Name: Genoom-brede Snapshot van chromatine regelgevers en staten in Xenopus Embryos van Chip-Seq (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Leer ChIP-Seq voor chromatine-onderzoek in Xenopus embryo's. Deze methode brengt genoom-brede chromatine-regulatoren in kaart en biedt inzicht in vroege celontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We danken Chris Benner voor het implementeren van het X. tropicalis genoom (xenTro2, xenTro2r) in HOMER en het Gilchrist-lab voor discussies over post-sequencing analyse. I.P. assisteerde bij de GO-termanalyse. G.E.G en J.C.S. werden ondersteund door de Wellcome Trust en worden nu ondersteund door de Medical Research Council (programmanummer U117597140).

<ol><li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+protein-DNA+interactions+in+vivo%3A+distribution+of+RNA+polymerase+on+specific+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).</li>
<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li>
<li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde%3A+evidence+that+histone+H4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li>
<li>Johnson, D., Mortazavi, A., Myers, R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Hellsten, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328 (5978), 633-636 (2010).</li>
<li>Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+and+microarray-based+analysis+of+protein+location%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location.</a> Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).</li>
<li>Blythe, S. A., Reid, C. D., Kessler, D. S., Klein, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+in+early+Xenopus+laevis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation in early Xenopus laevis embryos.</a> Dev Dyn. 238 (6), 1422-1432 (2009).</li>
<li>Gentsch, G. E., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+physical+chromatin+associations+across+the+Xenopus+genome+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Investigating physical chromatin associations across the Xenopus genome by chromatin immunoprecipitation.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), (2014).</li>
<li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J Embryol Exp Morphol. 77, 15-37 (1983).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li>
<li>Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer+%28IGV%29%3A+high-performance+genomics+data+visualization+and+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration.</a> Brief Bioinform. 14 (2), 178-192 (2013).</li>
<li>Imoto, S., Nolan, J., Bioinformatics Miyano, S. 20 (9), 1453-1454 (2004).</li>
<li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAST%2B%3A+architecture+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BLAST+: architecture and applications.</a> BMC Bioinformatics. 10, 421(2009).</li>
<li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blast2GO%3A+a+universal+tool+for+annotation%2C+visualization+and+analysis+in+functional+genomics+research%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Blast2GO: a universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research.</a> Bioinformatics. 21 (18), 3674-3676 (2005).</li>
<li>Sive, H., Grainger, R., Harland, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+H+%22Early+development+of+Xenopus+laevis%3A+A+laboratory+manual%22">Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2000).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+factors+influencing+ChIP-seq+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of factors influencing ChIP-seq fidelity.</a> Nat Methods. 9 (6), 609-614 (2012).</li>
<li>Sharov, A. A., Ko, M. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exhaustive+search+for+over-represented+DNA+sequence+motifs+with+CisFinder%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Exhaustive search for over-represented DNA sequence motifs with CisFinder.</a> DNA Res. 16 (5), 261-273 (2009).</li>
<li>Bailey, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEME+SUITE%3A+tools+for+motif+discovery+and+searching%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MEME SUITE: tools for motif discovery and searching.</a> Nucl Acids Res. 37 (2), W202-W208 (2009).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Gentsch, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+T-box+transcription+factor+profiling+reveals+joint+regulation+of+embryonic+neuromesodermal+bipotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In vivo T-box transcription factor profiling reveals joint regulation of embryonic neuromesodermal bipotency.</a> Cell Rep. 4 (6), 1185-1196 (2013).</li>
<li>Barabasi, A. L., Oltvai, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+biology%3A+understanding+the+cell%27s+functional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Network biology: understanding the cell's functional organization.</a> Nat Rev Genet. 5 (2), 101-113 (2004).</li>
<li>Biggin, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+transcription+networks+as+highly+connected%2C+quantitative+continua%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Animal transcription networks as highly connected, quantitative continua.</a> Dev Cell. 21 (4), 611-626 (2011).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%3A+a+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. , Garland. New York & London. (1994).</li>
<li>Akkers, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hierarchy+of+H3K4me3+and+H3K27me3+acquisition+in+spatial+gene+regulation+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A hierarchy of H3K4me3 and H3K27me3 acquisition in spatial gene regulation in Xenopus embryos.</a> Dev Cell. 17 (3), 425-434 (2009).</li>
<li>Yoon, S. J., Wills, A. E., Chuong, E., Gupta, R., Baker, J. C. HEB and E2A function as SMAD/FOXH1 cofactors. Genes Dev. 25 (15), 1654-1661 (2011).</li>
<li>Jallow, Z., Jacobi, U. G., Weeks, D. L., Dawid, I. B., Veenstra, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+and+redundant+roles+of+TBP+and+a+vertebrate-specific+TBP+paralog+in+embryonic+gene+regulation+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Specialized and redundant roles of TBP and a vertebrate-specific TBP paralog in embryonic gene regulation in Xenopus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (37), 13525(2004).</li>
<li>Buchholz, D. R., Paul, B. D., Shi, Y. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-specific+changes+in+promoter+occupancy+by+thyroid+hormone+receptor+during+frog+metamorphosis.+Implications+for+developmental+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gene-specific changes in promoter occupancy by thyroid hormone receptor during frog metamorphosis. Implications for developmental gene regulation.</a> J Biol Chem. 280 (50), 41222-41228 (2005).</li>
<li>Wills, A. E., Guptaa, R., Chuonga, E., Baker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+and+deep+sequencing+in+Xenopus+tropicalis+and+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation and deep sequencing in Xenopus tropicalis and Xenopus laevis.</a> Methods. 66 (3), 410-421 (2014).</li>
