Name: Massaspectrometrische benaderingen tot Protein Structure en interacties te bestuderen in gevriesdroogde Poeders (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Leer hoe je eiwitstructuur en interacties bestudeert met massaspectrometrische technieken in gevriesdroogde poeders. Deze methoden bieden hoogwaardige inzichten voor formuleringontwerp.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen met dank de financiële ondersteuning van NIH R01 GM085293 (PI: E. M. Topp) en van de College of Pharmacy aan Purdue University.

1. Monstervoorbereiding en Lyofilisatie <ol><li> Dialyseren de vereiste hoeveelheid Mb voorraad oplossing tegen een geschikte buffer en filter door een 0,22 pm steriel filter. </li><li> Bereid de benodigde hoeveelheid excipiënten en foto-leucine (L-2-amino-4,4-azi-pentaanzuur; pLeu) voorraadoplossingen in geschikte buffer. Filter de voorraad oplossingen door een 0,22 pm steriel filter. </li><li> Bereid formuleringen zoals getoond in Tabel 1 met de voorraadoplossingen van eiwitten, excipiënten, pLeu en buffer. </li><li> Monsters filter door een 0,22 pm steriel filter om deeltjes gevormd bij stap 1.3 te verwijderen. Vul de monsters afzonderlijk als 0,2 ml in 2 ml glazen flesjes. Gebruik glazen flesjes die transparant zijn voor UV (365 nm) licht zijn om pLeu in de SSPL-MS studies te activeren. </li><li> Flacons lading in een vriesdroger en initiëren vriesdrogen door het ontwerpen van een geschikte lyofilisatiecyclus. <ol><li> Hier monsters bevriezen bij -40 ° C, gevolgdprimaire drogen onder vacuüm (70 mTorr) bij -35 ° C gedurende 12 uur en secundaire droging bij 25 ° C gedurende 12 uur. Andere lyofilisatie cycli en droogmethoden (bijvoorbeeld sproeidrogen) kunnen ook worden gebruikt. </li></ol></li><li> Opvulling van de injectieflacons met gevriesdroogde monsters met stikstof voordat aftopping. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Formuleringen </td><td colspan="5"> Samenstelling (mg / ml) voorafgaand aan lyofilisatie </td></tr><tr><td> Mb </td><td> Trehalose </td><td> Sorbitol </td><td> pLeu c </td><td> Kalium, fosfaat, pH 7,4 </td></tr><tr><td> MbT een </td><td> 1.7 </td><td> 3.4 </td><td> - </td><td> - </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> Mbs een </td><td> 1.7 </td><td> - </td><td> 3.4 </td><td> - </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> MbT + pLeu b </td><td> 1.7 </td><td> 3.4 </td><td> - </td><td> 14.3 x 10 -3 tot 1,43 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> MBS + pLeu b </td><td> 1.7 </td><td> - </td><td> 3.4 </td><td> 14.3 x 10 -3 tot 1,43 </td><td> 0.4 </td></tr></tbody></table> Tabel 1:... Samenstelling van gevriesdroogde formuleringen Mb een Formuleringen voor de ssHDX-MS studie b formuleringen voor SSPL-MS studie C L-2-amino-4,4-azipentanoic zuur of foto-leucine (pLeu). pLeu op vijf verschillende concentraties (14,3 x 10 -3 tot 1,43 mg / ml) gevonden met 1x, 10x, 20x, 50x en 100x molaire overmaat ten opzichte Mb werden samen gevriesdroogd met MbT en MB formuleringen. 2. ssHDX-MS voor intacte eiwit <ol><li> Voeg een verzadigende hoeveelheid (~ 440 g) van K 2 CO 3-200 ml D2O previously geplaatst in het onderste compartiment van een exsiccator. Dicht de exsiccator luchtdicht en laat het evenwicht bij 5 ° C tot een stabiele relatieve luchtvochtigheid (RV) van ~ 43% is bereikt. Andere RH waarden van belang kan worden verkregen door het selecteren van verschillende verzadigde zoutoplossingen 23,24. </li><li> Initiëren ssHDX reacties door het plaatsen van niet-afgetopte flacons met de gevriesdroogde eiwit in het bovenste compartiment van de exsiccator. Dicht de exsiccator luchtdichte en incubeer bij 5 ° C te laten HDX te voorkomen (Figuur 2A). </li><li> Verzamel ssHDX monsters op verschillende tijdstippen in drievoud. Voor Mb formuleringen verzamelen monsters op negen tijdstippen 1, 2, 4, 8, 16, 32, 56, 92 en 144 uur. </li><li> Cap de flesjes onmiddellijk na terugtrekken uit de exsiccator en de reacties door flash bevriezen van de flesjes in vloeibare stikstof te lessen. WINKEL flesjes bij -80 ° C totdat massaspectrometrische analyse. </li><li> Analyseer monsters met behulp van een geschikte hoge resolutie vloeistofchromatografie-mass Spectrommethode Etry (LC-MS). Ontwerp of de aanschaf van een geschikte gekoelde LC systeem om back-uitwisseling tijdens de analyse van het monster te minimaliseren. Gebruik de setup van de kolom koelunit en LC-MS methode eerder gemelde 25. Opmerking: omdat de snelheid van amide protonenuitwisselings- afhankelijk van pH en temperatuur, kunnen deuteronen opgenomen in het eiwit wisselen met waterstof in de mobiele fase (&quot;back uitwisseling&quot;), waardoor een verlies van informatie. Hoewel een zure pH (pH 2,5) van quench buffer en HPLC oplosmiddelen back-exchange grotendeels te minimaliseren, waardoor de temperatuur (≤0 ° C) door middel van een geschikte kolom koelsysteem kan het eiwit van back-uitwisseling verdere bescherming . </li><li> Sluit de sample loop en eiwit val aan de klep die automatisch regelt de ontzouting en elutieproces. Kalibreer de massaspectrometer door injectie van een TOF lage concentratie afstemmen mengsel in de massaspectrometer in de m / z reeks 200-3,200. Het geïmmobiliseerdepepsine column en analytische kolom zijn niet vereist voor intacte eiwit analyse. </li><li> Stel de temperatuur in de gekoelde systeem om ≤0 ° C en wacht tot het systeem om een ​​stabiele temperatuur van ~ 0 ° C bereiken. </li><li> Snel de monsters van -80 ° C in vloeibare stikstof voor massaspectrometrische analyse. Behulp van een tang, zuig elke flacon van vloeibare stikstof en los het monster door toevoeging van een specifiek volume ijskoude quench buffer die 0,2% mierenzuur (FA) (pH 2,5) en 5% methanol in water aan het flesje. </li><li> Programmeer een geschikte HPLC en massaspectrometrie wordt gebruikt bij de besturingssoftware. Voor Mb formuleringen, ontzouten monster bevattende 20 pmol Mb in het eiwit val 1,7 min met 5% acetonitril, 95% water en 0,1% mierenzuur (FA) en elueren met een gradiënt verhoogd tot 80% acetonitril, 20% water en 0,1 % FA in 3,3 min. Verzamel massa spectra over de m / z bereik 200-3,200. </li><li> Om de massa van intacte bepaleneiwit verwerven van gegevens voor een ongedeutereerde eiwitmonster (dwz eiwit niet onderworpen aan ssHDX) in waterige oplossing met de werkwijze van stap 2.9. </li><li> Het verkrijgen van de massa&#39;s van ongedeutereerde en deuterium monsters door deconvolueren de ruwe spectra met behulp van data-analyse software. Hier stelt u de massa bereik 15,000-18,000 Da, de massa resolutie tot 1,0 Da, en de piekhoogte tot 90% voor de berekening van de massa van Mb. </li><li> Bereken het aantal deuteronen opgenomen in het intacte eiwit (hier, Mb) door het aftrekken van de massa ongedeutereerde eiwit uit de massa van gedeutereerde eiwit op elke uitwisseling tijdstip. </li><li> Bereken het percentage deuterium opname ten opzichte van de theoretische maximale middels de volgende vergelijking (Vergelijking 1) <img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq1.jpg" width="500px" /> waar totaal aantal verwisselbare amiden = totaal aantal aminozuren - aantal prolineresiduen - 2 (&quot;2&quot; is goed voor de N-terminale aminogroep en amide waterstof dat een snelle back-uitwisseling te ondergaan). </li><li> Breng de ssHDX kinetische gegevens met behulp van een geschikte exponentiële vergelijking. Een bi-exponentiële vergelijking (vergelijking 2) is meestal de eenvoudigste die een redelijk fit levert aan de ssHDX gegevens. In deze studie, voor MbT en MB&#39;s, passen de gegevens aan een bi-exponentiële model dat deuteronen toekent aan &quot;snelle&quot; en &quot;langzame&quot; uitwisselen van zwembaden. <img alt="Vergelijking 2" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq2.jpg" width="487px" /> waarbij N snelle en N traag zijn aantal uitwisselbare amiden in de &quot;snelle&quot; en &quot;langzame&quot; uitwisseling zwembaden, respectievelijk, en k snelle en langzame k de eerste orde snelheidsconstante verbonden met de twee zwembaden. </li></ol> 3. ssHDX-MS voor eiwit bij Peptide Niveau <ol><li> Voeren ssHDX door volgende stappen 2,1-2,8, met de volgende wijzigingen in stap 2.6. Sluit de geïmmobiliseerd pepsine colUMN en analytische kolom aan de klep zoals eerder vermeld 25 en vervang het eiwit val de klep verbonden met een peptide val. Kalibreer de massaspectrometer door de massa verhouding van 100 tot 1700 te laden. OPMERKING: Bij de bereiding (stap 2.8), een reductiemiddel en denatureringsmiddel in de quench buffer worden opgenomen om pepsine digestie van eiwitten met disulfidebindingen (bijvoorbeeld monoklonale antilichamen) te vergemakkelijken. </li><li> Programmeer een geschikte HPLC en massaspectrometrie wordt gebruikt bij de besturingssoftware. Voor Mb formuleringen, verteren monsters die 20 pmol Mb online met 0,1% FA, val en ontzouten peptiden voor 1,7 min met 10% acetonitril, 90% water en 0,1% FA in een peptide val. Elueer de fragmenten op de analytische kolom met een gradiënt stijging tot 60% acetonitril, 40% water en 0,1% FA in 4,0 min. Verwerven massa spectra over de m / z bereik 100-1,700. </li><li> Identificeer de peptische fragmenten door MS / MS analyse van eenongedeutereerde eiwitmonster. Met massaspectrometrie software experimentele massa peptide fragment-ionen vergelijken met de voorspelde massa van peptidefragmenten in een aangepaste database. Stel een massa-cut-off point (bijvoorbeeld 10 ppm) om massa&#39;s te identificeren met een laag foutenpercentage. Voor geëvenaard peptiden, bereiden een lijst bestaat uit (i) peptidensequentie, (ii) laadtoestand, en (iii) retentietijd. </li><li> Gebruik de lijst gegenereerd in stap 3.3 in kaart en bepaal het gemiddelde aantal deuteronen opgenomen voor elke pepsine verteren fragment. Dit kan worden bereikt door geschikte HDX-MS data analyse software 24. </li><li> Om het percentage deuterium opname te berekenen en de ssHDX kinetische gegevens geschikt zijn voor elk van de peptische fragmenten, volgt u stappen 2.13 en 2.14. In deze studie HDX kinetische gegevens voor elk van de zes niet-redundante pepsine verteren fragmenten uit MbT en MBS formuleringen bi-exponentiële associatiemodel (Vergelijking 2) werden geplaatst. </li></ol> 4. SSPL-MS voor Intact ProTein <ol><li> Om de fotolytische labelingsreactie, eerste schakelaar op de UV-crosslinker beginnen en laat de lampen op te warmen voor 5 min. Controleer de UV bron is uitgerust met lampen golflengte 365 nm tot de diazirine groep pLeu activeren. LET OP: Open nooit de deur van de UV-crosslinker wanneer de lampen aan zijn. Bescherm ogen en huid tegen blootstelling aan UV-licht als de bron niet wordt omsloten door een UV-beschermende glazen deur. </li><li> Schakel de UV-crosslinker voordat de deur geopend. Wanneer de lampen worden uitgeschakeld, Haal het beschermkapje van de flesjes die de gelyofiliseerde formulering en plaats ze in de UV verknoper geplaatst zoals aangegeven in figuur 2B. Bestralen de monsters met UV licht gedurende 40 minuten. </li><li> Voer controleproeven door stap 4,1-4,3 voor (i) monsters gevriesdroogd zonder pLeu en (ii) monsters gelyofiliseerd met pLeu gereconstitueerd in water. </li><li> Cap en bewaar de flesjes bij -20 ° C totdat massaspectrometrische analyse. </li><li> ReconstitUte de vaste monsters door het toevoegen van een geschikt volume van massaspectrometrie leerjaar gedestilleerd water om de concentratie tot 2 uM brengen. </li><li> Om steekproefanalyse begint, volgt u de stappen 2.6 en 2.9. LET OP: Aangezien back-uitwisseling is niet een probleem met covalente etikettering, doet SSPL-MS een speciale gekoelde LC systeem nodig. </li><li> Om het natieve massa van het eiwit bepalen, verwerven van gegevens voor een eiwit monster die niet is onderworpen aan SSPL door stap 2.9. Het verkrijgen van de massa&#39;s van niet-gelabelde en gelabelde monsters door deconvolueren de ruwe spectra zoals beschreven in stap 2.11. </li><li> Bereken het aantal pLeu bijgemengde met de volgende formule: <img alt="Vergelijking 3" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq3.jpg" width="438px" /> waarbij M L de massa van gemerkt eiwit, M N is de massa van natieve proteïne en 115 is de gemiddelde massa (Da) toegevoegd natieve eiwit na enkelvoudige pLeu opname. Merk op dat de etikettering reactie optreedt met the verlies van N2 (28 Da). De mono-isotopische massa van pLeu is 143,07. </li><li> Bereken het percentage eiwit populaties met verschillende aantallen labels met piekhoogten van de geëxtraheerde ion chromatogrammen. <img alt="Vergelijking 4" src="/files/ftp_upload/52503/52503eq4.jpg" width="401px" /> waarbij &quot;i&quot; geeft het aantal labels, PH i staat de piekhoogte van gemerkt eiwit L i PH u duidt de piekhoogte van de niet gelabelde eiwit zoals waargenomen door massaspectrometrie. </li></ol> 5. SSPL-MS eiwit op het peptideniveau <ol><li> Voeren SSPL door volgende stappen 4,1-4,4. </li><li> Voor peptideniveau analyse reconstitueren vaste materialen in ammonium bicarbonaat buffer (100 mM, pH 8,0). </li><li> Na reconstitutie meng de gemerkte eiwitoplossing met trypsine bij 10: 1 molaire verhouding van eiwit trypsine en incubeer bij 60 ° C gedurende 16 uur. </li><li> Schrik de reactie af door toevoeging van 0,1% FAin water om het monster eindconcentratie geven tot 2 uM eiwit. </li><li> Sluit de monsterlus, peptide val en analytische kolom klep verbonden met het HPLC-systeem. </li><li> Programmeer een geschikte HPLC en massaspectrometrie wordt gebruikt bij de besturingssoftware. Voor Mb formuleringen Injecteer 20 pmol van de gedigereerd eiwit in de monsterlus en ontzouten de peptiden in een peptide val gedurende 1,5 min met 5% acetonitril, 95% water en 0,1% FA, gevolgd door elutie in de analytische kolom met gradiënt te verhogen tot 55% acetonitril, 45% water en 0,1% FA in 22 min. Verzamel massa spectra over de m / z bereik 100-1,700. </li><li> Bereid een theoretische massa lijst voor peptide-pLeu adducten met behulp van een online tool zoals ExPASy 26 met nummers van pLeu eerder berekend uit de intacte eiwit analyse. Ten minste 4 gemist breuklijnen. Merk op dat de labeling reactie optreedt met het verlies van N2. Daarom is de massa van peptide-pLeu adduct = massa van ongelabelde tryptic peptide + n (massa pLeu) - n (massa N2), waarbij &quot;n&quot; het aantal pLeu opgenomen. OPMERKING: Als de massa-analyse van intacte eiwitten toonde maximaal drie gelabelde populaties van eiwit, overweeg maximaal drie mogelijke pLeu labels per peptide. Voor een peptide met een massa van 1000 Da, zou de theoretische massa van het peptide-pLeu adduct met 1 pLeu incorporatie zijn 1.000 + 1 (143) - 1 (28) = 1.115 Da. Ook de theoretische massa van peptide-pLeu adducten met 2 pLeu, 3 pLeu, etc. respectievelijk zouden 1230 Da, 1345 Da, enz. </li><li> Gebruik de massa-analyse software om de theoretische massa lijst gegenereerd in stap 5.7 met de experimenteel waargenomen massa overeenkomen. Stel een massa-cut-off point (bijvoorbeeld 50 ppm) om massa&#39;s te identificeren met een laag foutenpercentage. </li><li> Voor afgestemd peptiden, werd de werkelijke aantal pLeu opgenomen met de formule in stap 4.8 (vergelijking 3), waarbij M en L M N de massa gelabeldeen inheemse peptide, respectievelijk. </li></ol>

