Name: Het bepalen van membraaneiwit Topologie behulp Fluorescentie protease Protection (FPP) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Leer de topologie van integrale membraaneiwitten bepalen met behulp van Fluorescentie Protease Protection in levende cellen. Deze methode maakt gebruik van GFP-chimeren en selectieve proteasegevoeligheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen de Calcium Imaging Core Facility bij CMS bedanken voor hun hulp en begeleiding bij het vastleggen en analyseren van beelden. Dit onderzoek werd ondersteund door de U.S. National Institutes of Health (NIH) HL102208 aan N.A.B. Deze aanpak werd oorspronkelijk ontwikkeld door Holger Lorenz en Jennifer Lippincott-Schwartz bij NIH.

1. Generatie en Validatie van Fluorescent Protein Chimeras <ol><li> Voeg groen fluorescerend eiwit (GFP) aan de amino of carboxyl termini van het eiwit van belang onder toepassing van standaard recombinant DNA strategieën 13. Opmerking Hoewel we intensief gebruikt GFP andere varianten zoals cyaan fluorescerend eiwit (CFP), geel fluorescerend eiwit (YFP), DsRed en mCherry kunnen worden toegepast. Verbeteringen in fluorofoor vouwen efficiëntie, helderheid en fotostabiliteit worden voortdurend gemaakt, en onderzoekers moeten gebruik maken van de nieuwste generatie constructies. <ol><li> Bevestig juiste DNA-sequentie en zorgen dat de GFP-groep in frame met het eiwit van interesse. Voer sequentiebepaling met gebruikmaking van standaard recombinant DNA strategieën 21. OPMERKING: Veel instellingen hebben kern DNA-faciliteiten, die de onderzoeker wordt aangemoedigd om contact op voor meer informatie. </li><li> Voor enkele of dubbele doorgang membraaneiwitten, genererenzowel amino- en carboxyterminale versies van de fusie-eiwitten 19. </li><li> Voor multi-spanning eiwitten plaatst GFP binnen vermeende extramembrane lussen, evenals de eindpunten. Pas goed bij het genereren transmembraan chimaera fluorescentielicht fusie-eiwit gebonden aan de aminoterminus van het doeleiwit signaalsequenties vaak gesplitst door proteolyse wanneer het eiwit doorgegeven via de ER translocon. </li><li> Bij bestaande signaalsequenties, plaatst het fluorescerende fusieproteïne distaal van de splitsingsplaats om een ​​rijp eiwit dat een intacte amino-eindstandig gemerkte fluorescerende eiwit produceren. Werken met standaard recombinant DNA strategieën voor het genereren van chimeren 21. </li></ol></li><li> Bepaal de aanwezigheid van voldoende adequaat gelokaliseerde fluorescerende signaal in de cellijn van belang. <ol><li> Let op de cellen onder epifluorescentiemicroscopie behulp van de intrinsieke fluorescentie van GFP onder appropriaten filter voorwaarden. Voor GFP filtersets die 510-560 nm omvatten, bevestigen dat de juiste filters worden gebruikt voor de fluorofoor gebruikt. OPMERKING: Een voldoende signaal wordt bereikt wanneer beoordeling door oog verschaft een sterk signaal dat de celstructuur waarin het signaal zich bevindt gemakkelijk opgelost boven de achtergrond. Ook het kleurpatroon van het GFP-eiwit moet in overeenstemming met die van merkers voor de juiste organel, en bij voorkeur identiek aan die van het natieve niet-gecodeerde eiwit. </li></ol></li><li> Bepalen of een stabiele of kortstondige transfectie aanpak worden toegepast gebaseerd op het eiwit geëvalueerd. OPMERKING: Stabiele transfectanten algemeen veroorloven lagere niveaus van expressie dan voorbijgaande systemen. Alhoewel transiënte expressie levert hoge expressie van (afhankelijk van het eiwit ~ 5-24 uur na transfectie) eiwitten en verhoging signaalintensiteit kan ook leiden tot overexpressie artefacten zoals eiwitten aggrdelegatieovereenkomsten of verzadiging van eiwit aangrijpingspunten, wat leidt tot foutieve subcellulaire lokalisatie. </li></ol> 2. Transfectie van cellen en Cell Culture OPMERKING: Een verscheidenheid van cellen vatbaar zijn voor FPP analyse, waaronder Hek293, HeLa, COS-7 en CHO cellen 14. De volgende beschrijving is gebaseerd op expressie membraaneiwitten in HEK293-cellen. <ol><li> Groei humane embryonale niercellen (Hek293) als hechtende monolagen in 6 ml Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagles Medium (DMEM), aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS), 1% natriumpyruvaat en 250 pg / ml penicilline / streptomycine bij 37 ° C met 5% CO2. Voer alle werkzaamheden met cellen in een laminaire stroming weefselkweek kap. Groeien cellen in kweekmedium tot ~ 80% confluent in een T-75 kolf. </li><li> Transfecteren cellen met behulp van een standaard high-efficiency, lage toxiciteit transfectiemethode, waaronder lipiden, viral- of-elektroporatie gebaseerde technologieën te transien genererent of stabiele expressie. Normaal 2 ug plasmide DNA per 1 x 10 6 cellen geeft goede reproduceerbare eiwitexpressie. Handhaaf cellen voor 5-48 uur in geschikte weefselkweekmedium bij 37 ° C in een CO 2 kan weefselkweek