<li>Metz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+formaldehyde-induced+modifications+in+proteins%3A+reactions+with+model+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of formaldehyde-induced modifications in proteins: reactions with model peptides.</a> J Biol Chem. 279 (8), 6235-6243 (2004).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Mazzoni, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-based+mapping+of+developmental+transcriptional+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs.</a> Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).</li>
<li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+gene+expression+and+chromatin+profiling+of+individual+cell+types+within+a+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue.</a> Dev Cell. 18 (6), 1030-1040 (2010).</li>
<li>Bonn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+analysis+of+chromatin+state+identifies+temporal+signatures+of+enhancer+activity+during+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development.</a> Nat Genet. 44 (2), 148-156 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Ons protocol beschrijft hoe te maken en genoom-brede chromatine profielen van Xenopus embryo&#39;s te analyseren. Het omvat elke stap van het verknopen van eiwitten aan endogene loci in vivo te verwerken miljoenen leest vertegenwoordigen verrijkte genomische locaties in silico. Aangezien steeds meer genoom tocht beschikbaar zijn, moet dit protocol van toepassing is op andere model en niet-model organismen zijn. De belangrijkste experimentele sectie, die dit protocol onderscheidt van eerdere werk 8,31,33,34, is het post-fixatie procedure om verknoopte kernen te halen. Het vergemakkelijkt efficiënte chromatine oplosbaar en het scheren en eenvoudig opschalen. Samen met een verbeterde efficiëntie van de bibliotheek voorbereiding dit protocol maakt de bouw van high-complexiteit ChIP-Seq bibliotheken van anderhalf tot twee miljoen cellen die de chromatine-geassocieerde epitoop van belang. Voor ChIP-qPCR experimenten, een paar tienduizend van deze cellen zijn normaal gesproken genoegom te controleren op DNA verrijking bij misschien wel zes verschillende genomische loci. Deze aantallen zijn conservatieve schattingen, maar kan variëren afhankelijk van eiwit expressie niveau, de kwaliteit antilichaam, verknoping efficiëntie en epitoop toegankelijkheid. Als een gids, een enkele Xenopus embryo bevat ongeveer 4.000 cellen in het midden van de blastula stadium (8.5 na Nieuwkoop en Faber 29), 40.000 cellen in de late gastrulastadium (12) en 100.000 cellen op de vroege tailbud stadium (20). De precieze fixatie tijd voor een efficiënte immunoprecipitaties moet empirisch worden bepaald door ChIP-qPCR (paragraaf 10). In het algemeen langer fixatietijden vereist als het experiment omvat X. laevis embryo&#39;s, vroege ontwikkelingsstadia, en zwakke (of indirect) DNA-bindende eigenschappen. Het is echter niet aan te raden vaststelling Xenopus embryo&#39;s langer dan 40 minuten, of de verwerking van meer embryo&#39;s dan aangegeven (hoofdstuk 3), chromatine scheren minder efficiënt. Het is belangrijk nietaan een glycine gebruiken na fixatie als deze gemeenschappelijke stap voor het blussen van formaldehyde kan nucleaire extractie te maken uit dooier-rijke embryo&#39;s erg moeilijk. Momenteel is de reden hiervoor niet bekend. Het is denkbaar dat de formaldehyde-glycine adduct verder reageert met N-eindstandige aminogroepen of arginine residuen 35. Het antilichaam sleutel tot een ChIP experiment en voldoende controles moeten worden uitgevoerd om de specificiteit tonen voor het epitoop van belang (zie richtsnoeren Landt et al. 36). Indien geen ChIP-grade antilichaam beschikbaar is, kan de invoering van overeenkomstige epitoop-gemerkte fusie-eiwitten een legitiem alternatief als deze eiwitten kunnen innemen endogene bindingsplaatsen 37. In dit geval, niet-geïnjecteerde embryo&#39;s best te gebruiken als een negatieve controle in plaats van een chip met niet-specifiek serum. Deze strategie kan ook worden toegepast indien het eiwit van interesse tot expressie wordt gebracht op lage niveaus waardoor het slechte terugwinning van enriChed DNA. Voor het maken ChIP-Seq bibliotheken, vanwege de lage hoeveelheid DNA gebruikt wordt aanbevolen om te kiezen voor procedures die het aantal reinigingsstappen verminderen en reacties combineren om verlies van DNA bij beperken. De adapters en primers moeten verenigbaar zijn met multiplex sequencing en de NGS-platform te zijn (zie tabel van specifieke materialen / apparatuur). Bij gebruik van Y-adapters (met lange enkelstrengs armen), is het essentieel om vooraf versterken de bibliotheek met 3-5 ronden van PCR voor grootte-selectie DNA inserts (bijv. 100 tot 300 bp) van gelelektroforese. Enkelstrengs uiteinden veroorzaken DNA-fragmenten te heterogeen migreren. Proef uitgevoerd met verschillende hoeveelheden input DNA (bijvoorbeeld 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 en 20 ng) aanbevolen om het aantal PCR-cycli te bepalen (minder dan of gelijk aan 18 cycli) nodig om een maat maken -Selected bibliotheek 100 tot 200 ng. Vermindering van het aantal PCR-cycli maakt de sequentiebepaling van redundant leest minder waarschijnlijk. Vaste fase omkeerbare immobilisatie kralen zijn goed opruimen reagentia om efficiënt te herstellen het DNA van belang en betrouwbaar verwijder gratis adapters en dimeren van ligatie en PCR-reacties. In aantal, type en de lengte van leest, ongeveer 20-30000000 Eenzijdige bed van 36 bp is genoeg voor de meeste ChIP-Seq experimenten om de gehele Xenopus genoom met voldoende diepte bedekken. De meest voorkomende NGS machines zijn routinematig kunnen voldoen aan deze criteria. Het kan echter voordelig zijn om het aantal te verhogen van leest als een brede verdelingen van leest verwacht, zoals waargenomen met histon modificaties, dan scherpe pieken. Voor veel ChIP-Seq-experimenten, kan 4-5 anders geïndexeerde libraries worden samengevoegd en de sequentie in een stroomcel rijstrook met een krachtige NGS machine. Soms is ook raadzaam de gelezen lengte en sequentie beide uiteinden van de DNA matrijs (gepaarde-end) met mappability verhogen w verlengenduivin analyseren chromatine binnen repetitieve genomische regio&#39;s. Dit protocol is met succes toegepast op een breed scala van chromatine functies zoals transcriptiefactoren, signalering mediatoren en post-translationele modificaties histon. Echter, embryo&#39;s te verwerven in toenemende mate van cellulaire heterogeniteit als ze zich ontwikkelen en chromatine profielen moeilijker te interpreteren. Veelbelovende stappen zijn gemaakt in Arabidopsis en Drosophila om weefsel-specifiek profiel chromatine landschappen door het extraheren van celtype-specifieke kernen 38,39. Ons protocol bevat een nucleaire extractie stap, die de weg voor weefsel-specifieke ChIP-Seq kon vrijmaken in andere embryo&#39;s.

