Een protocol voor Lentiviral Transduction en Downstream Analyse van Intestinale Organoids
20 april 2015
In dit videoprotocol geven we een stapsgewijze uitleg van lentivirale transductie in organoïden van primair darm epitheel en van verwerking en downstream analyse van deze culturen door kwantitatieve RT-PCR, RNA-microarray en immunohistologie.
Het algemene doel van deze procedure is om stabiel getransduceerde organoïden te genereren uit primair muizen darm epitheel voor downstream analyse van darm organoïden. Dit wordt bereikt door eerst HEC 2 93 T cellen te transfecteren met lentivirale verpakkingsvectoren en een lentiviraal plasmide, dat het gen van belang codeert om hoge titerlosivirale deeltjes te produceren. De tweede stap is om gekweekte muizen darm organoïden voor te behandelen met een aantal groeifactoren om cystische hyperproliferatieve crypten te verkrijgen.
Vervolgens worden de organoïden getransduceerd met de hoge titerlosivirus en worden de getransduceerde organoïden in matrigel geïncubeerd. De laatste stap is om volledig gegroeide getransduceerde organoïden in paraffine in te bedden voor downstream immunohistochemische analyse. Uiteindelijk wordt lentivirale organoïd transductie gebruikt om genetische veranderingen te genereren in een in vitro model van het darm epitheel dat betrouwbaar, reproduceerbaar en snel is.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals kankercellijnen, is dat organoïden niet-gemutateerd verplaatste stamcelhiërarchie zijn. In tekstcellulaire polarisatie, kan het differentiëren in alle verschillende celtypen van het kleine darm epitheel. Bovendien kunnen getransduceerde organoïden worden gebruikt om specifieke genetische elementen te bestuderen, waardoor ze het gebruik van transgene muizen en facetten van kosten en snelheid overtreffen.
De productie van lentivirale deeltjes is een vijfdaags protocol dat begint met het splitsen van HEC 2 93 T cellen tot 60 tot 80%co fluentie in een 162 vierkante centimeter fles in celcultuur medium. Incubeer de cellen een nacht in een bevochtigde celcultuur incubator op 37 graden Celsius de volgende dag. Bereid de DNA transfectieoplossing en de polyethyleen amine of PEI transfectieoplossing voor zoals beschreven in de protocoltekst.
Voeg de DNA transfectieoplossing toe aan de PEI oplossing, draai om of draai een aantal keer en incubeer gedurende vijf minuten. Bij kamertemperatuur. Laat twee milliliter van de DNA TRANSFECTIE plus PEI oplossing druppelen op de HEC 2 93 T cellen en incubeer gedurende vier uur bij 37 graden Celsius na vier uur.
Ververs het kweekmedium. Om de PEI te verwijderen, incubeer de cellen gedurende twee dagen op 37 graden Celsius op dag vier, verzamel het supernatant in een 50 milliliter buis. Voeg nieuw kweekmedium toe aan de cellen en breng de fles terug naar de incubator. Centrifugeer het verzamelde supernatant bij 500 Gs gedurende vijf minuten.
Om dode cellen te verwijderen, gebruik dan een grote 60 milliliter spuit om de SUPERNAT door een 0,45 micrometer filter te duwen. Bewaar de gefilterde supernat een nacht op vier graden Celsius de volgende dag. Verzamel, centrifugeer en filter de tweede batch van supernatant zoals voor de eerste batch is getoond.
Verzamel de twee batches van supernatant in ultracentrifuge buizen. Centrifugeer gedurende 90 minuten bij 50.000 GS. Wanneer de centrifugatie voltooid is, verwijder de capsules met de ultracentrifuge buizen zeer voorzichtig en plaats ze in een laminaire stromingskast.
Open de capsule die de ultracentrifugebuis vasthoudt en decant het medium voorzichtig met de pellet aan de bovenzijde van de buis. Het is belangrijk om te onthouden welke kant van de buis de pellet zou hebben gevormd, omdat virale pellets moeilijk te visualiseren kunnen zijn. Gebruik vervolgens een micropipet om het laatste beetje medium te verwijderen zonder de ondoorzichtige bruine pellet die zichtbaar is aan de zijkant van de bodem van de ultracentrifugebuis te agiteren.
