RNA isolatie van de Cel specifieke subpopulaties met behulp van laser-capture Microdissection Gecombineerd met Rapid immunolabeling

Het algemene doel van deze procedure is om te demonstreren hoe snel immunolabeling van een muis hersencelpopulatie uitgevoerd kan worden die geïsoleerd is door middel van laser capture micro dissectie of LCM, terwijl de RNA-integriteit van de monsters behouden blijft. Dit wordt bereikt door eerst het gesneden hersweefsel snel te bevriezen. Vervolgens wordt de hersenen in dunne secties gesneden op RNA-vrije glazen microscoopglazen en behandeld met een snelle immunokleuring.

Ten slotte wordt de celpopulatie van belang geïsoleerd met behulp van LCM. Uiteindelijk maakt de snelle kleuring gevolgd door laser capture microdissectie het mogelijk om veranderingen in de expressie van het gen van belang te identificeren in het experimentele celmonster. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals fluorescent activated cell sorting, is dat met onze techniek de ruimtelijke resolutie wordt behouden waardoor de specifieke cel van ES uit het omringende weefsel kan worden opgelost.

Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn in deze Smith-cel ronddraaien omdat deze procedure verschillende kritieke stappen omvat die snel moeten worden uitgevoerd om de RNA-integriteit in de monsters te behouden. Om de monsters voor te bereiden op het snijden, worden de hersenen van postnatale muizen van dag één in ijskoud L 15-medium binnen twee minuten na het doden ontleed. Plaats vervolgens de hersenen in inbeddingsvormen in de juiste oriëntatie voor snijden en vul de vormen met bevroren weefsel, inbeddingsmedium.

Bevriest vervolgens de monsters onmiddellijk in vloeibare stikstof en bewaar ze binnen 30 seconden na het snel bevriezen op min 80 graden Celsius. Behandel vervolgens met membraan gecoate glazen schijven met oppervlakte-RNA-decontaminatie om eventuele sporen van RNA te verwijderen. Spoel ze in DEPC-water en laat ze drogen wanneer de platen droog zijn.

Stel de cryostaatkamertemperatuur in op min 20 graden Celsius en breng het bevroren monster over naar de cryostaat. Monteer voor elk monster de bevroren blok op de monsterstang en snij de monsters met een dikte van 10 micron, waarbij de secties op de met membraan gecoate platen worden verzameld. Laat de secties minimaal 10 minuten drogen en gebruik een hydrofobe barrièrepen om de weefsels te omcirkelen.

Na ongeveer 10 seconden plaatst u de platen in vers bereide koude fixeeroplossing gedurende maximaal vijf minuten bij min 20 graden Celsius. Breng nu de platen over naar een schone lade die voorbehandeld is met oppervlakte-RNA-decontaminatieoplossing. Schud de platen eerst één keer om overtollig fixeermiddel te verwijderen en was ze met zes tot acht snelle duiken in D-E-P-C-P-B-S, klap de platen om.

Om het overtollige D-E-P-C-P-B-S te verwijderen, voegt u 200 microliter van de primaire antilichaamoplossing toe aan elke sectie. Na 10 minuten bij kamertemperatuur, was de platen met drie snelle duiken in D-E-P-C-P-B-S en klap ze eenmaal om het overtollige wasoplossing te verwijderen. Behandel vervolgens de monsters in 200 microliter van de secundaire antilichaamoplossing bij kamertemperatuur na zes minuten.

Was de platen in D-E-P-C-P-B-S zoals zojuist gedemonstreerd en behandel ze in vers bereide BC-oplossing gedurende vier minuten na nog een snelle D-E-P-C-P-B-S-was. Meng 196 microliter vers bereide DAB met vier microliter RNA-remmer. Laat de DAB net voordat u de oplossing aan de sectie toevoegt een tot twee minuten ontwikkelen, gevolgd door A-D-E-P-C-P-B-S-was. Droog vervolgens de secties uit met een paar seconden incubatie in absoluut ethanol en klap de platen droog om door te gaan naar LCM.

Voeg vervolgens 50 microliter lysisbuffer van een RNA-extractiekit toe aan de dop van de opvangbuis. Plaats vervolgens één plaat onder de microscoop met de monsterszijde naar de dop gericht. Kies de beste vergroting voor het monster en pas de focus aan om de cellen van belang te zien.

Definieer vervolgens het snijgebied en begin met snijden met de laser. Verzamel het gesneden materiaal in de dop van de opvangbuis en lyzeer de verzamelde cellen gedurende 30 minuten bij 42 graden Celsius. Gedurende deze tijd, voorwaarden een RNA-zuiveringskolom uit de RNA-extractiekit met 250 microliter conditioneringsbuffer.

Laad vervolgens 50 microliter ethanol op de gelyseerde cellen op de kolom en centrifugeer de kolom gedurende twee minuten bij 16.000 Gs en kamertemperatuur gevolgd door twee spoelingen met wasbuffer. Elueer ten slotte het RNA in het minimale aanbevolen volume van 11 microliter RNA-vrij water en bewaar twee microliter om de kwaliteit van het RNA te testen. Deze snelle immunolabelingprocedure maakt de visualisatie van cellen van belang mogelijk terwijl de experimentele RNA-integriteit wordt gehandhaafd.

Afhankelijk van het experiment kan LCM zoals zojuist gedemonstreerd worden gebruikt om enkele cellen of grotere interessegebieden te isoleren. Gedegradeerd RNA heeft een aanzienlijke invloed op de kwaliteit van de downstream-analyse. Elk monster wordt dus verder verwerkt op een microfluïdisch X-gebaseerde platformbio-analyzer om kwantificering en verificatie van de integriteit van het geïsoleerde RNA mogelijk te maken zoals zojuist is gedemonstreerd.

Bijvoorbeeld, hier zijn typische bio-analyzerresultaten van zowel gedegradeerde als goede kwaliteit. RNA-monsters getoond. Inderdaad, digitale gel- en elektroferogrammen demonstreren het belang van het gebruik van een rase-remmer in elke oplossing om de RNA te beschermen. Na deze procedure kan hoogwaardig RNA verder worden verwerkt voor downstream-toepassingen, waaronder RNA-sequencing MICROARRAY of Q-R-D-P-C-R, bijvoorbeeld, in deze grafieken werd de gemiddelde verrijking voor TH en A A DC genexpressie in het micro gedissekteerde monster ten opzichte van middenhersensecties bepaald op meer dan 170-voudig.

Wanneer u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden dat u snel en met RNA-vrij materiaal moet werken. Na het bekijken van deze video, zou u een goed be