De eerste pogingen om eiwit-DNA-interacties in vivo te karakteriseren werden ongeveer 30 jaar geleden gerapporteerd in een poging om RNA-polymerase-gemedieerde gentranscriptie in bacteriën en in de fruitvlieg te begrijpen1,2. Sindsdien is het gebruik van immunoprecipitatie om verschillende chromatine-eigenschappen (ChIP) te verrijken, wijdverspreid aangenomen om bindingsgebeurtenissen en chromatine-toestanden met hoge efficiëntie vast te leggen3. Vervolgens, met de komst van krachtige microarray-technologieën, leidde deze methode tot de karakterisering van genoom-brede chromatine-landschappen4. Meer recentelijk is chromatine-profilering nog uitgebreider en hoger in resolutie geworden, omdat miljoenen co-immunoprecipiteerde DNA-sjablonen nu parallel kunnen worden gesequenced en op het genoom kunnen worden gekarteerd (ChIP-Seq)5. Naarmate er steeds meer genoomassemblages beschikbaar komen, is ChIP-Seq een aantrekkelijke aanpak om meer te leren over de genoomregulatie die ten grondslag ligt aan biologische processen.
Hier bieden we een protocol om ChIP-Seq uit te voeren op dooierrijke embryo's zoals die van de kikker Xenopus. De ontwerpen van de genomen van beide veel gebruikte Xenopus-soorten—X. tropicalis en X. laevis—zijn nu vrijgegeven door het International Xenopus Genome Consortium6. De embryo's van Xenopus-soorten delen veel gewenste kenmerken die genoom-brede chromatine-onderzoeken vergemakkelijken en mogelijk maken, waaronder de productie van grote aantallen hoogwaardige embryo's, de grote omvang van de embryo's zelf en hun externe ontwikkeling. Bovendien zijn de embryo's geschikt voor klassieke en nieuwe manipulaties zoals cel-lijn-tracering, whole-mount in situ hybridisatie, RNA-overexpressie en TALEN/CRISPR-gemedieerde knockout-technologie.
Het volgende protocol baseert zich op het werk van Lee et al., Blythe et al. en Gentsch et al.7-9. In het kort, Xenopus-embryo's worden formaldehyde-gefixeerd in het ontwikkelingsstadium van belang om eiwitten covalent te binden (cross-linken) aan hun geassocieerde genomische DNA. Na extractie van de kern wordt gecross-linkt chromatine gefragmenteerd om de volgende sequencing op specifieke genomische bindings- of modificatieplaatsen te richten en om de bijdragen van flankerende DNA-sequenties te minimaliseren. Vervolgens worden de chromatine-fragmenten geïmmunoprecipiteerd met een ChIP-kwaliteitsantilichaam om degenen die het eiwit van belang bevatten te verrijken. Het mede-geïmmunoprecipiteerde DNA wordt van het eiwit verwijderd en gezuiverd voordat een geïndexeerd (paarsgewijs-eind) bibliotheek wordt gemaakt voor next-generation sequencing (NGS). Aan het eind worden eenvoudige commandolijnen aangeboden voor de post-sequencing analyse van ChIP-Seq-gegevens.

