Name: Een protocol voor Lentiviral Transduction en Downstream Analyse van Intestinale Organoids (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Leer lentivirale transductie van darmorganoids voor genetische modificatie met RT-PCR en immunohistochemie. Deze methode biedt een betrouwbaar in vitro model voor darmepitheelonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J. Heijmans wordt ondersteund door een stipendium van de Nederlandse Kanker Foundation (KWF). G.R. van den Brink wordt ondersteund door financiering van de European Research Council in het kader van het zevende kaderprogramma (FP7/2007-2013)/European Research Council subsidieovereenkomstnummer 241344 en door een VIDI-subsidie van de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (GvdB).

1. Preparatie van Polyethylenimine (PEI) als Transfectie Reagens
<ol>
	<li>Los ongeveer 150 mg PEI op in 100 ml H2O.</li>
	<li>Pas de oplossing aan naar pH 7,4 door HCl toe te voegen totdat de oplossing helder wordt en roer tot het volledig is opgelost. Dit kan tussen de 10 en 60 minuten duren en voeg water toe tot een eindconcentratie van 1 mg/ml.</li>
	<li>Wanneer het helder is, filter de PEI-oplossing door een steriele 0,22 µm filter en bewaar in een -80 °C vrieskast in aliquoten van 5 ml.</li>
</ol>
2. Productie van Lentivirale Deeltjes
Dag 1:
<ol>
	<li>Splits HEK293T cellen tot 60%-80% confluency in 162 cm2 flacon of grote petrischaal in cellijncultuurmedium (DMEM gesupplementeerd met 10% FCS, 1% penicilline/streptomycine en 2 mM glutamine supplement).</li>
</ol>
Dag 2:
<ol start="2">
	<li>Bereid een DNA-transfectieoplossing voor die 45 µg totaal plasmide DNA bevat door lentivirale verpakkingsvectoren (7 µg van pVSVg; 5 µg van pRSV rev; 13 µg van pMDL) en 20 µg van lentiviraal plasmide dat het gen van belang of shRNA van belang codeert samen te voegen. Breng aan op een volume van 1 ml met behulp van DMEM.</li>
	<li>Bereid een PEI-transfectieoplossing voor door 90 µl van 1 mg/ml PEI toe te voegen aan 930 µl DMEM en incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voeg de DNA-transfectieoplossing toe aan de PEI-oplossing. Vortex of draai een aantal keer om en incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur om een DNA-transfectieoplossing te verkrijgen.</li>
	<li>Druppel 2 ml van de DNA-transfectieoplossing op de HEK293T cellen en incubeer gedurende 4 uur in een bevochtigde celcultuur incubator op 37 °C.</li>
	<li>Na 4 uur ververs het kweekmedium om PEI te verwijderen. Het is niet nodig om cellen te wassen voordat nieuw medium wordt toegevoegd. 
	OPMERKING: PEI is cytotoxisch en incubatietijden langer dan 4 uur kunnen schade aan de HEK293T cellen veroorzaken.</li>
</ol>
Dag 4:
<ol start="7">
	<li>Vervang het supernatant met nieuw kweekmedium. Bewaar het supernatant (dat virus bevat); dit zal worden gebruikt in stap 2.10.</li>
	<li>Plaats het supernatant in een 15 ml flacon. Om dode cellen te verwijderen, centrifugeer gedurende 5 min bij 500 x g.</li>
	<li>Duw het supernatant door een 0,45 µm filter met behulp van een grote 60 ml spuit. Bewaar overnacht bij 4 °C.</li>
</ol>
Dag 5:
<ol start="10">
	<li>Verzamel de tweede batch van supernatant; centrifugeer en filter zoals in stappen 2.8-2.9.</li>
	<li>Verzamel de supernatanten uit stappen 2.9 en 2.10 in ultracentrifugebuizen en centrifugeer gedurende 90 min bij 50.000 x g in een ultracentrifuge.</li>
	<li>Haal de capsules met de ultracentrifugebuizen heel voorzichtig eruit en plaats ze in een laminaire flow kast, onthoud de oriëntatie van de buis binnenin de centrifuge.</li>
	<li>Open de capsule die de ultracentrifugebuis bevat en decant het medium voorzichtig op een manier dat het pellet aan de bovenkant van de buis ligt. Aangezien virale pellets moeilijk te visualiseren kunnen zijn, onthoud aan welke kant van de buis een pellet zich zal hebben gevormd. Neem een micropipet en verwijder het laatste beetje medium terwijl u ervoor zorgt dat u het ondoorzichtige bruine pellet dat zichtbaar is aan de zijkant van de bodem van de ultracentrifugebuis niet schudt.</li>
	<li>Resuspendeer dit pellet in 500 µl van organoïdcultuurmedium gesupplementeerd met 10 mM nicotinamide, 10 µM Chir99021, 10 µM Y27632 en 8 µg/ml polybreen. Resuspendering in dit medium is belangrijk omdat hoog titer virus wordt gebruikt om organoïds direct te transducteren.</li>
	<li>Optioneel: bevries het virus in dit medium gealiquoteerd in twee batches van 250 µl bij -80 °C.</li>
</ol>
3. Lentivirale Transductie van Organoïden
Dag 0:
<ol>
	<li>Splits een volledige 0,95 cm2 put van organoïds twee dagen voor transductie in een nieuwe put, met als doel ongeveer 50 kleine organoïds te verkrijgen. Splits organoïds volgens een eerder gepubliceerd protocol1 (Figuur 3A, B).</li>
	<li>Supplemereer organoïdcultuurmedium met 10 µM Chir99021 en 10 mM nicotinamide om cystische hyperproliferatieve crypts te verkrijgen (Figuur 3C). 
	OPMERKING: Cystische crypts zullen het beste ontwikkelen wanneer vers gespleten organoïds in aanwezigheid van Chir99021 worden gekweekt.</li>
</ol>
Dag 2:
<ol start="3">
	<li>Verzamel organoïds door matrigel en medium op en neer te pipetten, waardoor het mengsel wordt verstoord met een p1000 micropipet. Plaats het mengsel in een 15 ml buis.</li>
	<li>Verstoor verder met behulp van een Pasteur pipet waarvan de distale opening is verkleind door smelten. Centrifugeer organoïds tot pellet gedurende 5 min bij 100 x g. 
	OPMERKING: Afhankelijk van de grootte van de centrifuge, gebruik een andere centrifugeersnelheid. Het is noodzakelijk om de exacte snelheid te vinden waarbij verstoorde organoïds worden gescheiden van het mengsel.</li>
	<li>Verwijder het