<ol><li>Lawrence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Billion+dollar+babies--biotech+drugs+as+blockbusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Billion dollar babies--biotech drugs as blockbusters.</a> Nat. Biotechnol. 25 (4), 380-382 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Global+Markets+and+Manufacturing+Technologies+for+Protein+Drugs%22">Global Markets and Manufacturing Technologies for Protein Drugs</a>. , BCC Research. BIO021D(2013).</li>
<li>Lai, M. C., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-state+chemical+stability+of+proteins+and+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Solid-state chemical stability of proteins and peptides.</a> J. Pharm. Sci. 88 (5), 489-500 (1999).</li>
<li>Carpenter, J. F., Pikal, M. J., Chang, B. S., Randolph, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+stable+lyophilized+protein+formulations%3A+some+practical+advice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Rational design of stable lyophilized protein formulations: some practical advice.</a> Pharm. Res. 14 (8), 969-975 (1997).</li>
<li>Carpenter, J. F., Chang, B. S., Garzon-Rodriguez, W., Randolph, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+stable+lyophilized+protein+formulations%3A+theory+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rational design of stable lyophilized protein formulations: theory and practice.</a> Pharm. Biotechnol. 13, 109-133 (2002).</li>
<li>Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+determination+in+solution+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein structure determination in solution by NMR spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 265 (36), 22059-22062 (1990).</li>
<li>Ilari, A., Savino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+determination+by+x-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein structure determination by x-ray crystallography.</a> Methods. Mol. Biol. 452, 63-87 (2008).</li>
<li>Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystallography+and+NMR+reveal+complementary+views+of+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">X-ray crystallography and NMR reveal complementary views of structure and dynamics.</a> Nat. Struct. Biol. 4, 862-865 (1997).</li>
<li>Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amorphous+pharmaceutical+solids%3A+preparation%2C+characterization+and+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug.+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Amorphous pharmaceutical solids: preparation, characterization and stabilization.</a> Adv Drug. Deliv. Rev. 48 (1), 27-42 (2001).</li>
<li>Manning, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+infrared+spectroscopy+to+monitor+protein+structure+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Use of infrared spectroscopy to monitor protein structure and stability.</a> Expert. Rev. Proteomics. 2 (5), 731-743 (2005).</li>
<li>Grohganz, H., Gildemyn, D., Skibsted, E., Flink, J. M., Rantanen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+solid-state+analysis+of+freeze-dried+protein+formulations+using+NIR+and+Raman+spectroscopies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid solid-state analysis of freeze-dried protein formulations using NIR and Raman spectroscopies.</a> J. Pharm. Sci. 100 (7), 2871-2875 (2011).</li>
<li>Bai, S., Nayar, R., Carpenter, J. F., Manning, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+determination+of+protein+conformation+in+the+solid+state+using+near+infrared+%28NIR%29+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Noninvasive determination of protein conformation in the solid state using near infrared (NIR) spectroscopy.</a> J. Pharm. Sci. 94 (9), 2030-2038 (2005).</li>
<li>Pikal, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+state+chemistry+of+proteins%3A+II.+The+correlation+of+storage+stability+of+freeze-dried+human+growth+hormone+%28hGH%29+with+structure+and+dynamics+in+the+glassy+solid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Solid state chemistry of proteins: II. The correlation of storage stability of freeze-dried human growth hormone (hGH) with structure and dynamics in the glassy solid.</a> J. Pharm. Sci. 97 (12), 5106-5121 (2008).</li>
<li>Wang, B., Tchessalov, S., Cicerone, M. T., Warne, N. W., Pikal, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sucrose+level+on+storage+stability+of+proteins+in+freeze-dried+solids%3A+II.+Correlation+of+aggregation+rate+with+protein+structure+and+molecular+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Impact of sucrose level on storage stability of proteins in freeze-dried solids: II. Correlation of aggregation rate with protein structure and molecular mobility.</a> J. Pharm. Sci. 98 (9), 3145-3166 (2009).</li>
<li>Schule, S., Friess, W., Bechtold-Peters, K., Garidel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+analysis+of+protein+secondary+structure+during+spray-drying+of+antibody%2Fmannitol+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Conformational analysis of protein secondary structure during spray-drying of antibody/mannitol formulations.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 65 (1), 1-9 (2007).</li>
<li>Baerga-Ortiz, A., Hughes, C. A., Mandell, J. G., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+mapping+of+a+monoclonal+antibody+against+human+thrombin+by+H%2FD-exchange+mass+spectrometry+reveals+selection+of+a+diverse+sequence+in+a+highly+conserved+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Protein.+Sci%22%5BJournal%5D)">Epitope mapping of a monoclonal antibody against human thrombin by H/D-exchange mass spectrometry reveals selection of a diverse sequence in a highly conserved protein.</a> Protein. Sci. 11 (6), 1300-1308 (2002).</li>
<li>Coales, S. J., Tuske, S. J., Tomasso, J. C., Hamuro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+mapping+by+amide+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+coupled+with+immobilization+of+antibody%2C+on-line+proteolysis%2C+liquid+chromatography+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid.+Commun.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Epitope mapping by amide hydrogen/deuterium exchange coupled with immobilization of antibody, on-line proteolysis, liquid chromatography and mass spectrometry.</a> Rapid. Commun. Mass. Spectrom. 23 (5), 639-647 (2009).</li>
<li>Pacholarz, K. J., Garlish, R. A., Taylor, R. J., Barran, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+based+tools+to+investigate+protein-ligand+interactions+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry based tools to investigate protein-ligand interactions for drug discovery.</a> Chem. Soc. Rev. 41 (11), 4335-4355 (2012).</li>
<li>Houde, D., Peng, Y., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+differentially+affect+IgG1+conformation+and+receptor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications differentially affect IgG1 conformation and receptor binding.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9 (8), 1716-1728 (2010).</li>
<li>Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry+in+biopharmaceutical+comparability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies.</a> J. Pharm. Sci. 100 (6), 2071-2086 (2011).</li>
<li>Dorman, G., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+photolabile+ligands+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Using photolabile ligands in drug discovery and development.</a> Trends. Biotechnol. 18 (2), 64-77 (2000).</li>
<li>Robinette, D., Neamati, N., Tomer, K. B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoaffinity+labeling+combined+with+mass+spectrometric+approaches+as+a+tool+for+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Photoaffinity labeling combined with mass spectrometric approaches as a tool for structural proteomics.</a> Expert. Rev. Proteomics. 3 (4), 399-408 (2006).</li>
<li>Greenspan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humidity+fixed+points+of+binary+saturated+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Research+of+the+National+Bureau+of+Standards%22%5BJournal%5D)">Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions.</a> Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81A (1), 8(1977).</li>
<li>Sophocleous, A. M., Zhang, J., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+hydration+in+lyophilized+myoglobin+by+hydrogen-deuterium+exchange+mass+spectrometry.+1.+Exchange+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 1. Exchange mapping.</a> Mol. Pharm. 9 (4), 718-726 (2012).</li>
<li>Keppel, T. R., Jacques, M. E., Young, R. W., Ratzlaff, K. L., Weis, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+inexpensive+refrigerated+LC+system+for+H%2FD+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">An efficient and inexpensive refrigerated LC system for H/D exchange mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 22 (8), 1472-1476 (2011).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy%3A+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nucleic. Acids. Res. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li>
<li>Sophocleous, A. M., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+hydration+in+lyophilized+myoglobin+by+hydrogen-deuterium+exchange+mass+spectrometry.+2.+Exchange+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 2. Exchange kinetics.</a> Mol. Pharm. 9 (4), 727-733 (2012).</li>
<li>Moorthy, B. S., Schultz, S. G., Kim, S. G., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+Protein+Aggregation+during+Storage+in+Lyophilized+Solids+Using+Solid+State+Amide+Hydrogen%2FDeuterium+Exchange+with+Mass+Spectrometric+Analysis+%28ssHDX-MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Predicting Protein Aggregation during Storage in Lyophilized Solids Using Solid State Amide Hydrogen/Deuterium Exchange with Mass Spectrometric Analysis (ssHDX-MS).</a> Mol. Pharm. 11 (6), 1869-1879 (2014).</li>
<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilization+and+development+of+solid+protein+pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.</a> Int. J. Pharm. 203 (1-2), 1-60 (2000).</li>
<li>Sarciaux, J. M., Mansour, S., Hageman, M. J., Nail, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+buffer+composition+and+processing+conditions+on+aggregation+of+bovine+IgG+during+freeze-drying%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of buffer composition and processing conditions on aggregation of bovine IgG during freeze-drying.</a> J. Pharm. Sci. 88 (12), 1354-1361 (1999).</li>
<li>Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+protein+structure+in+amorphous+solids+using+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Characterizing protein structure in amorphous solids using hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 366 (1), 18-28 (2007).</li>
<li>Sinha, S., Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+conformation+in+amorphous+solids+by+FTIR+and+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+with+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Protein conformation in amorphous solids by FTIR and by hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry.</a> Biophys. J. 95 (12), 5951-5961 (2008).</li>
<li>Iyer, L. K., Moorthy, B. S., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolytic+labeling+to+probe+molecular+interactions+in+lyophilized+powders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Photolytic labeling to probe molecular interactions in lyophilized powders.</a> Mol. Pharm. 10 (12), 4629-4639 (2013).</li>
<li>Hentze, N., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+dynamics+using+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry.</a> J. Vis. Exp. (81), e50839(2013).</li>
<li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Abzalimov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%2FD+exchange+and+mass+spectrometry+in+the+studies+of+protein+conformation+and+dynamics%3A+is+there+a+need+for+a+top-down+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">H/D exchange and mass spectrometry in the studies of protein conformation and dynamics: is there a need for a top-down approach.</a> Anal. Chem. 81 (19), 7892-7899 (2009).</li>
<li>Jumper, C. C., Schriemer, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+of+laser-initiated+carbene+reactions+for+protein+topographic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry of laser-initiated carbene reactions for protein topographic analysis.</a> Anal. Chem. 83 (8), 2913-2920 (2011).</li>
<li>Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+excipients+on+protein+conformation+in+lyophilized+solids+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of excipients on protein conformation in lyophilized solids by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Pharm. Res. 25 (2), 259-267 (2008).</li>
<li>Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+and+calcium+exert+site-specific+effects+on+calmodulin+conformation+in+amorphous+solids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Trehalose and calcium exert site-specific effects on calmodulin conformation in amorphous solids.</a> Biotechnol. Bioeng. 97 (6), 1650-1653 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Verschillende studies hebben gesuggereerd dat de lokale omgeving in gevriesdroogde monsters invloed eiwitafbraak 5,29,30. De instelling van een directe relatie tussen eiwitstructuur en stabiliteit in de vaste toestand is niet mogelijk gebleken door het ontbreken van analysemethoden hoge resolutie. De toepassing van de bestaande hoge resolutie methoden, zoals HDX en PL naar gevriesdroogde poeders vereist wijziging van oplossing protocollen en zorgvuldige interpretatie van de gegevens. HDX-MS en PL-MS zijn achtereenvolgens aangenomen eiwitconformaties monitoren in de solid-state. De hier gepresenteerde resultaten en elders 27,28,31-33 hebben het vermogen van deze methoden om eiwitconformatie met hoge resolutie in de vaste omgeving te monitoren aangetoond. Hoewel de kritische stappen in de data-analyse niet verschillen van de etikettering in oplossing 34-36, zijn belangrijke overwegingen tijdens de experimentele opstelling en de interpretatie van de gegevens die nodig zijn voor solid-state Chemical etikettering. Selectie van de etikettering reagens moet worden gebaseerd op de grootte en het mechanisme van de etikettering. De kleine omvang van deuterium laat de peptide hoofdketen gemakkelijk worden gesondeerd, terwijl de relatief grotere omvang van pLeu beperkt etikettering de zijketens. Zowel ssHDX en SSPL vertonen geen voorkeur voor een aminozuur, zodat etikettering alleen afhangt hoofdketen en zijketens blootstelling aan de matrix. Om effectief sonde eiwitconformaties in solid-state, moet de externe factoren die de etikettering proces zorgvuldig worden gecontroleerd. Het totale bedrag en de ruimtelijke verdeling van labelingmiddel in gevriesdroogde vaste verschilt van waterige oplossingen. In ssHDX, kan de hoeveelheid D 2 O in de vaste matrix het percentage eiwitontvouwende (of gedeeltelijke ontvouwing), hervouwen en deuterium uitwisseling beïnvloeden. Dit is niet het geval met de oplossing HDX, waarbij het ​​eiwit monster wordt gewoonlijk verdund met een ruime hoeveelheid D 2 O.Zorgvuldige screening van de effecten van de hydratatie van de ssHDX tarief kan de keuze van de ideale RH voorwaarden te informeren. Om de snelheid van vocht sorptie controleren en ineenstorting van het poeder in formuleringen die hygroscopisch hulpstoffen (bv sucrose en trehalose) te vermijden, ssHDX kan worden uitgevoerd onder gekoelde omstandigheden (2-8 ° C). Onze vorige studie over hydratatie effecten toonde verhoogde snelheid en mate van uitwisseling met toename van het vochtgehalte, zoals verwacht. In veel van ons werk, een tussenproduct RV van 43% bij 5 ° C gebleken ideale formuleringen onderscheiden redelijke tijd 24 te zijn. De reactie wordt gewoonlijk uitgevoerd totdat een plateau bereikt. Dit zorgt ervoor dat vocht sorptie en diffusie in de vaste stof niet de HDX te regelen. Het gebruik van kleine vaste steekproefomvang met pre-vriesdrogen volume van ≤2 ml helpt ook om ervoor te zorgen dat D 2 O dampsorptie is nagenoeg voltooid in het begin van de periode uitwisseling. Hoewel ssHDX-MS biedtkwantitatieve informatie over de conformatie van het eiwit in vaste toestand, zijn er bepaalde omstandigheden waarin interpretatie van gegevens niet volledig kan worden gebaseerd op de ssHDX studie alleen. Het is mogelijk dat de verlaagde deuterium opname waargenomen in een monster (in vergelijking met controle) kan door de hogere retentie van eiwitstructuur of de aanzienlijke hoeveelheid eiwit aggregaten aanwezig in het monster. In een dergelijk geval, de interpretatie van ssHDX gegevens vereist resultaten van andere complementaire methoden. Piekverbreding in deuterium massaspectra werd waargenomen voor verscheidene Mb formuleringen 27,28. Dit kan te wijten zijn aan verschillende factoren, zoals de aanwezigheid van gedeeltelijk ontvouwen eiwitpopulatie ruimtelijke heterogeniteit in het monster of de ruimtelijke gradiënten in de D2O concentratie. Echter, deze factoren niet onderscheiden in ssHDX-MS en vraagt ​​verder onderzoek. Zoals SSPL-MS is relatief nieuw in vergelijking met andere methoden, continu leren abuit haar toepassingen en beperkingen nodig is. In SSPL, wordt de foto-cross-linker gevriesdroogd met het eiwit. Het gebrek aan vocht beperkt de mobiliteit van componenten binnen de vaste matrix en de partiële structurele ontspanning die kunnen optreden bij vochtabsorptie in ssHDX geen verschijnsel SSPL. Dit beperkt etikettering SSPL de onmiddellijke nabijheid van de foto-vernetter. In tegenstelling HDX-MS, MS / MS analyse van de covalent gelabeld eiwit residuen niveau structurele informatie. Aangezien SSPL etikettering covalent en irreversibel, rug uitwisseling niet plaatsvindt en monsters kunnen worden bereid en zonder zorg voor verlies van label geanalyseerd. Om diffusie van labelingmiddel vergemakkelijken en labelingsefficiëntie in vaste matrix kan SSPL worden uitgevoerd met toenemende% RH. pLeu opname kan ook worden verbeterd door verhoging van de concentratie van fotoreactieve middel. De molaire verhouding van eiwit pLeu kan naar wens worden gevarieerd. In het algemeen 100x molaire overmaat pLeu proTein zal zorgen voor een adequate etikettering. Echter kunnen hoge pLeu concentratie de eiwitverlies tertiaire structuur in de vaste matrix. Vandaar Naast etikettering kinetiek en formulering samenstelling winkelwagentje pLeu concentratie moet worden gebaseerd op het behoud proteïne structurele integriteit. Zoals pLeu nonselectively etiketten XH (waarbij X = C, N, O) groep, is het mogelijk dat hulpstoffen met gelijkaardige etikettering sites kunnen grote invloed hebben op het niveau van eiwit etikettering. De interferentie van hulpstoffen in de beschikbaarheid van pLeu voor eiwitmarkerend nog te karakteriseren. Het is bekend dat het carbeen gegenereerd diazirine activering niet residu specifiek, maar een studie rapporteert voorkeur voor Asp en Glu 36. Hoewel het goed te weten ongeveer rest-specifieke interacties, peptide-niveau-informatie is ook nuttig en kunnen worden gebruikt om hulpstoffen ontwerpen om gebieden te blokkeren met hoge matrix blootstelling in de vaste toestand. SSPL-MS geeft gedetailleerde kwalitatieve informatie echterkwantitatieve gegevens moeten worden verkregen en robuuste metrics moeten worden ontwikkeld voor de formulering van de verschillen in een verscheidenheid van gevriesdroogde systemen te analyseren. Het gebruik van een residu-specifiek label gecombineerd met MS / MS analyse verder versterken oplossing van het amino- zuurniveau. Labeling reagentia zoals 2,3- butaandion labelen Arg, N-hydroxysuccinimide derivaten Lys en N -alkylmaleimide derivaten Cys kunnen worden gebruikt om moleculaire interacties in gevriesdroogde poeder nauwkeurig in kaart. Maar deze reagentia pH-afhankelijk en de reacties niet zo goed beheerd zoals fotolithische labeling in vaste toestand. Een alternatieve benadering is om de foto-vernetter nemen in de eiwitsequentie met gebruik van auxotrofe cellijnen, plaatsgerichte mutagenese of zijketen derivatisering. Onze vorige ssHDX-MS en SSPL-MS studies hebben aangetoond dat de etikettering van eiwit afhankelijk van de aard en de hoeveelheid hulpstoffengebruikt 24,27,28,31-33,37,38. ssHDX-MS van Mb mede-gevriesdroogd met guanidinehydrochloride (Gdn.HCl) toonden meer deuterium opname dan Mb mede-gevriesdroogd met een laag moleculair gewicht suikers 32. In een aparte SSPL-MS studie, Mb mede-gevriesdroogd met Gdn.HCl toonde een betere bescherming tegen fotolytische etikettering dan Mb met sucrose 33. Verder kwantitatieve metingen van ssHDX-MS zijn sterk gecorreleerd met de stabiliteit van eiwitten tijdens langdurige opslag 28. Deze studies suggereren dat ssHDX of SSPL eiwit weerspiegelt de mate van structurele retentie van de proteïne in gevriesdroogde poeder. Wij zijn van mening dat het behoud van de secundaire structuur in gevriesdroogde poeders biedt gunstige omgeving voor de zijketen etikettering met pLeu en bescherming van de amide waterstof uit deuterium uitwisseling. Echter, gedetailleerde vergelijking van de informatieve inhoud van deze methoden moet in de toekomst te worden uitgevoerd. Hoewel tot vaststelling van het nut van ssHDX-MS en SSPL-MSals een formulering screeningsmethode uiteindelijk zal verlangen dat die wordt toegepast op vele eiwitten, de resultaten van onze recente studies ondersteunt haar bredere toepassing. Met de verdere ontwikkeling, worden deze methoden naar verwachting op grote schaal bruikbaar voor het karakteriseren van solid-state eiwitformuleringen in de biofarmaceutische industrie.