<table><tbody><tr><td>1/16 inch tapered microtip</td><td>Qsonica</td><td>4417</td><td>Deze microtip is compatibel met Sonicator 3000 van Misonix en Q500/700 van Qsonica.</td></tr><tr><td>8 ml glazen monstervial met dop</td><td>Wheaton</td><td>224884</td><td>8 ml heldere glazen monstervialen voor waterige monsters met 15-425 grootte fenolrubber-gecoate schroefdoppen.</td></tr><tr><td>Adapter</td><td>bijv. IDT of Sigma</td><td>NA</td><td>TruSeq universele adapter, 
AATGATACGGCGACCACCGAG 
ATCTACACTCTTTCCCTACAC 
GACGCTCTTCCGATC*T. TruSeq geïndiceerde adapter, 
P-GATCGGAAGAGCACACGTC 
TGAACTCCAGTCAC &#8208;NNNNNN&#8208; 
ATCTCGTATGCCGTCT TCTGCTT*G. *, fosforotioaatbindingfosfaatgroep aan 5&#39; eind. NNNNNN, index (zie TruSeq ChIP Sample Preparation Guide voor DNA-sequentie). Bestel adapters HPLC gezuiverd. Adapters kunnen worden bereid door gelijke molaliteiten (elk 100 &#181;M) van de universele en de geïndiceerde adapter te combineren en ze langzaam af te koelen van 95 &#176;C naar kamertemperatuur. Gebruik 1,5 pmol per ng invoer-DNA. Bewaar bij -20 &#176;C.</td></tr><tr><td>b2g4pipe (software)</td><td>Blast2GO</td><td>niet-commercieel</td><td>http://www.blast2go.com/data/blast2go/b2g4pipe_v2.5.zip</td></tr><tr><td>BLAST+ (software)</td><td>Camacho et al.</td><td>niet-commercieel</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastDocs&amp; DOC_TYPE=Download</td></tr><tr><td>Bowtie (software)</td><td>Langmead et al.</td><td>niet-commercieel</td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml</td></tr><tr><td>cisFinder (software)</td><td>Sharov et al.</td><td>niet-commercieel</td><td>http://lgsun.grc.nia.nih.gov/CisFinder/</td></tr><tr><td>Chip voor capillaire elektroforese</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1504</td><td>Laad deze chip met 1 &micro;l DNA voor bibliotheekkwaliteitscontrole. Bewaar bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Chip-gebaseerd capillaire elektroforesesysteem</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td>De Agilent 2100 BioAnalyzer wordt gebruikt om de kwaliteit van ChIP-Seq-bibliotheken te controleren. Bewaar reagentia bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>ChIP-Seq bibliotheekvoorbereidingskit (KAPA Hyper Prep Kit)</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK8504</td><td>Kit bevat KAPA-eindreparatie en A-tailing enzymmix, eindreparatie en A-tailing buffer, DNA-ligase, ligatiebuffer, KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) en KAPA bibliotheekversterking primermix (10X) (zie ook PCR-primers). Adapters zijn niet inbegrepen. Bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>ChIP-Seq bibliotheekvoorbereidingskit (alternatief, ThruPLEX-FD Prep Kit)</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R40048</td><td>Kit gebruikt hun eigen stem-loop adapters en primers. Deze kit elimineert tussentijdse zuiveringsstappen en is even gevoelig als de KAPA Hyper Prep Kit. Bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Cluster3 (software)</td><td>de Hoon et al.</td><td>niet-commercieel</td><td>http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster</td></tr><tr><td>FastQC (software)</td><td>Simon Andrews</td><td>niet-commercieel</td><td>http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</td></tr><tr><td>Fluorometer</td><td>life technologies</td><td>Q32866</td><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td></tr><tr><td>Fluorometer reagentia</td><td>life technologies</td><td>Q32851</td><td>Het kit biedt geconcentreerd assayreagens, verdunningsbuffer en voorverdunde DNA-standaarden voor de Qubit fluorometer. Bewaar DNA-standaarden bij 4 &deg;C, buffer en kleurstof bij kamertemperatuur.</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>F8775-4X25ML</td><td>Formaldehydeoplossing, voor moleculaire biologie, 36,5-38% in H2O, gestabiliseerd met 10-15% methanol. Bewaar bij kamertemperatuur. LET OP: Formaldehyde is corrosief en zeer giftig.</td></tr><tr><td>Gel (E-Gel EX agarose, 2%)</td><td>life technologies</td><td>G4010</td><td>Voorgevormd gel met 11 putjes, openbaar formaat. Laat een baan tussen ladder en bibliotheek leeg om kruisbesmetting te voorkomen. Bewaar gels bij kamertemperatuur.</td></tr><tr><td>Gelelektroforesesysteem</td><td>life technologies</td><td>G6465</td><td>E-Gel iBase en E-Gel Safe Imager combokit voor het selecteren van de grootte van ChIP-Seq bibliotheken.</td></tr><tr><td>Gelextractiekit</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>Bewaar alle reagentia bij kamertemperatuur. Gebruik 500 &micro;l van QG-buffer per 100 mg van 2% agarose gelplakje om DNA te extraheren. Gebruik MinElute kolommen (van MinElute PCR-zuiveringskit) om DNA tweemaal elueren.</td></tr><tr><td>HOMER (software)</td><td>Chris Benner</td><td>niet-commercieel</td><td>http://homer.salk.edu/homer/index.html</td></tr><tr><td>Hybridisatieoven</td><td>Techne</td><td>FHB1D</td><td>Hybridizer HB-1D</td></tr><tr><td>IGV (software)</td><td>Robinson et al.</td><td>niet-commercieel</td><td>http://www.broadinstitute.org/igv/home</td></tr><tr><td>Illumina CASAVA-1.8 kwaliteitsfilter (software)</td><td>Assaf Gordon</td><td>niet-commercieel</td><td>http://cancan.cshl.edu/labmembers/gordon/fastq_illumina_filter</td></tr><tr><td>Java TreeView (software)</td><td>Alok Saldanha</td><td>niet-commercieel</td><td>http://jtreeview.sourceforge.net</td></tr><tr><td>Laboratorium jack</td><td>Edu-Lab</td><td>CH0642</td><td>Deze jack wordt gebruikt om monster in geluidsisolatie te verhogen voor sonificatie.</td></tr><tr><td>Ladder, 100 bp</td><td>New England BioLabs</td><td>N3231</td><td>Bewaar 1x oplossing bij kamertemperatuur. Bewaar voorraad bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Ladder, 1 kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N3232</td><td>Bewaar 1x oplossing bij kamertemperatuur. Bewaar voorraad bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuizen met lage retentie van 1,5 ml</td><td>life technologies</td><td>AM12450</td><td>nonstick, RNase-vrije microfuge buizen, 1,5 ml</td></tr><tr><td>MACS2 (software)</td><td>Tao Liu</td><td>niet-commercieel</td><td>https://github.com/taoliu/MACS</td></tr><tr><td>

genoom-brede snapshot van chromatine regelgevers en staten in<em&gt; xenopus</em&gt; embryo&#39;s van chip-seq

