Name: Th17 Ontsteking Model van orofaryngeale candidiasis in Immunodeficient Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Leer een Th17-inflammatiemodel van orofaryngeale candidiasis bij immuundeficiënte muizen. Deze methode helpt onderzoekers de rol van T-cel-gemedieerde immunopathologie bij Candida-infecties te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dr. Helene Bernstein voor het verstrekken van toegang tot haar flowcytometer. We danken ook de CFAR flowcytometriefaciliteit voor de flowcytometriediensten. Dit project werd gedeeltelijk ondersteund door CTSC kernutilisatie financiering en STERIS corporation/University Hospitals-Divisie van Infectieziekten subsidie aan PP.

OPMERKING: De experimenten met muizen werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele dierenwelzijn commissie (IACUC) richtlijnen. 1. Bereiding van de Rag-1 - / - muizen met I n Vitro Gekweekte Th17 cellen (Drie dagen voorafgaand aan de infectie) <ol><li> Voor de vaststelling Th17 cellen kweek CD4 + CD44low CD62Lhigh CD25- naïeve T-cellen (3 x 104) in U-bodem 96 putjes alleen of co-kweken ervan met 3 x 104 CD4 + CD25 + Foxp3 + Tregs in aanwezigheid van oplosbare α-CD3 (1 ug / ml), α-CD28 (2 ug / ml) antilichamen en antigen presenterende cellen, onder Th17 omstandigheden (gepolariseerde middels IL-6 (25 ng / ml), TGF-β (2 ng / ml) , α-IFN-γ (2 ug / ml) en α-IL-4 (2 ug / ml)) gedurende 3-4 dagen. OPMERKING: Naïve cellen en T-regs werden naargelang het gebruik van fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS) eend magnetische celisolatie procedures en gekweekt zoals eerder 19-22 beschreven. </li><li> Op dag 4 na het resuspenderen Th17 cellen met de pipet, verzamel uit kweken en centrifugeer ze onder steriele omstandigheden. <ol><li> Neem een ​​kleine hoeveelheid van deze cellen om hun levensvatbaarheid en voor fenotyperen onderzoeken. Resuspendeer ze in 500 pl RPMI medium, voeg propidiumjodide (200 ng / ml) en hun levensvatbaarheid onmiddellijk bepalen door flowcytometrie. Voeren fenotyperen door flowcytometrie beoordeling van IL-17A de productie na restimulatie (zie paragraaf 6.3). </li></ol></li><li> Centrifugeer en was het grootste deel van de cellen in steriele PBS bij 480 xg gedurende 6 min bij 4 ° C in alle stappen tenzij anders vermeld. </li><li> Gebruik deze cellen voor adoptieve overdracht in 6-8 weken oude CD45.2 RAG1 - / - immunodeficiënte muizen. <ol><li> Resuspendeer de cellen in 1 x 10 7 cellen / ml celdichtheid met koud steriel PBS. </li><li> Injecteer 100 ui van de cellen door intraperitoneal injectie, met behulp van 25 G naalden op 1 ml tuberculine spuiten, zodanig dat één muis ontvangt 1 x 10 6 cellen. Sommige muizen zal PBS of Th17 cellen alleen te ontvangen, en andere muizen zullen Th17 cellen die samen gekweekt met Treg cellen waren ontvangen. OPMERKING: Voer alle stappen aseptisch. </li></ol></li></ol> 2. Groeiende C. albicans voor infectie (een dag voor infectie) <ol><li> Voor enting, verspreiden vijf kolonies van de CAF2-1 C. albicans laboratoriumstam in 100 ul steriele PBS schorsing, en voeg de ophanging aan de steriele bouillon. </li><li> Inoculeer 5 kolonies van de C. albicans in 50 ml van de gist stikstof base (YNB zonder aminozuren) / pepton / Dextrose kweekmedium en geïncubeerd in een shaker incubator bij 30 ° C gedurende 15-18 uur bij 130 rpm. </li><li> Controleer de bouillon voor troebelheid, als een indicatie voor de groei van de schimmel. </li></ol> 3. CandidaOogsten en Counting Procedure (Op de Dag van de infectie) <ol><li> Verzamel 10 ml Candida bouillon in 15 ml buizen. Voor grotere hoeveelheden, verzamel Candida in 50 ml buizen. </li><li> Centrifugeer blastosporen 1900 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in alle stappen tenzij anders vermeld. Pellet blastosporen door centrifugeren, gevolgd door verwijdering van