Resuspendeer deze pellet in 500 microliter organoïd kweekmedium gesupplementeerd met nicotinamide kinase remmers en poly hersenresus. Suspenderen in dit medium is belangrijk omdat hoog titer virus direct wordt gebruikt voor transductie van organoïden twee dagen vóór transductie. Splits een volledige 0,95 vierkante centimeter put met organoïden in een nieuwe put van een 48 welplaat.
Volg een eerder gepubliceerd protocol. Streef ernaar om ongeveer 50 kleine organoïden in organoïd kweekmedium te verkrijgen. Medium gesupplementeerd met een glycogeensynthase kinase remmer en nicotinamide.
Om cystische hyperproliferatieve crypten te verkrijgen. Incubeer de organoïden gedurende twee dagen op de dag van transductie. Haal de organoïden met een P 1000 micropipet. Pipet het matra gel en medium op en neer, waardoor het mengsel wordt verstoord.
Plaats het mengsel in een 15 milliliter buis. Verstoor het mengsel verder met behulp van een PEs jouw pipet waarvan de distale opening is verminderd door smelten. Pellet de organoïden door centrifugeren bij 100 Gs gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens het supernatant bij 500 microliter van voorverwarmde één x trypsine en resuspendeer de organoïden. Incubeer gedurende drie minuten.
In een 37 graden Celsius waterbad, inactiveer de trypsine door 3,5 milliliter cellijn kweekmedium toe te voegen en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 500 Gs.Verwijder de super natan om de pellet in ongeveer 20 microliter medium te laten. Breng de organoïden over in deze laatste kleine hoeveelheid medium in een put.
Op een 48 welplaat. Voeg het eerder bereide hoge titerlosivirus in transductiemedium toe aan de organoïden en resuspendeer. Incubeer het organoïd virusmengsel gedurende één uur bij 37 graden Celsius in een kweekincubator om transductie mogelijk te maken. Na één uur, voeg één milliliter organoïd kweekmedium toe aan het organoïd virusmengsel, resuspendeer en breng het mengsel over in een micro centrifugeerbuis en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 850 GS.
Om de organoïden te pelleten, verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet. In 20 microliter ijskoud matra gel, plaats de druppel in het midden van een put. In een 48 welplaat en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius.
Voordat de druppel na 15 minuten stolt. Voeg voorzichtig 250 microliter organoïd kweekmedium toe, gesupplementeerd met nicotinamide en kinase remmers.
Verwarm een aluminium blok voor in een incubator bij 70 graden Celsius om de paraffine vloeibaar te houden. Verwijder het medium uit een enkele put met volledig gegroeide organoïden, laat de ingebed
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit videoprotocol biedt een gedetailleerde uitleg over lentivirale transductie in organoïden afgeleid van primair darmepitheel. Het beschrijft de verwerking en downstream-analyse van deze culturen met behulp van kwantitatieve RT-PCR, RNA-microarray en immunohistochemie.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Genetische modificatie
Achtergrond
- Lentivirale transductie is een methode die wordt gebruikt om genetisch materiaal in cellen te introduceren.
- Organoïden zijn 3D-structuren die de architectuur en functionaliteit van organen nabootsen.
- Primaire darmepitheel-organoïden zijn waardevol voor het bestuderen van de darmbiologie.
- Downstream analysetechnieken zijn essentieel voor het valideren van genetische modificaties.
Doel van de studie
- Om stabiel getransduceerde organoïden te genereren voor onderzoek naar het darmepitheel.
- Om genetische alteraties in een in vitro-model mogelijk te maken.
- Om betrouwbare en reproduceerbare studies naar de darmbiologie te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Transfectie van HEK 293 T-cellen met lentivirale verpakkingsvectoren.
- Productie van lentivirale partikels met een hoge titer.
- Voorbehandeling van organoïden met groeifactoren.
- Transductie van organoïden met lentivirus en incubatie in matrigel.
- Inbedding van organoïden in paraffine voor immunohistochemie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van genetisch gemodificeerde intestinale organoïden.
- Validatie van de transductie-efficiëntie via kwantitatieve RT-PCR.
- Analyse van genexpressie met behulp van RNA-microarray.
- Immunohistochemische karakterisering van organoïde-structuren.