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

De recrutering van chromatine-regulatoren en de toewijzing van chromatine-toestanden aan specifieke genomische loci zijn cruciaal voor celbestemmingsbeslissingen en de vorming van weefsels en organen tijdens de ontwikkeling. Het bepalen van de locaties en niveaus van dergelijke chromatine-eigenschappen in vivo zal waardevolle informatie verschaffen over de ruimte-tijdelijke regulatie van genomische elementen en zal aspiraties ondersteunen om embryonaal weefselontwikkeling in vitro te imiteren. De meest gebruikte methode voor genoombreed en hoge resolutie profilering is chromatine-immunoprecipitatie gevolgd door next-generation sequencing (ChIP-Seq). Dit protocol beschrijft hoe dooierrijke embryo's, zoals die van de kikker Xenopus kunnen worden verwerkt voor ChIP-Seq-experimenten, en het biedt eenvoudige commandolijnen voor post-sequencing analyse. Vanwege de hoge efficiëntie waarmee het protocol kernen uit formaldehyde-gefixeerd weefsel extraheert, stelt de methode eenvoudige opschaling mogelijk om voldoende ChIP-materiaal te verkrijgen voor genoombreed profilering. Ons protocol is met succes gebruikt om verschillende DNA-bindende eiwitten zoals transcriptiefactoren, signaalmediatoren, componenten van de transcriptiemachinerie, chromatine-modificatoren en post-translationele histonmodificaties in kaart te brengen, en dit in verschillende stadia van embryogenese. Ten slotte zou dit protocol breed toepasbaar moeten zijn op andere model- en niet-modelorganismen naarmate er steeds meer genoomassemblages beschikbaar komen.