incubator. </li><li> Monitor cellen voor expressie van het GFP-fusie-eiwit met epifluorescentie microscopie, met de intrinsieke fluorescentie signaal van GFP, met geschikte filtersets volgens het protocol van de fabrikant. Fluorescentie-signaal bereikt meestal een maximum binnen 24-72 uur na transfectie. Gebruik cellen, indien het fluorescentiesignaal een maximum niveau bereikt. Monitor proteïne expressieniveaus door immunoblot analyse met antilichamen gericht tegen hetzij het eiwit van belang of het GFP deel. </li><li> Voor experimentele analyse plaat cellen op gecoate dekglaasjes. Bekijk ofwel onder een live-cell configuratie of na fixatie en monteren op microscopie glijbanen. Plaat cellen tot 60% -80% samenvloeiing bereiken binnen 24-48 uur. <ol><li> Coat dekglaasjes met poly-lysine-oplossing (0,1 mg / ml), zodat het gehele oppervlak is bedekt. Incubeer gedurende 30 min onder een ultraviolet licht bij kamertemperatuur, gevolgd door 60 min in een cel incubator bij 37 ° C. Verwijder overtollige poly-lysine en spoel de dekglaasjes in PBS 3 keer. </li><li> Als alternatief, het bord van de cellen op een chambered dekglas bestaande uit celkweek platen met een optische glazen bodem om directe beeldvorming met olie-immersie doelstellingen mogelijk te maken. De werkelijke microscopie setup afhankelijk van de capaciteiten van de onderzoeker apparatuur, maar die snel oplossing veranderingen worden. Afhankelijk van het celtype en de celvorm, moeten de cellen ongeveer 60-90% samenvloeiing op het moment van het FPP assay. </li></ol></li></ol> 3. fluorescentiemicroscopie Setup <ol><li> Gebruik een hoge numerieke apertuur (NA) olie-immersie objectief voor een maximale signaal verzamelen en ruimtelijke resolutie, zoals een 60x, 1,42 NA olie-immersie objectief. Gebruik the volgende lasers om de fluoroforen stimuleren: Argon gas 488 nm (GFP en YFP) en 561 diode (RFP, mCherry). </li><li> Bepaal de optimale belichting, gain en opnamesnelheid van beelden voor elk construct. Pas laser intensiteit en de belichtingstijd te photobleaching te minimaliseren (zie stap 7.1.2). </li><li> Voor studies met behulp van meerdere fluoroforen (bijvoorbeeld een oplosbare marker voor membraan permeabilisatie in concert met een membraaneiwit marker), kiest u de juiste filter sets te signaal overspraak te minimaliseren en maximaliseren van signal-to-noise ratio&#39;s. </li></ol> 4. Vaststelling van optimale voorwaarden voor plasmamembraan Permeabilisatie <ol><li> Verwijder het celkweekmedium van cellen die alleen oplosbare fluorescerende eiwitten (bv EGFP, DsRed). Was de cellen 3x (1 min elk) in KHM buffer (110 mM kaliumacetaat, 3 mM MgCl2, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,2). Voer experimenten met cellen en alle reagentia bij kamertemperatuur. </li><li> Plaats cellen on dekglaasjes (zie stap 2.4) in KHM buffer op een fluorescentie microscoop podium en het verzamelen van de eerste afbeelding, die de controle fase &#39;niet-gepermeabiliseerde&#39; vertegenwoordigt. </li><li> Om het plasmamembraan selectief doorlaatbaar, voeg digitonine (30 uM) in KHM buffer aan de cellen. Perfuseren cellen met buffer (buffer + digitonine) met een snelheid van 5 ml / min gedurende 10-60 sec. </li><li> Bepaal de optimale digitonine concentratie geleidelijk verhogen van de concentratie van digitonine. De optimale digitonine concentratie wordt bereikt wanneer er volledig verlies van fluorescentie signaal van oplosbare EGFP binnen 10-60 sec van digitonine toepassing. Voor veel cellen toepassing van 10-50 pM digitonine volstaat om de celmembraan permeabel. <ol><li> Voor alle toepassingen gebruiken de laagst mogelijke concentratie van digitonine. Verzamel beelden na digitonine permeabilization voor gepermeabiliseerde achtergrond signaal. </li></ol></li><li> Bevestigen dat het GFP-eiwitchimeer van belang is membraan ingreerde door bevestiging cellulaire retentie van het fluorescentiesignaal volgende digitonine permeabilisatie van het plasmamembraan 16. <ol><li> Versneld een organel specifieke fluorescent eiwit 23. Mitochondriale eiwitten werken goed in dit verband 16, bijvoorbeeld, pDsRed2-Mito vector. Bepaal optimale expressie zoals beschreven in stap 2.1. </li><li> Bevestigen dat de digitonine concentratie is geschikt voor het soort cel in dienst door ervoor te zorgen dat de morfologie van intracellulaire organellen constant blijft gedurende langere (tot 60 min) blootstelling aan digitonine. OPMERKING: Gebruik standaard immunofluorescentie microscopie protocollen met behulp van antilichamen tegen verschillende cellulaire compartimenten, zoals lysosomen (bijvoorbeeld LAMP1), Golgi (bijvoorbeeld TGN38), endoplasmatisch reticulum (bijv calnexin), endosomen (bijvoorbeeld Rab5), mitochondria (bijvoorbeeld cytochroom c). Als intracellulaire organel morfologie / integriteit verandert dramatisch over 60 min, is het waarschijnlijk dat de digitonine concentratie te hoog was, en vereist een vermindering digitonine concentratie en / of blootstellingstijd. OPMERKING: Digitonine is giftig bij inademing en contact met de huid. