Met behulp van fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Onderzoek Cell-type-specifieke genexpressie in Rat Brain Tissue
May 28th, 2015
Het doel van dit protocol is om de techniek van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te gebruiken om specifieke typen neurale cellen te sorteren voor daaropvolgende analyse van celtype-specifieke genexpressie, epigenetische markers en/of eiwitexpressie.
Het algemene doel van deze procedure is om individuele neurale celtypen te isoleren uit hersenweefsel voor verdere analyse. Dit wordt bereikt door eerst het neurale weefsel te dissociëren in een enkele cel suspensie. In de tweede stap wordt de myeline uit de suspensie verwijderd en vervolgens worden de cellen gekleurd voor celtype specifieke antilichamen.
In de laatste stap worden de individuele celpopulaties gesorteerd door flowcytometrie. Uiteindelijk zal deze methode van celtype specifieke isolatie gebruikers in staat stellen om veranderingen in gen- of eiwitexpressie of epigenetische modificaties op een celtype specifieke manier te meten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het gebied van neurowetenschappen, zoals welke celtypen bepaalde receptoren tot expressie brengen, welke bepaalde eiwitten tot expressie brengen en welke bepaalde epigenetische modificaties tot expressie brengen, zodat we celtype specifieke mechanismen in de hersenen beter kunnen begrijpen.
Begin de neurale dissociatie door steriele scheermessen te gebruiken om elk monster dat is geoogst uit volwassen hersenweefsel in kleine stukken van 30 tot 400 milligram te snijden op het deksel van een zes-wells cultuurplaat. Dompel vervolgens het weefsel in één milliliter calcium- en magnesiumvrij HBSS en gebruik een pipet om de monsters over te brengen naar steriele twee milliliter centrifugeerbuisjes wanneer alle weefsels zijn verzameld. Centrifugeer de monsters en aspeer de supernatanten.
Voeg 1.900 microliters warm enzym toe. Meng een en incubeer de monsters gedurende 15 minuten. In een 37 graden Celsius waterbad, draai de buis om elke vijf minuten om de bezonken stukken weefsel te resuspenderen.
Aan het einde van de incubatie, voeg 30 microliters vers bereid enzym toe. Meng twee naar elk monster en draai voorzichtig de buizen om. Gebruik vervolgens een pestpipet getipeerd als een, om elk monster te dissociëren met 30 op en neer bewegingen.
Zorg ervoor dat u geen bubbels genereert. Incubeer de monsters nog eens 15 minuten bij 37 graden Celsius met omdraaien elke vijf minuten, gevolgd door dissociatie van de monsters met pestpipet. Nummer twee, zoals net gedemonstreerd.
Schakel vervolgens over naar pipet Nummer drie, herhaal de dissociatie en incubeer de monsters nog 10 minuten. In het waterbad met omdraaien elke vijf minuten aan het einde van de incubatie, filter de enkele cel suspensies door 80 micron cel zeefjes in 15 milliliter Falcon buisjes. Was elke zeef met 10 milliliter calcium- en magnesiumvrij HBSS om de enzymatische reacties te stoppen wanneer het laatste monster is gefilterd, centrifugeer de buisjes en aspeer de supernatanten om de myeline uit de cel te verwijderen.
Resuspendeer de pellets volledig in 400 microliters myeline verwijderingsbuffer en voeg de juiste hoeveelheid myeline verwijderingskralen toe aan elke buis. Pipet de oplossingen op en neer totdat de cellen en kralen grondig gemengd zijn. Bewaar vervolgens het monster gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.
Na de incubatie was je elk monster in vijf milliliter myeline verwijderingsbuffer terwijl de cellen draaien, plaats een kolom voor elk monster in het magnetische veld van een magnetische sorteerder en plaats een schone 80 micron filter op elke kolom. Spoel elke filter en kolom drie keer af met één milliliter myeline verwijderingsbuffer en verzamel alle stroom door in een afvalcontainer. Na de laatste spoeling, plaats direct onder elke kolom vijf milliliter polystyreen ronde bodem buisjes om de eluaat te verzamelen.
Aspeer vervolgens de supernaam uit de monsters en resuspendeer de pellets in 500 microliters myeline verwijderingsbuffer. Breng onmiddellijk de cel suspensies aan op de kolommen en verzamel de cellen in de buisjes eronder. Spoel vervolgens elke filter en kolom vier keer af met één milliliter myeline verwijderingsbuffer per wasbeurt.
Na de laatste wasbeurt, centrifugeer de cellen en aspeer de supernatanten om de cellen te kleuren voor sortering door flowcytometrie. Vortex elke monster gedurende ongeveer twee seconden om de pellets te dissociëren en breng een microliter cellen van elke buis over in individuele buisjes. Voor de kleuringscontroles, voeg onmiddellijk vijf microliters FC-blok toe aan elke buis, inclusief de kleuringscontroles.
Vortex vervolgens de monsters opnieuw en incubeer ze bij vier graden Celsius. Na vijf minuten, voeg 100 microliters van de juiste primaire antilichaam cocktail toe. Bedek de buisjes om de antilichamen te beschermen tegen licht en incubeer de cellen gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius.