Gelijkwaardige resultaten die hier gepresenteerd worden verwacht als het protocol goed wordt uitgevoerd en het antilichaam in gebruik is van de chip-grade kwaliteit (zie bespreking). Dit protocol maakt de extractie van kernen van formaldehyde vaste Xenopus embryo&#39;s en het efficiënt scheren van chromatine door sonicatie (Figuur 1A-C). Gefragmenteerde chromatine toont een asymmetrische verdeling van DNA-fragmenten van doorgaans 100 tot 1000 bp en een piek tussen 300 en 500 bp (figuur 1C). Een minimale 50 pg immunologisch DNA moet een geïndexeerde gepaarde-end ChIP-Seq bibliotheek met even grote DNA inserts (Figuur 2A) succesvol maken. De bibliotheek zou grotendeels vrij van adapter dimeren, die kan worden gezien op het elektroferogram ongeveer 120 bp. Bij sequentiebepaling-door-synthese, voorbewerkte leest zijn toegewezen aan het genoom (Figuur 2B, C). In een geslaagd experiment <em&gt; X. tropicalis embryo, gewoonlijk 50 tot 70% van één einde bed van 40 bp uniek kan worden toegewezen aan het genoom samenstel van v7.1 met maximaal twee mismatches. Terwijl de ingang leest uitlijnen vrij gelijkmatig over het genoom, de uitlijning van de chip leest resultaten in streng-specifieke verrijkingen dat het chromatine kenmerk van belang flankeren. Dit is omdat alle fragmenten de sequentie van het 5&#39;-uiteinde (figuur 2C) 25. Uitbreiding van de uitlijning in het lezen van richting om een ​​gemiddelde fragment grootte produceert nauwkeurige profielen voor enkele chromatine functies zoals transcriptiefactorbindingsplaatsen evenementen. Deze DNA bezettingsgraad verschijnen pieken bij gevisualiseerd IGV of andere compatibele genoom browser. Extra bellers zoals MACS worden gebruikt om de locatie van deze pieken (figuur 3A) te bepalen. Zo tienduizenden bindingsplaatsen zijn bepaald X. tropicalis genoom voor T-box transcriptiefactoren zoals Vegt 26. ChIP-qPCR ervamenten moeten de plaatselijke verrijking gevonden door ChIP-Seq (Figuur 3B) te bevestigen. ChIP-Seq experimenten maken het mogelijk het verkennen van genoom-brede kenmerken van chromatine functies. Bijvoorbeeld, het berekenen van de lees verdeling over genomische elementen zoals de transcriptie start en beëindiging sites kunnen elke ruimtelijke Bindvoorkeuren rond genen (Figuur 3C) te markeren. Evenzo wordt een heatmap van gelezen distributies op de piek locaties gebruikt om verschillende chromatine eigenschappen te vergelijken op een genoom-brede schaal (Figuur 3D). Bepaalde transcriptiefactoren binden DNA-sequentie-specifiek. De novo motief analyse van genomisch DNA onderliggende pieken dergelijke informatie, waaronder co verrijkte motieven potentiële co-factoren (figuur 3E) halen. De grote meerderheid van de target genen tonen DNA bezetting op een lagere plaats van hoger niveau (Figuur 3F). Dit schaalvrije functie lijkt vrij gebruikelijk bij tr te zijnanscription factoren en suggereert dat slechts een kleine fractie van target genen die rechtstreeks worden gereguleerd met biologische relevantie 27,28. De analyse van verrijkte GO termen of andere kenmerken, zoals de differentiële expressie van doelgenen kan verder inzicht openbaren in de biologische functie van de functie chromatine in Xenopus embryo (Figuur 3G). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/52535/52535fig1highres.jpg" /> Figuur 1. Chromatine immunoprecipitatie procedure Xenopus embryo. (A) Embryo&#39;s worden met formaldehyde gefixeerd op het ontwikkelingsstadium van belang covalent te binden (verknopen) alle eiwitten geassocieerd met genomisch DNA. Bij nucleaire extractie (B), wordt verknoopt chromatine gefragmenteerd om een beperking van genomische DNA-bindende of chromatine modificatie locaties door het minimaliseren van de flankerende DNA sequentie (C). Vervolgens worden de chromatine fragmenten immunologisch met ChIP-grade antilichaam aan die waarin het epitoop van belang (D) bieden. De co-immunogeprecipiteerde DNA wordt afgestroopt het eiwit en gezuiverd (E) voor het maken van de chip fragment bibliotheek voor NGS (figuur 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52535/52535fig2highres.jpg" /> Figuur 2. ChIP-Seq bibliotheek voorbereiding, sequencing-door-synthese, in kaart brengen en de piek roeping. (A) Het elektroferogram toont een goede ChIP-Seq bibliotheek met DNA templates van 250-450 bp. Deze sjablonen met zich meebrengen het DNA-insert van belang geflankeerd door de universele (58 bp) en de geïndexeerde (63 bp) adapter. (B) </strong&gt; Miljoenen clusters met elk cluster met identieke sjablonen, gesequenced base van base in aanwezigheid van alle vier nucleotiden bezitten omkeerbaar onderscheiden fluorofoor en identieke beëindiging eigenschappen. Fluorescerende beelden worden verwerkt realtime overeenkomstige basen, die uiteindelijk geassembleerd in leest noemen. (C) alleen lezen die kaart uniek het Xenopus genoom gehouden. Aangezien alle fragmenten de sequentie van het 5&#39;-uiteinde, het in kaart brengen van ChIP leest leidt strengs specifieke pieken die het chromatine eigenschap van belang flankeren. Daarbij piek bellers detecteren de verrijking die afkomstig is van immunoprecipitatie en verlengen de leest tot een gemiddelde fragment lengte aan chromatine functies nauwkeurig te lokaliseren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt = &quot;Figuur 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52535 / 52535fig3highres.jpg&quot; /&gt; Figuur 3. Een voorbeeld van post-sequentie analyse en visualisatie van gegevens via de zygote T-box transcriptiefactor Vegt (zVegT). Gelezen hier getoonde tellingen genormaliseerd tot 10 miljoen unieke mat en niet-redundante leest. (A) Fragment van het genoom-brede profiel van zVegT verbindend in X. tropicalis gastrulastadium embryo&#39;s (fase 11-12,5 na Nieuwkoop en Faber 29). Elke piek, een stapel-up van verlengd leest, vertegenwoordigt één bindingsplaats. Deze pieken worden genoemd MACS2 met een valse ontdekking rate (FDR) van minder dan 1%. Elke MESP gen toont zeer proximale en upstream zVegT bindend, maar slechts mespa en mespb worden uitgedrukt door die fase (RNA-Seq data 30). (B) DNA bezettingsgraad van zVegT zoals bepaald door ChIP-qPCR op verschillende loci (met inbegrip van een niet -gebonden regio 0,5 kb stroomopwaarts van β-actine) confirm de specifieke verrijking gevonden door ChIP-Seq. Vergelijk resultaten voor mespa met piek genoemd (rode balk) in (A). De DNA bezettingsgraad wordt gevisualiseerd als een percentage van input voor zowel de chip met de Vegt antilichaam (konijn polyklonaal IgG isotype) en de chip met het antilichaam controle (normaal konijnenserum IgG). Foutenbalken geven de standaardafwijking van twee biologische herhalingen. (C) Metagene analyse blijkt preferentiële zVegT binding (markeringen weggegooid dan 25 bp) aan de promotor ten opzichte van een andere genomische regio heen en in gen organen. (D) Temperatuurkaart toont k-gemiddelde geclusterd (k = 5) DNA bezettingsgraad (labels binned meer dan 25 bp) van zVegT en Smad2 / Smad3 (CHIP-Seq data 31) ten opzichte van alle zVegT-gebonden regio&#39;s op gastrulastadium. De heatmap is inloggen 2 gebaseerd en gecentreerd op 5 labels per bp. (E) De novo motief analyse ontdekt de canonieke T-doos transcriptiefactorbindingsplaatsen motief in 38% van zVegT-gebonden regio&#39;s als de onderliggende motief score is genormaliseerd naar een 5% ontdekking tarief op de achtergrond sequenties. De kaart toont de hoogste dichtheid verrijking voor de T-box-motief in het midden van zVegT bindingsplaatsen, terwijl de canonieke Smad2 / Smad3 bindende motief nauwelijks verrijkt. (F) histogram toont de DNA bezettingsgraad van zVegT die zijn berekend voor elk doelwitgen van alle pieken (+/- 200 bp) tussen 5 kb upstream [-]. en 1 kb stroomafwaarts [+] van overeenkomstige transcriptie startplaatsen (G) Top 300 genen met hoogste DNA bezettingsgraad binnen -5 kb en 1 kb zijn verrijkt biologische processen van de vroege embryonale ontwikkeling. Deze GO termen zijn in lijn met de vermeende functie van zVegT. De FDR is gebaseerd op een tweezijdige Fisher&#39;s exact test en gecorrigeerd voor meerdere testen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>

De vraag hoe chromatine toezichthouders en chromatine staten van invloed op het genoom in vivo is de sleutel tot ons begrip van hoe vroeg lot van de cel beslissingen worden genomen in het zich ontwikkelende embryo. ChIP-Seq-de meest populaire benadering van chromatine functies onderzoeken op mondiaal niveau wordt hier geschetst voor Xenopus embryo.