Eiwit drugs zijn de snelst groeiende sector van de biofarmaceutische industrie en bieden een veelbelovende nieuwe behandelingen voor eerder onbehandelbare ziekten, waaronder hormonale stoornissen, kanker en auto-immuunziekten 1. In 2012, de wereldwijde biotherapeutics markt bereikte $ 138.000.000.000 en zal naar verwachting $ 179.000.000.000 door het jaar te bereiken 2018 2. Eiwitten zijn groter en meer kwetsbaar dan conventionele kleine moleculen en dus meer vatbaar zijn voor vele soorten degradatie 3. Om adequate houdbaarheid en stabiliteit, zijn eiwitgeneesmiddelen vaak geformuleerd als gevriesdroogd (dwz gevriesdroogd) vaste poeders. Echter, een eiwit nog degradatie ondergaan in de vaste toestand, vooral als het natieve structuur niet behouden tijdens het lyofilisatieproces 4,5. Ervoor te zorgen dat de structuur is behouden is alleen haalbaar als er analysemethoden die eiwitconformatie kunnen peilen in de solid-state met sufficient-resolutie. NMR spectroscopie 6 en röntgenkristallografie 7 zijn de gebruikelijke hoge resolutie methoden eiwitstructuur evalueren oplossing en kristallijne vaste stoffen 8. Vanwege de aard van hulpstoffen en verwerkingsmethoden, gelyofiliseerde eiwitformuleringen zijn meestal amorf in plaats van kristallijn 9. Het gebrek aan homogeniteit en microscopische orde maakt de hiervoor genoemde technieken onpraktisch voor eiwitten in amorfe vaste stof. Fourier transformatie infrarood spectroscopie (FTIR) 10, Raman spectroscopie 11 en nabij infrarood spectroscopie (NIR) 12 werden regelmatig door de biofarmaceutische industrie eiwit secundaire structuur vergelijken gelyofiliseerde poeders die van de natieve oplossing staat structuur. Deze werkwijzen hebben een lage resolutie en kan alleen informatie over globale veranderingen in secondaire structuur. Solid-state structurele karakterisering met behulp van FTIRheeft aangetoond ofwel zwak 13,14 of slechte 15 correlatie met langdurige opslag stabiliteit. Deze beperkingen maken de noodzaak van geschikte hoge resolutie methoden om eiwitten structurele verstoringen in de vaste toestand te identificeren. Chemische labeling gekoppeld aan proteolyse en massaspectrometrische analyse bleek een krachtige aanpak van de monitoring eiwitstructuur en moleculaire interacties in waterige oplossing. In farmaceutische ontwikkeling heeft HDX-MS gebruikt voor epitoop kartering in antigeen-antilichaam interacties 16,17, in kaart receptor-geneesmiddel interacties 18 de effecten van post-translationele modificaties op de conformatie van eiwitgeneesmiddelen 19 monitoren en te vergelijken batch-to-batch variatie in ontwikkeling biosimilars 20. Zo hebben activeerbare liganden gebruikt om drug targets te identificeren en bindingsaffiniteit en specificiteit van geneesmiddel-receptor interacties 21,22 bepalen. Naar eXtend de toepassing van deze methoden om gevriesdroogde preparaten, heeft onze groep ontwikkelde solid-state massa waterstof deuterium uitwisseling spectrometrie (ssHDX-MS) en solid-state fotolytische etikettering massaspectrometrie (SSPL-MS) te eiwitconformaties en hulpstof interacties in gevriesdroogde monsters te bestuderen met een hoge resolutie. In beide ssHDX-MS en SSPL-MS, wordt het eiwit aangeduid onder ideale reactieomstandigheden in gevriesdroogde vaste stoffen, en de monsters worden vervolgens gereconstitueerd en met massaspectrometrie met of zonder proteolytische digestie onderzocht. ssHDX-MS geeft informatie over de belangrijkste keten blootstelling aan deuterium damp, terwijl SSPL-MS geeft informatie over de omgeving van de zijketens (Figuur 1). De twee werkwijzen kunnen aldus aanvullende informaties eiwit conformatie in de vaste toestand verstrekken. Hier geven we een algemeen protocol voor het bestuderen van eiwitten in gevriesdroogde vaste stoffen middels ssHDX-MS en SSPL-MS (figuur 2), met als Mbmodeleiwit. We tonen het vermogen van de twee methoden verschillen in samenstellingen met twee verschillende excipiënten onderscheiden. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig1.jpg" /> Figuur 1:. SsHDX en SSPL maatregel eiwitstructuur in gevriesdroogde vaste stoffen via verschillende markeringsmechanismen (A) In HDX, de ruggengraat amide waterstof uitwisseling met deuterium als functie van eiwitstructuur en D2O toegankelijkheid. In de vaste toestand, de snelheid en mate van deuterium uitwisseling afhangen van het niveau van D2O sorptie eiwit mobiliteit (ontvouwen en hervouwen evenementen) en de aard van de in de vaste matrix hulpstoffen. (B) In PL, UV-bestraling bij 365 nm initieert de vorming van een reactieve carbeen intermediair uit de diazirine functionele groep van pLeu en is niet-specifiek in elke XH bond (X = een ieder atoom), of ad geplaatstded over een C = C-binding in de onmiddellijke omgeving. In de vaste toestand, de snelheid en mate van labeling afhankelijk van de lokale concentratie van de labelingmiddel, bestralingstijd, eiwitstructuur en de aard van hulpstoffen aanwezig in de vaste matrix. Panelen A en B tonen de maximale theoretische etikettering die respectievelijk kunnen voordoen op backbone en zijketens in eiwit. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig2.jpg" /> Figuur 2: Schematische showing solid-state HDX-MS (A) en PL-MS (B) voor eiwitten in gevriesdroogde formulering.