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM). </li></ol></li></ol> 5. protease Behandeling van fluorescerende eiwitten <ol><li> Was de cellen in KHM buffer en voeg protease (proteïnase K, 50 ug / ml in buffer KHM) direct op de cellen. Perfuseren cellen bij een stroomsnelheid van 5 ml / min met behulp van een zwaartekracht perfusie systeem continu bad de bereiding. <ol><li> Store oplossingen in 50 ml spuiten en polyethyleen buis verbonden onafhankelijke reservoirs naar een spruitstuk met een enkele uitlaat aan het bad (5 ml / min debiet). Plaats een zuigpipet een constante (0,5 ml) badvolume behouden of verwezenlijken oplossing uitwisseling handmatig schakelen tussen perfusie reservoirs. </li></ol></li><li> Verzamel afbeeldingen te bepalen of de fluorescent signaal aanhoudt of degradeert. Een verlies van&gt; 90% van de oorspronkelijke signaalintensiteit gedurende 30-60 sec is met proteolytische afbraak van het GFP-eiwit chimeer (zie Representatieve resultaten). </li><li> Als er geen signaal wordt waargenomen met proteinase K, wanneer een dergelijk verlies wordt verwacht, vervang de proteinase K oplossing met trypsine (4-8 mM) in KHM buffer. Indien nodig, gebruik van een mengsel van proteïnase K en trypsine. Het is niet nodig om de proteaseactiviteit blussen. </li></ol> 6. Alternatieve Aanpak voor plasmamembraaneiwitten met externe Domeinen <ol><li> Voor plasma membraaneiwitten, voert u de test voor externe fluorescerende eiwitten hersenschimmen voorafgaand aan permeabilisatie digitonine. Was de cellen op dekglaasjes in KHM buffer (5 ml / min x 3 min), en neem een ​​afbeelding voor pre-protease behandeling en kwantificeren pre-protease fluorescentie signaal als in stap 7. </li><li> Expose cellen protease (proteinase K, 50 ug / ml trypsine of 4-8 mM in buffer KHM) in thij geen digitonine te doorstromen de cellen met KHM media die protease (stroomsnelheid 5 ml / min). Verzamel beelden van de fluorescent eiwit, te bepalen hoe snel het signaal verdwijnt of hoe lang het signaal aanhoudt. </li><li> Voor digitonine permeabilisatie, doven alle proteaseactiviteit, door wassen van de cellen driemaal (1 min elk) in celkweekmedium bevattende 10% serum (FBS). </li><li> Was de cellen te doorstromen met KHM buffer (stroomsnelheid van 5 ml / min) gedurende 2 min. Verwerven afbeelding van een pre-doorlaatbaar maken. Permeabilize het celmembraan zoals beschreven in stap 4. </li><li> Verzamel afbeeldingen volgende protease toevoeging als beschreven in stap 5. </li></ol> 7. beeldanalyse <ol><li> Gebruik een omgekeerde microscoop die &quot;live cell&quot; opname, waarbij verlies van fluorescentie signaal kan worden in real-time. Voor continue monitoring, in dienst identieke parameters (exposure tijd, winnen, laser intensiteit, enz.). <ol><li> Bepaal experimental parameters door het observeren van de fluorescentie-signaal van de GFP-eiwit van belang onder controle omstandigheden (dat wil zeggen, KBH alleen buffer). Stel de gain, laser intensiteit en belichtingstijd instellingen op de computer-gestuurde microscoop om ervoor te zorgen dat er geen noemenswaardig verlies van de intensiteit van het signaal over een 10-20 min periode. OPMERKING: Signaalsterkte is geen absolute waarde, maar is gebaseerd op de microscoop systeem instellingen beschikbaar voor elke PI. Monitor veranderingen in relatieve fluorescentie-intensiteit. </li></ol></li><li> Als alternatief behandelen cellen op vaste tijdstippen in digitonine gevolgd door protease en repareren cellen voorafgaand aan de montage op dekglaasjes voor beeldvorming. Bepalen tijdstippen empirisch volgende procedures in de stappen 4 en 5. Voor het eerste onderzoek, beginnen bij 0, 30, 60, 120 en 300 seconden na de toevoeging van digitonine of protease. <ol><li> Fix cellen (20 min bij kamertemperatuur) met een voldoende hoeveelheid fixatief (3,7% paraformaldehyde in PBS) volledig onderdompelen the cellen. </li><li> Quench resterende paraformaldehyde door spoelen cellen met PBS die 20 mM glycine (3 x 5 min). </li><li> Mount dekglaasjes door het verwijderen van overtollige vloeistof uit het dekglaasje en het omkeren van de dekglaasje op 50 ul montage media op een glazen microscoopglaasjes voor de beeldvorming. Laat dia&#39;s om &#39;s nachts drogen voordat beeldvorming. </li></ol></li><li> Verzamel fluorescentie microscopie beelden (onder de juiste filters toestellen die compatibel zijn met de fluorofoor wordt gebruikt) met behulp van de afbeelding video-opname functie op een computergestuurde fluorescentie microscoop. </li><li> Kwantificeren fluorescent signaal-intensiteiten als functie van incubatie conditie. Haal de gemiddelde pixelintensiteit binnen een gebied van belang (ROI) die een individuele cel omsluit. </li></ol>