Conclusies
- Lentivirale transductie is een effectieve methode voor het modificeren van intestinale organoïden.
- Deze aanpak biedt een betrouwbaar model voor het bestuderen van de biologie van het intestinale epitheel.
- De beschreven methoden kunnen worden toegepast op diverse genetische studies in organoïden.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Lentivirale transductie van intestinale organoïden maakt snelle, kosteneffectieve functionele genomica mogelijk in een fysiologisch relevant in vitro-model, waardoor de afhankelijkheid van transgene muismodellen wordt verminderd. Deze aanpak ondersteunt target-validatie en mechanische risicoreductie door nauwkeurige genetische manipulatie toe te staan in een systeem dat de hiërarchie van intestinale stamcellen, polariteit en gedifferentieerde celtypen behoudt. Het protocol biedt een schaalbare workflow voor het genereren van stabiele genetische wijzigingen die geschikt zijn voor downstream kwantitatieve analyse, wat de ontdekkingen in de gastro-intestinale biologie en aanverwante therapeutische gebieden versnelt.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk via induceerbare transgene expressie of shRNA-gemedieerde knockdown in intestinale organoïden.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie door genetische perturbaties te modelleren in een op het natuurlijke weefsel lijkende epitheliale architectuur.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in de resultaten van targetmodulatie door homeostatische differentiatie en celpolariteit te behouden.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert getransduceerde organoïdepopulaties die geschikt zijn voor kwantitatieve RT-PCR, RNA-microarray en immunohistochemische analyses.
- Operationele waarde: Standaardiseert de preparatie van organoïden via voorbehandeling met groeifactoren om cystische hyperproliferatieve crypten te genereren voor een consistente transductie.
- Klaarheid voor assay: Maakt betrouwbare screeningplatforms voor verbindingen of genetica mogelijk met behulp van fluorescerende of immunohistochemische reporters zoals EGFP.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Behoudt de ziekte-relevante biologie van het darmepitheel, wat extrapolatie naar in vivo modellen ondersteunt.
- Preklinisch nut: Faciliteert analyse die is afgestemd op biomarkers via downstreamverwerking voor de detectie van eiwitten en nucleïnezuren.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Maakt iteratieve cycli van genetische modificatie mogelijk om targets te ontrisken vóór in vivo validatie.
Integratie van pipeline & workflow
De methode wordt geïntegreerd in vroege discovery-workflows door genetische perturbatiestudies mogelijk te maken die bijdragen aan targetselectie en lead-optimalisatie, waarbij de resultaten via moleculaire en histologische profilering worden ingezet voor preklinische validatie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen via induceerbare overexpressie of knockdown van genen van belang in een gepolariseerd epitheliaal systeem.
- Screening: Biedt een transductie-efficiëntie die geschikt is voor schaalbare readouts middels qPCR, microarray of IHC zonder dat selectiemarkers vereist zijn.
- Analytics: Genereert kwantitatieve nucleïnezuur- en eiwitexpressiegegevens om genetische condities te vergelijken en de fenotypische impact te beoordelen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt genetische modificaties met functionele readouts in een weefselachtige context, wat correlatie van biomarkers ondersteunt.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor lentivirale modulatie van meerdere targets in modellen voor darmziekten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door genetische effecten te modelleren in een niet-getransformeerd, fysiologisch accuraat epitheliaal systeem.
- Operationele waarde: Waarborgt de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde lentivirale productie en organoïde-voorbehandelingsstappen.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door de tijdlijnen voor targetvalidatie te versnellen vergeleken met transgene benaderingen.
- Impact op de portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van functionele resultaten in een menselijk relevant weefselsurrogaat.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de productie van lentivirale vectoren, organoïdenkweek en histologische verwerking.
- Afhankelijk van toegang tot ultracentrifugatie, fluorescentiemicroscopie en infrastructuur voor paraffine-inbedding.
- Vereist cross-team standaardisatie tussen de afdelingen virologie, celkweek en histologie voor consistente resultaten.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij uitbreiding naar colon-organoïden of systemen afgeleid van ziektemodellen.
- Beperkt door de opbrengst van organoïden en de gevoeligheid voor enzymatische dissociatiestappen tijdens de verwerking.