<table><tbody><tr><td>Equine myoglobin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0630-5G</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Trehalose dihydraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#T9531</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#240850</td><td></td></tr><tr><td>L-Photo-leucine</td><td>Thermo Scientific</td><td>#22610</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P0662</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P3786</td><td></td></tr><tr><td>Deuteriumoxide</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>#DLM-4-PK</td><td>Alternatief (Cat. Nr.: 151882, Sigma-Aldrich)</td></tr><tr><td>Geïmmobiliseerd pepsine</td><td>Applied Biosystems</td><td>#2-3132-00</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Promega</td><td>#V511A</td><td>Chymotrypsine (Cat. Nr.: #V1062, Promega) kan aanvullend worden gebruikt</td></tr><tr><td>Water, Optima LC/MS-kwaliteit</td><td>Fisher Chemical</td><td>#7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#34998</td><td></td></tr><tr><td>Mierenzuur</td><td>Thermo Scientific</td><td>#28905</td><td></td></tr><tr><td>ESI-TOF Calibrant</td><td>Agilent Technologies</td><td>#G1969-85000</td><td>Zeer ontvlambare vloeistof</td></tr><tr><td>Proteïne microtrap</td><td>Michrom Bioresources</td><td>TR1/25108/03</td><td></td></tr><tr><td>Peptide microtrap</td><td>Michrom Bioresources</td><td>TR1/25109/02</td><td></td></tr><tr><td>Analytische kolom</td><td>Agilent Technologies</td><td>Zorbax 300SB-C18</td><td></td></tr><tr><td>Vriesdroger</td><td>VirTis AdVantage Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stratalinker uitgerust met vijf 365 nm lampen</td><td>Stratagene Corp.</td><td>Stratalinker 2400</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Agilent Technologies</td><td>1200 series LC</td><td>Gekoeld LC-systeem voor HDX-MS</td></tr><tr><td>ESI-qTOF MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>6520 qTOF</td><td></td></tr><tr><td>HDExaminer (HDX-MS data-analysesoftware)</td><td>Sierra Analytics</td><td></td><td>http://www.massspec.com/HDExaminer.html</td></tr></tbody></table>