<ol><li>Sevier, C. S., Kaiser, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+transfer+of+disulphide+bonds+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation and transfer of disulphide bonds in living cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 836-847 (2002).</li>
<li>Brodsky, J. L., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+and+quality+control+in+the+endoplasmic+reticulum%3A+Recent+lessons+from+yeast+and+mammalian+cell+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+In+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein folding and quality control in the endoplasmic reticulum: Recent lessons from yeast and mammalian cell systems.</a> Current Opinion In Cell Biology. 23, 464-475 (2011).</li>
<li>Kyte, J., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+displaying+the+hydropathic+character+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple method for displaying the hydropathic character of a protein.</a> J Mol Biol. 157, 105-132 (1982).</li>
<li>Ott, C. M., Lingappa, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+membrane+protein+biosynthesis%3A+why+topology+is+hard+to+predict%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Integral membrane protein biosynthesis: why topology is hard to predict.</a> J Cell Sci. 115, 2003-2009 (2002).</li>
<li>Traxler, B., Boyd, D., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+topological+analysis+of+integral+cytoplasmic+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">The topological analysis of integral cytoplasmic membrane proteins.</a> The Journal of Membrane Biology. 132, 1-11 (1993).</li>
<li>Cserzo, M., Wallin, E., Simon, I., von Heijne, G., Elofsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+transmembrane+alpha-helices+in+prokaryotic+membrane+proteins%3A+the+dense+alignment+surface+method%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Prediction of transmembrane alpha-helices in prokaryotic membrane proteins: the dense alignment surface method.</a> Protein Eng. 10, 673-676 (1997).</li>
<li>Geest, M., Lolkema, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+topology+and+insertion+of+membrane+proteins%3A+search+for+topogenic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Membrane topology and insertion of membrane proteins: search for topogenic signals.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 13-33 (2000).</li>
<li>Bogdanov, M., Zhang, W., Xie, J., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+protein+topology+mapping+by+the+substituted+cysteine+accessibility+method+%28SCAM%28TM%29%29%3A+application+to+lipid-specific+membrane+protein+topogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Transmembrane protein topology mapping by the substituted cysteine accessibility method (SCAM(TM)): application to lipid-specific membrane protein topogenesis.</a> Methods. 36, 148-171 (2005).</li>
<li>Chang, X. B., Hou, Y. X., Jensen, T. J., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+membrane+topology+by+glycosylation+site+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mapping of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator membrane topology by glycosylation site insertion.</a> J Biol Chem. 269, 18572-18575 (1994).</li>
<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li>
<li>Zamyatnin, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+integral+membrane+protein+topology+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Assessment of the integral membrane protein topology in living cells.</a> Plant J. 46, 145-154 (2006).</li>
<li>Lorenz, H., Hailey, D. W., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+protease+protection+of+GFP+chimeras+to+reveal+protein+topology+and+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence protease protection of GFP chimeras to reveal protein topology and subcellular localization.</a> Nat Methods. 3, 205-210 (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning.+a+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning. a Laboratory Manual</a>. , 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).</li>
<li>Shah, K., McCormack, C. E., Bradbury, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+you+know+the+sex+of+your+cells%3F+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Do you know the sex of your cells? American journal of physiology.</a> Cell Physiology. 306, C3-C18 (2014).</li>
<li>Wang, H., Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+transmembrane+Ser%2FThr+kinase+complexes+with+protein+phosphatase-1+and+inhibitor-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel transmembrane Ser/Thr kinase complexes with protein phosphatase-1 and inhibitor-2.</a> J Biol Chem. 277, 49605-49612 (2002).</li>
<li>Nixon, A., Jia, Y., White, C., Bradbury, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+protease+protection+reveals+the+topology+of+the+integral+membrane+protein+Lemur+Tyrosine+Kinase+2+%28LMTK2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence protease protection reveals the topology of the integral membrane protein Lemur Tyrosine Kinase 2 (LMTK2).</a> Am J Physiol. 304 (2), C164-C169 (2012).</li>
<li>Tagawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+trafficking+of+caveolar+domains+in+the+cell%3A+caveolae+as+stable%2C+cargo-triggered%2C+vesicular+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Assembly and trafficking of caveolar domains in the cell: caveolae as stable, cargo-triggered, vesicular transporters.</a> J Cell Biol. 170, 769-779 (2005).</li>
<li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+specifying+subunit+VIII+of+human+cytochrome+c+oxidase+is+localized+to+chromosome+11+and+is+expressed+in+both+muscle+and+non-muscle+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues.</a> J Biol Chem. 264, 10595-10600 (1989).</li>
<li>Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+green+fluorescent+protein+as+a+tool+for+visualizing+subcellular+organelles+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells.</a> Curr Biol. 5, 635-642 (1995).</li>
<li>Lorenz, H., Windl, O., Kretzschmar, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+phenotyping+of+secretory+and+nuclear+prion+proteins+associated+with+inherited+prion+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cellular phenotyping of secretory and nuclear prion proteins associated with inherited prion diseases.</a> J Biol Chem. 277, 8508-8516 (2002).</li>
<li>Ben-Gedalya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin-A-induced+prion+protein+aggresomes+are+dynamic+quality-control+cellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin-A-induced prion protein aggresomes are dynamic quality-control cellular compartments.</a> J Cell Sci. 124, 1891-1902 (2011).</li>
<li>Rogers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+mapping+of+the+Syrian+hamster+prion+protein+utilizing+chimeric+and+mutant+genes+in+a+vaccinia+virus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epitope mapping of the Syrian hamster prion protein utilizing chimeric and mutant genes in a vaccinia virus expression system.</a> J Immunol. 147, 3568-3574 (1991).</li>
<li>Lisenbee, C. S., Karnik, S. K., Trelease, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+and+mislocalization+of+a+tail-anchored+GFP+redefines+the+identity+of+peroxisomal+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Overexpression and mislocalization of a tail-anchored GFP redefines the identity of peroxisomal ER.</a> Traffic. 4, 491-501 (2003).</li>
<li>Brandee, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mislocalization+and+degradation+of+human+P23H-Rhodopsin-GFP+in+knockin+mouse+model+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Mislocalization and degradation of human P23H-Rhodopsin-GFP in knockin mouse model of retinitis pigmentosa.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 9728-9736 (2011).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