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Al-Nafussi, A. I., Wright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+epidermal+growth+factor+%28EGF%29+on+cell+proliferation+of+the+gastrointestinal+mucosa+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv.+B%2C+Cell+Pathology+Including+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">The effect of epidermal growth factor (EGF) on cell proliferation of the gastrointestinal mucosa in rodents.</a> Virchows Archiv. B, Cell Pathology Including Molecular Pathology. 40 (1), 63-69 (1982).</li>
<li>Haramis, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+crypt+formation+and+juvenile+polyposis+on+BMP+inhibition+in+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine.</a> Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin1%2C+a+novel+intestinotrophic+mitogen%2C+ameliorates+experimental+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice.</a> Gastroenterology. 132 (4), 1331-1343 (2007).</li>
<li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+BAC+transgenic+epithelial+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Generation of BAC transgenic epithelial organoids.</a> PLoS One. 8 (10), e76871(2013).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).</li>
<li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Rep. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li>
<li>Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+murine+leukemia+virus+DNA+depends+on+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis.</a> The EMBO Journal. 12 (5), 2099-2108 (1993).</li>
<li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476 (7360), 293-297 (2011).</li>
<li>Bahnson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+enhancement+of+retroviral+mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer.</a> Journal Of Virological Methods. 54 (2-3), 131-143 (1995).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het huidige videoprotocol beschrijft lentivirale transductie van organoïden van primair darmepitheel en downstream-analyse van deze organoïden met behulp van kwantitatieve RNA-technieken en immunohistochemie.
Lentivirale transductie wordt vaak uitgevoerd in aangehechte of zwevende cellen in kweekplaten. Omdat de driedimensionale structuur van organoïden ze moeilijk doordringbaar maakt voor virale deeltjes, worden verschillende methoden gebruikt om de efficiëntie te verhogen. Prebehandeling van...