het supernatant. </li><li> Als er meer dan één buis, verzamel het Candida Blastosporen van meerdere buizen, toevoegen steriele PBS om de pellets en resuspendeer ze in 10 ml PBS te tellen. </li><li> Neem 20 pi van blastosporen in 1,5 ml microcentrifuge buizen, voeg 20 ul van 2X paraformaldehyde en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15-20 min. Tel de vaste blastosporen met de hemocytometer onder de microscoop. OPMERKING: Paraformaldehyde is kankerverwekkend. Open de onverdunde oplossing alleen in de zuurkast. </li><li> Intussen herhalen wassen blastosporen ten minste tweemaal door centrifugeren tzoom in PBS, en pelletiseren de blastosporen. Houd de pellets in 15 ml buisjes bij kamertemperatuur in de ABSL1 kap, klaar voor infectie. </li><li> Laat wat steriele PBS bij kamertemperatuur resuspenderen de blastosporen voor infectie. </li><li> Na tellen, voeg steriel PBS aan de blastospore pellet aan de gist blastospore celaantallen 2 x10 8 van gistcellen / ml toegepast. Dit is de blastospore suspensie die wordt gebruikt om de muizen te infecteren. OPMERKING: Voer alle stappen aseptisch. </li></ol> 4. Muizen Infectie (3-5 dagen na de Cel Transfer) OPMERKING: De basis infectie procedure wordt uitgevoerd zoals eerder 19,23-25 ​​beschreven. <ol><li> Weeg de Rag-1 - / - muizen die PBS of de cellen drie dagen eerder ontvangen. </li><li> Bereken de dosis anesthetica met hun lichaamsgewicht. Verdoven de muizen door toedienen van ketamine / xylazine mengsel (16,1 mg / ml en 1,6 mg / ml), met 25 G naalden op 1 ml tuberculine spuiten, door intraperitoneal injectie. <ol><li> Dien 50 ui per 10 g lichaamsgewicht. (Dwz 0,8 mg ketamine en 0,08 mg xylazine / 10 g lichaamsgewicht of 80 mg ketamine en 8 mg xylazine per kg lichaamsgewicht respectievelijk). Observeren voor teen knijpen respons om de 15 min na de anesthesie. LET OP: Deze dosering zal 60-90 min van anesthesie, wat genoeg is voor de infectie procedure induceren. </li><li> Breng de oftalmische zalf smeermiddel in de ogen van de muizen te voorkomen dat de hoornvliezen uitdroogt. Als het oog smeermiddel kan uitdrogen, herhaal oogheelkundige smering elke 45 min. </li></ol></li><li> Injecteer 1 ml zoutoplossing (0,9% NaCl) subcutaan aan de achterzijde grenzend aan de voorpoot, rehydratatie van de muizen helpen tijdens anesthesie. </li><li> Vraag een nieuwe, schone kooi. Volg de procedure infectie één muis tegelijk plaatsen elke muis in de nieuwe kooi eenmaal geïnfecteerd. Voer de PBS / schijnvertoning infectie eerste, en vervolgens overgaan tot de Candida-infectie groups. </li><li> Pak de verdoofde muis en de mond wijd aan de basis van de tong onthullen openen. <ol><li> Plaats een 3 mm diameter watten verzadigd met 50 pl PBS of blastospore suspensie, sublinguaal in de mondholte gedurende 90 min. Flip de muizen om de 15 min voorzijde en terug naar long congestie te voorkomen, ervoor te zorgen dat de katoenen ballen niet bewegen. </li></ol></li><li> Een timer voor elke muis 90 min Sham of Candida inoculatie waarborgen in de mondholte. </li><li> Houd ze in een kooi onder de warmtelamp (4 meter afstand), en elke muis op warmte gel pads. </li><li> Zorg ervoor dat de tong binnen en weg wordt onttrokken aan de tanden, tanden verscheurende de tong te voorkomen. </li><li> Aan het einde van de 90 minuten, verwijder de katoenen bal uit de mond van de muis. Kijk uit voor elke muis die kan herstellen van anesthesie eerder dan 75 minuten. In dat geval verdoven ze weer met slechts ketamine (40 mg / kg). </li></ol> 5. Bericht procedure Monitoring (tijdens de 90 min Anesthesie) <ol><li> Gebruik warmte gel pads tijdens de 90 min anesthesie. <ol><li> Om het lichaam op temperatuur te houden en om verstikking te voorkomen, staan ​​niet toe dat de muizen om te herstellen op de reguliere corn-cob muis beddengoed. </li></ol></li><li> Na het herstel van