De juiste oriëntatie en topologie van membraaneiwitten essentieel is voor hun functie. Ondanks het belang van het begrijpen membraaneiwit topologie, zijn er vele eiwitten waarvoor dergelijke gegevens volledig ontbreekt. FPP biedt een eenvoudige en efficiënte manier om te bepalen membraaneiwit topologie, en een die kan worden uitgevoerd door de meeste laboratoria. De FPP aanpak biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van eerdere methoden om eiwitten topologie. Zo hoeft een panel van meervoudige antilichamen weer versch...

De plasmamembranen, evenals talrijke intracellulaire membranen dienen als barrières tussen twee waterige compartimenten. Bij de plasmamembraan is de scheiding tussen de buitenkant en de binnenkant van de cel; voor intracellulaire organellen is tussen het cytoplasma en de organel lumen. Bijvoorbeeld, het endoplasmatisch reticulum (ER) membraan scheidt een oxiderende omgeving binnen het lumen van het ER een cytosolische reducerende omgeving 1. Membraan eiwitten worden gesynthetiseerd op-ER geassocieerd ribosomen, en het bereiken van hun uiteindelijke topologie binnen de ER membraan 2. De overname van de juiste membraan oriëntatie en topologie voor eiwitten is essentieel voor hun normale functie. Correct topologie maakt relevante domeinen van membraaneiwitten te communiceren met hun bindingspartners, het mogelijk kritische post-translationele modificaties optreden, en in het geval van plasma membraaneiwitten, kan de cel te interageren met en te reageren to zijn omgeving. Om de functie van een membraaneiwit volledig waarderen, is het duidelijk noodzakelijk om te weten hoe dit eiwit is georiënteerd ten opzichte van het membraan waarin deze zich bevindt, dat wil zeggen, de membraan topologie. Naast het verwerven van wetenschappelijke basiskennis begrijpen van de topologie van een membraaneiwit en die aspecten van een eiwit oppervlak blootgesteld aan verschillende milieu zijn klinische implicaties gemarkeerd aangezien membraaneiwitten omvatten de meeste farmacologische doelen 3. Tot voor kort, benaderingen te bepalen membraaneiwit topologie aanzienlijke investering in tijd en geld hebben geëist of reagentia die moeilijk te verkrijgen zijn vereist. Zowel experimentele als in silico benaderingen zijn gebruikt om de membraan topologie van eiwitten die binnen het plasmamembraan bepaalt. Aangezien de eerste voorspellingen van membraanomspannende domeinen basis van de geëvalueerde hydrofobiciteit van inddual aminozuren 3, talrijke algoritmes zijn nu beschikbaar op het internet, en eenvoudig vereisen kennis van het eiwit aminozuursequentie. Echter, aannames zijn vaak de kern van deze modellering programma&#39;s, aannames die kunnen leiden tot onjuiste opgaven van de topologie 4,5. Voorts terwijl deze computergebaseerde voorspellingen voorlopig membraanoverspannende gebieden kunnen toewijzen, zij niet altijd bepalen of de amino- of carboxy-termini van eiwitten in het cytoplasma, organel lumen of cel exterieur. Zelfs met meer rekenkracht en het gebruik van automatische leeralgoritmen 6, zoals gegevens nog een model, en worden gevalideerd middels experimenteel verkregen gegevens. Directe experimentele bepaling van membraantopologie is uitgevoerd met panelen van monoklonale antilichamen met bekende epitopen verdeeld over het eiwit, waarbij de beoordeling van hun immunoreactiviteit werd vóór en na cel permeabilisatie. Ditbenadering vereist een reeks antilichamen die niet beschikbaar zijn voor het eiwit van interesse. Een andere mogelijkheid is epitooplabels zoals myc of hemagglutinine (HA) in verschillende plaatsen in het eiwit, wederom gevolgd door bepaling van immunoreactiviteit voor en na membraan permeabilisatie ingenieur. Naast immunogene labels, enzymatische labels (zoals alkalisch fosfatase, β-galactosidase, of β-lactamase) en chemische modificaties zoals cysteine ​​scanning zijn allemaal gebruikt om membraaneiwit topologie 7,8 bepalen. Een extra methode toegepast voor topologische kaart brengen van plasmamembraaneiwitten berust op een iets andere benadering van epitoop-merkers. In deze werkwijze de tag sequentie de N-gekoppelde glycosylering consensussequentie NXS / T. Omdat glycosylering optreedt wanneer een dergelijke sequentie aanwezig in het lumen van de biosynthetische route, de aanwezigheid van het label in een luminale versus iseen cytosolisch compartiment wordt gemakkelijk waargenomen als een massaverschuiving op SDS-PAGE gels. Een dergelijke aanpak is toegepast op de multispanning ionkanaal CFTR 9. Hoewel al deze benaderingen zijn gebruikt, is het duidelijk dat ze allemaal aanzienlijke investeringen in de moleculaire biologie te genereren en de sequentie verdeelstuk constructen vereisen. Om topologische informatie over transmembraaneiwitten zich binnen intracellulaire organellen te bepalen heeft bewezen een grotere uitdaging te zijn. De toepassing van fluorescentie gebaseerde technologie heeft echter de bepaling van membraantopologie veel eenvoudiger. De techniek van bimoleculaire fluorescentie complementatie (BiFC) berust op de wisselwerking tussen twee niet-fluorescerend fragmenten van een fluorescerend eiwit, herstel van de fluorescente eigenschappen van dat eiwit 10. Hoewel aanvankelijk beschreven voor de bepaling van eiwit-eiwit interacties in vivo 10, heeft deze benadering ook gebruiktaan membraaneiwit topologie in plantencellen 11 bepalen. Deze benadering is echter ook tijdsintensief omdat het onderzoek generatie niet alleen fusie-eiwitten met het eiwit van belang maar ook diverse fusieproteïnen gericht naar het cytosol of organel lumen en vereist kennis die intracellulaire membranen het eiwit van interesse bevindt in . Een alternatieve eenvoudiger benadering bepalen membraaneiwit topologie is beschreven 12. De test Fluorescentie Protease bescherming (FPP) vereist het genereren van een fusie-eiwit tussen GFP en het gen van belang. De benadering is gebaseerd op de relatieve toegankelijkheid van niet-specifieke proteasen de GFP rest; naargelang GFP wordt beschermd tegen proteolyse door die in het lumen van intracellulaire organellen of wordt blootgesteld aan proteolyse door aanwezig in het cytosol. Dus als de GFP groep op het eiwit van interesse staat voor het cytoplasma, het wordt blootgesteld aanproteaseactiviteit en het fluorescentiesignaal verloren. Omgekeerd, indien het GFP groep op het eiwit van interesse staat voor een omgeving &#39;beschermd&#39; van de protease (zoals de Golgi lumen) dan zal het fluorescentiesignaal blijven. Om ervoor te zorgen proteasen om de cel in te voeren, maar intracellulaire membraan compartimenten het cholesterol bindend drug digitonine wordt gebruikt, niet in te voeren. Cholesterol is de dominante sterol in vertebraten, en specifiek in het plasmamembraan opzichte van intracellulaire compartimenten verrijkt. De glycoside toxine, digitonine, geëxtraheerd uit de plant Digitalis purpurea. Digitonine een affiniteit voor cholesterol rijke membranen, waar het leidt tot selectieve membraan permeabiliztion 14,16 (Figuur 1). Naast het feit uitgang van kleine cytosolische componenten, digitonine permeabilisatie maakt ook de toegang van exogene moleculen, zoals proteinase K of trypsine. De FPP-protocol maakt gebruik van de fact de plasmamembraan bevat tot 80% van cellulaire cholesterol 17, terwijl andere organellen, zoals ER, Golgi, endosomen, mitochondria, die zeer laag cholesterolgehalte hebben, intact 14 blijft. De selectieve opname van cholesterol in de plasmamembraan waargenomen in vele eukaryotische cellen, die het gebruik van digitonine-afhankelijke plasma membraan permeabilisatie in uiteenlopende eukaryotische soorten S. cerevisiae menselijke 14,18. Het FPP assay een eenvoudige, snelle en vrij robuust middel van het bepalen (a) of een eiwit membraangebonden / associated of vrij diffundeerbaar in het cytosol en (b) die domein van een membraaneiwit kijkt het cytosol of organel lumen. Moet een membraaneiwit hebben meerdere oriëntaties, zal het signaal ontstaan ​​uit de dominante vorm en kleine vormen zal niet worden gedetecteerd. Hoewel er enige bezorgdheid dat de toevoeging van een GFP groep aan het eiwit van interesse functionaliteit kan beïnvloeden kan worden en/ Of subcellulaire lokalisatie, dit is eigenlijk meer theoretisch dan de werkelijke. Inderdaad veel studies hebben duidelijk aangetoond dat het GFP-tag niet de eigenschappen van het eiwit 19,20 veranderen.

