Experimentele Evaluatie van de muis Gezelligheid behulp van een geautomatiseerd Beeldverwerking Approach
15 mei 2016
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor muis sociability kwantificeren. Muizen worden gefilmd als ze bewegen en interactie in een speciale kooi. Filmbewerking maakt de automatische kwantificering van sociability met uitstekende nauwkeurigheid en betrouwbaarheid.
Het algemene doel van deze gedragsexperimenten in combinatie met automatische analyse is om de gezelligheid van muizen op een tijdsefficiënte manier te kwantificeren. Deze methode kan helpen bij het snel screenen van geneesmiddelen om de gezelligheid te verhogen in gevalideerde muismodellen van autismespectrumstoornissen. Het belangrijkste voordeel van het introduceren van geautomatiseerde analyse is dat het het proces versnelt en het screenen efficiënter maakt.
De behoefte aan een geautomatiseerde methode om het sociale gedrag van muizen te beoordelen, ontstond omdat het real-time visueel screenen van een enkele dosis van een kandidaatverbinding meer dan 50 uur duurt. Later in de video zal mijn afgestudeerde student Frency Varghese de geautomatiseerde analyse demonstreren. Begin met het opzetten van de kooi met drie compartimenten en zwarte wanden.
Plaats voor de eerste sessie een lege omgekeerde draadbeker in elk eindcompartiment van de kooi. Bereid vervolgens de videocamera voor om de kooi van bovenaf te bekijken. Alle drie de compartimenten moeten met een resolutie van minimaal 720 bij 480 pixels te zien zijn.
Belicht vervolgens de kooi met indirecte gloeilampverlichting zodat het kooi-interieur, gemeten vanaf de vloer, niet meer dan 3,5 Lux heeft. Zorg ook voor infraroodlicht om de kooi op een niveau te belichten dat de camera kan detecteren. Neem een enkele-frame afbeelding van de lege kooi als referentie.
Plaats voor de eerste sessie de testmuis in de kooi. Wissel vervolgens de geautomatiseerde analyse van de video in door een hand over de kooi te zwaaien. Laat de muis 10 minuten lang de testkooi verkennen.
Breng het daarna terug naar zijn eigen kooi. Voor de tweede sessie plaats de stimulusmuis onder een van de twee omgekeerde bekers. Selecteer welke beker op een uitgebalanceerde manier wordt gekozen.
Geef in de software aan welke beker de stimulusmuis onder was geplaatst. Voor naamgevingsconventies is de beker met de muis die is ingesloten, de sociale beker, terwijl de andere beker de non-sociale beker is. De compartimenten worden op een vergelijkbare manier genoemd.
Vraag het begin van de tweede sessie aan met een handzwaai zoals de eerste sessie. Aan het einde van de tweede sessie verwijdert u de omgekeerde bekers om de tweede muis vrij te laten. Gebruik een andere handzwaai om het begin van de derde sessie aan te geven en laat de twee muizen 10 minuten lang in de testkooi met elkaar interactie hebben.
Na 10 minuten brengt u beide muizen terug naar hun eigen kooi. Deze sectie legt uit hoe u de films verwerkt met behulp van de gebruikersinterface. Echter, een snelle batchmodusanalyse zonder gebruikersinvoer is ook mogelijk.
Begin met het laden van de film met behulp van de Laad knop. Selecteer vervolgens de kooiconfiguratie. Het analyseprogramma lokaliseert de kooigrenzen, compartimenten en bekers.
Selecteer een van de vier vooraf ingestelde configuraties of pas de coördinaten handmatig aan. Voer nu voor elk frame van de film de volgende verwerkingsstappen uit. Converteer eerst de frames naar grijswaarden.
Trek vervolgens het grijswaarden referentieframe af dat tijdens de voorbereidingen is gemaakt, waardoor de pixelwaarden overal behalve op de positie van de muis op nul worden gezet. Binariseer vervolgens de frames door alle pixels boven een drempelhelderheid wit in te stellen en alle andere zwart te maken. Pas deze instelling aan om de lichtomstandigheden te matchen.
Verwijder nu de staart uit de afbeeldingen door de Eroderen/Dilateren functie te gebruiken. Erodieer eerst de gebinarizeerde afbeelding drie keer. Dilaat vervolgens het frame zes keer.
Erodieer vervolgens de frames nog drie keer. Dit kan aanpassing vereisen als een andere pixelresolutie wordt gebruikt. De handzwaaien worden gemakkelijk geïdentificeerd als enorme sprongen in het volume van witte pixels.