anesthesie, toedienen eens 1 ml steriele 0,9% NaCl subcutaan op twee plaatsen op de rug. </li><li> Blijf op de vijf PBS (sham) geënt muizen per kooi. Huis slechts 1-2 geïnfecteerde muizen per kooi. </li><li> Vul de procedure kaart met initialen elke dag na de procedure noteren de veranderingen in het lichaamsgewicht, verzorgen gewoonten en de algehele gezondheid. </li></ol> 6. Het beoordelen van de Ontsteking 6.1) Gewichtsverlies <ol><li> Weeg de muizen elke dag tijdens de infectie, ingaande op de dag voorafgaand aan de infectie procedure. OPMERKING: Typisch, de immunodeficiënte muizen geïnjecteerd met Th17 cellen en zonder T regs bezwijken voor 20-30% Gewichtsverlies door toegenomen schimmelbelasting 19 en verergerd ontsteking. </li></ol> 6.2) Histologie scoring van de tong <ol><li> Offeren de muizen door CO 2 stikken, gevolgd door cervicale dislocatie. </li><li> Open de kaken en ontleden de tong met een schaar en pincet. Gebruik stompe tang om de mond te houden en met de schaar reiken aan de achterkant van de mond naar de achterkant van de tong insnijden. </li><li> Voor immuuncytochemische hematoxyline en eosine (H &amp; E) kleuring van de tong weefsels, spoel de tong weefsels met ijskoude PBS. Voeg 5 ml van 10% formaline voor 2-3 tongen en ze op te lossen O / N in 15 ml buizen. <ol><li> De volgende dag, verwijder de formaline en dompel de weefsels in 5 ml 70% ethanol hyper-fixatie te voorkomen. Stuur ze naar commerciële dienst te gaan met inbedden in paraffine, snijden en kleuring van paraffine secties. OPMERKING: Commerciële histologie dienst wordt gebruikt om deze stappen uit te voeren. </li&gt; </ol></li><li> Als de dia&#39;s zijn terug van de commerciële histologie, de rang van de ontsteking en houdt de weefselcoupes onder een lichtmicroscoop. <ol><li> Score van 0 tot 5, waarbij 0 geen ontsteking, en 5 het meest ernstige ontsteking. Score de ontsteking met behulp van tabel 1. </li></ol></li></ol> 6.3) Cytokineproductie door Th17 cellen OPMERKING: Overmatige TNF-α productie is één van de uitlezingen op overmatige immunopathologie. Bij muizen adoptief overgebracht met Th17 cellen alleen veroorzaakt immunopathologie die wordt geassocieerd met overmatige productie van TNF-α in Th17 cellen. <ol><li> Verzamel een enkele celsuspensie van de milt, cervicale lymfeknopen, axillaire lymfeklieren en tong, met eerder beschreven werkwijzen 19,26. </li><li> Restimulate de cellen met forbolmyristaatacetaat (PMA) (50 ng / ml) en Ionomycine (500 ng / ml) gedurende 4 uur met Brefeldine A (10 ug / ml) in het last 2 uur. Was de cellen met PBS en bevestig ze met een commercieel fixatie / permeabilisatie kit volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Voer intracellulaire cytokine kleuring met fluorochroom geconjugeerde anti-TNF-α, anti-IL-17A en ROR-γt antilichamen zoals eerder 19 beschreven. </li><li> Kort resuspendeer de cellen in de 1X permeabilisatie buffer met de cocktail van anti-TNF-α, anti-IL-17A en ROR-γt antilichamen, elk antilichaam bij 2-3 ug / ml eindconcentratie. </li><li> Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij KT. </li><li> Na de incubatie was de cellen met 1X permeabilisatie buffer. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 500 gl PBS met 0,5% runderserumalbumine voor flowcytometrie analyse. </li></ol>

<ol><li>Allam, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-23-producing+CD68%28%2B%29+macrophage-like+cells+predominate+within+an+IL-17-polarized+infiltrate+in+chronic+periodontitis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Periodontology%22%5BJournal%5D)">IL-23-producing CD68(+) macrophage-like cells predominate within an IL-17-polarized infiltrate in chronic periodontitis lesions.</a> Journal of Clinical Periodontology. 38 (10), 879-886 (2011).</li>