Het intestinale epitheel is een van de snelst proliferatieve weefsels in het lichaam, wat ervoor heeft gezorgd dat het veel interesse heeft getrokken in onderzoek naar kanker en stamcellen. In 2009 werd een techniek gepubliceerd om langdurige culturen van kleine darmcrypts in matrigel te genereren, waarbij een 3-dimensionale structuur wordt geconserveerd1. Deze structuren, intestinale organoïden genoemd, kunnen worden gekweekt met behulp van standaardtechnieken, waarbij het omringende medium wordt aangevuld met een aantal gedefinieerde groeifactoren, inclusief de Bmp-signaleringsremmer noggin (Nog), de Wnt-signaleringsversterker rspondin 1 (Rspo1) en epidermale groeifactor (Egf), die allemaal zijn gevonden om intestinale proliferatie te versterken2-4.
Organoïden overtreffen traditionele kankercellijnen in de aspecten dat ze niet-gemuteerd zijn, de stamcelhiërarchie hebben behouden, intacte cellulaire polarisatie vertonen en differentiatie vertonen in alle cellijnen die in het nascente kleine darm epitheel worden aangetroffen. Omdat ze kunnen worden getransduceerd om transgenen of RNA-interferentieconstructen te dragen5, worden ze gebruikt om specifieke genetische elementen te bestuderen, waarbij ze experimenten met transgene muizen overtreffen op het gebied van kosten en snelheid. Transgene expressie in organoïden kan worden uitgevoerd met behulp van muisine retrovirale of lentivirale vectoren6,7. Vanwege de beperkingen van muisine retrovirussen, die alleen mitotische cellen kunnen transduceren8, wordt lentivirale transductie vaker gebruikt voor cellen die moeilijk te infecteren zijn, zoals organoïden.
Viral getransduceerde en stabiel expresserende transgene organoïden kunnen worden gebruikt voor een veelvoud van downstream-analyses, inclusief kwantitatieve RNA-analyses en immunohistochemie. Alles bij elkaar genomen, is de kweek van organoïden van primaire intestinale epitheelcellen uitgegroeid tot een routinetechniek die gemakkelijk te implementeren is zonder specifieke laboratoriumvereisten, en is het de nieuwe standaard geworden in celcultuur in onderzoek naar het intestinale epitheel.
Technieken van virale transductie en daaropvolgende downstream-analyse in organoïden zijn vervelend om uit te voeren en om organoidexperimenten te ondersteunen hebben we dit videoprotocol gegenereerd, dat methoden voor lentivirale transductie van gekweekte organoïden laat zien. We laten bovendien zien hoe correcte verwerking van organoïden de opbrengst kan verhogen en daarom de prestaties van downstream-analyse met behulp van RNA-technieken of immunohistochemie kan verbeteren. In het protocol werden uitsluitend organoïden die zijn afgeleid van kleine darmcrypts gebruikt, hoewel de beschreven technieken ook kunnen worden toegepast op colonische organoïden.

<table><tbody><tr><td>Polyethyleen imine</td><td>Polysciences</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runder serum</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>BD 356231</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl cysteïne</td><td>Sigma</td><td>A9165-1G</td><td></td></tr><tr><td>muis Egf</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8045</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>glutamax 100x</td><td>Invitrogen</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Y27632&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Y0503-5MG</td><td></td></tr><tr><td>polybreen</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Lonza</td><td>BE02-007E</td><td></td></tr><tr><td>puromycine</td><td>Sigma</td><td>P 7255</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-mercaptoethanol</td><td>Merck</td><td>8,057,400,250</td><td></td></tr><tr><td>Ovation Pico WTA systeem</td><td>NuGen</td><td>3300-12</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>glazen kelkje kegelvormig 12&nbsp;mm x 75&nbsp;mm 5&nbsp;ml</td><td>VWR</td><td>LSUKM12</td><td></td></tr><tr><td>Eosine geelachtig</td><td>VWR</td><td>1,159,350,025</td><td></td></tr></tbody></table>

een protocol voor lentiviral transduction en downstream analyse van intestinale organoids

