Name: Chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes gemedieerde gen silencing in Disease Vector muggenlarven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Leer gen-silencing in ziektevector muggenlarven met chitosan/interfererende RNA nanodeeltjes. Deze methode maakt efficiënt onderzoek naar genfunctie mogelijk in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering van de Kansas Agricultural Experiment Station en K-State Arthropod Genomics Center naar KYZ ondersteunde de oorspronkelijke ontwikkeling van chitosan/dsRNA-gemedieerde gen-silencing in A. gambiae19. Het A. gambiae werk dat hier wordt beschreven, werd gedeeltelijk ondersteund door R01-AI095842 van NIH/NIAID naar KM. Ontwikkeling van chitosan/siRNA-gemedieerde gen-silencing in A. aegypti20,21 werd ondersteund door NIH/NIAID Award R01-AI081795 naar MDS. De inhoud van deze studie is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de NIH.

1. muggensoorten en Grootbrengende <ol><li> Onderhouden A. gambiae G3 en A. aegypti Liverpool IB12 stammen (voor de representatieve studies hieronder) of andere stammen plaats volgens standaard laboratorium praktijk of zoals eerder beschreven 23,24. </li></ol> 2. dsRNA en siRNA Ontwerp en Productie <ol><li> Ontwerp primers voor lange dsRNA sjablonen specifiek voor het gen van belang te construeren. Gebruik de E-RNAi hulpmiddel 25. Opbrengst dsRNA volgens de werkwijze van keuze of zoals eerder beschreven 19. <ol><li> Voor een negatieve controle, synthetiseren dsRNA 19 overeenkomt met de sequentie van groen fluorescerend eiwit (GFP), β-galactosidase (β-gal) of een ander gen niet tot expressie gebracht in muggen. Indien gewenst, kan dsRNA 19 gebruikt om de representatieve resultaten hieronder samengevat genereren worden gebruikt als een positieve controle. Store dsRNA opgelost in-RNAse vrij water bij -80 °; C totdat het nodig is. </li></ol></li><li> Als alternatief ontwerp-gen-specifieke siRNA volgens standaard lab praktijk of zoals eerder 10 beschreven. Versleutelen van de sequentie van een knock-down siRNA om negatieve controle siRNA die niet overeenkomt met een mug gen te ontwerpen. Koop de aangepaste siRNA&#39;s, die beschikbaar zijn via een aantal gerenommeerde leveranciers. <ol><li> Desgewenst kan siRNAs 20,21 benut de representatieve resultaten hieronder samengevat verkregen worden als positieve controles. WINKEL siRNA opgelost in RNAse-vrij water bij -80 ° C totdat het nodig is. </li></ol></li></ol> 3. Voorbereiden Chitosan / interfererende RNA Nanodeeltjes <ol><li> Verzamel pre RT 100 mM natriumsulfaat (100 mM Na 2 SO 4 in gedeïoniseerd H2O) en 0,1 M natriumacetaat (0,1 M NaCl 2 H 3 O 2 -0,1 M azijnzuur, pH 4,5 in gedeïoniseerd H2O) buffers. </li><li> Ontbinden chitosan (≥75%gedeacetyleerd) in 0,1 M natriumacetaatbuffer 0,02% (w / v) werkoplossing maken en houden van de oplossing op kamertemperatuur vóór gebruik. </li><li> Los dsRNA of siRNA in 50 pl gedeïoniseerd H2O toevoegen aan 100 mM natriumsulfaat buffer 100 pi oplossing van 32 ug dsRNA / siRNA per 100 ul 50 mM natriumsulfaat maken. </li><li> Voeg 100 ul van chitosan oplossing van het dsRNA / siRNA oplossing en verwarm het mengsel in een waterbad bij 55 ° C gedurende 1 min. Stel een controle door toevoeging van 100 ui 50 mM natriumsulfaat 100 gl chitosanoplossing en volgt dezelfde procedure. </li><li> Meng de oplossingen onmiddellijk gedurende 30 seconden op hoge snelheid vortexen bij kamertemperatuur om de vorming van nanodeeltjes vergemakkelijken. </li><li> Centrifugeer het mengsel bij 13.000 xg gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, waarna een pellet zichtbaar zijn. Breng het supernatant naar een nieuwe buis van 1,5 ml. Air-droog de pellet voor ≈10 min bij RT alvorens het te gebruiken om muggen voedsel te bereiden. </li><li> Maatregel de concentratie van dsRNA / siRNA in de supernatant met de supernatant van de controle (zie 3.5) als blanco de totale hoeveelheid dsRNA / siRNA, dat in het supernatant berekenen. Met het verschil tussen starten hoeveelheden dsRNA / siRNA en bedragen nog in de supernatanten het percentage dsRNA / siRNA ingevangen in de nanodeeltjes berekenen. Dit beladingsrendement gewoonlijk meer dan 90%. </li><li> Herhaal deze procedure als meer nanodeeltjes nodig. Gebruik de gedroogde nanodeeltjes onmiddellijk. De impact van koude opslag van deeltjes voorafgaand aan het gebruik is niet onderzocht. </li></ol> 4. Voorbereiden Mosquito Eten met chitosan / interfererende RNA Nanodeeltjes <ol><li> Bereid 1 ml van een 2% agarose-oplossing (w / v) in gedeïoniseerd water, smelt de agarose en houd gesmolten agarose-oplossing in een 55 ° C waterbad voor gebruik. </li><li> Meng visvoer vlokken (47% ruw eiwit, min. Ruw vet 10%, max. Ruwe celstof 3%) en droge gist bij eenverhouding van 2: 1 (w / w). Maal het mengsel tot kleine deeltjes met een mortier en een stamper (begaanbaar door No. 50 USA standaard test zeef). Gebruik de grond eten, die bruinachtig van kleur moeten zijn, hetzij onmiddellijk of op te slaan in een afgesloten container bij 4 ° C gedurende enkele weken. </li><li> In een 1,5 ml tube, meng 6 mg gemalen voedsel met de gedroogde nanodeeltjes uit paragraaf 3.7 met een tandenstoker. </li><li> Voeg 30 ul van 2% pre-gesmolten agarosegel oplossing voor de food-nanodeeltjes mengsel; onmiddellijk en grondig te roeren met behulp van een tandenstoker of pipet tip. </li><li> Gebruik de gel met voedsel en nanodeeltjes op de muggenlarven onmiddellijk te voeden. Alternatief, wanneer de gel volledig gestold bij kamertemperatuur, slaan de gel bij 4 ° C en gebruik de volgende dag, of bij -80 ° C voor later gebruik. </li></ol> 5. Het voeden muggenlarven met levensmiddelen die Chitosan / interfererende RNA Nanodeeltjes <ol><li> Voeden A. gambiae muggenlarven: <ol><li> Verwijderen van een single gel pellet van de 1,5 ml buis met behulp van een tandenstoker en snijd het in 6 gelijke plakjes met een schone scheermesje of tandenstoker. </li><li> Breng 20 derde instar larven in een 500 ml petrischaal met 100 ml gedeïoniseerd water. </li><li> Voer de muggenlarven door één plak van