Het bepalen van membraaneiwit Topologie behulp Fluorescentie protease Protection (FPP)

Het algemene doel van deze procedure is om de topologie van integrale membraaneiwitten te bepalen. Dit wordt bereikt door expressie van effusie, eiwit tussen groen fluorescerend eiwit of GFP en de amino- of carboxylstaarten van het membraan. Eiwit van belang in cellen voor controledoeleinden, oplosbare fluorescerende eiwitten zoals RFP kunnen worden geëxpresseerd.

Vervolgens wordt het plasmamembraan onderworpen aan selectieve permeatie. Met behulp van het detergent dig, zullen oplosbare fluorescerende eiwitten de cel verlaten, terwijl membraangebonden fluorescerende eiwitten in de cel worden vastgehouden. De laatste stap is het aanbrengen van een protease op de perme-cellen en het bepalen van het behoud of het verlies van het fluorescerende signaal.

Uiteindelijk worden veranderingen in fluorescentie-intensiteit waargenomen met behulp van fluorescentiemicroscopiebeeldvorming gebruikt om de topologie en oriëntatie van integrale membraaneiwitten te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals epitopenkartering, is dat de procedure niet veel gespecialiseerde apparatuur of verschillende reagentia vereist die moeilijk te verkrijgen zijn. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de membraaneiwitbiologie, zoals welke domeinen van een integraal membraaneiwit zich binnen het cytosol kunnen bevinden versus welke domeinen zich binnen het lumen van organellen zoals het endoplasmatisch reticulum goud G of endosomen kunnen bevinden.

Begin deze procedure met de generatie en validatie van fluorescent eiwit KY zoals beschreven in het tekstprotocol. Transfecteer vervolgens het fluorescente eiwit KY in humane embryonale niercellen of HEK 2 93 cellen met behulp van een willekeurige standaard hoge efficiëntie, laag toxiciteit transfectiemethode, inclusief lipide-, virale of op elektroporatie gebaseerde technologieën om tijdelijke of stabiele expressie te genereren, cellen worden vervolgens geplaatst op met polylysine beklede dekselglasjes. Houd de cellen vijf tot 48 uur in geschikte weefselkweekmedia bij 37 graden Celsius in een kooldioxide-geschikte weefselkweekincubator.

Bewaak de cellen op expressie van het GFP-fusie-eiwit met behulp van epifluorescentiemicroscopie, en het intrinsieke fluorescerende signaal van het GFP-fluorescentiesignaal bereikt meestal een maximum binnen 24 tot 72 uur. Na transfectie. Gebruik de cellen wanneer het fluorescerende signaal een maximumniveau bereikt, eiwitexpressie kan ook worden gecontroleerd door immuno-blotanalyse met behulp van antilichamen gericht tegen het eiwit van belang of het GFP-motief.

Om te beginnen, zet het zwaartekrachtvoedingssysteem op voor het behandelen van de cellen. Bereid 50 milliliter spuiten voor oplossingen met polyethyleenbuis die is verbonden met onafhankelijke reservoirs en naar een manifold met een enkele uitlaat bij het bad. Plaats een zuigpijp om een constant badvolume te handhaven en om oplossingsuitwisseling te bereiken door handmatig te schakelen tussen perfusiereservoirs voor plasmamembraanpermeatie.

Verwijder eerst het celkweekmedium uit de cellen. Was de cellen drie keer gedurende één minuut. Plaats de dekglasjes in KHM-buffer op een fluorescentiemicroscoopstandaard en verzamel de eerste afbeelding, die de controle niet-permeabele afbeelding vertegenwoordigt om selectief het plasmamembraan te permeëren.

Voeg digit toin toe in KHM-buffer aan de cellen, perfuseer de cellen met buffer plus digit toin met een snelheid van vijf milliliter per minuut gedurende 10 tot 60 seconden. Bevestiging dat het plasmamembraan adequaat permeabel is, wordt gemakkelijk uitgevoerd door expressie van een oplosbaar GFP- of RFP-molecuul, dat gemakkelijk uit de cel zal diffunderen na membraan. Permeatie bevestigt vervolgens dat de GFP-eiwitchimeer van belang membraangeïntegreerd is door de cellulaire retentie van het fluorescerende signaal na digon en permeatie van het plasmamembraan te bevestigen.

Druk vervolgens een orgaanspecifiek fluorescerend eiwit uit, zoals een mitochondriaal eiwit zoals vermeld in het tekstprotocol. Bepaal optimale expressiecondities zoals eerder. Bevestig dat de dig en concentratie geschikt is voor het gebruikte celtype door ervoor te zorgen dat de morfologie van intracellulaire orgaankanalen constant blijft tijdens langdurige blootstelling.

Om digit toin. Na het wassen van de cellen in KHM-buffer, voeg protease direct op de cellen toe. Peruse de cellen met een stroomsnelheid van vijf milliliter per minuut, met behulp van een zwaartekrachtvoedingssysteem om de voorbereiding continu te baden.

Bepaal vervolgens of het fluorescerende signaal aanhoudt of degradeert. Verzamel fluorescentiemicroscoopbeelden onder de juiste filtersets door gebruik te maken van de videobeeldopnamefunctie op een computergestuurde fluorescentiemicroscoop. Kwantificeer fluorescentie signaalintensiteiten als functie van incubatieconditie.

Verkrijg de gemiddelde pixelintensiteit binnen een gebied van belang dat een individuele cel omsluit. Een verlies van meer dan 90% van de initiële signaalintensiteit gedurende 30 tot 60 seconden is consistent met proteolytische degradatie van het GFP-eiwit ky. Een volledige verdwijning van oplosbaar fluorescerend signaal zou binnen 10 tot 60 seconden na toediening van digit toin moeten optreden.

Bevestiging dat het eiwit van belang is geassocieerd met intracellulaire organellen wordt bereikt door het vaststellen van de retentie van het fluorescerende signaal na digon en permeatie. De carboxylstaart van membraangeankerde kinase LTK twee werd gefuseerd met GFP en tijdelijk gefluctueerd fluorescent ltk. Twee GFP-signaal ging snel verloren na toevoeging van proteinase K, wat aangeeft dat de locatie van het carboxyl-uiteinde van ltk twee zich binnen het cytosol bevindt.

Cavi en GFP is een plasmamembraaneiwit met een GFP-motief dat aan het cytosolische domein is bevestigd. Net als bij LTK twee, is het signaal van cavi en GFP digit toin ongevoelig, maar gevoelig voor de daaropvolgende toevoeging van protease DS rood mito codeert voor rood fluorescerend eiwit gefuseerd met de mitochondriale targetsequentie van cytochroom C oxidase na digon permeatie, evenals toevoeging van proteinase K. De fluorescentie geassocieerd met DS rood mito blijft stabiel