Name: Met behulp van fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Onderzoek Cell-type-specifieke genexpressie in Rat Brain Tissue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Leer fluorescerende cel sortering (FACS) om specifieke neurale celtypen uit hersenweefsel te isoleren voor genexpressie-analyse. Deze methode ondersteunt onderzoek naar celtype-specifieke mechanismen in de neurobiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Lynn Opdenaker van het University of Delaware Center for Translational Research bij het Helen F. Graham Cancer Center bedanken voor technische assistentie, evenals Nancy Martin van de Duke University Cancer Institute Flow Cytometry Shared Resource, en Dr. Susan H. Smith voor begeleiding bij methoden en gegevensverzameling.

1. Voorbereiding voor weefselcollectie (15 – 30 min)
<ol>
	<li>Polijst drie sets glazen Pasteur pipetten in afnemende diameters en nummer ze “1” = ongeveer 1 mm diameter, “2” = ongeveer 0,75 mm diameter, en ”3” = ongeveer 0,50 mm diameter.</li>
	<li>Resuspendeer gelyofiliseerd Enzym A met alle Buffer A volgens het protocol dat bij de Neural Dissociation Kit wordt geleverd (zie tabel met materialen). Niet mengen. Verdeel de oplossing in 50 µl aliquots en bewaar deze bij -20 ºC voor later gebruik.</li>
	<li>Maak 1 L myeline verwijderingsbuffer en vacuümfilter voor sterilisatie [myeline verwijderingsbuffer = 1.000 ml van 0,1 M fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), 2 ml van 500 mM Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), en 10 g Runderserumalbumine (BSA)].</li>
	<li>Snijd nylon gaasblad in kleine 1  x 1 inch (2,5 x 2,5 cm) vierkanten die zullen worden gebruikt voor het filteren van cellulaire restanten en autoclaveer in een kleine beker bedekt met aluminiumfolie.</li>
	<li>Bereid 1 L wasbuffer voor [wasbuffer = 1.000 ml van 0,1 M PBS, 2 ml van 500 mM EDTA, en 10 g BSA].</li>
</ol>
2. Weefselcollectie
<ol>
	<li>Schakel waterbad in op 37 ºC.</li>
	<li>Bereid Buffer X uit de Neural Dissociation Kit voor door beta-mercaptoethanol toe te voegen aan Buffer X tot een eindconcentratie van 0,067 mM (voor 4 monsters, voeg 13,5 µl van 50 mM beta-mercaptoethanol toe aan 10 ml van Buffer X).</li>
	<li>Bereid Enzym Mix 1 voor door 50 µl van Enzym P te mengen met 1.900 µl van Buffer X voor elk monster zoals beschreven in het protocol voor de Neural Dissociation Kit Voorbeeld: voor 4 monsters, meng 200 µl van Enzym P met 7.600 µl van Buffer X.</li>
	<li>Plaats Buffer X in het waterbad op 37 ºC.</li>
	<li>Plaats 2 ml koude Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) (zonder Ca++ en Mg++) in een putje van een steriele 6-putjes kweekplaat voor elk monster dat zal worden verzameld en houd het op ijs voor weefseldisseratie.</li>
</ol>
3. Weefseldisseratie (45 min – 1 uur)
<ol>
	<li>Injecteer het dier met een geschikt volume euthanasieoplossing (commerciële barbituraat-oplossing, bijv. Euthasol), volgens de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en perfuseer al het bloed met koude 0,9% zoutoplossing.
		<ol>
			<li>Gebruik een overdosis euthanasieoplossing bij ratten.</li>
			<li>Controleer de anesthesie via ademhaling en via teenprik. Wanneer het dier voldoende verdoofd is (geen reactie op de teenprik en diepe, langzame ademhaling), kan de rat worden geperfuseerd.</li>
			<li>Snij de borstholte open met een stel zware schaar. Snijd het diafragma door om toegang tot het hart mogelijk te maken. Snijd de ribben langs beide zijden naar boven toe tot aan de top van de borstkas om volledige toegang tot het hart mogelijk te maken. Op dat punt kan de ribbenkast naar de zijkant worden gehouden met een stel hemostaten.</li>
			<li>Voer een hartperfusie uit door een 18 G naald (voor volwassen ratten) aan te sluiten op een elektrische pomp in de linker ventrikel van het hart. De pomp zuigt koude 0,9% zoutoplossing op.</li>
			<li>Snij vervolgens het rechter atrium open met een klein paar schaar om het bloed en de vloeibare perfusieoplossing uit het lichaam te laten wegvloeien.</li>
			<li>Perfuseer ratten met ongeveer 10 ml (voor volwassen ratten) van 0,9% zoutoplossing om alle perifere immuuncellen en -factoren te verwijderen.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Dissereer het gewenste deel van de hersenregio met behulp van steriele scheermessen en passende disseratie, plaats de weefselstukken vervolgens in de koude HBSS zonder Ca2+ en Mg2+. 
	OPMERKING: Het protocol vereist HBSS zonder Ca2+ en Mg2+ in de vroege stadia van het protocol omdat deze ionen kunnen interfereren met de enzymen die nodig zijn voor neurale dissociatie.</li>
	<li>Nadat alle weefselmonsters zijn verzameld, keer terug naar de schone werkbank of steriele kweekkap voor weefselverwerking.</li>
</ol>
4. Neurale dissociatie (1 uur)
<ol>
	<li>Snij elk weefselmonster in kleine stukken met behulp van steriele scheermessen op het deksel van de 6-putjes kweekplaat. Dit protocol is gebruikt voor weefselmonsters van ongeveer 30 - 100 mg, maar is goedgekeurd voor weefselmonsters tot 400 mg. Voor weefselmonsters groter dan 400 mg, moeten de reagentiavolumes geschikt worden opgeschaald.</li>
	<li>Gebruik 1 ml verse HBSS zonder Ca2+ en Mg2+ om de gesneden weefselstukken met een pipet over te brengen naar een steriele 2 ml centrifugeerbuis. Herhaal stappen 4.1 en 4.2 voor alle monsters totdat alle monsters zijn overgebracht naar een 2ml centrifugeerbuis.</li>
	<li>Centrifugeer de monsters gedurende 2 min bij 300 x g bij RT en aspireer het supernatant.</li>
	<li>Voeg 1.900 µl warme Enzym Mix 1, zoals bereid in stappen 2.2 en 2.3, toe aan elk monster en sluit de buisjes.</li>
	<li>Incubeer de monsters gedurende 15 min in het 37 ºC waterbad, door de buisjes om de 5 min te keren om de neergedaalde weefselstukken weer op te schorsen.</li>