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinale crypt-villus structuren, aangeduid als organoïden, kunnen driedimensionaal in duurzame cultuur worden gehouden wanneer ze worden aangevuld met de juiste groeifactoren. Aangezien organoïden zeer vergelijkbaar zijn met het oorspronkelijke weefsel in termen van homeostatische stamceldifferentiatie, celpolariteit en aanwezigheid van alle terminaal gedifferentieerde celtypen die bekend zijn in het volwassen intestinale epitheel, dienen ze als een essentiële bron in experimenteel onderzoek naar het epitheel. De mogelijkheid om transgenen of interfererende RNA uit te drukken met behulp van lentivirale of retrovirale vectoren in organoïden heeft de mogelijkheden voor functionele analyse van het intestinale epitheel en intestinale stamcellen vergroot, waarbij traditionele muis-transgenica worden overtroffen in snelheid en kosten. In het huidige videoprotocol laten we zien hoe transductie van kleine intestinale organoïden met lentivirale vectoren kan worden gebruikt, geïllustreerd door het gebruik van doxycylin-induceerbare transgenen of IPTG-induceerbare korte haarklover RNA voor overexpressie of gen-knockdown. Verder, gezien de organoïdcultuur minute celtellingen oplevert die zelfs kunnen worden verminderd door experimentele behandeling, leggen we uit hoe organoïden kunnen worden verwerkt voor downstream-analyse gericht op kwantitatieve RT-PCR, RNA-microarray en immunohistochemie. Technieken die transgenenexpressie en gen-knockdown in intestinale organoïden mogelijk maken, dragen bij aan het onderzoekspotentieel dat deze intestinale epitheelstructuren hebben, waardoor organoïdcultuur een nieuwe standaard wordt in celcultuur.

Lentivirale transductie van organoïden
De techniek van organoïdtransductie met behulp van lentivirale deeltjes is afhankelijk van de juiste behandeling van de organoïden vóór en tijdens de transductie. Organoïden (Figuur 3A) werden gekweekt en vervolgens gedissoleerd tot individuele crypten (Figuur 3B). Zoals eerder gerapporteerd, werden deze individuele crypten cystische crypten wanneer ze werden gekweekt in de aanwezigheid van de GSK3-remmer Chir990...

In dit videoprotocol geven we een stapsgewijze uitleg van lentivirale transductie in organoïden van primair darm epitheel en van verwerking en downstream analyse van deze culturen door kwantitatieve RT-PCR, RNA-microarray en immunohistologie.