de gel pellet (fijngehakt in kleinere stukken) per petrischaal eenmaal per dag gedurende vier dagen. Zorg ervoor dat de larven voeden observeren op de korrel, die aanzienlijk moeten worden verkleind of geheel afwezig zijn door de volgende dag. Na verloop van tijd, zal muggen ontwikkelen tot larven late vierde instar. </li><li> Noteer elke zichtbare fenotypische veranderingen tijdens het experiment. Onderzoeken het transcript niveaus en andere fenotypische veranderingen zoals besproken in hoofdstuk 6 aan het einde van de periode van vier dagen. </li></ol></li><li> Voeden A. aegypti muggenlarven: <ol><li> Snijd de gel pellet in 6 gelijke plakjes met een schone scheermesje of tandenstoker. </li><li> Plaats 50-jarige leeftijd gesynchroniseerd 24 uur na ei uitbroeden filarven eerste instar in een petrischaaltje in ≈40 ml gedeïoniseerd water. </li><li> Voeden larven één schijfje per petrischaal voor 4 uur / dag, vervolgens transfer larven terug naar de reguliere larvale voeding van 2: 1 begane visvoer vlokken en droge gist voor de rest van de dag. Herhaal de procedure dagelijks gedurende de vier larvale stadia. </li><li> Onderzoeken het transcript niveaus en andere fenotypische veranderingen zoals besproken in hoofdstuk 6 op de gewenste ontwikkelingsstoornissen tijdstippen. </li></ol></li></ol> 6. Bevestiging van Gene Knockdown <ol><li> Relatieve transcript kwantificering door qRT-PCR in A. aegypti en A. gambiae larven. <ol><li> Voer en analyseren qRT-PCR assays met drie biologische replicaten op ten minste 10 samengevoegde controle versus experimentele larven beschreven 11,19,20 of volgens standaard laboratorium procedure. Representatieve resultaten zijn hieronder opgenomen. </li><li> Voor de analyse van een bepaald type weefsel / lichaamsdeel (dwz., Hersenen of antenne), perform qRT-PCR zoals beschreven in 6.1.1 na dissectie om het weefsel van belang vorderen (zie bijvoorbeeld Mysore et al. 21). </li></ol></li><li> Bevestiging van knockdown door in situ hybridisatie <ol><li> Synthetiseren-digoxygenine gelabeld antisense en zinsbeheersing riboprobes volgens standaard lab praktijk of zoals beschreven 26. </li><li> Uitvoeren in situ hybridisatie volgens de Haugen et al. 27 protocol bevestiging van knockdown zoals eerder beschreven 11,20 en in het onderdeel representatieve resultaten hieronder. </li></ol></li><li> Bevestiging van de knock-down door immunohistochemie <ol><li> Als antilichamen tegen het eiwitproduct van het gen gerichte beschikbaar, immunohistochemie uitgevoerd zoals eerder beschreven 28 die de identificatie van individuen met de grootste niveaus van knockdown op fenotype analyse 20 vergemakkelijkt zoals geïllustreerd in de representative resultaten hieronder. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Malaria. , World Health Organization. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/topics/malaria/en">http://www.who.int/topics/malaria/en</a> (2014).</li>
<li>Dengue. , Malaria Centers for Disease Control and Prevention. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/dengue/">http://www.cdc.gov/dengue/</a> (2014).</li>
<li>Knipling, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+insects+of+public+health+importance%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Genetic control of insects of public health importance.</a> Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).</li>
<li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female-specific+flightless+phenotype+for+mosquito+control%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Female-specific flightless phenotype for mosquito control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).</li>
<li>Wise de Valdez, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+elimination+of+dengue+vector+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic elimination of dengue vector mosquitoes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).</li>
<li>Harris, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+suppression+of+a+field+mosquito+population+by+sustained+release+of+engineered+male+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+dsRNA+for+RNAi+in+insects%3A+an+overview+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+science%22%5BJournal%5D)">Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions.</a> Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).</li>
<li>Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limitation+and+possible+solutions+of+RNAi-based+technology+for+insect+pest+control%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+science%22%5BJournal%5D)">limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control.</a> Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).</li>
<li>Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+genes+in+Aedes+aegypti+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).</li>
<li>Clemons, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA-mediated+gene+targeting+in+Aedes+aegypti+embryos+reveals+that+frazzled+regulates+vector+mosquito+CNS+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development.</a> PLoS One. 6 (1), e16730(2011).</li>
<li>Haugen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin-1a+is+required+for+Aedes+aegypti+embryonic+nerve+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development.</a> PLoS One. 6 (6), e21694(2011).</li>
<li>Nguyen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genetic+characterization+of+salivary+gland+development+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti.</a> EvoDevo. 4 (1), 9(2013).</li>
<li>Sarro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+commissureless2+function+during+dipteran+insect+nerve+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development.</a> Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).</li>
<li>Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+delivery+of+double-stranded+RNA+in+larvae+of+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%3A+implications+for+pest+mosquito+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control.</a> J Insect Sci. 13, 69(2013).</li>