<ol><li>Schwarz, J. M., Smith, S. H., Bilbo, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+analysis+of+neuronal-glial+interactions+in+the+nucleus+accumbens+following+morphine+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">FACS analysis of neuronal-glial interactions in the nucleus accumbens following morphine administration.</a> Psychopharmacology. 230 (4), 525-535 (2013).</li>
<li>Schwarz, J. M., Hutchinson, M. R., Bilbo, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early-life+experience+decreases+drug-induced+reinstatement+of+morphine+CPP+in+adulthood+via+microglial-specific+epigenetic+programming+of+anti-inflammatory+IL-10+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early-life experience decreases drug-induced reinstatement of morphine CPP in adulthood via microglial-specific epigenetic programming of anti-inflammatory IL-10 expression.</a> J Neurosci. 31 (49), 17835-1523 (2011).</li>
<li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+flow+cytometry+data%3A+a+guide+for+the+perplexed%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).</li>
<li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+identifies+unique+cocaine-induced+gene+regulation+in+selectively+activated+adult+striatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons.</a> J Neurosci. 31 (11), 4251-4259 (2011).</li>
<li>Fanous, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+gene+alterations+are+induced+in+FACS-purified+Fos-positive+neurons+activated+during+cue-induced+relapse+to+heroin+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking.</a> J Neurochem. 124 (1), 100-108 (2013).</li>
<li>Liu, Q. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+molecular+alterations+in+methamphetamine-activated+Fos-expressing+neurons+from+single+rat+dorsal+striatum+using+fluorescence-activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS).</a> J Neurochem. 128 (1), 173-185 (2013).</li>
<li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+purification+of+immunolabeled+cell+types+from+adult+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain.</a> J Neurosci Methods. 203 (1), 10-18 (2012).</li>
<li>Nolte, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFAP+promoter-controlled+EGFP-expressing+transgenic+mice%3A+a+tool+to+visualize+astrocytes+and+astrogliosis+in+living+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue.</a> Glia. 33 (1), 72-86 (2000).</li>
<li>Okana, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methyltransferases+Dnmt3a+and+Dnmt3b+are+essential+for+de+novo+methylation+and+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development.</a> Cell. 99 (3), 247-257 (1999).</li>
<li>Bogdanović, O., Veenstra, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+and+methyl-CpG+binding+proteins%3A+developmental+requirements+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">DNA methylation and methyl-CpG binding proteins: developmental requirements and function.</a> Chromosoma. 118 (5), 549-565 (2009).</li>
<li>Iwamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+show+distinctive+DNA+methylation+profile+and+higher+inter-individual+variations+compared+with+non-neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Neurons show distinctive DNA methylation profile and higher inter-individual variations compared with non-neurons.</a> Genome Res. 21 (5), 688-696 (2011).</li>
<li>Nishioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell-type+specific+DNA+methylation+patterns+of+the+Cacna1c+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell-type specific DNA methylation patterns of the Cacna1c gene.</a> Int J Dev Neurosci. 31 (2), 89-95 (2013).</li>
<li>Kozlenkov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+DNA+methylation+between+human+neuronal+and+glial+cells+are+concentrated+in+enhancers+and+non-CpG+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Differences in DNA methylation between human neuronal and glial cells are concentrated in enhancers and non-CpG sites.</a> Nucleic Acid Res. 42 (1), 109-127 (2014).</li>
<li>Russo, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+factor+kappa+B+signaling+regulates+neuronal+morphology+and+cocaine+reward%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nuclear factor kappa B signaling regulates neuronal morphology and cocaine reward.</a> J Neurosci. 29 (11), 3529-3537 (2009).</li>
<li>Bhatt, D., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+NF-%CE%BAB-Mediated+Transcription+of+Inflammatory+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of the NF-κB-Mediated Transcription of Inflammatory Genes.</a> Front Immunol. 5, 71(2014).</li>
<li>Okada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+sorting+of+neuronal+and+glial+nuclei+from+central+nervous+system+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue.</a> J Cell Physiol. 226 (2), 552-558 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Net als veel andere weefsels en systemen bestaat de hersenen uit een heterogene celpopulatie die samenwerkt om gedrag te beïnvloeden. De analyse van genexpressie, eiwitexpressie of epigenetische modificaties van individuele cellen binnen die heterogene populatie heeft het potentieel om informatie te onthullen over de functie van het systeem als geheel, om cellulaire processen te identificeren die zowel normaal gedrag als ziekteprocessen reguleren, en om celtypespecifieke doelen te bieden voor mogelijke therapieën. Het is...