Een protocol voor Lentiviral Transduction en Downstream Analyse van Intestinale Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van stabiel getransduceerde organoïden uit primair intestinaal epitheel van muizen voor verdere analyse van intestinale organoïden. Dit wordt bereikt door eerst HEC 2 93 T-cellen te transfecteren met lentivirale verpakkingsvectoren en een lentiviraal plasmide, dat het gen van belang codeert, om lentivirale deeltjes met een hoge titer te produceren. De tweede stap is het voorbehandelen van gekweekte intestinale organoïden van muizen met een aantal groeifactoren om cystische, hyperproliferatieve crypten te verkrijgen.Transduceer vervolgens de organoïden met het lentivirus met een hoog titer en incubeer de getransduceerde organoïden in matrigel. De laatste stap is het inbedden van volgroeide, getransduceerde organoïden in paraffine voor daaropvolgende immunohistochemische analyse. Uiteindelijk wordt lentivirale transductie van organoïden gebruikt om genetische alteraties aan te brengen in een in vitro model van het darmepitheel dat betrouwbaar, reproduceerbaar en snel is.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals kankercellijnen, is dat organoïden een niet-gemuteerde, verplaatste stamcelhiërarchie vormen. In de context van cellulaire polarisatie kunnen ze differentiëren in alle verschillende celtypen van het epitheel van de dunne darm. Bovendien kunnen getransduceerde organoïden worden gebruikt om specifieke genetische elementen te bestuderen, waardoor het gebruik van transgene muizen wordt overbodig gemaakt wat betreft kosten en snelheid.De productie van lentivirale deeltjes is een protocol van vijf dagen dat begint met het splitsen van HEC 2 93 T-cellen tot een confluentie van 60 tot 80% in een kolf van 162 vierkante centimeter met celkweekmedium. Incubeer de cellen de volgende dag overnacht in een bevochtigde celkweekincubator bij 37 °C. Bereid de DNA-transfectieoplossing en de polyethyleenimine- of PEI-transfectieoplossing voor zoals beschreven in de protocoltekst.Voeg de DNA-transfectie-oplossing toe aan de PEI-oplossing, vortex of keer het buisje een aantal keer om en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Druppel twee milliliters van de DNA-transfectie-plus-PEI-oplossing op de HEC 2 93 T-cellen en incubeer gedurende vier uur bij 37 °C.Vernieuw het cultuurmedium. Om het PEI te verwijderen, worden de cellen twee dagen geïncubeerd bij 37 °C. Verzamel op dag vier het supernatant in een buis van 50 ml. Voeg nieuw cultuurmedium toe aan de cellen en plaats de kolf terug in de incubator. Centrifugeer het verzamelde supernatant bij 500 ×g gedurende vijf minuten.Om dode cellen te verwijderen, gebruikt u een grote spuit van 60 milliliter om het SUPERNAT door een 0,45 micrometer filter te drukken. Bewaar het gefiltreerde supernatant overnight bij vier graden Celsius tot de volgende dag. Verzamel, centrifugeer en filter de tweede batch supernatant zoals beschreven voor de eerste batch.Voeg de twee batches supernatant samen in ultracentrifugebuizen. Centrifugeer 90 minuten bij 50,000 GS. Wanneer de centrifugatie is voltooid, verwijder dan zeer voorzichtig de houders met de ultracentrifugebuizen en plaats deze in een laminaire flowkast.Open de capsule waarin de ultracentrifugebuis zich bevindt en schenk het medium voorzichtig af, waarbij de pellet zich aan de bovenzijde van de buis bevindt. Het is belangrijk om te onthouden aan welke zijde van de buis de pellet zich heeft gevormd, aangezien virale pellets moeilijk te visualiseren kunnen zijn. Gebruik vervolgens een micropipet om het laatste beetje medium te verwijderen, waarbij u er op let dat u de ondoorzichtige bruine pellet, die zichtbaar is aan de zijkant van de bodem van de ultracentrifugebuis, niet verstoort.Resuspendeer dit pellet in 500 microliters organoïdenkweekmedium aangevuld met nicotinamidekinase-remmers en poly brain resus. Suspensie in dit medium is belangrijk, aangezien virus met een hoge titer twee dagen vóór transductie direct zal worden gebruikt voor de transductie van organoïden. Verdeel een volledige put van 0,95 vierkante centimeter met organoïden over een nieuwe put van een 48-wells plaat.Volg een eerder gepubliceerd protocol. Streef naar het verkrijgen van ongeveer 50 kleine organoïden in organoïdekweek. Medium aangevuld met een glycogeensynthase-kinase-remmer en nicotinamide.Om cystische hyperproliferatieve crypten te verkrijgen, worden de organoïden twee dagen geïncubeerd. Oogst de organoïden op de dag van transductie met een P 1000 micropipet. Pipetteer de Matrigel en het medium herhaaldelijk op en neer om het mengsel te homogeniseren.Plaats het mengsel in een buis van 15 