<li>Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rehydration+driven+RNAi%3A+a+novel+approach+for+effectively+delivering+dsRNA+to+mosquito+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medical+entomology%22%5BJournal%5D)">Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae.</a> Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).</li>
<li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+elements+of+successful+insect+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+insect+physiology%22%5BJournal%5D)">Towards the elements of successful insect RNAi.</a> Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).</li>
<li>Coy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+adult+Aedes+aegypti+mosquitoes+through+oral+delivery+of+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Entomol%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA.</a> J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan%2Fdouble-stranded+RNA+nanoparticle-mediated+RNA+interference+to+silence+chitin+synthase+genes+through+larval+feeding+in+the+African+malaria+mosquito+%28Anopheles+gambiae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae).</a> Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).</li>
<li>Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Aedes+aegypti+olfactory+system+development+through+chitosan%2FsiRNA+nanoparticle+targeting+of+semaphorin-1a%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+neglected+tropical+diseases%22%5BJournal%5D)">Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a.</a> PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215(2013).</li>
<li>Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan%2FsiRNA+nanoparticle+targeting+demonstrates+a+requirement+for+single-minded+during+larval+and+pupal+olfactory+system+development+of+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti.</a> BMC developmental biology. 14 (1), 9(2014).</li>
<li>Dass, C. R., Choong, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan-mediated+orally+delivered+nucleic+acids%3A+a+gutful+of+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+drug+targeting%22%5BJournal%5D)">Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy.</a> Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).</li>
<li>An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+regulatory+unit+that+controls+melanization+and+affects+longevity+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+life+sciences+%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes.</a> Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).</li>
<li>Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClemons%2C+A+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22">Cold Spring Harb Protoc</a>. 2010 (10), (2010).</li>
<li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-RNAi%3A+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).</li>
<li>Patel, N. H. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPatel%2C+NH+%22A+laboratory+guide+to+RNA%3A+Isolation%2C+Analysis%2C+and+Synthesis%22">A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis</a>. PA, K. rieg , Wiley-Liss. (1996).</li>
<li>Haugen, M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugen%2C+M+%22Whole-mount+in+situ+hybridization+for+analysis+of+gene+expression+during+Aedes+aegypti+development%22">Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development</a>. 2010 (10), Cold Spring Harb Protoc. (2010).</li>
<li>Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+analysis+of+protein+expression+during+Aedes+aegypti+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).</li>
<li>Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiling+of+diel+and+circadian+gene+expression+in+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).</li>
<li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li>
<li>Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+Aedes+aegypti+using+TALENs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs.</a> Methods. 69 (1), 38-45 (2014).</li>
<li>Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+administration+of+bacterially+expressed+VP28dsRNA+to+protect+Penaeus+monodon+from+white+spot+syndrome+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Biotechnol+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus.</a> Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).</li>
<li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+nanoparticle+delivered+dsRNA+toward+genetic+control+of+insect+pests%29%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests).</a> Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).</li>
<li>Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+with+polyvalent+siRNA-nanoparticle+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).</li>
<li>Davis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+RNAi+in+humans+from+systemically+administered+siRNA+via+targeted+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles.</a> Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).</li>
<li>Molinaro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine+and+chitosan+carriers+for+the+delivery+of+RNA+interference+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+delivery%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors.</a> Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).</li>
<li>Singha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymers+in+small-interfering+RNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acid+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Polymers in small-interfering RNA delivery.</a> Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes hierin beschreven methode werd gebruikt om effectief genen richten tijdens de larvale ontwikkeling A. gambiae (figuren 2, 3) en A. aegypti (figuren 4, 5, 6, Tabellen 1, 2). Chitosan nanodeeltjes kunnen worden bereid met ofwel lange dsRNA of siRNA, die beide met succes gebruikt in muggen zoals blijkt uit de representatieve resultaten hierin beschreven. Synthese van dsRNA goedkoper dan de aankoop siRNA, maar is arbeidsintensi...