Het doel van het hieronder beschreven protocol is om individuele celtypen te isoleren uit een heterogene populatie van hersenweefsel voor de verdere analyse van celtypespecifieke genexpressie, eiwitexpressie of zelfs epigenetische markers. De hersenen bestaan uit veel celtypen die zijn afgeleid van verschillende voorlopercellen en die celtypespecifieke eigenschappen en functies hebben. Ondanks deze verschillen kunnen deze verschillende neurale celtypen vergelijkbare receptoren en intracellulaire signaalmoleculen tot expressie brengen, wat de analyse van deze meer universele eiwitten moeilijk te meten of te interpreteren maakt op een celtypespecifieke manier met conventionele methoden. Neurowetenschappers moeten de functie en activering van deze verschillende celtypen in de hersenen identificeren en hoe ze individueel gedrag kunnen beïnvloeden, aangezien dit uiteindelijk de eerste stap zal zijn om specifiekere geneesmiddelen en therapeutische doelen voor neurologische en neuropsychiatrische ziekten te identificeren. Ondanks dit overkoepelende doel van neurowetenschappelijk onderzoek, kan het moeilijk zijn om individuele neurale celtypen uit de hersenen te isoleren voor de analyse van gen- of eiwitexpressie, de activering van signaalmoleculen of de modificatie van epigenetische markers op DNA. Van de technieken die momenteel worden gebruikt, kan immunohistochemie de expressie van eiwitten op een celtypespecifieke manier identificeren in combinatie met aanvullende kleuring van een celtypespecifieke marker, hoewel dit afhankelijk is van specifieke antilichamen die goed kunnen kleuren voor de eiwitten van belang en het kan moeilijk zijn om te kwantificeren. In situ hybridisatie kan de specifieke lokalisatie van messenger ribonucleïnezuur (mRNA) in individuele cellen in de hersenen identificeren, maar dit is een arbeidsintensief proces dat ook de co-analyse van specifieke celtypen beperkt en alleen toelaat voor de analyse van een of misschien een paar genen van belang. Laser capture microdissectie gebruikt een laser om subpopulaties van cellen te isoleren die via microscopie worden gevisualiseerd; echter, de tijdrovende aard van dit proces en de relatief lage opbrengst kunnen de verdere analyse van eiwitten of mRNA-niveaus aanzienlijk beperken, vooral als de expressie van deze moleculen vanaf het begin laag is. Fluorescerende geactiveerde celsortering (FACS) is een relatief nieuwe techniek op het gebied van neurowetenschappen om individuele celtypen uit de hersenen te isoleren voor verdere analyse van genexpressie1 en/of epigenetische doelen2. Dit proces kan ook worden gebruikt om specifieke soorten neurale cellen te sorteren voor verdere analyse van celtypespecifieke genexpressie, eiwitexpressie of epigenetische markers. FACS wordt al tientallen jaren gebruikt in een aantal medische onderzoeksgebieden zoals kanker en immunologie om verschillende cellen te tellen en te sorteren op basis van fysieke of biochemische kenmerken3. Bovendien is flowcytometrie klassiek gebruikt om eiwitexpressie op celbasis te analyseren, met behulp van specifieke antilichamen. De hieronder beschreven procedure maakt gebruik van klassieke flowcytometrietechnieken om individuele celtypen te isoleren voor verdere analyse van moleculaire biologie-eindpunten. De flowcytometer kan enkele duizenden cellen per seconde analyseren, wat het een snelle en efficiënte alternatief maakt voor de hierboven beschreven technieken. Bovendien kunnen cellen worden geïsoleerd op basis van de cellulaire expressie van een specifiek eiwit (bijvoorbeeld een neurotransmitterreceptor) of een combinatie van twee of meer eiwitten (co-lokalisatie van meerdere eiwitten in een specifiek celtype). Dit stelt de gebruiker in staat om zeer selectieve neurale celtypen te isoleren op basis van hun moleculaire eigenschappen om hun functie in de hersenen te identificeren.