milliliter. Disrupt het mengsel verder met een PEs-pipet waarvan de distale opening is verkleind door versmelting. Pelleteer de organoïden door te centrifugeren bij 100 Gs gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens het supernatant, voeg 500 microliters voorverwarmde 1x trypsine toe en resuspendeer de organoïden; incubeer gedurende drie minuten.Inactiveer de trypsine in een waterbad van 37 °C door 3,5 milliliters cellijn-kweekmedium toe te voegen en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 500 ×g. Verwijder het supernatant zodat het pellet in ongeveer 20 microliters medium achterblijft. Draag de organoïden in deze laatste kleine hoeveelheid medium over naar een well.Voeg op een 48-wells plaat het eerder bereide lentivirus met hoge titer in transductiemedium toe aan de organoïden en resuspendeer. Incubeer het mengsel van organoïden en virus gedurende één uur bij 37 °C in een kweekincubator om transductie mogelijk te maken. Voeg na één uur 1 mL organoïdenkweekmedium toe aan het mengsel, resuspendeer en breng het mengsel over naar een microcentrifugebuisje. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 850 ×g.Om de organoïden te pelletteren, verwijdert u het supernatant en resuspendeert u de pellet. Plaats de druppel van 20 µL ijskoude Matrigel in het midden van een well in een 48-wells plaat en incubeer dit gedurende 15 minuten bij 37 °C.Laat de druppel 15 minuten uitharden. Voeg vervolgens voorzichtig 250 µL organoïdenkweekmedium toe, aangevuld met nicotinamide en kinase-remmers.Warm een aluminium blok voor in een incubator bij 70 °C om de paraffine vloeibaar te houden. Verwijder het medium uit een enkele put met volgroeide organoïden, waarbij de ingebedde organoïden intact blijven, en voeg één milliliter 4% paraformaldehyde in PBS direct toe aan de put. Vervang de paraformaldehyde door één milliliter PBS.Resuspendeer de gefixeerde organoïden in de PBS en breng deze over naar een glazen flacon. Laat de organoïden gedurende één minuut naar de bodem zinken. Pipetteer vervolgens de PBS weg en vervang deze door 70% ethanol waarin enkele druppels eosine-oplossing zijn opgelost.Om visualisatie van de organoïden tijdens het inbeddingsproces mogelijk te maken, laat u de organoïden 30 minuten in 70% ethanol bij kamertemperatuur staan. Verwijder de 70% ethanol door voorzichtig te pipetteren. De organoïden zijn met het blote oog zichtbaar dankzij de roze kleur van eosine.Vervang de inbeddingsoplossing door 96% ethanol en laat dit gedurende 30 minuten op kamertemperatuur staan. Breng de organoïden vervolgens stapsgewijs over door 70% ethanol, 90% ethanol, 96% ethanol, 100% ethanol, 100% ethanol, xyleen en xyleen. Giet de laatste xyleenwas af en giet paraffine in het glazen vials.Plaats het vials direct in het voorverwarmde aluminiumblok op 70 °C gedurende 30 minuten. Vervang na 30 minuten de paraffine door nieuwe, schone paraffine met behulp van een voorverwarmde PE-pipet of pipetteerhulp. Giet de paraffine af en gebruik een voorverwarmde pest of een pipet met een grote opening om de organoïden in de mal voor het paraffineblok te pipetteren, in een laag vloeibare paraffine.Verwarm een dissectienaald met een bunsenbrander en manipuleer alle organoïden zoveel mogelijk naar het midden van de mal voor het paraffineblok. Wanneer de lokalisatie van de organoïden in de mal bevredigend is, koel de mal licht af om de paraffinelaag te laten stollen. Voltooi het blok door meer paraffine bovenop te gieten en voeg een standaard histologische inbedcassette toe.In dit protocol werden organoïden van het darmepitheel getransduceerd met lentivirussen. Normale organoïden groeien als crypt-villusstructuren met een aantal crypten die voortkomen uit een gedeeld villusdomein. Na behandeling van deze organoïden met de GSK-3β-remmer, CHIR 99021, neemt de proliferatie toe en worden de crypten cystisch na de transductie van de organoïden.Door gebruik te maken van lentivirale EGFP-overexpressie vertonen de organoïden een fluorescente EGFP-expressie. Stappen ter verbetering van de transductie, die kunnen worden uitgevoerd wanneer de transductie-efficiëntie laag is, zoals inoculatie of verlengde virale incubatie, zijn niet nodig, aangezien deze stappen de reeds hoge efficiëntie niet zullen verhogen. Vervolgens worden deze organoïden verwerkt voor RNA-technieken en immunohistochemie. Deze representatieve afbeelding is een doorsnede van een muis intestinale organoïde, gekleurd voor BRDU na incubatie met BRDU gedurende één uur voorafgaand aan de fixatie.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u organoïden uit primair intestinaal epitheel kunt transduceren met behulp van lentivirale of retrovirale partikels.