Genoom-brede Snapshot van chromatine regelgevers en staten in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryo&#39;s van Chip-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Het doel van deze procedure, algemeen bekend als ChIP-seq, kort voor chromatine immunoprecipitatie, gevolgd door next-generation sequencing, is om de genoombrede locatie van chromatineregulatoren en chromatinetoestanden in het opus-embryo te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst zap-embryo's te fixeren en daarbij de DNA-gebonden eiwitten covalent te koppelen aan het genoom. Vervolgens worden de kernen geëxtraheerd en wordt hun chromatine gesolubiliseerd en gedeeld door sonicatie.Op dit punt wordt het geïnteresseerde DNA-gebonden eiwit gezuiverd door immunoprecipitatie en uitgebreide wassing. De laatste stap is het creëren van een geïndexeerde ChIP-seq-bibliotheek van de gezuiverde DNA-fragmenten. Uiteindelijk worden miljoenen vijf prime mensen van deze DNA-fragmenten, zogenaamde res, parallel gesequenced, uitgelijnd op het genoom en uitgebreid tot gemiddelde fragmentlengte.Lokale verrijking van res zogenaamde pieken worden bepaald om alle locatiespecifieke DNA-bezettingen van het geïnteresseerde eiwit te identificeren, en daarmee de studie van zijn genoombrede kenmerken uit te breiden. Dus dit protocol kan gedetailleerde inzichten geven in de genoombrede chromatine architectuur van emus-embryo's. Het kan ook potentieel worden toegepast op andere organismen met gesequencede genomen.Begin met de deed-embryo's. Details tot aan dit punt worden gegeven in het tekstprotocol. Breng ze over in een glasbuisje van acht milliliter en was ze met 0,01 XMMR.Na het wassen, fixeer de embryo's met 1% para formaldehyde en 0,01 XMMR. Laat de fixatie gedurende minimaal 15 tot maximaal 40 minuten op kamertemperatuur plaatsvinden. Beëindig de fixatie door de embryo's drie keer te wassen met koud 0,01 XMMR.Voorkom dat de embryo's het oppervlak van de oplossing aanraken, omdat oppervlaktespanning leidt tot scheuren. Zodra het fixeermiddel is weggewassen, maak aliquoten van 250 embryo's in microafvalbuisjes. Hypogewicht vervolgens zoveel mogelijk van de 0,01 XMMR en ga verder met de chromatine-extractie om te pauzeren.Hier vergelijk de embryo's in 250 microliters koud HEG-buffer. Eenmaal bezonken in de buffer, kunnen de embryo's in vloeibare stikstof worden snel bevroren en bewaard bij min 80 graden Celsius. Begin met het homogeniseren van de gefixeerde embryo's in E één-buffer.Details over opschalen en buffervoorbereiding worden gegeven in het tekstprotocol. Centrifugeer vervolgens. De homogenaten bij vier graden Celsius aspergeer en gooi weg de sate en resuspendeer de pellets in E een.Houd de monster gedurende 10 minuten op ijs. Herhaal de centrifugatie en suspendeer dit keer de palette in E twee. Wacht 10 minuten terwijl het homogenaat op ijs afkoelt.Herhaal vervolgens de centrifugatie opnieuw, en suspendeer het pellet in E drie. Dit keer, na nog eens 10 minuten afkoelen, zou de suspensie redelijk transparant moeten zijn omdat de onische detergent de meeste resterende dooierplaatjes oplosbaar maakt. Herhaal nu de centrifugatie.Andre.Suspendeer de pellets in een tot drie milliliters E drie. Gebruik indien nodig de laatste centrifugatiestap om alle pellets los te trekken van de gewenste gekruiste kernen. Deze suspensie bevat ook pigmentgranules en enkele resterende dooierplaatjes.Deze granulen en dooierplaatjes worden na sonicatie door centrifugatie van het chromatine gescheiden. Houd het monster nu op ijs en ga verder met chromatinefragmentatie. Snap, bevries het monster in plaats daarvan voor tijdelijke opslag.Begin met het overbrengen van het monster in E drie naar een op maat gemaakte polystyreenbuis. Voor de sonicatie, bevestig de buis aan een 800 ml beker met ijswater met behulp van een korte thermometerklem zodat deze tijdens sonicatie op zijn plaats blijft. Plaats de beker op een jack en pas de jack aan zodat de sondetip ongeveer tweederde van de weg in het monster wordt ondergedompeld.De sondetip mag de buiswand niet raken. Optimaliseer de sonicatie, beginnend met de door de fabrikant aanbevolen parameters van mijn Sonic Sonicate 3000 uitgerust met een 1/16 inch taps toelopende microtip, gedurende in totaal zeven minuten. 30 seconden per keer tussen sonicatie.Laat het monster een minuut rusten. Begin elke sonicatie met een vermogen van één en verhoog het geleidelijk tot tussen twee en vier. Als het monster begint te schuimen, herpositioneer de buis en laat het schuim verdwijnen voordat u doorgaat. Na de sonicatie is het chromatine gesolubiliseerde en gescheurd.Breng het over naar voorgekoelde 1,5 milliliter microafvalbuisjes en centrifugeer op volle snelheid. Vijf minuten bij vier graden Celsius, verzamel de SNA en breng het over naar voorgekoelde buisjes. Gooi de pellet weg.Gebruik 50 microliters van SUP natant om de fragmentatie visueel te beoordelen en bewaar de resterende hoeveelheid voor immunoprecipitatie. Begin met het overbrengen van 10 tot 30 microliters van she chromatine SUP naar een nieuwe buis om als inputmonster te dienen. Voeg vervolgens chip-kwaliteitsantilichaam toe bij ongeveer één microgram per miljoen cellen aan het resterende chromatine.Incubeer het chromatine-antilichaammonster een nacht, ook bij vier graden Celsius, maar met 10 RPM rotatie. De volgende dag was de antilichaam-compatibele magnetische kralen in E drie gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gebruik de door de fabrikant aanbevolen kralenconcentratie bij de gewassen kralen om het antilichaam vooraf ingecubeerde chromatine te incuberen bij vier graden Celsius met rotatie gedurende nog eens vier uur.Gebruik vervolgens gekoelde ripper-buffer om de kralen 10 keer te wassen. Gebruik de magneet gedurende 20 tot 30 seconden om de kralen tussen de wasbeurten te scheiden. De oplossing moet helder zijn.Volg de ripper-buffer wasbeurten met één wassing met gekoelde 10 buffer. Breng vervolgens de kralen over in een kleine hoeveelheid 10 buffer naar een nieuwe buis. Scheid de kralen en gooi de resterende buffer weg.Om het immunogeprecipiteerde chromatine los te maken. Reese heeft de kralen gebogen in 50