<li>Loesche, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontal+disease%3A+link+to+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Compendium+Of+Continuing+Education+In+Dentistry%22%5BJournal%5D)">Periodontal disease: link to cardiovascular disease.</a> Compendium Of Continuing Education In Dentistry. 21 (6), 463-466 (2000).</li>
<li>Sfyroeras, G. S., Roussas, N., Saleptsis, V. G., Argyriou, C., Giannoukas, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+periodontal+disease+and+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Association between periodontal disease and stroke.</a> Journal Of Vascular Surgery. 55 (4), 1178-1184 (2012).</li>
<li>Huppler, A. R., Bishu, S., Gaffen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucocutaneous+candidiasis%3A+the+IL-17+pathway+and+implications+for+targeted+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mucocutaneous candidiasis: the IL-17 pathway and implications for targeted immunotherapy.</a> Arthritis Research & Therapy. 14 (4), 217(2012).</li>
<li>Sitheeque, M. A., Samaranayake, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+hyperplastic+candidosis%2Fcandidiasis+%28candidal+leukoplakia%29.+Critical+Reviews+In%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Biology+And+Medicine+%3A+An+Official+Publication+Of+The+American+Association+Of+Oral+Biologists%22%5BJournal%5D)">Chronic hyperplastic candidosis/candidiasis (candidal leukoplakia). Critical Reviews In.</a> Oral Biology And Medicine : An Official Publication Of The American Association Of Oral Biologists. 14 (4), 253-267 (2003).</li>
<li>Canabarro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+subgingival+colonization+of+Candida+albicans+and+other+yeasts+with+severity+of+chronic+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Periodontal+Research%22%5BJournal%5D)">Association of subgingival colonization of Candida albicans and other yeasts with severity of chronic periodontitis.</a> Journal Of Periodontal Research. 48 (4), 428-432 (2013).</li>
<li>Urzua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+diversity+in+the+oral+microbiota+of+subjects+with+periodontitis%3A+Candida+albicans+and+Candida+dubliniensis+colonize+the+periodontal+pockets%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Mycology%22%5BJournal%5D)">Yeast diversity in the oral microbiota of subjects with periodontitis: Candida albicans and Candida dubliniensis colonize the periodontal pockets.</a> Medical Mycology. 46 (8), 783-793 (2008).</li>
<li>Ergun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+status+and+Candida+colonization+in+patients+with+Sjogren%27s+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina+Oral%2C+Patologia+Oral+Y+Cirugia+Bucal%22%5BJournal%5D)">Oral status and Candida colonization in patients with Sjogren's Syndrome.</a> Medicina Oral, Patologia Oral Y Cirugia Bucal. 15 (2), e310-e315 (2010).</li>
<li>Hernandez, Y. L., Daniels, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+candidiasis+in+Sjogren%27s+syndrome%3A+prevalence%2C+clinical+correlations%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Surgery%2C+Oral+Medicine%2C+And+Oral+Pathology%22%5BJournal%5D)">Oral candidiasis in Sjogren's syndrome: prevalence, clinical correlations, and treatment.</a> Oral Surgery, Oral Medicine, And Oral Pathology. 68 (3), 324-329 (1989).</li>
<li>Gall, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+spp.+in+oral+cancer+and+oral+precancerous+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+Microbiologica%22%5BJournal%5D)">Candida spp. in oral cancer and oral precancerous lesions.</a> The New Microbiologica. 36 (3), 283-288 (2013).</li>
<li>Grady, J. F., Reade, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+as+a+promoter+of+oral+mucosal+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Candida albicans as a promoter of oral mucosal neoplasia.</a> Carcinogenesis. 13 (5), 783-786 (1992).</li>