Om FACS uit te voeren, worden neurale cellen bereid in een eencellig suspensie die door een flowcel wordt geleid die de cellen draagt en uitlijnt zodat ze een voor een door een lichtstraal en lasers gaan voor analyse. Een computer verzamelt de gegevens van elke cel en zet deze in een histogram om gespecificeerde parameters (grootte, korreligheid en fluorescentie) te analyseren. Op basis van deze parameters kunnen de cellen onmiddellijk worden gesorteerd in afzonderlijke buizen voor hun herinnering en verdere analyse van elk gewenst eindpunt. Het hieronder beschreven protocol maakt gebruik van drie antilichamen om neuronen te sorteren (met behulp van een Thymocyte antigen 1, Thy1-antilichaam), astrocyten (met behulp van een gliale glutamaattransporter, GLT1-antilichaam) en microglia (met behulp van een cluster van differentiatiemolecuul 11B, CD11b-antilichaam). Dit protocol kan worden gebruikt zoals hieronder beschreven of gewijzigd met verschillende antilichamen, afhankelijk van het celtype dat men zou willen isoleren voor zijn eigen experimenten.
Er zijn enkele voorbehouden om te overwegen bij het bepalen of dit protocol geschikt is voor specifieke experimenten. Een belangrijk voorbehoud kan betrekking hebben op het specifieke celtype dat men zou willen isoleren. In dit protocol zijn de drie antilichamen die worden gebruikt extracellulaire antilichamen, die de experimentator toestaan de celtypen intact te houden tijdens de kleuringsprocedure, waardoor de integriteit van het RNA, DNA en eiwitten binnenin wordt behouden. Het is mogelijk dat men een specifiek neuronaal celtype zou willen isoleren met behulp van een antilichaam dat een eiwit identificeert dat alleen binnenin die specifieke cel wordt tot expressie gebracht. Bijvoorbeeld, men zou dopaminerge neuronen willen isoleren met behulp van een antilichaam voor tyrosine hydroxylase of acetylcholine neuronen met behulp van een antilichaam voor choline acetyltransferase. Deze eiwitten zijn intracellulair en daarom zou fixatie en permeabilisatie van het celmembraan vereist zijn voor vervolgkleuring met de juiste antilichamen. Hoewel dit eerder is gedaan 4,5, kan dit proces de opbrengst van RNA of DNA uit deze gepermeabiliseerde cellen aanzienlijk verminderen. Een ander voorbehoud kan zijn dat niet alle antilichamen geschikt zijn voor FACS. Bijvoorbeeld, men kan momenteel een antilichaam gebruiken dat erg goed werkt voor western blot, een techniek die de denaturatie van eiwitten vereist. Dit antilichaam is mogelijk niet noodzakelijkerwijs geschikt voor de identificatie van deze celtypen met behulp van FACS, aangezien de eiwitten op geen enkel moment in dit protocol worden gedenatureerd en dus het antilichaam geen manier heeft om zich te binden aan zijn inherente antigeen. Bedrijven verstrekken specificatiebladen die de toepassingen identificeren waarvoor een antilichaam