a-protocol-for-lentiviral-transduction-downstream-analysis-intestinal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

Dit protocol legt de primaire Lgr5-positve organoïde cultuur en de daaropvolgende prestaties van retrovirale transductie. Dit maakt Cre-induceerbare overexpressie of knock-down van de geleverde transgen en maakt de functionele studies die in de roman worden uitgevoerd in vitro organotypisch   modelsysteem.

Een video Protocol van retrovirale infectie in het jeugdwerk Intestinale organoïde Cultuur

Intestinale organoid culturen van hele crypten gevestigd zijn en laat niet de analyse van zelf-vernieuwing en differentiatie in een cel-specifieke mode. Dit protocol beschrijft reconstitutie van gesorteerde stengel (Lgr5+) en niche (Paneth) cellen, die aanleiding tot organoids geven terwijl het toelaten van hun voorafgaande biochemische en genetische modificatie en de functionaalanalyse.

De Organoid reconstitutie Assay (ORA) voor de functionele analyse van intestinale stam en Niche cellen

We beschrijven stap-voor-stap instructies voor: 1) efficiënt ingenieur intestinale organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes voor Lenti-of retrovirale transductie, en, 2) het genereren van bevroren secties van engineered organoïden. Deze aanpak biedt een krachtig hulpmiddel om de genexpressie in organoïden efficiënt te veranderen voor onderzoek naar stroomafwaartse effecten.

Genetische manipulatie van primaire muis intestinale Organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes transductie virale vectoren voor bevroren snijden

Dit protocol beschrijft hoe menselijke intestinale organoïden kunnen worden geïnfecteerd vanaf hun apicale of basolaterale kant om gastheer / pathogeeninteracties op eencellig niveau te karakteriseren met behulp van eencellige RNA-sequencing (scRNAseq) -technologie.

Aanpassing van gastro-intestinale organoïden voor pathogene infectie en single cell sequencing onder bioveiligheidsniveau 3 (BSL-3) omstandigheden

Dit protocol biedt gedetailleerde instructies voor het vaststellen van muriene dunne darm organoïden, het isoleren van type-1 aangeboren lymfoïde cellen uit de muriene dunne darm lamina propria, en het vaststellen van 3-dimensionale (3D) co-culturen tussen beide celtypen om bi-directionele interacties tussen intestinale epitheelcellen en type-1 aangeboren lymfoïde cellen te bestuderen.

Co-cultuur van murine dunne darm epitheliale organoïden met aangeboren lymfoïde cellen

Hier presenteren we een protocol om darmorganoïden van ratten te genereren en deze te gebruiken in verschillende stroomafwaartse toepassingen. Ratten zijn vaak een geprefereerd preklinisch model, en het robuuste intestinale organoïdesysteem voorziet in de behoefte aan een in vitro systeem om in vivo studies te begeleiden.

Generatie en manipulatie van darmorganoïden van ratten

Dit protocol beschrijft een aanpak voor het uitvoeren van calciumbeeldvorming in met virus geïnfecteerde menselijke darmorganoïden en biedt een benadering voor analyse.

Levende calciumbeeldvorming van met virus geïnfecteerde menselijke darmorganoïde monolagen met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren

Het protocol combineert menselijke darmorganoïdetechnologie met transcriptomische analyse van één cel om aanzienlijk inzicht te geven in voorheen onontgonnen darmbiologie.

Menselijke darmorganoïden gebruiken om het epitheel van de dunne darm te begrijpen op transcriptioneel niveau van één cel

Dit artikel beschrijft een nieuw protocol en reagensset ontworpen voor de gevoelige meting van de neurotoxische effecten van verbindingen en behandelingen op co-culturen van neuronen en astrocyten met behulp van hoge inhoudsanalyse. Resultaten tonen aan dat de hoge inhoudelijke analyse een spannende nieuwe technologie voor neurotoxiciteit assessment vertegenwoordigt.

Een Neuronale en astrocyte co-cultuur assay voor High Content Analysis van neurotoxiciteit

Leer lentivirale transductie van darmorganoids voor genetische modificatie met RT-PCR en immunohistochemie. Deze methode biedt een betrouwbaar in vitro model voor darmepitheelonderzoek.

Een protocol voor Lentiviral Transduction en Downstream Analyse van Intestinale Organoids

Meer video's verkennen