Aan het einde van de incubatie, was de monsters in twee milliliter wasbuffer, aspeer vervolgens de supernatanten en label elk monster met 100 microliters van de juiste secundaire antilichamen. Bedek de buisjes en plaats ze gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Was vervolgens de monsters in twee milliliter wasbuffer, centrifugeer de monsters en aspeer vervolgens af.
Supernatanten Resuspendeer de pellets in 250 microliters steriele PBS en sorteer de cellen hier. Representatieve flow gesorteerd populaties van neurale cellen uit een enkele mannelijke hippocampus worden getoond. De cellen werden eerst uitgesloten van alle mogelijke gebeurtenissen op basis van hun voorwaartse en zijwaartse verstrooiingseigenschappen. Vervolgens werden de enkele cellen of enkele cellen uitgesloten van eventuele dubbele of grotere klonten cellen op basis van hun grootte om nauwkeurige sorteer van de individuele celtypen mogelijk te maken. De enkele cellen werden vervolgens gesorteerd in CD 11 B positieve en CD 11 B negatieve celpopulaties met verdere sorteer van de CD 11 B negatieve cellen in GT een en TH een positieve cellen. Het analyseprogramma werd vervolgens gebruikt om het totale aantal gebeurtenissen in elke populatie te bepalen, evenals het percentage van de ouderpopulaties om de zuiverheid van de gesorteerd cellen te bevestigen.
In dit specifieke voorbeeld, werd de relatieve genexpressie van alternatieve celtype specifieke genen geanalyseerd door real-time PCR. Zoals verwacht, bevestigden deze gegevens de zuiverheid van de gesorteerd cellen, evenals enkele interessante verschillen tussen de onderzochte hersengebieden. Na bevestiging van de zuiverheid van de sorteer, kan de expressie van andere genen van belang worden gemeten om de specifieke celtype te
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om specifieke soorten neurale cellen te isoleren uit hersenweefsel met behulp van fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS). De procedure maakt daarnaast analyse mogelijk van celtype-specifieke genexpressie, epigenetische markers en eiwitexpressie.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Genexpressieanalyse
Achtergrond
- Isolatie van neurale celtypen is cruciaal voor het begrijpen van hersenmechanismen.
- Celtype-specifieke analyse kan verschillen in receptor- en eiwitexpressie onthullen.
- FACS maakt nauwkeurige sorteringen van individuele celpopulaties mogelijk.
- Deze methode kan helpen bij het bestuderen van epigenetische modificaties in neurale cellen.
Doel van het onderzoek
- Om individuele neurale celtypen te isoleren voor gedetailleerde analyse.
- Om gen- en eiwitexpressie in specifieke celpopulaties te onderzoeken.
- Om het begrip van celtype-specifieke mechanismen in de hersenen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Dissociatie van zenuwweefsel tot een enkele celsuspensie.
- Verwijdering van myeline uit de celsuspensie.
- Kleuren van cellen met celtype-specifieke antilichamen.
- Sortering van individuele celpopulaties met behulp van flowcytometrie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van verschillende neurale celtypen.
- Mogelijkheid om veranderingen in genexpressie specifiek voor celtypen te meten.
- Identificatie van celtypen die bepaalde receptoren en eiwitten tot expressie brengen.
- Inzichten in epigenetische modificaties in verschillende neurale populaties.
Conclusies
- De FACS-techniek is effectief voor het isoleren van neurale celtypen.
- Deze methode biedt een basis voor het bestuderen van celtype-specifieke mechanismen.
- Toekomstig onderzoek kan deze aanpak gebruiken om verschillende neurowetenschappelijke vragen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding cell-type-specific mechanisms in the brain is critical for de-risking target validation in neuroscience drug discovery. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) enables precise isolation of neural populations, supporting mechanistic de-risking by linking gene expression changes to specific cell types. This approach enhances predictive confidence in target selection by revealing cell-type-specific expression patterns that may be masked in whole-tissue analyses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by determining which neural cell types express specific receptors, proteins, or epigenetic markers.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct measurement of target engagement in defined cell populations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying cell-type-specific expression patterns that inform target prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated neural cell populations for downstream screening of compounds affecting gene or protein expression.
- Operational Value: Standardizes input material for assays, improving reproducibility and reducing variability in readouts.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple targets and brain regions through consistent cell isolation workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by preserving cell-type-specific epigenetic and expression profiles from discovery through validation.
- Operational Value: Provides quantitative, sortable outputs that align with translational biomarker strategies.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by confirming target expression in relevant human-equivalent cell types.
Pipeline & Workflow Integration
FACS integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, enabling cell-type-specific readouts that inform go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating cell types to assess target expression and pathway activity.
- Screening: Delivers purified cell populations for assay readiness, ensuring consistent compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative data on gene, protein, and epigenetic expression for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity through preserved cell-type-specific molecular profiles.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation capability applicable across multiple neuroscience projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility of neural cell preparations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency in early discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on cell-type-specific target validation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neural tissue dissociation, flow cytometry, and antibody panel design.
- Depends on access to cell sorters, centrifugation equipment, and myelin removal reagents.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols and gating strategies.
- Involves adaptation considerations for different brain regions and cell surface markers.
- Limited by tissue availability and viability constraints during enzymatic dissociation.