Dit maakt automatische detectie van sessiestarts en sessievolgorde mogelijk. Detecteer binnen elke sessie het grootste component van witte pixels met behulp van de L/Comp opdracht. Dit elimineert de pixels die niet tot de muis behoren.
Gebruik vervolgens de Zoek Eindes functie om de twee meest verre pixels binnen het grootste component van witte pixels te bepalen. Dit zijn de neus en staart. De software bepaalt het zwaartepunt of COG voor het witte pixelobject en berekent de richting van beweging van frame naar frame.
Voor sessies met twee muizen moeten twee objecten worden gevolgd. Selecteer en oriënteer de twee grootste witte pixelobjecten met behulp van dezelfde opdrachtset. De software controleert automatisch de COG's van frame naar frame.
Als een van de objecten meer dan 20% in grootte verandert of een COG verder beweegt dan mogelijk is voor een muis, wordt de binarisatiedrempel automatisch verhoogd totdat aan deze criteria is voldaan. De software controleert automatisch de zwaartepunten van frame naar frame. Als een van de objecten meer dan 20% in grootte verandert of een zwaartepunt verder beweegt dan mogelijk is voor een muis, wordt de binarisatiedrempel automatisch aangepast totdat aan deze criteria is voldaan.
Interacties worden automatisch gedetecteerd wanneer de objecten binnen twee centimeter zijn. Deze segmenten worden afgespeeld voor gebruikersinvoer. Label voor elk segment de perspectief van de testmuis als Sociaal vermijden, Sociaal benaderen of Geen van beide.
Om de automatische analyse te verifiëren, laadt u de film met behulp van de Laad knop. Klik vervolgens op Start Sessie 1 om het eerste frame van die sessie weer te geven. Gebruik de Afspelen/Stop opdracht om de afspeelbewerking te bedienen.
De verwerkte films tonen elke muis met een andere kleur cirkel bij hun kop en staart. Ook worden de gezelligheidsmaatregelen op het scherm weergegeven en tijdens het afspelen bijgewerkt. Corrigeer eventuele fouten die zijn ontdekt in de geautomatiseerde analyse.
De meest voorkomende fout is een kop-staart omdraaiing die kan worden opgelost met een gereedschap op de interface. Dit komt voor in ongeveer 20%van de video's. In het zeldzame geval van een meer gecompliceerde fout, kunnen ze meestal worden opgelost door handmatig de locatie van de neus van de muis a
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om de sociabiliteit van muizen te kwantificeren met behulp van geautomatiseerde analyse van videopopnamen. Deze aanpak verhoogt de efficiëntie van sociabiliteitsscreening in muismodellen voor autismespectrumstoornissen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsanalyse
- Autismeonderzoek
Achtergrond
- Het beoordelen van de sociabiliteit van muizen is essentieel voor het begrijpen van sociaal gedrag.
- Traditionele methoden zijn tijdrovend en arbeidsintensief.
- Geautomatiseerde analyse kan de tijd die nodig is voor sociabiliteitsbeoordelingen aanzienlijk verkorten.
- Deze methode is bijzonder relevant voor drugscreening in autismeonderzoek.
Doel van de studie
- Om een tijdsefficiënte methode te ontwikkelen voor het kwantificeren van sociabiliteit bij muizen.
- Om de snelle screening van verbindingen die de sociabiliteit kunnen verhogen, te faciliteren.
- Om de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van sociabiliteitsbeoordelingen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Het filmen van muizen in een speciaal ontworpen kooi met drie compartimenten.
- Geautomatiseerde verwerking van videodata voor de kwantificering van sociabiliteit.
- Vergelijking van resultaten met traditionele visuele screeningsmethoden.
- Demonstratie van het geautomatiseerde analyseproces.
Belangrijkste resultaten
- De geautomatiseerde methode biedt nauwkeurige en betrouwbare metingen van de sociabiliteit.
- Vermindert de benodigde tijd voor sociabiliteitsbeoordelingen aanzienlijk.
- Maakt efficiënte screening van geneesmiddelen in muismodellen mogelijk.
- Aantoonbare effectiviteit in een reële experimentele opstelling.
Conclusies
- Geautomatiseerde analyse is een waardevol instrument voor het beoordelen van de sociabiliteit van muizen.