<table><tbody><tr><td>Neural Dissociation Kit (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>Myelin Removal Beads II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-733</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Mesh Sheet</td><td>Amazon</td><td>CMN-0074-10YD</td><td>40 inch breedte, 80 micron gaasmaat</td></tr><tr><td>Fc Block / anti-CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>BDB550270</td><td>reactiviteit voor rat</td></tr><tr><td>APC-geconjugeerd CD11b antilichaam</td><td>Biolegend</td><td>201809</td><td>reactiviteit voor rat</td></tr><tr><td>Konijn anti-GLT1</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-20136</td><td>reactiviteit voor rat of mens</td></tr><tr><td>PE-geconjugeerd secundair anti-konijn antilichaam</td><td>eBioscience</td><td>1037259</td><td>secundair antilichaam voor anti-GLT1</td></tr><tr><td>FITC-geconjugeerd anti-rat CD90 (Thy1) muis antilichaam</td><td>Biolegend</td><td>202504</td><td>reactiviteit voor rat</td></tr></tbody></table>

met behulp van fluorescentie-geactiveerde cell sorting voor onderzoek cell-type-specifieke genexpressie in rat brain tissue

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

De hersenen bestaat uit vier primaire celtypen inclusief neuronen, astrocyten, microglia en oligodendrocyten. Hoewel zij niet het meest voorkomende celtype in de hersenen, neuronen de meest bestudeerde van deze celtypen gezien hun directe rol in gedrag beïnvloeden. Andere celtypen in de hersenen beïnvloeden ook neuronale functie en gedrag via de signaalmoleculen ze produceren. Neuroscientists moet de interactie tussen celsoorten inzicht in de hersenen beter begrijpen hoe deze interacties beïnvloeden neurale functie en ziekte. Tot op heden de meest voorkomende werkwijze voor het analyseren eiwit of genexpressie gebruikt de homogenisering van hele weefselmonsters, meestal bloed, en zonder acht te slaan celtype. Deze aanpak is een informatieve aanpak voor de behandeling van algemene veranderingen in gen of eiwit expressie die neurale functie en het gedrag kunnen beïnvloeden; echter, deze analysemethode leent zich niet tot een beter begrip van de cel-type-specifieke genexpressie en het effect van cel-tot-cel communicatie op neurale functie. Analyse van behavioral epigenetica heeft een oppervlakte van groeiende aandacht die wordt onderzocht is hoe wijzigingen van het desoxyribonucleïnezuur (DNA) structuur langetermijneffect genexpressie en gedrag; echter, deze informatie alleen relevant indien geanalyseerd in een celtype-specifieke wijze gezien de differentiële lijn en dus epigenetische markers die aanwezig zijn op bepaalde genen van afzonderlijke neurale celtypes kunnen zijn. De Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS) techniek hierna beschreven is een eenvoudige en effectieve manier om afzonderlijke neurale cellen te isoleren voor daaropvolgende analyse van genexpressie, eiwitexpressie of epigenetische modificaties van DNA. Deze techniek kan ook worden gemodificeerd om specifiekere neurale celtypes te isoleren in de hersenen voor daaropvolgende celtype-specifieke analyse.

