van deze technieken ten opzichte van bestaande methoden zoals CD- en FDIR-spectroscopie is dat eiwitstructuur en omgeving met hoge resolutie in de vaste toestand kunnen worden onderzocht. Om te beginnen, plaats 200 milliliter deuteriumoxide in het onderste compartiment van een droogijs en voeg 400 gram kaliumcarbonaat toe. Om een verzadigde oplossing te maken, plaats de porseleinen droogijsplaat erin en verzegel de droogijs luchtdicht. Laat het vijf graden Celsius gelijkmaken om een stabiele relatieve luchtvochtigheid dicht bij 43% te bereiken. Plaats vervolgens de ongedekte flacons met gelyofiliseerd eiwit in het bovenste compartiment van de droogijs, verzegel de droogijs en incubeer bij vijf graden Celsius.

Om de waterstof-deuterium-uitwisselingsreactie te initiëren om een monster te verzamelen, sluit de flacon onmiddellijk nadat deze uit de droogijs is verwijderd en doof vervolgens de reactie door de flacon en vloeibaar stikstof snel te bevriezen. Bewaar de flacon bij min 80 graden Celsius tot massaspectrometrische analyse. Gebruik hoge resolutie massaspectrometrie om de monsters te analyseren om back-uitwisseling te minimaliseren.

Hoe is het vloeistofchromatografische systeem in een gekoelde doos? Om het instrument op te zetten, verbind eerst de monsterschroevendraaier en de eiwitval met de klep die de ontzouting en de elutieprocessen regelt. Kalibreer vervolgens het systeem door de laagconcentratie tuningmix in de massaspectrometer te injecteren en de massa-ladingverhouding van 200 tot 3.200 in te stellen.

Koel vervolgens het gekoelde systeem af tot een stabiele werktemperatuur van ongeveer nul graden Celsius. Bereid de blusbuffer voor die 0,2%mierenzuur en 5%methanol in water bevat en koel deze op ijs. Na het overbrengen van de monsters naar vloeibaar stikstof, verwijder voorzichtig een flacon en reconstitueer het monster door twee milliliter blusbuffer toe te voegen.

Laad vervolgens een geschikte HPLC- en massaspectrometriemethode. Om het monster hier te analyseren, ontzout 20 picomol myoglobine in de eiwitval gedurende 1,7 minuten met 5%acetyl nitrile en 0,1%mierenzuur. Eluteer vervolgens het eiwit over een 3,3 minuten durende gradiënt, toenemend tot 80%aceto nitrile en 0,1%mierenzuur.

Injecteer het monster en verzamel de massaspectra over een massa-ladingverhouding van 200 tot 3.200. Gebruik dezelfde methode met een ongepaste eiwitmonster om de massa van het intacte eiwit als referentie te bepalen. Verkrijg de eiwitmassa door de ruwe spectra te ontcijferen met behulp van gegevensanalysesoftware. Voor myoglobinemonsteranalyse stelt u het massabereik in van 15 tot 18 kilodalton, de massa-resolutie op één dalton en de piekkante op 90%. Voor peptideanalyse bereidt u de monsters voor volgens hetzelfde protocol als voor intacte eiwitten.

Wanneer de monsters klaar zijn om te worden geanalyseerd, verbindt u een geïmmobiliseerd pepin-kolom en een analytische kolom met de klep en vervangt u de eiwitval door een peptideval. Het systeem kalibreren voor peptiden is uitgevoerd voor intacte eiwitten, maar door de massa-ladingverhouding van 100 tot 1700 in te stellen, koelt u het gekoelde systeem af tot een stabiele werktemperatuur van ongeveer nul graden. Zodra het systeem is gekalibreerd, programmeert u de juiste HPLC- en massaspectrometriemethode.

Vervolgens verteer je 20 picomol myoglobine op de Pepin-kolom met 0,1%mierenzuur in water programmeer de methode om de peptiden in de peptideval 1,7 minuten te vangen en te ontzouten met 10%acetyl nitrile en 0,1%mierenzuur, en om de peptiden in vier minuten te elueren met een gradiënt die toeneemt tot 60%acetyl nitrile en 0,1%mierenzuur. Injecteer vervolgens het monster en verzamel de massaspectra over een massa-ladingverhouding van 100 tot 1700. Analyseer een ongedateerde peptidemonster met tandemmassaspectrometrie om de peptische fragmenten te identificeren.

Controleer vervolgens de experimenteel bepaalde fragmenten met software-gegenereerde voorspelde massa's. Stel vervolgens de massa-cutoff in op 10 delen per miljoen om massa's met een hoge foutmarge voor peptiden met overeenkomsten te elimineren. Noteer de peptidesequentie, ladingstoestand en de retentietijd.

Gebruik de verzamelde peptidegegevens om het gemiddelde aantal deuteros dat per peptisch fragment is opgenomen te berekenen. Gebruik de gegevensanalysesoftware. Lyofiliseer eerst het eiwit met het hulpmiddel en lucine zoals aangegeven in het tekstprotocol. Nadat de monsters zijn voorbereid, zet u een UV-crosslinker met 365 nanometer UV-lampen aan. Laat de lampen vijf minuten