<table><tbody><tr><td>Digitonine</td><td>Calbiochem</td><td>300410</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Cav1-GFP</td><td>Addgene</td><td>44433</td><td></td></tr><tr><td>pAcGFP-1 Golgi</td><td>Clontech</td><td>632464</td><td></td></tr><tr><td>Polylysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Montage media</td><td>Dako</td><td>cS704</td><td></td></tr></tbody></table>

het bepalen van membraaneiwit topologie behulp fluorescentie protease protection (fpp)

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

De juiste topologie en oriëntatie van integrale membraaneiwitten zijn essentieel voor hun juiste functie, maar dergelijke informatie is voor veel membraaneiwitten nog niet vastgesteld. Er wordt een eenvoudige techniek gepresenteerd, genaamd fluoresceine proteasebescherming (FPP), die de bepaling van de topologie van membraaneiwitten in levende cellen mogelijk maakt. Deze techniek heeft tal van voordelen ten opzichte van andere methoden voor het bepalen van de eiwittopologie, omdat het niet de beschikbaarheid vereist van meerdere antilichamen tegen verschillende domeinen van het membraaneiwit, geen grote hoeveelheden eiwit vereist en kan worden uitgevoerd op levende cellen. De FPP-methode maakt gebruik van de ruimtelijk beperkte werking van proteasen op de afbraak van groen fluorescent eiwit (GFP) getagde membraaneiwitten om hun membraantopologie en -oriëntatie te bepalen. Deze eenvoudige benadering is toepasbaar op een grote verscheidenheid aan celtypen en kan worden gebruikt om de oriëntatie van membraaneiwitten in verschillende subcellulaire organellen zoals de mitochondriën, Golgi, endoplasmatisch reticulum en componenten van het endosomale/recyclingsysteem te bepalen. Membraaneiwitten, getagd op de N-termini of C-termini met een GFP-fusie, worden tot expressie gebracht in een cel van belang, die onderhevig is aan selectieve permeabilisatie met behulp van het detergent digitonine. Digitonine heeft de capaciteit om het plasmamembraan te permeabiliseren, terwijl intracellulaire organellen intact blijven. GFP-deeltjes die worden blootgesteld aan het cytosol kunnen selectief worden afgebroken door de toepassing van protease, terwijl GFP-deeltjes die aanwezig zijn in het lumen van organellen worden beschermd tegen de protease en intact blijven. De FPP-test is eenvoudig en resultaten kunnen snel worden verkregen.

Plasmamembraan Permeabilisatie Efficiënte plasmamembraan permeabilisatie wordt bepaald door het gebruik van oplosbare fluorescerende eiwitten (bijvoorbeeld GFP, DsRed) (stap 4). Deze eiwitten, bij expressie in cellen vrij te diffunderen in het cytosol, en gaan verloren wanneer de plasma membraan doorlaatbaar gemaakt met digitonine (figuur 2). Een volledig verdwijnen van fluorescent signaal dient binnen 10-60 sec van digitonine toepassing. Bevestiging dat he...

Hier presenteren we een protocol om de oriëntatie en topologie van integrale membraaneiwitten in levende cellen te bepalen. Dit eenvoudige protocol is gebaseerd op de selectieve proteasegevoeligheid van chimaeren tussen het eiwit van belang en GFP.