Het belang van myeline-depletie en weefselperfusie
Figuur 1 illustreert het belang van myelinedepletie. Myelinedepletie (stappen 5.1 tot en met 5.12 van het bovenstaande protocol) vindt plaats wanneer de enkelcel-suspensie wordt geïncubeerd met de Myelin Removal Beads, gewassen en vervolgens door de kolom van de magnetische sorteerder wordt geleid. Het doel van deze stappen is om de hoeveelheid cellulair debris in elk monster te verminderen. Naarmate neuronen worden gedissocie...

Het doel van dit protocol is om de techniek van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te gebruiken om specifieke typen neurale cellen te sorteren voor daaropvolgende analyse van celtype-specifieke genexpressie, epigenetische markers en/of eiwitexpressie.

Met behulp van fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Onderzoek Cell-type-specifieke genexpressie in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van individuele neurale celtypen uit hersenweefsel voor verdere analyse. Dit wordt bereikt door het neurale weefsel eerst te dissociëren tot een suspensie van enkelvoudige cellen. In de tweede stap wordt het myeline uit de suspensie verwijderd, waarna de cellen worden gekleurd met celtype-specifieke antilichamen.In de laatste stap worden de individuele celpopulaties gesorteerd via flowcytometrie. Uiteindelijk stelt deze methode voor celtype-specifieke isolatie gebruikers in staat om veranderingen in gen- of eiwitexpressie of epigenetische modificaties op een celtype-specifieke manier te analyseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de neurowetenschappen, zoals welke celtypen bepaalde receptoren tot expressie brengen, welke bepaalde eiwitten tot expressie brengen en welke bepaalde epigenetische modificaties tot expressie brengen, zodat we celtype-specifieke mechanismen in de hersenen beter kunnen begrijpen.Begin de neurale dissociatie door elk monster, geoogst uit hersenweefsel van volwassenen, met steriele scheermesjes in kleine stukjes van 30 tot 400 milligram te snijden op het deksel van een zes-wells kweekplaat. Dompel het weefsel vervolgens onder in één milliliter calcium- en magnesiumvrije HBSS en gebruik een pipet om de monsters over te brengen naar steriele centrifugebuisjes van twee milliliter zodra al het weefsel is verzameld. Centrifugeer de monsters en aspireer de supernatanten.Voeg 1.900 µL warm enzym toe. Meng dit en incubeer de monsters gedurende 15 minuten in een waterbad van 37 °C, waarbij de buis elke vijf minuten enkele keren wordt omgekeerd om de bezonken stukjes weefsel opnieuw te suspenderen.Voeg aan het einde van de incubatie 30 µL vers bereid enzym toe. Meng dit met elk monster en keer de buisjes voorzichtig om. Gebruik vervolgens een pestpipet gelabeld als één om elk monster te dissociëren met 30 op- en neerwaartse bewegingen.Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Incubeer de monsters nog eens 15 minuten bij 37 °C met omkering elke vijf minuten, gevolgd door dissociatie van de monsters met pestpipet nummer twee, zoals zojuist gedemonstreerd.Schakel vervolgens over naar pipet nummer drie, herhaal de dissociatie en incubeer de monsters nog 10 minuten. In het waterbad met inversie elke vijf minuten; filter aan het einde van de incubatie de enkelcel-suspensies door 80 micron celzeven in 15 milliliter Falcon-buizen. Spoel elke zeef met 10 milliliters calcium- en magnesiumvrij HBSS om de enzymatische reacties te stoppen. Wanneer het laatste monster is gefilterd, worden de buizen gecentrifugeerd en worden de supernatanten geaspireerd om het myeline uit de cellen te verwijderen.Resuspendeer de pellets grondig in 400 µL myelin removal buffer en voeg de juiste hoeveelheid myelin removal beads toe aan elke buis. Pipetteer de oplossingen op en neer tot de cellen en beads volledig zijn gemengd. Incubeer het monster vervolgens 15 minuten bij 4 °C.Was na de incubatie elk monster in vijf milliliter myelin removal buffer terwijl de cellen centrifugeren, plaats voor elk monster één kolom in het magnetische veld van een magnetische sorteerder en plaats een