massaspectrometrische benaderingen tot protein structure en interacties te bestuderen in gevriesdroogde poeders

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Amide waterstof / deuterium uitwisseling (ssHDX-MS) en zijketen fotolytische etikettering (SSPL-MS), gevolgd door massaspectrometrische analyse kan waardevol voor het karakteriseren van gevriesdroogde preparaten van therapeutische eiwitten zijn. Etikettering gevolgd door geschikte proteolytische vertering kan de eiwitstructuur en interacties in kaart te brengen met peptide-niveau resolutie. Aangezien het eiwit structuurelementen worden gestabiliseerd door een netwerk van chemische bindingen van de belangrijkste ketens en zijketens van aminozuren, specifieke kenmerken van atomen in de aminozuurresten geeft inzicht in de structuur en conformatie van het eiwit. In tegenstelling tot de routine-methoden die worden gebruikt om eiwitten in gevriesdroogde vaste stoffen (bijvoorbeeld, FTIR), ssHDX-MS en SSPL-MS bieden kwantitatieve en locatie-specifieke informatie te bestuderen. De omvang van deuterium opname en kinetische parameters kunnen worden gerelateerd snel en langzaam uitwisseling amide pools (N snelle N langzaam) en direct weerspiegelt het degree vouwen van eiwitten en de structuur in gevriesdroogde formuleringen. Stabiele fotolytische etikettering niet back-uitwisseling, een voordeel ten opzichte ssHDX-MS ondergaan. Hier bieden we gedetailleerde protocollen voor zowel ssHDX-MS en SSPL-MS, met behulp van myoglobine (Mb) als model eiwit in gevriesdroogde formuleringen die ofwel trehalose of sorbitol.