<li>Dwivedi, P. P., Mallya, S., Dongari-Bagtzoglou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+immunocompetent+murine+model+for+Candida+albicans-promoted+oral+epithelial+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Mycology%22%5BJournal%5D)">A novel immunocompetent murine model for Candida albicans-promoted oral epithelial dysplasia.</a> Medical Mycology. 47 (2), 157-167 (2009).</li>
<li>Cheng, S. C., Joosten, L. A., Kullberg, B. J., Netea, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+Candida+albicans+and+the+mammalian+innate+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interplay between Candida albicans and the mammalian innate host defense.</a> Infection and Immunity. 80 (4), 1304-1313 (2012).</li>
<li>Marodi, L., Johnston, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+Candida+species+disease+in+infants+and+children%3A+occurrence%2C+risk+factors%2C+management%2C+and+innate+host+defense+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+In+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Invasive Candida species disease in infants and children: occurrence, risk factors, management, and innate host defense mechanisms.</a> Current Opinion In Pediatrics. 19 (6), 693-697 (2007).</li>
<li>Kumamoto, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+gastrointestinal+Candida+colonization.+Current+Opinion+In%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Inflammation and gastrointestinal Candida colonization. Current Opinion In.</a> Microbiology. 14 (4), 386-391 (2011).</li>
<li>Kraneveld, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relation+between+oral+Candida+load+and+bacterial+microbiome+profiles+in+Dutch+older+adults%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The relation between oral Candida load and bacterial microbiome profiles in Dutch older adults.</a> PloS One. 7 (8), e42770(2012).</li>
<li>Hernandez-Santos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+cells+confer+long-term+adaptive+immunity+to+oral+mucosal+Candida+albicans+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Th17 cells confer long-term adaptive immunity to oral mucosal Candida albicans infections.</a> Mucosal Immunology. 6 (5), 900-910 (2013).</li>
<li>Hasina, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABT-510+is+an+effective+chemopreventive+agent+in+the+mouse+4-nitroquinoline+1-oxide+model+of+oral+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Prevention+Research%22%5BJournal%5D)">ABT-510 is an effective chemopreventive agent in the mouse 4-nitroquinoline 1-oxide model of oral carcinogenesis.</a> Cancer Prevention Research. 2 (4), 385-393 (2009).</li>
<li>Pandiyan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29Foxp3%28%2B%29+regulatory+T+cells+promote+Th17+cells+in+vitro+and+enhance+host+resistance+in+mouse+Candida+albicans+Th17+cell+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells promote Th17 cells in vitro and enhance host resistance in mouse Candida albicans Th17 cell infection model.</a> Immunity. 34 (3), 422-434 (2011).</li>
<li>Pandiyan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+IL-15+in+activating+STAT5+and+fine-tuning+IL-17A+production+in+CD4+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of IL-15 in activating STAT5 and fine-tuning IL-17A production in CD4 T lymphocytes.</a> J Immunol. 189 (9), 4237-4246 (2012).</li>
<li>Pandiyan, P., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+CD4%2BCD25%2BFoxp3%2B+regulatory+T+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Direct%22%5BJournal%5D)">The control of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell survival.</a> Biology Direct. 3 (6), (2008).</li>