Het bepalen van membraaneiwit Topologie behulp Fluorescentie protease Protection (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Het algemene doel van deze procedure is het bepalen van de topologie van integrale membraaneiwitten. Dit wordt bereikt door de expressie van het eiwit van belang in cellen, waarbij GFP (green fluorescent protein) gefuseerd wordt aan de amino- of carboxylstaarten van het membraaneiwit. Voor controledoeleinden kunnen oplosbare fluorescerende eiwitten, zoals RFP, worden tot expressie gebracht.Vervolgens wordt het plasmamembraan onderworpen aan selectieve permeabilisatie. Door het gebruik van het detergent dig zullen oplosbare fluorescerende eiwitten de cel verlaten, terwijl membraangebonden fluorescerende eiwitten in de cel behouden blijven. De laatste stap is de toepassing van een protease op de gepermeabiliseerde cellen en het bepalen van het behoud of verlies van het fluorescentiesignaal.Uiteindelijk worden veranderingen in de fluorescentie-intensiteit, waargenomen via fluorescentiemicroscopie, gebruikt om de topologie en oriëntatie van integrale membraaneiwitten aan te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals epitopenmapping, is dat de procedure niet veel gespecialiseerde apparatuur of diverse reagentia vereist die mogelijk moeilijk verkrijgbaar zijn. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de biologie van membraaneiwitten, zoals welke domeinen van een integraal membraaneiwit zich in het cytosol bevinden versus welke domeinen zich in het lumen van organellen bevinden, zoals het endoplasmatisch reticulum of endosomen.Begin deze procedure met de generatie en validatie van het fluorescerende eiwit KY zoals beschreven in het tekstprotocol. Transfect vervolgens het fluorescerende eiwit KY in menselijke embryonale niercellen of HEK 2 93-cellen met behulp van een standaard methode voor hoog-efficiënte transfectie met lage toxiciteit, inclusief lipide-, virale- of elektroporatietechnologieën om transiënte of stabiele expressie te genereren; de cellen worden vervolgens uitgeplaat op met polylysine gecoate dekglasjes. Houd de cellen gedurende vijf tot 48 uur in geschikt weefselkweekmedium bij 37 °C in een weefselkweekincubator met koolstofdioxideregeling.Controleer de cellen op expressie van het GFP-fusie-eiwit met behulp van epifluorescentiemicroscopie; het intrinsieke fluorescentiesignaal van GFP bereikt gewoonlijk een maximum binnen 24 tot 72 uur na transfectie. Gebruik de cellen wanneer het fluorescentiesignaal een maximaal niveau bereikt. De eiwitexpressie kan ook worden gecontroleerd via immunoblotanalyse met antilichamen gericht tegen het eiwit van belang of het GFP-gedeelte.Begin met het opzetten van het zwaartekracht-gevoede perfusiesysteem voor de behandeling van de cellen. Bereid spuiten van 50 milliliter voor voor de oplossingen, voorzien van polyethyleenbuisjes die zijn verbonden met onafhankelijke reservoirs en met een verdeelstuk met één uitlaat bij het bad. Plaats een zuigpipet om een constant badvolume te handhaven en realiseer uitwisseling van oplossingen door handmatig te schakelen tussen de perfusiereservoirs voor permeabilisatie van het plasmamembraan.Verwijder eerst het celkweekmedium van de cellen. Was de cellen drie keer gedurende één minuut per keer. Plaats de dekglasjes in KHM-buffer op de tafel van een fluorescentiemicroscoop en leg de eerste afbeelding vast, die dient als controle-afbeelding van de niet-gepermeabiliseerde cellen om de plasmamembraan selectief te permeabiliseren.Voeg digitonine in KHM-buffer toe aan de cellen en perfuseer de cellen met de buffer plus digitonine met een snelheid van 5 mL per minuut gedurende 10 tot 60 seconden. De bevestiging dat het plasmamembraan adequaat permeabel is, kan eenvoudig worden uitgevoerd door de expressie van een oplosbaar GFP- of RFP-molecuul, dat na permeabilisatie van het membraan gemakkelijk uit de cel zal diffunderen. Bevestig vervolgens dat de GFP-proteïnechimeer van belang membraangeïntegreerd is door de cellulaire retentie van het fluorescentiesignaal te bevestigen na toevoeging van digitonine en permeabilisatie van het plasmamembraan.Express vervolgens een orgaanspecifiek fluorescent eiwit, zoals een mitochondriaal eiwit, zoals beschreven in het tekstprotocol. Bepaal zoals voorheen de optimale expressiecondities. Bevestig dat de dosis en concentratie geschikt zijn voor het gebruikte celtype door te controleren of de morfologie van de intracellulaire organelkanalen constant blijft bij langdurige blootstelling.Om te beginnen: voeg na het wassen van de cellen in KHM-buffer protease direct toe aan de cellen. Perfuseer de cellen met een stroomsnelheid van 5 ml per minuut, waarbij een door zwaartekracht gevoed perfusiesysteem wordt gebruikt om het preparaat continu te spoelen.Bepaal vervolgens of het fluorescentiesignaal aanhoudt of afneemt. Leg fluorescentiemicroscopiebeelden vast onder de juiste filtersets met de functie voor video-beeldopname op een computergestuurde fluorescentiemicroscoop. Kwantificeer de fluorescentiesignaalintensiteiten als functie van de incubatieconditie.Bepaal de gemiddelde pixelintensiteit binnen een regio van belang die een individuele cel omsluit. Een verlies van meer dan 90% van de initiële signaalintensiteit gedurende 30 tot 60 seconden is consistent met proteolytische degradatie van het GFP-eiwit ky. Een volledig verdwijnen van het oplosbare fluorescentiesignaal dient plaats te vinden binnen 10 tot 60 seconden na applicatie van digitonine.Bevestiging dat het eiwit van belang geassocieerd is met intracellulaire organellen wordt verkregen door vast te stellen dat het fluorescentiesignaal behouden blijft na digitoninebehandeling en permeabilisatie. De carboxylstaart van het membraangeankerde kinase LTK two werd gefuseerd met GFP en transient tot fluorescent LTK two GFP tot expressie gebracht. Het LTK two GFP-signaal ging snel verloren na toevoeging van proteinase K, wat aangeeft dat de locatie van de carboxylterminus van LTK two zich binnen het cytosol bevindt.Cavi en GFP is een plasmamembraaneiwit met een GFP-groep gekoppeld aan het cytosolische domein. Net als bij LTK twee is het signaal van cavi en GFP ongevoelig voor digitonine, maar wel gevoelig voor de daaropvolgende toevoeging van protease. DS red mito codeert voor een rood fluorescent eiwit gefuseerd aan de mitochondriale targetsequentie van cytochroom C oxidase na digitonine-permeabilisatie, evenals de toevoeging van proteinase K. De fluorescentie geassocieerd met DS red mito blijft stabiel. Dit is consistent met het feit dat Fluor four zich in de mitochondriën bevindt, waar het niet is blootgesteld aan het cytosol.Wanneer het fluorescerende deel dat aan een membraaneiwit is gekoppeld naar de buitenkant van de cel is gericht, zoals bij het GPI-verankerde prioneiwit gekoppeld aan yellow fluorescent protein. Behandeling met proteinase zou het fluorescerende signaal snel moeten doven zonder dat voorafgaande permeabilisatie van het cytoplasma nodig is, zoals verwacht. Na de proteinasebehandeling verdween het extracellulaire fluorescerende signaal snel bij cellen die dit construct tot expressie brachten.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in één tot twee uur worden uitgevoerd mits correct gedaan. Na het bekijken van deze video zou u een beter inzicht moeten hebben in hoe u de topologie van uw membraaneiwit van belang kunt bepalen.