Bloed voeden vector muggen van de Anophelinen en Aedine geslachten overbrengen ziekteverwekkers verantwoordelijk voor enkele van de ergste bedreigingen van de mensheid. Naar schatting 3,4 miljard mensen het risico voor het oplopen van malaria, die verantwoordelijk is voor meer dan een half miljoen doden per jaar wereldwijd. Malaria resultaat van infectie door Plasmodium sp. Parasieten, die door beten van geïnfecteerde muggen van het geslacht Anopheles, inclusief de belangrijkste Afrikaanse vector Anopheles gambiae (mensen worden doorgegeven <a href="http://www.who.int/topics/malaria/en/">http://www.who.int/topics/malaria/en/</a> , 2014) 1. Aedes aegypti mug de primaire vector voor dengue virus dat dengue koorts, een niet-specifieke koorts die de meest voorkomende en belangrijke arboviral ziekte in de wereld veroorzaakt. Dengue-virus is op dit moment een bedreiging voor&gt; 2,5 miljard mensen in de tropen, met een jaarlijkse incidence van ongeveer 50 miljoen gevallen resulterend in ~ 24.000 sterfgevallen per jaar ( <a href="http://www.cdc.gov/dengue/">http://www.cdc.gov/dengue/</a> , 2014) 2. Ondanks de verwoestende wereldwijde impact van door muggen overgebrachte ziekten op de menselijke gezondheid, doeltreffende middelen ter voorkoming en behandeling van deze ziekten ontbreken. Mosquito controle is op dit moment de beste methode van ziektepreventie. Het potentieel voor het regelen van geleedpotigen overgedragen ziekten door de genetische manipulatie van de vectoren is erkend voor meer dan vier decennia 3. Transgene stammen van A. aegypti ontworpen om een onderdrukbaar vrouwelijke-specifieke vliegende fenotype hebben onlangs het potentieel voor het gebruik van transgene vector controle strategieën een realiteit 4-6. Deze ontwikkelingen hebben de onderzoekers uitgedaagd om nieuwe genetische targets te identificeren voor vector controle en extra middel om het manipuleren van gen-functie in vector muggen. Wijziging van genexpressie dijdens de ontwikkeling, zoals het geval was bij vrouwelijke-vliegende muggen 4 was, kan de opheldering van nieuwe vector controle strategieën te bevorderen. Echter grotendeels door technische problemen, de functies van zeer weinig genen gekarakteriseerd tijdens de ontwikkeling van A. gambiae, A. aegypti, of andere muggensoorten. Sinds zijn ontdekking in C. elegans 7, RNA interferentie (RNAi), die wordt bewaard in dieren, planten en micro-organismen, is uitgebreid gebruikt voor functionele genetische studies in diverse organismen, waaronder insecten 8,9. De RNAi route wordt geïnitieerd door Dicer, die splitst lange dsRNA in korte 20-25 nucleotide-lange siRNA&#39;s die functioneren als sequentie-specifieke interfererende RNA. siRNA stilte genen die complementair zijn in de juiste volgorde zijn door het bevorderen van transcript omzet, splitsing, en verstoring van de vertaling 9. Lange dsRNA moleculen (meestal 300-600 bp) of aangepaste siRNA gericht op een particular sequentie kan worden gebruikt in het onderzoekslaboratorium voor silencing elk gen van interesse. Door het beheer wanneer interfererende RNA is uitgebracht, kunnen onderzoekers de tijd te controleren op welk gen silencing ingewijden. Dit voordeel is nuttig als het kan worden gebruikt om problemen zoals ontwikkelingsstoornissen letaliteit of steriliteit, die de productie en het onderhoud van stammen dragende erfelijke mutaties, een duur en arbeidsintensief proces dat nog niet in alle insectensoorten kunnen belemmeren overwinnen. Hoewel de mate van gen silencing door RNAi varieert van gen tot gen, weefsel weefsel en dier tot dier, wordt RNAi veel gebruikt voor functionele analyse van genen in muggen en andere insecten 8,9. Drie interfererende RNA levering strategieën zijn gebruikt muggen: micro-injectie, inweken / topische toediening, en inslikken. Voor een gedetailleerde geschiedenis en vergelijking van het gebruik van deze drie technieken bij insecten, verwijzen wij u naar Yu et al 8. We hebben met succes gebruik microinjectie 10 als een middel om siRNAs ontwikkelingsstoornissen genen in A. targeten aegypti embryo&#39;s, larven en poppen 11-14. Echter, dit arbeidsintensieve levering strategie vereist zowel een micro-injectie setup en een bedreven hand. Bovendien microinjectie is belastend het organisme, een verstorende factor, vooral wanneer gedrags fenotypen worden beoordeeld. Tenslotte kan microinjectie levering niet worden uitgebreid tot het veld vectorcontrole. Als alternatief, onderdompelen het organisme interfererende RNA oplossing ook een populaire manier induceren gene silencing, aangezien het gemakkelijk en vergt weinig of arbeid. Doorwekende heeft hoofdzakelijk insectencellijn toegepast bestudeert 8, maar in een recente studie werd knockdown in A. bereikt aegypti larven ondergedompeld in een oplossing van dsRNA 15, die de dieren leek te inname. Voor studies met analyse van veelvoudige experimental groepen of fenotypes, inweken is nogal kostbaar. Lopez-Martinez et al. 16 beschreven rehydratie gedreven RNAi, een nieuwe benadering voor interfererende RNA aflevering dat uitdroging in zoutoplossing en rehydratie gaat met een enkele druppel water met interfererende RNA. Deze benadering knipt de kosten geheel dier onderdompeling, maar is duurder dan micro-injectie en kan de toepassing ervan soorten die hoge osmotische druk kan verdragen beperkt. Bovendien is het moeilijk voor te stellen hoe onderdompeling of dehydratatie / rehydratatie onderdompeling methode kan worden aangepast voor vectorcontrole in het veld. Daarom, voor post-embryonale studies, levering van interfererende RNA met voedsel ingenomen een levensvatbare alternatieve strategie. Alhoewel-inname gebaseerde strategieën werken niet in alle insectensoorten, misschien wel het meest bijzonder Drosophila melanogaster, is orale toediening van interfererende RNA gemengd met voedsel gen si bevorderdlencing in verschillende insecten 8,17, waaronder A. aegypti volwassenen 18. We beschreven chitosan-nanodeeltjes gemedieerde RNAi in A. gambiae larven 19 en hebben met succes toegepast deze aanpak voor de vermindering van de genexpressie in A. aegypti larven 20,21. Hier, methodologie voor deze RNAi procedure, wat inhoudt dat het insluiten van interfererende RNA door het polymeer chitosan, is gedetailleerd. Chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes worden gevormd door zelf-assemblage van polykationen met interfererende RNA via elektrostatische krachten tussen de positieve ladingen van de aminogroepen van chitosan en negatieve ladingen op de hoofdketen van interfererende RNA 19 van het fosfaat groepen. De beschreven werkwijze is geschikt voor zowel lange dsRNA moleculen (hierna dsRNA) of dubbelstrengs siRNA (hierna siRNA). Na synthese, chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes gemengd met larven eten en afgeleverdlarven bij inslikken. Deze methode is relatief goedkoop, vereist weinig apparatuur en arbeid 19, en faciliteert high-throughput analyse van meerdere fenotypes, met inbegrip van de analyse van het gedrag 20,21. Deze methode, die kan worden aangepast voor gen-silencing studies in andere insecten, waaronder andere vectoren ziekte en insecten landbouwongedierte, zou kunnen worden gebruikt voor gen-silencing in een verscheidenheid van andere diersoorten. Bovendien, chitosan, een goedkope, niet-toxisch en biologisch afbreekbaar polymeer 22, zou kunnen worden gebruikt in het veld soortspecifieke muggen.