- Deze methode kan het onderzoek naar autismespectrumstoornissen versnellen.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze aanpak voor verdere gedragsonderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Geautomatiseerde kwantificatie van de sociabiliteit bij muizen maakt snelle screening mogelijk van verbindingen die zich richten op tekortkomingen in sociaal gedrag in gevalideerde modellen van autismespectrumstoornissen. Door de beoordelingstijd te reduceren van meer dan 50 uur per dosis naar efficiënte batchverwerking, ondersteunt deze methode high-throughput targetvalidatie en leadidentificatie. Het levert kwantitatieve, reproduceerbare gedragsmatige resultaten die het voorspellende vertrouwen bij vroege beslissingen in de ontdekkingsfase verbeteren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Kwantificeert sociabiliteit via de tijd die wordt doorgebracht nabij sociale versus niet-sociale stimuli en het aantal sociale benaderingen, wat mechanistische toetsing van therapeutische hypothesen mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Geautomatiseerde neusvolging en bewegingsanalyse elimineren handmatige scoring, waardoor de doorvoer toeneemt en de inter-observatorvariabiliteit afneemt.
- Voorspellende waarde: Genereert dosisresponsieve metrieken voor sociabiliteit die target de-risking en portfolio-triage ondersteunen bij de ontdekking van geneesmiddelen voor het centrale zenuwstelsel (CNS).
Screening & Assayontwikkeling
- Klaar voor analyse: Een gestandaardiseerd apparaat met drie compartimenten en geautomatiseerde videoanalyse vormt een reproduceerbaar platform voor de beoordeling van sociabiliteit.
- Kwantitatieve resultaten: Meet overgangen tussen compartimenten, de tijd in de sociale zone en sociale benaderings- of vermijdingsgebeurtenissen als continue variabelen voor het screenen van verbindingen.
- Schaalbaarheid: De mogelijkheid tot batchverwerking maakt het mogelijk om meerdere verbindingen parallel te evalueren, wat de progressie van hit-to-lead ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Modelleert direct een verminderde sociabiliteit, een kernsymptoomdomein bij autismespectrumstoornissen, wat de afstemming van translationele biomarkers mogelijk maakt.
- Preklinische continuïteit: Ondersteunt longitudinale evaluatie van veranderingen in de sociabiliteit over verschillende behandelregimes in gevalideerde muismodellen.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Objectieve sociabiliteitsgegevens informeren go/no-go-beslissingen door mechanistische ambiguïteit in gedragstypen te verminderen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van target-hypothesen via lead-identificatie tot de preklinische beoordeling van de effectiviteit, waarbij sociabiliteit dient als kwantificeerbaar eindpunt voor verbindingen die sociaal gedrag moduleren.
- Discovery Biology: Maakt hypothese-gestuurde evaluatie van sociabiliteitsmechanismen mogelijk door de voorkeur voor sociale interactie en benaderingsgedrag te kwantificeren.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, geautomatiseerde sociabiliteitsscores die de reproduceerbaarheid van assays en de vergelijking van verbindingen over platen en dagen ondersteunen.
- Analytics: Genereert numerieke sociabiliteitsindices (tijd, transities, aantal benaderingen) die statistische analyse en structuur-activiteitsrelatie-modellering faciliteren.
- Translationeel Onderzoek: Legt de verbinding met klinische relevantie door een kerngebied van de diagnostiek van autisme te modelleren, wat bijdraagt aan preklinische validatie in lijn met biomarkers.
- Enterprise Reuse: De geautomatiseerde workflow is aanpasbaar aan verschillende kooidesigns en soorten, wat toepassing over verschillende programma's in de gedragsfarmacologie mogelijk maakt.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Biedt objectieve, kwantitatieve maten voor sociabiliteit die subjectiviteit verminderen en het vertrouwen in target-engagement vergroten.
- Operationele waarde: Automatisering reduceert de handmatige tijd per assay van uren naar minuten, waardoor high-throughput screeningcampagnes mogelijk worden.
- Strategische waarde: Versnelt de lead-optimalisatie door snelle feedback over sociabiliteit te leveren, wat de kapitaalefficiëntie in CNS-programma's verbetert.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van robuuste sociabiliteitsprofielen in ziekterelevante modellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in gedragsneurowetenschappen en videotrakingsalgoritmen voor de installatie en validatie.
- Vereist gestandaardiseerde verlichting, infraroodmogelijkheden en een camera met een minimale resolutie van 720x480 voor betrouwbare neusdetectie.
- Vereist consistente sessietiming en een tegengebalanceerde plaatsing van stimuli om positionele bias te voorkomen.
- Omvat handmatige verificatie van de kop-staartoriëntatie in ~20% van de video's om geautomatiseerde trakingsfouten te corrigeren.
- Is afhankelijk van de aanpassing van de binarisatiedrempel om de takingsnauwkeurigheid te behouden bij variërende verlichting en muizenstammen.