Hier zijn ssHDX-MS en SSPL-MS werd gebruikt om het effect van hulpstoffen op de conformatie en halfgeleiderelementen interacties van gevriesdroogde Mb formaties bestuderen. De concentraties van eiwit en excipiënten die in deze studie worden in Tabel 1. Representatieve resultaten van de ssHDX-MS en SSPL-MS analyse van gevriesdroogde Mb verkregen door de bovenstaande protocollen worden gepresenteerd. Deuterium opname op intacte eiwit niveau ssHDX-MS is in staat om onderscheid te maken tussen Mb formuleringen op intacte niveau. De deconvoluted massa spectra van intacte Mb na 144 uur van ssHDX uit formulering MBS toonde meer deuterium opname dan formulering MbT (Figuur 3A). Op een gemiddelde MBS toonde 46% hoger dan deuterium opname MbT (tabel 2). <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig3.jpg"/&gt; Figuur 3: ssHDX-MS voor intacte Mb: (A) deconvoluted massa spectra van deuterium intacte Mb uit formuleringen MbT (vaste lijn) en MBS (stippellijn) na 144 uur van ssHDX. De deconvoluted massaspectrum van ongedeutereerde intacte Mb wordt ook getoond (stippellijn). (B) ssHDX kinetiek voor intacte Mb in formuleringen MbT (vaste lijn) en MBS (stippellijn). Het tijdsverloop van ssHDX werd een vergelijking uitgerust twee fasen exponentiële associatie met Graph Pad Prism software versie 5 (n = 3, ± SD). De deuterering kinetiek voor intacte MBS en MbT zijn vergelijkbaar op vroege tijdstippen (1-4 uur), maar MBS toonde verhoogde deuterium uitwisseling met de toename in de tijd (8-144 uur) (Figuur 3B). Dit duidt op het belang van het selecteren langere tijdstippen voor ssHDX bij lagere RV en temperatuur. Ook kan de D2O sorptie en diffusie proces de snelheid van ssHDX op de vroege tijdstip po beïnvloedenints. Onze vorige studies hebben aangetoond dat vochtabsorptie in ssHDX voltooid in een periode van uren en heeft minimale bijdrage kinetiek wisselen na deze tijd. De waargenomen snelheid en mate van uitwisseling daarom niet alleen maatregelen van D2O adsorptie 27,28. De kleine foutbalken in figuur 3B aangegeven standaardafwijkingen van drie onafhankelijke ssHDX-MS monsters blijkt dat de proef zeer reproduceerbaar. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Deuterium opname (%) b </td><td> N snelle c </td><td> k snel c </td><td> N trage c </td><td> k trage c </td></tr><tr><td> MbT een </td><td> 15,9 ± 0,5 </td><td> 13,1 (0,8) </td><td> 0.43 (0.03) </td><td> 11,0 (0,9) </td><td> 0.019 (0.001) </td></tr><tr><td> Mbs een </td><td> 23.2 ± 0.5 </td><td> 15,4 (0,7) </td><td> 0.49 (0.04) </td><td> 19.2 (0.6) </td><td> 0.024 (0.002) </td></tr><tr><td> % Verandering d </td><td> 46% </td><td> 18% </td><td> 14% </td><td> 75% </td><td> 26% </td></tr></tbody></table> Tabel 2:. Kwantitatieve metingen van deuterium opname in ssHDX studies Mb formuleringen een Zie tabel 1 voor samenstelling B percentage deuterium opname opzichte theoretische maximum van intacte Mb na 144 uur van HDX bij 5 ° C, 43% RH (n = 3. , gemiddelde ± SD). c Parameters bepaald door lineaire regressie van ssHDX-MS kinetische gegevens. Tijdsverloop van deuterium ruil voor intacte Mb werd gemonteerd op een bi-exponentiële vereniging model (Eqn. 2). Waarden tussen haakjes zijn standaard fouten van de regressie parameters. D Het percentage verandering in de metingen waren calculated als 100 x [(waarde van MBS - waarde uit MbT) / (waarde uit MbT)]. De regressie parameters (N snelle N langzaam, k snelle en langzame k) voor deuterium opnamekinetiek voor MbT en MB zijn in tabel 2. Hoewel de N snelle en langzame N waarden groter MBS dan MbT verschillen in N slow waarden groter waren dan verschillen in het N snelle waarden. Met name de N snelle waarde in MB&#39;s slechts 18% groter dan in MbT, terwijl de N langzame waarde is in MBS 75% groter dan in MbT. Dit suggereert dat de kleinere N langzame waarden MbT mogelijk vanwege de hogere retentie van Mb structuur of bescherming van amidegroepen door excipiënten die worden blootgesteld aan D2O in MB. Echter, de gedetailleerde mechanismen niet goed begrepen. De snelheidsconstanten (k snelle en langzame k) voor beide formuleringen zijn zeer vergelijkbaar. Deuterium opname op de peptide-niveau Na pepsine digestie, totaal 52 peptiden werden geïdentificeerd. Zes niet-redundante fragmenten overeenkomend met 100% van de Mb sequentie werden gebruikt voor de analyse hier gerapporteerd. Aanvullende informatie kan worden verkregen door het gebruik van overlappende fragmenten, zoals gerapporteerd door onze groep eerder 24. Het percentage deuterium opname voor elk peptide werd berekend en de resultaten van 144 uur monsters uitgezet (figuur 4A). HDX kinetiek voor de zes peptische fragmenten toonde bi-exponentieel gedrag (figuur 4B), in overeenstemming met subpopulaties van amide waterstofatomen ondergaan &quot;snelle&quot; en &quot;langzame&quot; uitwisseling. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig4.jpg" /> Figuur 4: ssHDX-MS voor Mb op de peptide-niveau: (A) Procent deuterium opname voor 6 niet-redundant peptische fragmenten uit Mb in formuleringen MbT (grijs) en MBS (wit) na 144 uur van de HDX. (B) ssHDX kinetiek voor zes niet-redundante ulcus fragmenten uit Mb in formuleringen MbT (vaste lijn) en MBS (stippellijn). Het tijdsverloop van ssHDX werd een vergelijking uitgerust twee fasen exponentiële associatie met Graph Pad Prism software versie 5 (n = 3, ± SD). Regressie parameters voor de niet-redundante peptiden zijn weergegeven in figuur 5. Omdat de ingebouwde snelheidsconstanten voor peptidefragmenten niet de gemiddelde snelheidsconstante voor afzonderlijke amiden, de waargenomen snelheidsconstanten voor peptische fragmenten niet lineair gerelateerd aan die van het intacte eiwit. De nummer snelle waarden voor de meeste peptische fragmenten (behalve fragment 56-69) in formuleringen MBS waren iets hoger dan die MbT (figuur 5A). Ook de k snel waarden toonde in het algemeen weinig verschil tussen formulations en in verschillende gebieden van de Mb molecuul (Figuur 5B). Echter, de N langzaam en k langzaam waarden voor MBS zijn significant groter in alle fragmenten dan voor MbT (figuur 5C en 5D). De aanzienlijke toename in N traag en k langzaam voor MBS in de &quot;slow&quot; uitwisseling pools mobieler amidegroepen weerspiegelen. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig5.jpg" /> Figuur 5: ssHDX kinetische parameters voor Mb ulcus peptiden: N snel (A), k snel (B), N langzame (C) en k langzame (D) waarden verkregen uit niet-lineaire regressie van ssHDX-MS kinetische gegevens voor zes niet-redundante ulcus peptiden uit Mb in formuleringen MbT (grijs) en MBS ( wit) (n = 3, ± SE). &lt;/ P&gt; Fotolytische etikettering op intacte eiwit niveau Mb bestraald in aanwezigheid van 20x overmaat pLeu gevormd multiple Mb-pLeu adducten, zoals gedetecteerd door LC-MS (figuur 6A). De deconvoluted spectra MbT bestraald gedurende 40 minuten met 20x pLeu kwamen 3 etiketten met de toevoeging van 115, 230 en 345 Da tot de massa van ongelabelde Mb. MBS evenzo bestraald met 20x pLeu vertoonden minder pLeu opname op de intacte niveau, met maximaal 2 gelabeld populatie ontdekt door LC-MS. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig6.jpg" /> Figuur 6: SSPL-MS intacte Mb: (A) deconvoluted massaspectra voor MbT (getrokken lijn) en MB (stippellijn) gelabeld met 20x overmaat (5% w / w) pLeu. Deconvoluted massaspectrum van natief Mb (Mb gelyofiliseerd en bestraald in afwezigheid van pLeu) wordt weergegeven als de stippellijn. U </em&gt; duidt een bevolking van eiwit dat ongelabelde na bestraling blijft. Populaties van eiwit uitvoering 1, 2 en 3 pLeu labels worden weergegeven als 1L, 2L en 3L respectievelijk. (B) SSPL-MS kinetiek intacte Mb in formuleringen MbT (dichte cirkels) en MB (open cirkels) als een functie van pLeu concentratie. Alle monsters werden bestraald gedurende 40 min. Error bars liggen op de symbolen. (C) SSPL-MS kinetiek intacte Mb in formuleringen MbT (dichte cirkels) en MB (open cirkels) gevriesdroogd en bestraald in aanwezigheid van 100x overmaat pLeu (20,7% w / w) als functie van de belichtingstijd. Error bars liggen op de symbolen. In kinetische studies, het percentage van gemerkt eiwit exponentieel toegenomen voor zowel MbT en MBS met toenemende bestraling tijd (figuur 6B). MBS toonde minder pLeu opname dan MbT bij elke bestraling tijd. Beide formuleringen bleek een plateau bereiken op 40 min. Aldus kan een kinetisch onderzoek ons<html> eful de duur van de bestraling noodzakelijk om volledige activatie te verkrijgen pLeu bepalen. Labeling kinetiek bestudeerd als functie van pLeu concentratie (figuur 6C). De procent van gemerkt eiwit verhoogd met pLeu concentratie voor zowel MbT en MB. Echter, bij 20,7% w / w pLeu, MbT daalde in pLeu opname. Dit kan het gevolg uitsluiting van pLeu van het oppervlak van het eiwit bij hoge pLeu concentratie. Daarom moet een studie met variërende concentraties van pLeu worden uitgevoerd om geschikte pLeu concentratie waarmee voldoende etikettering in de gehele proteïne oppervlak zonder oppervlak uitsluiting selecteren. In deze studie werd 20x overmaat pLeu geselecteerd voor verdere peptide-niveau studies. De algehele verminderde etikettering waargenomen voor MBS suggereert slechte zijketen toegankelijkheid van de matrix met pLeu. Dit is consistent met een conformatieverandering in aanwezigheid van sorbitol die resulteert in verminderde labeling. content &quot;&gt; Fotolytische etikettering op de peptide-niveau Op basis van de intacte eiwit labeling studies, werd 20x teveel pLeu geselecteerd om te vergelijken MbT en MB&#39;s op de peptide-niveau. Gemerkte monsters werden gedigereerd met trypsine en door LC-MS geanalyseerd. Een totaal van 40 peptiden overeenkomend met 100% van de Mb sequentie werden gedetecteerd MbT en MB monsters. In sommige gevallen kan tryptische digestie beperkt eiwitsequentie dekking als Lys en / of Arg residuen sterk gelabeld. Om sequentie dekking te verbeteren kan een mengsel van trypsine en chymotrypsine worden gebruikt om het gelabelde eiwit verteren. <img alt="Figuur 7" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig7.jpg" /> Figuur 7: SSPL-MS Mb op peptideniveau: cartoonvertegenwoordiging Mb gelabeld met 20x overmaat pLeu (5% w / w) in aanwezigheid van trehalose (A) en sorbitol (B). Het gemerkte eiwit werd gedigereerd met trypsin en gelabelde peptiden werden afgebeeld op de kristalstructuur van Mb (VOB ID 1WLA). De gelabelde en ongelabelde gebieden gekleurd magenta en groen resp. SSPL-MS met trypsine spijsvertering biedt kwalitatieve informatie over de peptiden worden bestempeld. Gezien de verschillende gemerkte populaties op intact niveau, de promiscue mechanisme van pLeu etikettering en verschillen in ionisatie efficiëntie van gelabelde en ongelabelde peptiden, is het moeilijk de kwantitatieve metrieken verkrijgen voor SSPL-MS na digestie. Echter, de kwalitatieve informatie nog steeds geven inzicht in eiwit conformationele veranderingen op het peptide-niveau. In dit onderzoek, zowel MbT en MB formuleringen vertoonden pLeu opname in de meeste van het eiwit oppervlak. Vergeleken met MBS peptidefragmenten 32-42, 134-139 en 146-153 van MbT toonde pLeu kenmerking (figuur 7). Dit suggereert dat de zijketens van deze aminozuren worden blootgesteld aan pLeu, zoals de helices in deze regions intact zijn in de MbT matrix. Daarentegen bescherming tegen pLeu etikettering MBS matrix is ​​met structurele verstoringen in deze regio. Kortom, de resultaten van ssHDX-MS en SSPL-MS suggereert dat de werkwijzen complementaire hoge resolutie peptide-niveau informaties backbone (ssHDX-MS) en zijketen (SSPL-MS) blootstelling en excipienten effecten in gevriesdroogde eiwit formuleringen kunnen bieden .