<li>Pandiyan, P., Zheng, L., Ishihara, S., Reed, J., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29Foxp3%28%2B%29+regulatory+T+cells+induce+cytokine+deprivation-mediated+apoptosis+of+effector+CD4%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells induce cytokine deprivation-mediated apoptosis of effector CD4(+) T cells.</a> Nat Immunol. 8 (12), 1353-1362 (2007).</li>
<li>Conti, H. R., Huppler, A. R., Whibley, N., Gaffen, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+In+Immunology%22%5BJournal%5D)">Animal models for candidiasis.</a> Current Protocols In Immunology. Coligan, J. E., et al. 105, 11-19 (2014).</li>
<li>Conti, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+cells+and+IL-17+receptor+signaling+are+essential+for+mucosal+host+defense+against+oral+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis.</a> J Exp Med. 206 (2), 299-311 (2009).</li>
<li>Kamai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+model+of+oropharyngeal+candidiasis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+And+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">New model of oropharyngeal candidiasis in mice.</a> Antimicrobial Agents And Chemotherapy. 45 (11), 3195-3197 (2001).</li>
<li>Pandiyan, P., Bhaskaran, N., Zhang, Y., Weinberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+T+cells+from+mouse+oral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Isolation of T cells from mouse oral tissues.</a> Biological Procedures Online. 16 (1), 4(2014).</li>
<li>Gladiator, A., Wangler, N., Trautwein-Weidner, K., LeibundGut-Landmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+IL-17-secreting+innate+lymphoid+cells+are+essential+for+host+defense+against+fungal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: IL-17-secreting innate lymphoid cells are essential for host defense against fungal infection.</a> J Immunol. 190 (2), 521-525 (2013).</li>
<li>Leppkes, M., Roulis, M., Neurath, M. F., Kollias, G., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+functions+of+TNF-alpha+in+the+regulation+of+the+intestinal+epithelial+response+to+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic functions of TNF-alpha in the regulation of the intestinal epithelial response to inflammation.</a> International Immunology. 26 (9), 509-515 (2014).</li>
<li>Bishu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptor+CARD9+is+required+for+adaptive+but+not+innate+immunity+to+oral+mucosal+Candida+albicans+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The adaptor CARD9 is required for adaptive but not innate immunity to oral mucosal Candida albicans infections.</a> Infection and Immunity. 82 (3), 1173-1180 (2014).</li>
<li>Quintin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+NK+cells+against+Candida+albicans+infection+in+immunocompetent+or+immunocompromised+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential role of NK cells against Candida albicans infection in immunocompetent or immunocompromised mice.</a> Eur J Immunol. 44 (8), 2405-2414 (2014).</li>
<li>Ramirez-Garcia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+and+cancer%3A+Can+this+yeast+induce+cancer+development+or+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+In+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida albicans and cancer: Can this yeast induce cancer development or progression.</a> Critical Reviews In Microbiology. , 1-13 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dit model is gebaseerd op het induceren van orale C. albicans infectie afhankelijk Th17 ontsteking. Door de afwezigheid van T regs, de Th17 cellen geïnduceerde ontsteking ongeremd en leidt tot slechte resolutie immunopathologie. In vitro verkregen naïeve CD4-cellen als gepolariseerde Th17 cellen werden gebruikt voor de adoptieve overdracht. 40 - 50% van de gekweekte CD4 + -cellen tonen detecteerbaar IL-17A expressie rond dag 3 (Th17 cellen), en daarom werden gebruikt voor de injectie bij mui...