<table><tbody><tr><td>0.02 ml pipetteman</td><td>Rainin</td><td>PR20</td><td>voor het opschorten van interfererende RNA</td></tr><tr><td>0.2 ml pipetteman</td><td>Rainin</td><td>PR200</td><td>voor het opschorten van interfererende RNA en de bereiding van interfererende RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>0.5 ml gemaakt buis </td><td>Fischer Scientific</td><td>05-408-120</td><td>voor het opdelen van gesuspendeerd interfererend RNA</td></tr><tr><td>1 ml pipetteman</td><td>Rainin</td><td>PR1000</td><td>voor het opschorten van interfererende RNA en de bereiding van interfererende RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>1.5 ml gemaakt buis </td><td>Fischer Scientific</td><td>05-408-046</td><td>voor de bereiding van interfererende RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>1M Sodium Acetaat, pH 4.5</td><td>TEKnova</td><td>S0299</td><td>om natriumacetaatbuffer te bereiden</td></tr><tr><td>Azijnzuur, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade</td><td>BDH</td><td>VWR BDH3092-500MLP</td><td>om natriumacetaatbuffer te bereiden</td></tr><tr><td>Agarose Genetic Technology Grade</td><td>MP Biomedicals LLC.</td><td>800668</td><td>om bereid interfererend RNA/nanoparticles te coaten</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf AG</td><td>5415D</td><td>om interfererend RNA/nanoparticles te pellen</td></tr><tr><td>Chitosan, uit garnalenschelpen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3646-25G</td><td>om te combineren met interfererend RNA voor de bereiding van interfererend RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>Droge Gist</td><td>Universal Food Corp</td><td>NA</td><td>om voedsel voor muggenlarven met interfererend RNA/nanoparticles te bereiden</td></tr><tr><td>E-RNAi tool</td><td>German Cancer Research Center</td><td>NA</td><td>voor het ontwerp van dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//</td></tr><tr><td>goudvissenvoer</td><td>Wardley</td><td>Goldfish FLAKE FOOD</td><td>om voedsel voor muggenlarven met interfererend RNA/nanoparticles te bereiden</td></tr><tr><td>Verwarmd waterbad</td><td>Thermo Scientific</td><td>51221048</td><td>om het interfererend RNA/nanoparticles op 55oC te verwarmen</td></tr><tr><td>IJs</td><td>niet van toepassing</td><td>niet van toepassing</td><td>voor het ontdooien van interfererend RNA en de bereiding van interfererend RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>IJsemmer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-591-44</td><td>voor het bewaren van ijs dat tijdens de procedure wordt gebruikt</td></tr><tr><td>leverpoeder</td><td>MP Biomedicals LLC.</td><td>900396</td><td>om muggenlarven te voeren na de behandeling met interfererend RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>Magnetron</td><td>Een verscheidenheid aan leveranciers</td><td>niet van toepassing</td><td>om 2% agarose-oplossing te bereiden</td></tr><tr><td>Petrischaal (100 x 15 mm)</td><td>Fischer Scientific</td><td>875713</td><td>voedingskamer voor interfererend RNA/nanoparticles voor larven</td></tr><tr><td>pH-meter</td><td>Mettler Toledo</td><td>S220</td><td>voor het bereiden van buffers</td></tr><tr><td>Schermesje</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-640</td><td>om het interfererend RNA/nanoparticle-pellet voor voedingen te verdelen</td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Thermo Scientific/Dharmacon</td><td>aangepast</td><td>voor de bereiding van siRNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>Natriumsulfaat, watervrij (Na2SO4)</td><td>BDH/verspreid door VWR</td><td>VWR BDH0302-500G</td><td>om 50 mM natriumsulfaatoplossing te bereiden waarin het interfererende RNA zal worden gesuspendeerd</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>VWR</td><td>61066-046</td><td>om de temperatuur van het waterbad te meten</td></tr><tr><td>Tandstokbjes</td><td>VWR</td><td>470146-908</td><td>voor het roeren tijdens de bereiding van interfererend RNA/nanoparticle-voedsel en het snijden van gel-pellets</td></tr><tr><td>Ultralage vriezer</td><td>Een verscheidenheid aan leveranciers</td><td>niet van toepassing</td><td>voor het bewaren van interfererend RNA-aliquots en interfererend RNA/nanoparticles bij -80oC</td></tr><tr><td>Vortexmixer</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-216-108</td><td>voor de bereiding van chitosan/interfererend RNA</td></tr><tr><td>Weegpapier</td><td>Fischer Scientific</td><td>NC9798735</td><td>om het interfererend RNA/nanoparticle-pellet voor voedingen te verdelen</td></tr></tbody></table>