Hier presenteren we gedetailleerde protocollen voor solid-state amide waterstof/deuterium uitwisseling massaspectrometrie (ssHDX-MS) en solid-state fotolytische labelen massaspectrometrie (ssPL-MS) voor eiwitten in vaste poeders. De methoden leveren hoge resolutie informatie over eiwitconformatie en interacties in de amorfe vaste toestand, wat nuttig kan zijn in formuleringsontwerp.

Massaspectrometrische benaderingen tot Protein Structure en interacties te bestuderen in gevriesdroogde Poeders

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Het algemene doel van deze procedure is om de structuur van een eiwit met een hoge resolutie te monitoren met behulp van waterstof-deuteriumuitwisseling en zijketenlytische markering gekoppeld aan massaspectrometrie. Dit wordt bereikt door het eiwit eerst te lyofiliseren in de aanwezigheid van verschillende hulpstoffen. Bij waterstof-deuteriumuitwisseling in de vaste fase wordt het gelyofiliseerde eiwit blootgesteld aan deuteriumoxide-damp in een afgesloten desiccator onder gecontroleerde relatieve vochtigheid en temperatuur.Voor lytische labelering wordt het eiwit gelyofiliseerd met hulpstoffen en een fotoreactief agens. Het flesje wordt vervolgens bestraald met UV-licht om het agens covalent aan het eiwit te binden. Voor elke methode worden de monsters gereconstitueerd en geanalyseerd met een massaspectrometer, zowel op het niveau van het intacte eiwit als op peptide-resolutie.Deze twee methoden leveren complementaire informatie. Formuleringen waarin de proteïnestructuur grotendeels behouden blijft, vertonen een afname van de deuteriumopname en een toename van de lytische labeling, terwijl formuleringen met een verstoorde structuur een toename van de deuteriumopname en een afname van de lytische labeling vertonen. Chemische labeling, zoals waterstof-deuteriumuitwisseling en fotocrosslinking gekoppeld aan massespectrometrische analyse, is onlangs aangepast om de proteïnestructuur en interacties in levende supports te bestuderen.Het belangrijkste voordeel van deze technieken ten opzichte van bestaande methoden zoals CD- en FDIR-spectroscopie is dat de eiwitstructuur en de omgeving met een hoge resolutie in de vaste fase kunnen worden onderzocht. Begin met het plaatsen van 200 milliliters deuteriumoxide in het onderste compartiment van een exsiccator en voeg 400 grams kaliumcarbonaat toe om een verzadigde oplossing te maken; plaats de porseleinen exsiccatorplaat binnenin en sluit de exsiccator luchtdicht af. Laat het systeem equilibreren bij vijf degrees Celsius om een stabiele relatieve vochtigheid van ongeveer 43% te bereiken. Plaats vervolgens de ongekapte vials met gelyofiliseerd eiwit in het bovenste compartiment van de exsiccator, sluit de exsiccator en incubeer bij vijf degrees Celsius.Om de waterstof-deuteriumuitwisselingsreactie te starten voor het verzamelen van een monster, sluit u het vial onmiddellijk af na het verwijderen uit het droogmiddel en quencht u vervolgens de reactie door het vial snel te bevriezen in vloeibare stikstof. Bewaar het vial bij -80 °C tot de massaspectrometrische analyse. Gebruik massaspectrometrie met een hoge resolutie om de monsters te analyseren om teruguitwisseling te minimaliseren.Hoe is het vloeistofchromatografiesysteem in een koelbox geplaatst? Sluit voor de installatie van het instrument eerst de sample loop en de proteïnevanger aan op het ventiel dat de ontzouting en de elutieprocessen regelt. Kalibreer vervolgens het systeem door het tuningmix met een lage concentratie in de massaspectrometer te injecteren en het massa-ladingsverhoudingsbereik in te stellen op 200 tot 3, 200.Koel vervolgens het koelsysteem af tot een stabiele bedrijfstemperatuur van ongeveer 0 °C. Bereid de quenchbuffer voor bestaande uit 0,2% mierenzuur en 5% methanol in water en koel deze op ijs. Verplaats de monsters naar vloeibare stikstof, haal vervolgens voorzichtig een vial eruit en reconstitueer het monster door toevoeging van 2 mL quenchbuffer.Laad vervolgens een geschikte HPLC- en massaspectrometrie-methode. Om het monster hier te analyseren, wordt 20 picomoles myoglobine in de proteïnevanger gedesalteerd gedurende 1,7 minuten met 5% acetylnitril en 0,1% mierenzuur. Elueer vervolgens het eiwit over een gradiënt van 3,3 minuten, waarbij het gehalte wordt verhoogd tot 80% acetonitril en 0,1% mierenzuur.Injecteer het monster en verzamel de massaspectra over een massa-ladingsverhouding van 200 tot 3.200. Om de massa van het intacte eiwit als referentie te bepalen, gebruikt u dezelfde methode met een monster van een eiwit met een bekende waarde. Bepaal de eiwitmassa door de ruwe spectra te deconvolueren met behulp van data-analysesoftware. Stel voor de analyse van het myoglobine-monster het massabereik in op 15 tot 18 kilodalton, de massaresolutie op 1 Dalton en de piekcutoff op 90%. Bereid voor peptide-analyse de monsters voor volgens hetzelfde protocol als voor intacte eiwitten.Wanneer de monsters klaar zijn voor analyse, sluit dan een geïmmobiliseerde pepsin kolom en een analytische kolom aan op het ventiel en vervang de proteïnevanger door een peptidevanger. Kalibreer het systeem voor peptiden zoals is gedaan voor intacte eiwitten, maar stel de massa-ladingsverhouding in op een bereik van 100 tot 1700, en koel vervolgens het gekoelde systeem af tot een stabiele bedrijfstemperatuur van ongeveer 0 °C. Zodra het systeem is gekalibreerd, programmeert u de juiste HPLC- en massaspectrometrie-methode.Verteer hier 20 picomoles myoglobine op de Pepin-kolom met 0,1% mierenzuur in water; programmeer de methode om de peptiden gedurende 1,7 minuten op te vangen en te ontzouten in de peptide-trap met 10% acetonitril en 0,1% mierenzuur, en om de peptiden in vier minuten te elueren met een gradiënt die toeneemt tot 60% acetonitril en 0,1% mierenzuur. Injecteer vervolgens het monster en verzamel de massaspectra over een massa-ladingsverhouding van 100 tot 1700. Analyseer een niet-gedateerd peptide-monster met tandem-massaspectrometrie om de peptidenfragmenten te identificeren.Controleer vervolgens het experimenteel bepaalde fragment door dit te vergelijken met de door software gegenereerde voorspelde massa's. Stel daarna de massa-cutoff in op 10 parts per million om massa's met een hoge foutmarge voor peptiden met overeenkomsten te elimineren. Noteer de ladingstoestand van de peptidevolgorde en de retentietijd.Gebruik de samengestelde peptidegegevens om het gemiddelde aantal geïncorporeerde deuteria per peptisch fragment te berekenen met de data-analyse software. Lyofiliseer eerst het eiwit met de hulpstof en lucine zoals aangegeven in het tekstprotocol. Schakel na het voorbereiden van de monsters een UV-crosslinker in die is voorzien van 365 nanometer UV-lampen. Laat de lampen vijf minuten opwarmen.Zodra de lampen zijn opgewarmd, schakelt u deze uit en plaatst u de ongekapte vials met de formulering in de crosslinker-kamer. Bestraal de monsters gedurende 40 minuten met UV-licht en voeg monsters zonder fotoleucine toe als controle. Sluit de vials na bestraling af en bewaar deze bij -20 °C tot aan de massaspectrometrische analyse. Bereid de monsters voor op analyse door gedestilleerd water van massaspectrometrie-kwaliteit toe te voegen om een uiteindelijke proteïneconcentratie van 2 µM te verkrijgen.Analyse vervolgens de monsters met dezelfde massaspectrometrie-methode als voor de intacte gedeutereerde eiwitten. Gebruik hiervoor echter niet het gekoelde lc-systeem. Verkrijg massaspectrometrie-gegevens van een niet-gelabeld eiwitmonster om de natuurlijke massa van het eiwit te bepalen.Voer de data-analyse uit zoals bij de DERATED-monsters voor de analyse van het peptideniveau. Voer eerst vastestoffotolytische labeling uit met intacte eiwitten en bewaar deze bij -20 °C. Reconstitueer vervolgens het monster met 100 mM ammoniumbicarbonaatbuffer om een uiteindelijke eiwitconcentratie van 10 µM te verkrijgen.Meng het monster met trypsine in een molaire verhouding van 10:1 proteïne tot trypsine en incubeer dit mengsel 16 uur bij 60 °C. Verbind ondertussen de monsterlus, de peptideval en de analytische kolom met het ventiel van het HPLC-systeem. Stop na het verteren van het eiwit de reactie door 0,1% mierenzuur in water toe te voegen om een uiteindelijke proteïneconcentratie van 2 µM te verkrijgen.Programmeer vervolgens het systeem met de HPLC- en massaspectrometrie-methoden. Injecteer en ontzout hier 20 picomoles van het gedigesteerde myoglobine in de peptide-trap gedurende 1.5 minuten met 5% acetonitrile en 0.1% mierenzuur; elueer de peptiden door de gradiënt over 22 minuten te verhogen naar 55% acetonitrile en verzamel de massespectra over een bereik van 100 tot 1700 massa-ladingsverhouding. Gebruik een online tool om de theoretische massa van het peptide te berekenen.Fotoleucine-adduct met de aantallen fotoleucine die eerder zijn verkregen uit de analyse van het intacte eiwit. Neem ten minste vier gemiste splitsingen op. Maak in Excel een massalijst voor het peptide-fotoleucine-adduct.Koppel vervolgens de lijst met theoretische massa's aan de experimenteel waargenomen massa's door een afkapwaarde in te stellen om massa's met een lage foutmarge te identificeren. Tijdens waterstof-deuteriumuitwisseling maakt het ontvouwen van het eiwit de vervanging van waterstof door deuterium mogelijk; eiwitten die hun structuur behouden, zijn minder vatbaar voor deuteriumuitwisseling. Wanneer massaspectrometrie voor waterstof-deuteriumuitwisseling in de vaste fase werd uitgevoerd op myoglobineformuleringen met talose en formuleringen met sorbitol, vertoonde de formulering met sorbitol een 46% hogere deuteriumopname, wat suggereert dat de structuur van myoglobine in sorbitol sterker verstoord is tijdens het lytische proces.Fotoleucine vormt crosslinks met toegankelijke zijketens van aminozuren. Massaspectrometrie-analyse in de vaste fase van myoglobineformuleringen met sorbitol en TLO's toonde een hogere opname van fotoleucine in de TLO-formulering aan dan in het tegenovergestelde. Dit suggereert dat de zijketens in de TLO-formulering toegankelijk bleven.Zowel waterstof-deuteriumuitwisseling als lytische labeling maken gebruik van commercieel verkrijgbare reagentia en algemeen beschikbare MS-instrumentatie om eiwitten in vaste fase te karakteriseren voor elke gegeven formulering. De totale tijd vanaf de monsterbereiding tot de volledige data-analyse is minder dan twee weken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u informatie met een hoge resolutie over de eiwitstructuur verkrijgt en van het belang hiervan bij het ontwerp van stabiele gelyofiliseerde eiwitformuleringen.