Orale infecties en ontstekingen zijn gerelateerd aan kanker en hart- en vaatziekten, en hebben een dramatische impact op de algemene menselijke gezondheid2,3. Opportunistische infecties en ontstekingen veroorzaakt door C. albicans worden geassocieerd met primaire immunodeficiënties (PID)4,5, inflammatoire aandoeningen zoals parodontitis 6,7, het syndroom van Sjögren en aandoeningen van de speekselklieren8,9, evenals oraal plaveiselcelcarcinoom 10-12. C. albicans is een dimorfe commensaal schimmel die asymptomatisch de monden van 60% van gezonde mensen koloniseert, maar het is de meest voorkomende schimmelpathogeen die infecties veroorzaakt wanneer de afweer van de gastheer verzwakt is13-15. Het veroorzaakt terugkerende en chronische infecties en ontstekingen bij patiënten met AIDS en PID, en ook bij andere immuungecompromitteerde individuen. Als commensaal is de kolonisatiebelasting ervan geassocieerd met de verandering in de diversiteit van het algehele orale microbioom16. Als pathogeen veroorzaakt het verschillende vormen van orofaryngeale candidiasis zoals acute pseudomembraneuze, acute atrofische, chronische atrofische, chronische hypertrofische/hyperplastische en angulaire cheilitis. 
Bescherming tegen C. albicans wordt niet alleen bepaald door de immuunresistentie van de gastheer, maar ook door het vermogen om de door Candida geïnduceerde immunopathologie adequaat te beheersen. Hoewel commensale organismen zoals C. albicans bijdragen aan de modulatie en verergering van andere orale ontstekingsaandoeningen, zijn de mechanismen waardoor dysbiose optreedt tijdens opportunistische infecties onduidelijk. Naast de bekende rol van adaptieve Th17-cellen in de geheugenrespons op C. albicans17, blijft hun rol bij het initiëren en in stand houden van ontstekingspathologie tijdens chronische infecties onduidelijk. Verder zijn orale ontstekingsziekten zoals het syndroom van Sjögren en parodontitis geassocieerd met door Th17 gemedieerde pathologie. Interessant is dat deze ziekten ook sterk geassocieerd zijn met frequente OPC. De interacties tussen Th17-cellen, orale immunopathologie van OPC en andere orale ontstekingsziekten zijn echter niet onderzocht. 
Hoewel muismodellen van primaire en secundaire infectie van orale candidiasis beschikbaar zijn, is er geen muismodel om Candida-infectie geassocieerde Th17-ontsteking te bestuderen, vooral in de context van immunodeficiëntie. Deze studie presenteert een methode voor het vaststellen van orale Th17-ontsteking geassocieerd met orale Candida infectie bij muizen. Candida infectie bij muizen wordt gekenmerkt door schimmellaesies, ontsteking in de tong, verminderde voedselinname, gewichtsverlies en uiteindelijk een moribunde toestand. De orale pathologie lijkt op chronische schimmelinfectielaesies, evenals epitheeldysafie in orale muizenkankermodellen12,18.