chitosan / interfererende rna nanodeeltjes gemedieerde gen silencing in disease vector muggenlarven

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Vector muggen toebrengen meer menselijk lijden dan enig ander organisme - en doodt elk jaar meer dan een miljoen mensen. De mug genoom projecten gefaciliteerd onderzoek naar nieuwe facetten van mosquito biologie, met inbegrip van functionele genetische studies in de primaire Afrikaanse malaria vector Anopheles gambiae en de dengue en gele koorts vector Aedes aegypti. RNA-interferentie (RNAi-) gemedieerde gene silencing is gebruikt om genen van belang te richten in deze beide ziekteoverbrenger muggensoorten. Hier beschrijven we een werkwijze voor het bereiden van chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes die gecombineerd met voedsel en ingenomen door larven. Deze technisch eenvoudige, high-throughput en relatief goedkope methode, die verenigbaar met lange dubbelstrengs RNA (dsRNA) of kleine interfererende RNA (siRNA) moleculen, is gebruikt voor de succesvolle knock-down van verschillende genen in A. gambiae en A. aegyptilarven. Na larvale voedingen, knock-down, dat wordt gecontroleerd door middel van qRT-PCR of in situ hybridisatie, kunnen aanhouden op zijn minst door de late popstadium. Deze methodologie kan voor allerlei muggen en andere insecten, waaronder landbouwongedierte, evenals andere niet-model organismen. Naast zijn bruikbaarheid bij het onderzoekslaboratorium, in de toekomst, chitosan, een goedkope, niet-toxisch en biologisch afbreekbaar polymeer, zou kunnen worden gebruikt in het veld.

<html> A. gambiae: Chitosan / dsRNA nanodeeltjes worden gevormd als gevolg van de elektrostatische interactie tussen aminogroepen van chitosan en de fosfaatgroepen van dsRNA. De efficiëntie van dsRNA opname in nanodeeltjes is gewoonlijk meer dan 90% zoals gemeten door uitputting van dsRNA uit de oplossing. Atomic force microscopie beelden tonen dat chitosan-dsRNA gemiddelde deeltjesgrootte 140 nm in diameter, variërend 100-200 nm (Figuur 1). <p c...

Hier beschrijven we een werkwijze voor het remmen van genfunctie in ziektedragers muggen door het gebruik van chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes die worden opgenomen door larven.

Chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes gemedieerde gen silencing in Disease Vector muggenlarven