determining-membrane-protein-topology-using-fluorescence-protease

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een methode die de kinetiek van ionen transport van membraaneiwitten maatregelen naast locatie-specifieke analyse van conformationele veranderingen met behulp van fluorescentie op enkele cellen. Deze techniek is aanpasbaar aan ionkanalen, transporteurs en ion pompen en kan worden gebruikt om de afstand tussen de beperkingen eiwitsubeenheden te bepalen.

Het onderzoeken van de Conformationele dynamiek van membraaneiwitten In situ Met Site-directed fluorescentie Etikettering

Het testen van eiwit-eiwit interacties is onmisbaar voor dissectie van eiwitten functionaliteit. Hier introduceren we...

Eiwit Membraan Overlay Test: een protocol om interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten Test In vitro</em

In this video, we demonstrate a fluorescence-detection size-exclusion chromatography technique to screen for green fluorescent protein (GFP)-fused membrane protein stability in Escherichia coli following detergent solubilization. Proteins exhibiting a symmetrical peak in the size-exclusion profile with little or no free GFP indicate purified proteins with minimum degradation and aggregation, which can subsequently be selected for structure-function analysis.

Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography: A Technique to Identify the Integrity of Fluorescent Membrane Proteins upon Detergent Solubilization

Een biochemische benadering wordt beschreven in vivo eiwit-eiwit interacties (PPI) van membraaneiwitten identificeren. De methode combineert eiwit verknoping, affiniteitszuivering en massaspectrometrie, en is aanpasbaar aan vrijwel elk type cel of organisme. Met deze benadering ook de identificatie van voorbijgaande PPI mogelijk.

Membraan-STEKEL: een biochemische Tool om eiwit-eiwit interacties van membraaneiwitten Identificeer In Vivo

Dit artikel beschrijft een methode voor het beoordelen van de interacties en assemblages van integrale membraaneiwitten in vitro met verschillende partnerfactoren in een lipid-proximaal milieu.

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren In Vitro

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van een kwantitatieve analyse van het niveau van de plasma-membraan vereniging voor fluorescently-tagged verbond-geassocieerde proteïne. De methode is gebaseerd op de computationele decompositie van membraan en cytoplasmatische onderdeel van signaal waargenomen in cellen die zijn gemarkeerd met plasmamembraan fluorescerende marker.

Bepaling van het plasmamembraan partitioneren voor zijdelings-geassocieerde eiwitten

Dit protocol presenteert een methode voor het meten van adenine nucleotide binding aan receptoren in real time in een cellulaire omgeving. Binding wordt gemeten als Förster resonantie energieoverdracht (FRET) tussen trinitrofenylnucleotidederivaten en eiwit gelabeld met een niet-canoniek, fluorescerend aminozuur.

Het meten van nucleotidebinding aan intacte, functionele membraaneiwitten in realtime

De fluorescentielekkagetest is een eenvoudige methode die het onderzoek van peptide / membraaninteracties mogelijk maakt om hun betrokkenheid bij verschillende biologische processen te begrijpen en vooral het vermogen van cel-penetrerende peptiden om fosfolipiden bilayers te verstoren tijdens een direct cellulair translocatieproces.

Fluorescerende lekkagetest om membraan destabilisatie door cel-penetrerend peptide te onderzoeken

Het huidige protocol beschrijft een procedure voor het uitvoeren van fluorescerende grootte-uitsluitingschromatografie (FSEC) op membraaneiwitten om hun kwaliteit te beoordelen voor downstream functionele en structurele analyse. Representatieve FSEC-resultaten verzameld voor verschillende G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's) onder wasmiddel-opgeloste en detergent-vrije omstandigheden worden gepresenteerd.

Snelle beoordeling van de kwaliteit van membraaneiwitten door fluorescerende grootte-uitsluitingschromatografie

Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van hoe monsters te maken voor single-eiwittracking in solid-supported lipid bilayers. Het verklaart ook een eenvoudige fluorescentiemicroscoop met enkelvoudige moleculegevoeligheid en een hoge framerate. Tot slot beschrijven we de procedure voor het extraheren van single-protein trajecten.

Tracking van enkele eiwitten in lipide-dubbellagen met behulp van fluorescentiemicroscopie

Leer de topologie van integrale membraaneiwitten bepalen met behulp van Fluorescentie Protease Protection in levende cellen. Deze methode maakt gebruik van GFP-chimeren en selectieve proteasegevoeligheid.

Het bepalen van membraaneiwit Topologie behulp Fluorescentie protease Protection (FPP)

Meer video's verkennen