mass-spectrometric-approaches-to-study-protein-structure-interactions

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Massaspectrometrie heeft bewezen een waardevol instrument voor het analyseren van grote eiwitcomplexen worden. Deze methode maakt het mogelijk inzicht in de samenstelling, de stoichiometrie en de algemene structuur van multi-subunit assemblages. We beschrijven hier, stap-voor-stap hoe u een structurele massaspectrometrie analyse uit te voeren, en karakteriseren macromoleculaire structuren.

Het analyseren van grote eiwitcomplexen de Structuurfondsen massaspectrometrie

Nauwkeurige massa meting betekent een belangrijke stap tijdens het onderzoek van eiwitten. Matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie (MALDI) massaspectrometrie (MS) kan worden gebruikt voor deze vaststelling en van zijn belangrijkste voordeel is de tolerantie voor zouten, detergentia en verontreinigingen. Hier tonen we een toegankelijke benadering voor de analyse van eiwitten groter dan 100 kDa door MALDI-MS.

Matrix-laserdesorptie / ionisatie Time of Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrische analyse van intacte eiwitten groter dan 100 kDa

Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwit-functie. Hierin beschrijven we het gebruik van tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie gekoppeld met waterstof deuterium ruil voor het sonderen van de snelle structurele veranderingen die functie rijden besteld en ontvouwen eiwitten.

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

De architectuur van eiwitcomplexen is essentieel voor hun functie. Diverse massaspectrometrische technieken combineren bewezen krachtige te bestuderen van hun vergadering. Wij bieden protocollen voor chemische dwarsbinding en inheemse massaspectrometrie en laten zien hoe deze complementaire technieken helpen ophelderen van de architectuur van multi subeenheid eiwit assemblages.

Chemische dwarsbinding en massaspectrometrie van Intact eiwitcomplexen te bestuderen de architectuur van multi subeenheid eiwit assembly's combineren

Eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet interacties zijn cruciaal voor alle cellulaire functies. Hierin beschrijven we een protocol waarmee parallelle analyse van deze interacties met een eiwit van keuze. Ons protocol is geoptimaliseerd voor de plant celculturen en affiniteit zuivering combineert met massa spectrometrie gebaseerde eiwitten en metaboliet detectie.

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

De Spectrometrie van de massa (MS) heeft ontpopt als een belangrijk instrument voor het onderzoek naar de structuur en de dynamiek van macromoleculaire assemblages. Hier, wij op basis van MS om te ondervragen eiwit complexvorming en ligand bindende benaderingen worden geïntegreerd.

Analyseren van platforms voor eiwit en eiwit-Ligand complexen door integratieve structurele massaspectrometrie

Hier presenteren we hoe kleine Angle X-Ray Scattering (SAXS) kan worden gebruikt om informatie op lage resolutie enveloppen die vertegenwoordigen de macromoleculaire structuur te verkrijgen. Wanneer gebruikt in combinatie met hoge resolutie structurele technieken zoals röntgendiffractie en nucleaire magnetische resonantie, bieden SAXS gedetailleerde inzichten in multidomain eiwitten en macromoleculaire complexen in-oplossing.

Structurele Studies van macromoleculen in oplossing met behulp van kleine Angle X-Ray Scattering

Lanthipeptide synthetases katalyseren multistep reacties tijdens de biosynthese van peptide natuurlijke producten. Hier beschrijven we een continue, bottom-up, waterstof-deuterium uitwisseling massaspectrometrie (HDX-MS) workflow die kan worden gebruikt om de conformationele dynamiek van lanthipeptide synthetases te bestuderen, evenals andere vergelijkbare enzymen die betrokken zijn bij peptide natuurlijke productbiosynthese.

Een Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform voor het onderzoeken van Peptide Biosynthetische Enzymen

De experimentele procedures voor het uitvoeren van covalente etikettering op basis van diethylpyrocarbonaat met massaspectrometrische detectie worden beschreven. Diethylpyrocarbonaat wordt eenvoudig gemengd met het eiwit- of eiwitcomplex van belang, wat leidt tot de wijziging van oplosmiddeltoegankelijke aminozuurresiduen. De gemodificeerde residuen kunnen worden geïdentificeerd na proteolytische vergisting en vloeistofchromatografie/massaspectrometrieanalyse.

Covalente etikettering met diethylpyrocarbonaat voor het bestuderen van eiwitstructuur in hogere orde door massaspectrometrie

Neutronenbackscattering spectroscopie biedt een niet-destructieve en labelvrije toegang tot de ps-ns dynamiek van eiwitten en hun hydratatiewater. De workflow wordt gepresenteerd met twee studies over amyloïde eiwitten: over de tijd-opgeloste dynamiek van lysozym tijdens aggregatie en over de hydratatiewaterdynamiek van tau op vezelvorming.

Neutronenspectroscopie met hoge resolutie om picoseconde-nanosecondedynamiek van eiwitten en hydratatiewater te bestuderen

Leer hoe je eiwitstructuur en interacties bestudeert met massaspectrometrische technieken in gevriesdroogde poeders. Deze methoden bieden hoogwaardige inzichten voor formuleringontwerp.

Massaspectrometrische benaderingen tot Protein Structure en interacties te bestuderen in gevriesdroogde Poeders

Meer video's verkennen