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

Het algemene doel van deze procedure is het ontwerpen en gebruiken van tussin-interfererend RNA-nanodeeltjes voor gene silencing-studies in muggenlarven. Dit wordt bereikt door eerst tussin-interfererend RNA-nanodeeltjes te prepareren door het combineren van chitine en interfererend RNA, gevolgd door verhitting, vortexen en centrifugeren. Het volgende doel is om de nanodeeltjes te mengen met larvenvoer en agarose om gelpellets te bereiden die voer en nanodeeltjes bevatten.Het nanopartikelvoer wordt aan de muggenlarven gevoerd en de larven die zich voeden met het pellet worden geobserveerd, waarna uiteindelijk de gen-silencing wordt geverifieerd middels kwantitatieve real-time polymeraseketenreactie of in C via hybridisatie-assays. Fenotypes met verlies van functie kunnen worden onderzocht.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het onderzoek naar vector-muggen. Zo hebben we deze techniek gebruikt om de functies van genen te bestuderen tijdens de ontwikkeling van het reukstelsel, de middendarm van de hersenen en andere weefsels die van belang zijn voor de vector. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat deze een hoge doorvoer heeft, relatief goedkoop is en minder stressvol is voor het organisme dan het toedienen van interfererend RNA via micro-injectie, wat een hoger vaardigheidsniveau vereist en niet in het veld kan worden toegepast.Samen met postdoctoral fellow Ava Maur zal technicus Ping Lee de procedure demonstreren. Begin met het oplossen van tussin in 0,1 molar natriumacetaatbuffer om een werkoplossing van 0,02% te maken. Bewaar de oplossing bij kamertemperatuur vóór gebruik. Los vervolgens dubbelstrengs RNA of small interfering RNA, beide hierna aangeduid als interfering RNA, op in 50 µL gedeïoniseerd water.Maak een oplossing van 100 µL bestaande uit 32 µg nucleïnezuur per 100 µL 50 mM natriumsulfaat. Voeg vervolgens 100 µL tussin-oplossing toe aan de interfererende RNA-oplossing. Verwarm het mengsel gedurende één minuut in een waterbad op 55 °C.Stel een controle op door 100 µL 50 mM natriumsulfaat toe te voegen aan 100 µL Tustin-oplossing en volg na het verhitten dezelfde procedure. Meng de oplossingen onmiddellijk gedurende 30 seconden door middel van vortexen op hoge snelheid bij kamertemperatuur om de vorming van nanodeeltjes te vergemakkelijken; centrifugeer het mengsel vervolgens 10 minuten bij 13.000 G bij kamertemperatuur, waarna een pellet zichtbaar zou moeten zijn. Draag het supernatant over naar een nieuwe buis van 1,5 mL en laat de pellet ongeveer 10 minuten aan de lucht drogen bij kamertemperatuur voordat deze wordt gebruikt.Om muggenvoer te bereiden met behulp van UV-spectrofotometrie, wordt de concentratie interfererend RNA in het SNAT gemeten door het S-supernatans van de controle als blanco te gebruiken om de totale hoeveelheid interfererend RNA te berekenen die in het SNAT achterblijft. Gebruik het verschil tussen de beginhoeveelheden interfererend RNA en de hoeveelheden die in de supernatanten achterblijven om het percentage interfererend RNA te berekenen dat is ingevangen in de nanodeeltjes. Deze ladingsefficiëntie is normaal gesproken hoger dan 90%. Herhaal dezelfde procedure als er meer nanodeeltjes nodig zijn.Gebruik de gedroogde nanodeeltjes onmiddellijk, aangezien de impact van koude opslag van deeltjes voorafgaand aan het gebruik niet is geëvalueerd. Om eerst het muggenvoedsel te formuleren, bereidt u een 2% agro-oplossing in gedeïoniseerd water en smelt u de aros. Bewaar de gesmolten agro-oplossing in een waterbad van 55 °C vóór gebruik.Meng vervolgens visvoervlokken en droge gist in een verhouding van één op twee. Maal het mengsel met een vijzel en stamper tot kleine deeltjes. Het gemalen voer heeft een bruine kleur.Meng in een buisje van 1,5 milliliter zes milligram gemalen voedsel met de droge nanodeeltjes met behulp van een tandenstoker. Voeg vervolgens 30 microliters van een 2% vooraf gesmolten agros-geloplossing toe aan het mengsel van voedsel en nanodeeltjes. Roer onmiddellijk en grondig met een tandenstoker of een pipetpunt.De gel die voedsel en nanodeeltjes bevat, is nu klaar om aan de muggenlarven van de Anopheles gambiae te worden gevoed. Verwijder één gelpellet uit de 1,5 milliliter buis met een tandenstoker en snijd deze in vier gelijke stukken met een schoon scheermesje of een tandenstoker. Breng vervolgens 23e instar larven over naar een Petrischaal met 100 milliliters gedeïoniseerd water.Voer de muggenlarven door één plakje van de gelpellet toe te voegen. Hak deze uiteindelijk in kleine stukjes per petrischaal. Observeer gedurende vier dagen, één keer per dag, of de larven van de pellet eten; de pellet moet de volgende dag aanzienlijk in omvang zijn afgenomen of volledig verdwenen zijn.Muggen zullen zich ontwikkelen tot het late vierde larvale stadium. Noteer alle zichtbare fenotypische veranderingen tijdens het experiment. Onderzoek de transcriptieniveaus en andere fenotypische veranderingen, zoals beschreven in het tekstprotocol, aan het einde van de periode van vier dagen waarin de eighty-GTI muggenlarven zijn gevoed.Snijd het gelpellet in vier gelijke plakjes met een schoon scheermesje of tandenstoker, zoals eerder beschreven. Plaats vervolgens 50 h gesynchroniseerde 24 uur na het uitkomen van de eieren. Eerst in stervormige larven in een Petrischaal.In ongeveer 40 milliliter gedeïoniseerd water. Voer de larven één schijfje per Petrischaal gedurende vier uur per dag. Opnieuw dient het schijfje fijngehakt te worden in kleinere stukjes.Breng de larven vervolgens voor de rest van de dag terug naar het reguliere larvenvoedsel, bestaande uit een verhouding van twee op één gemalen visvoervlokken en droge gist. Herhaal deze procedure dagelijks gedurende de vier larvale stadia. Onderzoek de transcriptieniveaus en andere fenotypische veranderingen, zoals beschreven in het tekstprotocol, op het gewenste tijdstip van ontwikkeling.De hier getoonde punten zijn van een controle-gevoede vierde instars An. gambiae-larve die er normaal uitziet, zoals verwacht. Echter, de peritrofische matrix is verstoord in larven die gevoed zijn met chitine-interfererend RNA gericht tegen chitinesynthase 1, zoals blijkt uit dextranblauw, dat is gelekt in de maag. Normale expressie van orco, de obligate geurreceptor-coreceptor, wordt waargenomen in de antennes van controle-gevoede vierde instars Ae. aegypti-larven.In tegenstelling hiermee is de Orco-expressie afwezig bij dieren die zijn gevoed met interfererend RNA gericht tegen het single-minded-gen, in vergelijking met de gevoede controledieren. Dieren met een knockdown van single-minded vertonen defect geurtrackingsgedrag. Na het bekijken van deze video zou men een goed begrip moeten hebben van hoe Keon interfererend RNA-nanodeeltjes kunnen worden gebruikt om genen te silencen tijdens de ontwikkeling van de vectormug.Deze techniek, die mogelijk kan worden uitgebreid naar de studie van volwassen muggen of andere opkomende modelorganismen, heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers om de functies van genen te verkennen die zijn geïdentificeerd in genoomprojecten van de mug als ziektevector.