genome-wide-snapshot-chromatin-regulators-states-xenopus-embryos-chip

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

De differentiatie van ESC samenvalt met cel-type specifieke veranderingen in de structuur en samenstelling van het chromatine. De detectie van deze veranderingen geeft waardevolle inzichten in de mechanismen die stemcellness en celdifferentiatie te definiëren. Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) vormt een waardevolle methode om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen stamcellen differentiatie ontleden.

Chromatine immunoprecipitatie van menselijke embryonale stamcellen

Demonstreren we een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) methode om factor interacties op weefsel-specifieke genen te identificeren tijdens of na het begin van weefsel-specifieke genexpressie in muis embryonale weefsel. Dit protocol moet worden breed toepasbaar voor de studie van weefsel-specifieke gen activatie als het zich voordoet tijdens de normale embryonale ontwikkeling.

Chromatine immunoprecipitatie assay for Tissue-specifieke genen met behulp van een vroeg stadium muizenembryo&#39;s

Een fijnafstemming regulatie van gentranscriptie ten grondslag ligt aan embryonale cel lot beslissing. Hierin beschrijven we chromatine immunoprecipitatie assays gebruikt om epigenetische regulatie van zowel cardiale differentiatie van stamcellen en cardiale ontwikkeling van muizenembryo's te onderzoeken.

Epigenetische regulatie van Cardiac Differentiatie van embryonale stamcellen en weefsels

Hier beschrijven we een chromatine immunoprecipitation (ChIP) en ChIP-seq de protocol van de voorbereiding van de bibliotheek voor het genereren van wereldwijde epigenomic profielen van lage-overvloed kip embryonale monsters.

Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) Protocol voor lage-overvloed embryonale monsters

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde high-throughput ChIP-sequencing protocol en computationele analyses pijpleiding voor de bepaling van genoom-brede chromatine staat patronen uit bevroren tumor weefsels en cellijnen.

Een geïntegreerd Platform voor het toewijzen van de genoom-brede van chromatine Staten met behulp van High-throughput ChIP-sequencing in Tumor weefsels

Dit werk beschrijft een protocol voor het genereren van hoge resolutie in situ Hi-C bibliotheken van strak geënsceneerd pre gastrulatie Drosophila melanogaster embryo's.

Generatie van genoom-brede chromatine conformatie Capture bibliotheken uit strak geënsceneerde vroege Drosophila embryo 's

Hier beschrijven we methoden voor het uitvoeren van ChIP-Seq en CARIP-Seq, met inbegrip van de voorbereiding van de bibliotheek van next-generation sequencing, voor het genereren van wereldwijde epigenomic en chromatine-geassocieerde RNA kaarten in ES-cellen.

CARIP-Seq en ChIP-Seq: methoden voor het identificeren van de chromatine-geassocieerde RNAs en eiwit-DNA interacties in embryonale stamcellen

Deze methode is ontworpen om de vorming van PRC2-gemedieerde chromatine-domeinen in cellijnen te volgen, en de methode kan worden aangepast aan vele andere systemen.

Een methode om de Novo vorming van Chromatin domeinen te bestuderen

Nauwkeurige bepaling van eiwitbindende locaties in het genoom is belangrijk voor het begrijpen van genregulatie. Hier beschrijven we een genomische mapping methode die chromatine-immunogeprecipiteerd DNA behandelt met exonucleasevertering (ChIP-exo) gevolgd door sequencing met hoge doorvoer. Deze methode detecteert eiwit-DNA interacties met near base-pair mapping resolutie en hoge signaal-ruisverhouding bij zoogdierneuronen.

Hoge resolutie mapping van eiwit-DNA interacties in muis stamcel-afgeleide neuronen met behulp van chromatine immunoprecipitation-exonuclease (ChIP-Exo)

Dit protocol biedt een gestroomlijnde computationele pijplijn voor het kwantificeren van ontluikende enhancer-transcripties. Door de toegankelijkheid van chromatine, de chromatinefunctie en transcriptiegegevens te integreren, maakt het nauwkeurige detectie en strengspecifieke analyse van de enhancer-activiteit in complexe intragene regio's mogelijk, terwijl het toegankelijk blijft voor onderzoekers zonder uitgebreide bio-informaticatraining.

Een computationele pijplijn voor intergene/intragene enhancer RNA-kwantificering in embryonale stamcellen van muizen

Hier presenteren we een snel en eenvoudig ATAC-seq-protocol dat geïmplementeerd kan worden in L4-fase Caenorhabditis elegans whole-worm met slechts 30 μL wormpellet.

Chromatine toegankelijkheidsprofilering bij hele Caenorhabditis elegans L4-larven

Leer ChIP-Seq voor chromatine-onderzoek in Xenopus embryo's. Deze methode brengt genoom-brede chromatine-regulatoren in kaart en biedt inzicht in vroege celontwikkeling.

Genoom-brede Snapshot van chromatine regelgevers en staten in

Meer video's verkennen