Een protocol voor Lentiviral Transduction en Downstream Analyse van Intestinale Organoids
April 20th, 2015
In dit videoprotocol geven we een stapsgewijze uitleg van lentivirale transductie in organoïden van primair darm epitheel en van verwerking en downstream analyse van deze culturen door kwantitatieve RT-PCR, RNA-microarray en immunohistologie.
Het algemene doel van deze procedure is om stabiel getransduceerde organoïden te genereren uit primair muizen darm epitheel voor downstream analyse van darm organoïden. Dit wordt bereikt door eerst HEC 2 93 T cellen te transfecteren met lentivirale verpakkingsvectoren en een lentiviraal plasmide, dat het gen van belang codeert om hoge titerlosivirale deeltjes te produceren. De tweede stap is om gekweekte muizen darm organoïden voor te behandelen met een aantal groeifactoren om cystische hyperproliferatieve crypten te verkrijgen.
Vervolgens worden de organoïden getransduceerd met de hoge titerlosivirus en worden de getransduceerde organoïden in matrigel geïncubeerd. De laatste stap is om volledig gegroeide getransduceerde organoïden in paraffine in te bedden voor downstream immunohistochemische analyse. Uiteindelijk wordt lentivirale organoïd transductie gebruikt om genetische veranderingen te genereren in een in vitro model van het darm epitheel dat betrouwbaar, reproduceerbaar en snel is.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals kankercellijnen, is dat organoïden niet-gemutateerd verplaatste stamcelhiërarchie zijn. In tekstcellulaire polarisatie, kan het differentiëren in alle verschillende celtypen van het kleine darm epitheel. Bovendien kunnen getransduceerde organoïden worden gebruikt om specifieke genetische elementen te bestuderen, waardoor ze het gebruik van transgene muizen en facetten van kosten en snelheid overtreffen.
De productie van lentivirale deeltjes is een vijfdaags protocol dat begint met het splitsen van HEC 2 93 T cellen tot 60 tot 80%co fluentie in een 162 vierkante centimeter fles in celcultuur medium. Incubeer de cellen een nacht in een bevochtigde celcultuur incubator op 37 graden Celsius de volgende dag. Bereid de DNA transfectieoplossing en de polyethyleen amine of PEI transfectieoplossing voor zoals beschreven in de protocoltekst.
Voeg de DNA transfectieoplossing toe aan de PEI oplossing, draai om of draai een aantal keer en incubeer gedurende vijf minuten. Bij kamertemperatuur. Laat twee milliliter van de DNA TRANSFECTIE plus PEI oplossing druppelen op de HEC 2 93 T cellen en incubeer gedurende vier uur bij 37 graden Celsius na vier uur.
Ververs het kweekmedium. Om de PEI te verwijderen, incubeer de cellen gedurende twee dagen op 37 graden Celsius op dag vier, verzamel het supernatant in een 50 milliliter buis. Voeg nieuw kweekmedium toe aan de cellen en breng de fles terug naar de incubator. Centrifugeer het verzamelde supernatant bij 500 Gs gedurende vijf minuten.
Om dode cellen te verwijderen, gebruik dan een grote 60 milliliter spuit om de SUPERNAT door een 0,45 micrometer filter te duwen. Bewaar de gefilterde supernat een nacht op vier graden Celsius de volgende dag. Verzamel, centrifugeer en filter de tweede batch van supernatant zoals voor de eerste batch is getoond.
Verzamel de twee batches van supernatant in ultracentrifuge buizen. Centrifugeer gedurende 90 minuten bij 50.000 GS. Wanneer de centrifugatie voltooid is, verwijder de capsules met de ultracentrifuge buizen zeer voorzichtig en plaats ze in een laminaire stromingskast.
Open de capsule die de ultracentrifugebuis vasthoudt en decant het medium voorzichtig met de pellet aan de bovenzijde van de buis. Het is belangrijk om te onthouden welke kant van de buis de pellet zou hebben gevormd, omdat virale pellets moeilijk te visualiseren kunnen zijn. Gebruik vervolgens een micropipet om het laatste beetje medium te verwijderen zonder de ondoorzichtige bruine pellet die zichtbaar is aan de zijkant van de bodem van de ultracentrifugebuis te agiteren.
Resuspendeer deze pellet in 500 microliter organoïd kweekmedium gesupplementeerd met nicotinamide kinase remmers en poly hersenresus. Suspenderen in dit medium is belangrijk omdat hoog titer virus direct wordt gebruikt voor transductie van organoïden twee dagen vóór transductie. Splits een volledige 0,95 vierkante centimeter put met organoïden in een nieuwe put van een 48 welplaat.
Volg een eerder gepubliceerd protocol. Streef ernaar om ongeveer 50 kleine organoïden in organoïd kweekmedium te verkrijgen. Medium gesupplementeerd met een glycogeensynthase kinase remmer en nicotinamide.
Om cystische hyperproliferatieve crypten te verkrijgen. Incubeer de organoïden gedurende twee dagen op de dag van transductie. Haal de organoïden met een P 1000 micropipet. Pipet het matra gel en medium op en neer, waardoor het mengsel wordt verstoord.
Plaats het mengsel in een 15 milliliter buis. Verstoor het mengsel verder met behulp van een PEs jouw pipet waarvan de distale opening is verminderd door smelten. Pellet de organoïden door centrifugeren bij 100 Gs gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens het supernatant bij 500 microliter van voorverwarmde één x trypsine en resuspendeer de organoïden. Incubeer gedurende drie minuten.
In een 37 graden Celsius waterbad, inactiveer de trypsine door 3,5 milliliter cellijn kweekmedium toe te voegen en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 500 Gs.Verwijder de super natan om de pellet in ongeveer 20 microliter medium te laten. Breng de organoïden over in deze laatste kleine hoeveelheid medium in een put.