chitosaninterfering-rna-nanoparticle-mediated-gene-silencing-disease

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Omgekeerde genetische benaderingen hebben bewezen zeer nuttig voor het bepalen van welke genen de basis liggen van resistentie tegen pathogenen in vector muggen. Deze video protocol illustreert een methode die wordt gebruikt door de Dimopoulos lab dsRNA injecteren in Anopheles gambiae muggen die de malariaparasiet haven. De techniek het manipuleren van de injectie installatie en het injecteren van dsRNA in de thorax wordt geïllustreerd.

Protocol voor RNAi Testen in volwassen muggen (A. gambiae)

In dit protocol combineren we RNAi-gemedieerde gensilencing...

RNAi-gemedieerde Gene Knockdown en<em&gt; In Vivo</em&gt; Urineproductie Assay in het volwassenenonderwijs Vrouw<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Muggen

RNA-interferentie (RNAi) is een uiterst waardevol hulpmiddel voor het onthullen van genfunctie. De mogelijkheid om genen te targeten met behulp van RNAi tijdens pre-adulte stadia is echter beperkt in de belangrijkste menselijke malariavector Anopheles gambiae. We beschrijven een RNAi-protocol om genfunctie te verminderen via directe injectie tijdens de popontwikkeling.

RNAi Trigger delivery in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Poppen

Wij rapporteren met behulp van een kunstmatige intronic kleine RNA expressie strategie te ontwikkelen van een niet-defecte recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo uitvoeringssysteem. Een gedetailleerde procedure voor de bouw, de verpakking en de kwantitatieve analyse van de rAaeDV vectoren evenals wat larvale infectie wordt beschreven.

Gebruik van een Recombinant Mosquito Densovirus als een gen levering Vector voor de functionele analyse van genen in muggenlarven

Dit manuscript toont de uitputting van de genexpressie in de middendarm van de Duitse kakkerlak via orale inname van double-stranded RNA ingekapseld in liposomen.

Praktisch gebruik van RNA-interferentie: mondelinge levering van Double-stranded RNA in liposomen dragers voor kakkerlakken

Dit artikel demonstreert nieuwe technieken ontwikkeld voor mondelinge levering van double-stranded RNA (dsRNA) via de vaatbundels weefsels van planten voor RNA-interferentie (RNAi) in het floëem sap voederen van insecten.

Double-stranded RNA orale afleveringsmethoden voor het opwekken van RNA-interferentie in het floëem en Hemipteran insecten Plant-sap-voeding

Dit protocol beschrijft een microinjection methodologie die we hebben gestandaardiseerd en gebruikt jarenlang voor bepaalde hoeveelheden van nucleïnezuren rechtstreeks naar de Hemolymfe van muggen en huis vliegt. Dit protocol resulteert in minimale injectie sterfte en laat dosis gecorreleerd metingen van vruchtbaarheid.

Reproduceerbaar dsRNA Microinjection en Oviposition Bioassay in muggen en huis vliegt

De orale toediening van dsRNA geproduceerd door bacteriën, een toedieningsmethode voor RNA-interferentie (RNAi) die routinematig wordt gebruikt bij Caenorhabditis elegans, werd hier met succes toegepast op volwassen muggen. Onze methode maakt robuuste omgekeerde geneticastudies en transmissieblokkerende vectorstudies mogelijk zonder het gebruik van injectie.

Effectieve orale RNA-interferentie (RNAi) toediening aan volwassen Anopheles gambiae muggen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de afgifte van chitosan/dsRNA-nanodeeltjes in larven van zijderups Bombyx mori om genuitschakeling te induceren door inslikken.

Larvale RNA-interferentie in zijderups Bombyx mori door Chitosan/dsRNA-afgifte van nanodeeltjes

Beschrijving van een virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) methode voor de knock-down van genexpressie...

Virus-geïnduceerde gen silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana En Tomaat

Leer gen-silencing in ziektevector muggenlarven met chitosan/interfererende RNA nanodeeltjes. Deze methode maakt efficiënt onderzoek naar genfunctie mogelijk in vivo.

Chitosan / interfererende RNA nanodeeltjes gemedieerde gen silencing in Disease Vector muggenlarven

Meer video's verkennen