schoon 80 micron filter bovenop elke kolom. Spoel elk filter en elke kolom drie keer met één milliliter myelin removal buffer en verzamel al het doorstroomvolume in een afvalcontainer. Plaats na de laatste spoeling polystyreen buisjes met ronde bodem van vijf milliliter direct onder elke kolom om het eluaat op te vangen.Aspireer vervolgens het supernatant van de monsters en resuspendeer de pellets in 500 µL myelineremovingsbuffer. Breng de cel-suspensies onmiddellijk aan op de kolommen en vang de cellen op in de buisjes eronder. Spoel vervolgens elk filter en elke kolom vier keer met 1 mL myelineremovingsbuffer per wasbeurt.Na de laatste wasbeurt worden de cellen gecentrifugeerd en de supernatanten afgezogen om de cellen te kleuren voor sortering via flowcytometrie. Vortex elk monster ongeveer twee seconden om de pellets te dissociëren en breng één µL cellen van elke buis over naar individuele buisjes. Voeg voor de kleuringscontroles onmiddellijk vijf µL FC-block toe aan elke buis, inclusief de kleuringscontroles.Vortex de monsters vervolgens opnieuw en incubeer ze bij vier graden Celsius. Voeg na vijf minuten 100 µL van de juiste primaire antilichaamcocktail toe. Dek de buisjes af om de antilichamen tegen licht te beschermen en incubeer de cellen 20 minuten bij vier graden Celsius.Was na afloop van de incubatie de monsters in twee milliliters wasbuffer, aspireer vervolgens de supernatanten en label elk monster met 100 microliters van het passende secundaire antilichaam. Sluit de buisjes af en plaats deze gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Was de monsters vervolgens in twee milliliters wasbuffer, centrifugeer de monsters en aspireer deze daarna af.Resuspendeer de pellets in 250 µL steriele PBS en sorteer de cellen; hier worden representatieve flow-gesorteerde populaties van neurale cellen uit een enkele mannelijke hippocampus getoond. De cellen werden eerst gefilterd uit alle mogelijke events op basis van hun forward scatter- en side scatter-eigenschappen. Vervolgens werden de enkelvoudige cellen of singlets gefilterd van doubletten of grotere celklonters op basis van hun grootte om nauwkeurige sortering van de individuele celtypen mogelijk te maken. De enkelvoudige cellen werden daarna gesorteerd in CD 11 B-positieve en CD 11 B-negatieve celpopulaties, met verdere sortering van de CD 11 B-negatieve cellen in GT 1- en TH 1-positieve cellen. Het analyseprogramma werd vervolgens gebruikt om het totale aantal events in elke populatie te bepalen, evenals het percentage van de ouderpopulaties om de zuiverheid van de gesorteerde cellen te bevestigen.In dit specifieke voorbeeld werd de relatieve genexpressie van alternatieve celtype-specifieke genen geanalyseerd via real-time PCR. Zoals verwacht bevestigden deze gegevens de zuiverheid van de gesorteerde cellen en werden er enkele interessante verschillen geïdentificeerd tussen de onderzochte hersengebieden. Na bevestiging van de zuiverheid van de sortering kan de expressie van andere genen van belang worden gemeten om vast te stellen in welk specifiek celtype ze tot expressie komen, of dat hun expressie na behandeling op een celtype-specifieke wijze verandert.Bijvoorbeeld werd hier de expressie van cow binding onderzocht, een calciumbindend eiwit dat vaak wordt gebruikt om neuronen in de hippocampus en het cerebellum te identificeren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u specifieke neurale celtypen van belang, zoals de neurale cel die hier wordt getoond, kunt isoleren met behulp van geschikte celoppervlak-antilichamen.

using-fluorescence-activated-cell-sorting-to-examine-cell-type

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates a method to isolate fluorescently labeled neurons from a mouse brain.

Isolating Fluorescently Labeled Neurons from a Murine Brain

This video demonstrates the procedure for isolating and sorting nuclei from fresh-frozen human brain tissue using fluorescence-activated nuclei sorting (FANS), which enables the study of different cell populations for various neurological applications.