Op een 48 welplaat. Voeg het eerder bereide hoge titerlosivirus in transductiemedium toe aan de organoïden en resuspendeer. Incubeer het organoïd virusmengsel gedurende één uur bij 37 graden Celsius in een kweekincubator om transductie mogelijk te maken. Na één uur, voeg één milliliter organoïd kweekmedium toe aan het organoïd virusmengsel, resuspendeer en breng het mengsel over in een micro centrifugeerbuis en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 850 GS.
Om de organoïden te pelleten, verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet. In 20 microliter ijskoud matra gel, plaats de druppel in het midden van een put. In een 48 welplaat en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius.
Voordat de druppel na 15 minuten stolt. Voeg voorzichtig 250 microliter organoïd kweekmedium toe, gesupplementeerd met nicotinamide en kinase remmers.
Verwarm een aluminium blok voor in een incubator bij 70 graden Celsius om de paraffine vloeibaar te houden. Verwijder het medium uit een enkele put met volledig gegroeide organoïden, laat de ingebed
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit videoprotocol biedt een gedetailleerde uitleg van lentivirale transductie in organoïden afgeleid van primair darm epitheel. Het beschrijft de verwerking en downstream analyse van deze culturen met behulp van kwantitatieve RT-PCR, RNA-microarray en immunohistologie.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Genetische manipulatie
Achtergrond
- Lentivirale transductie is een methode die wordt gebruikt om genetisch materiaal in cellen te introduceren.
- Organoïden zijn 3D-structuren die de architectuur en functionaliteit van organen nabootsen.
- Primaire darm epitheel organoïden zijn waardevol voor het bestuderen van darmbiologie.
- Downstream analysetechnieken zijn essentieel voor het valideren van genetische modificaties.
Doel van het onderzoek
- Om stabiel getransduceerde organoïden te genereren voor onderzoek naar darm epitheel.
- Om genetische veranderingen in een in vitro model mogelijk te maken.
- Om betrouwbare en reproduceerbare studies van darmbiologie te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Transfectie van HEC 2 93 T cellen met lentivirale verpakkingsvectoren.
- Productie van lentivirale deeltjes met een hoog titer.
- Prebehandeling van organoïden met groeifactoren.
- Transductie van organoïden met lentivirus en incubatie in matrigel.
- Inbedding van organoïden in paraffine voor immunohistologie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van genetisch gemodificeerde darm organoïden.
- Validatie van transductie-efficiëntie door middel van kwantitatieve RT-PCR.
- Analyse van genexpressie met behulp van RNA-microarray.
- Immunohistochemische karakterisering van organoïdstructuren.
Conclusies
- Lentivirale transductie is een effectieve methode voor het modificeren van darm organoïden.
- Deze aanpak biedt een betrouwbaar model voor het bestuderen van darm epitheel biologie.
- De beschreven methoden kunnen worden toegepast op verschillende genetische studies in organoïden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Lentiviral transduction of intestinal organoids enables rapid, cost-effective functional genomics in a physiologically relevant in vitro model, reducing reliance on transgenic mouse models. This approach supports target validation and mechanistic de-risking by allowing precise genetic manipulation in a system that maintains intestinal stem cell hierarchy, polarity, and differentiated cell types. The protocol provides a scalable workflow for generating stable genetic alterations suitable for downstream quantitative analysis, accelerating discovery in gastrointestinal biology and related therapeutic areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through inducible transgene expression or shRNA-mediated knockdown in intestinal organoids.
- Operational Value: Supports functional target validation by modeling genetic perturbations in a native-like epithelial architecture.
- Predictive Value: Increases confidence in target modulation outcomes by preserving homeostatic differentiation and cell polarity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces transduced organoid populations suitable for quantitative RT-PCR, RNA-microarray, and immunohistochemistry readouts.
- Operational Value: Standardizes organoid preparation via growth factor pretreatment to generate cystic hyperproliferative crypts for consistent transduction.
- Assay Readiness: Enables reliable compound or genetic screening platforms using fluorescent or immunohistochemical reporters like EGFP.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease-relevant intestinal epithelium biology, supporting extrapolation to in vivo models.
- Preclinical Utility: Facilitates biomarker-aligned analysis through downstream processing for protein and nucleic acid detection.
- Risk-Adjusted Advancement: Allows iterative genetic modification cycles to de-risk targets before in vivo validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling genetic perturbation studies that inform target selection and lead optimization, with outputs feeding into preclinical validation through molecular and histological profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via inducible overexpression or knockdown of genes of interest in a polarized epithelial system.
- Screening: Delivers transduction efficiency suitable for scalable readouts using qPCR, microarray, or IHC without requiring selection markers.
- Analytics: Generates quantitative nucleic acid and protein expression data to compare genetic conditions and assess phenotypic impact.
- Translational Research: Connects genetic modifications to functional readouts in a tissue-like context, supporting biomarker correlation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for lentiviral-mediated modulation across multiple targets in intestinal disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by modeling genetic effects in a non-transformed, physiologically accurate epithelial system.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized lentiviral production and organoid pretreatment steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by accelerating target validation timelines versus transgenic approaches.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional outcomes in a human-relevant tissue surrogate.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral vector production, organoid culture, and histological processing.
- Depends on access to ultracentrifugation, fluorescence microscopy, and paraffin embedding infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization between virology, cell culture, and histology units for consistent results.
- Involves adaptation considerations when extending to colonic organoids or disease-model-derived systems.
- Limited by organoid yield and sensitivity to enzymatic dissociation steps during processing.