Isolating Cell Populations from Brain Tissue Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

This video demonstrates a protocol to isolate cells from rat hippocampi, including neurons, astrocytes, and microglia.

Obtaining Various Neural Cell Populations from a Rat Hippocampus

This video demonstrates the dissociation of frozen rat brain tissue into a single-cell suspension using enzymatic digestion and mechanical trituration. The prepared cells are fixed and permeabilized with ethanol for downstream applications like flow cytometry or gene expression analysis.

Obtaining a Single-Cell Suspension from Frozen Rat Brain Tissue

Genexpressie analyse van een subset van cellen in een specifiek weefsel vormt een grote uitdaging. In dit artikel wordt beschreven hoe u een hoge kwaliteit totaal RNA van een specifieke cel populatie te isoleren door het combineren van een snelle immunolabeling methode met lasermicrodissectie.

RNA isolatie van de Cel specifieke subpopulaties met behulp van laser-capture Microdissection Gecombineerd met Rapid immunolabeling

We rapporteren een op Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) gebaseerde methode om neurale stamcellen (NSC's) en hun nakomelingen te isoleren uit de subventriculaire zone (SVZ) van de volwassen muizenhersenen. Toegepast op Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgene muizen, maakt het de studie van celcyclusprogressie mogelijk door live beeldvorming.

Celsortering van neurale stamcellen en stamcellen uit de Adult Mouse subventriculaire zone en Live-beeldvorming van de celcyclus Dynamics

Hier presenteren we een Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protocol om moleculaire veranderingen studeren in Fos-uiting van neuronale ensembles van zowel verse als bevroren hersenweefsel. Het gebruik van bevroren weefsel maakt FACS isoleren van vele hersengebieden over meerdere zittingen aan het gebruik van kostbare proefdieren maximaliseren.

Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS) en genexpressie analyse van Fos expressie neuronen van verse en diepgevroren Rat Brain Tissue

Hier presenteren we een combinatorische aanpak voor het classificeren van neuronale celtypes voorafgaand aan isolatie en voor de daaropvolgende karakterisering van enkelvoudige transcriptomen. Dit protocol optimaliseert de voorbereiding van monsters voor succesvolle RNA Sequencing (RNA-Seq) en beschrijft een methodologie die speciaal is ontwikkeld voor een beter begrip van cellulaire diversiteit.

Single-cell RNA-Seq van gedefinieerde subsetjes van retinale Ganglion-cellen

Hier presenteren we een protocol dat near-infrarood kleurstoffen gebruikt in combinatie met Immunohistochemistry en hoge-resolutie scannen naar eiwitten in hersengebieden te testen.

Het gebruiken van dichtbijgelegen-infrarode fluorescentie en hoge resolutie het scannen om eiwituitdrukking in de knaagdieren hersenen te meten

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) is een krachtig hulpmiddel om de rol van het 18 kDa translocator eiwit of serotonine 5HT2A-receptorexpressie bij de ziekte van Alzheimer op cellulaire schaal te bestuderen. Dit protocol beschrijft de ex-vivo toepassing van FACS-RTT in het TgF344-AD rat model.

Fluorescentie-geactiveerde celsortering-radioligand behandeld weefsel (FACS-RTT) om de cellulaire oorsprong van radioactief signaal te bepalen

Hier wordt een methode gepresenteerd om enkele kernen geïsoleerd uit de gyrus van de muis te sequencen die de meeste neuronen uitsluit door fluorescentie-geactiveerde kernen (FAN) -sortering. Deze aanpak genereert hoogwaardige expressieprofielen en vergemakkelijkt de studie van de meeste andere celtypen die in de niche zijn vertegenwoordigd, inclusief schaarse populaties zoals neurale stamcellen.

Fluorescentie-geactiveerde kernen negatieve sortering van neuronen gecombineerd met single nuclei RNA-sequencing om de hippocampale neurogene niche te bestuderen

Leer fluorescerende cel sortering (FACS) om specifieke neurale celtypen uit hersenweefsel te isoleren voor genexpressie-analyse. Deze methode ondersteunt onderzoek naar celtype-specifieke mechanismen in de neurobiologie.

Met behulp van fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Onderzoek Cell-type-specifieke genexpressie in Rat Brain Tissue

Meer video's verkennen