<table><tbody><tr><td>CAF-2</td><td>University of Pittsburgh (Sarah Gaffen)</td><td>-</td><td>Candida-cultuur</td></tr><tr><td>U-bottom 96 well plates&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>055588</td><td>Gebruikt voor celcultuur</td></tr><tr><td>a-CD3&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-0031-85</td><td>Polarisatie van cellen naar Th17-omstandigheden</td></tr><tr><td>a-CD28&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td>Polarisatie van cellen naar Th17-omstandigheden</td></tr><tr><td>m-IL-6</td><td>Bio Basic</td><td>RC232</td><td>Polarisatie van cellen naar Th17-omstandigheden</td></tr><tr><td>h-TGF-b&nbsp;</td><td>R&amp;D</td><td>240-B</td><td>Polarisatie van cellen naar Th17-omstandigheden</td></tr><tr><td>a-IFN-g&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-7311-85</td><td>Polarisatie van cellen naar Th17-omstandigheden</td></tr><tr><td>a-IL-4&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>16-7041-85</td><td>Polarisatie van cellen naar Th17-omstandigheden</td></tr><tr><td>&alpha;-IL17A ef660</td><td>eBiosciences</td><td>50-7177-82</td><td>Gebruikt voor celcultuur - 1:50</td></tr><tr><td>&alpha;-TNFa-PE-Cy7</td><td>eBiosciences</td><td>25-7423-41</td><td>Gebruikt voor celcultuur - 1:100</td></tr><tr><td>&alpha;-RORgt PE&nbsp;</td><td>eBiosciences</td><td>12-6981-82</td><td>Gebruikt voor celcultuur - 1:50</td></tr><tr><td>YNB w/o amino acids)/Peptone/Dextrose broth medium&nbsp;</td><td>Bio Basic</td><td>S507.SIZE</td><td>Medium voor candida-groei</td></tr><tr><td>Shaker incubator&nbsp;</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4300</td><td>Incubatiegroei voor candida</td></tr><tr><td>15 ml buizen</td><td>Bio Basic</td><td>BT888-SY</td><td>Gebruikt voor celcultuur en candida-groei</td></tr><tr><td>50 ml buizen</td><td>Bio Basic</td><td>CT 788-YS</td><td>Gebruikt voor celcultuur en candida-groei</td></tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>VWR International LLC</td><td>82017-654</td><td>Voor pelleting candida -900 g</td></tr><tr><td>Allegra Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>392302</td><td>Celcultuur - 480 g</td></tr><tr><td>1,5 ml eppendorfbuizen</td><td>Bio Basic</td><td>BT620-NS</td><td>Bereiden van de uiteindelijke concentratie van candida</td></tr><tr><td>2x paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Fixeren van candida voor telling</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>VWR International LLC</td><td>15170-172</td><td>Tellen van cellen</td></tr><tr><td>PBS - fosfaatgebufferd zoutoplossing</td><td>Bio Basic</td><td>PD8117</td><td>Bereiding van buffers</td></tr><tr><td>Ketamine/xylazine&nbsp;</td><td>Case Western Reserve University - Animal Resource Center</td><td>-</td><td>Verkregen van ARC-goedgekeurd protocol voor anesthesie</td></tr><tr><td>Oftalmische smeermiddelen&nbsp;</td><td>Allergan</td><td>-</td><td>Oogzalf voor dieren om uitdroging te voorkomen</td></tr><tr><td>Zoutoplossing (0,9% NaCl)</td><td>G Biosciences</td><td>786-561</td><td>Toegediend aan dieren om uitdroging te voorkomen</td></tr><tr><td>3-mm-diameter katoenwolbal&nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>BP7603</td><td>3 mm ballen voor candida-infectie</td></tr><tr><td>Hitte-gelpads</td><td>Case Western Reserve University - Animal Resource Center</td><td>-</td><td>Voor het handhaven van de lichaamstemperatuur en snelle herstel</td></tr><tr><td>Hematoxyline en Eosine kleuring</td><td>Histoserv - MD</td><td>-</td><td>Weefselhistologie</td></tr><tr><td>10% formaline&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>JC1111/MC</td><td>Weefselhistologie</td></tr><tr><td>70% ethanol&nbsp;</td><td>VWR International LLC</td><td>97064-490</td><td>Sterilisatiedoel</td></tr><tr><td>PMA - Phorbol 12-myristaat 13-acetaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585-1MG</td><td>Re-stimulatie van cellen</td></tr><tr><td>Ionomycine</td><td>Life Technologies</td><td>124222 1mg</td><td>Re-stimulatie van cellen</td></tr><tr><td>Fixatie doorlaatbaarheid kit</td><td>eBiosciences</td><td>E16913-106</td><td>Cellen fixeren voor Flow cytometry</td></tr><tr><td>Tuberculin-spuitjes</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td>Injectie voor muizen</td></tr><tr><td>25 G x 3/8 naalden</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>Injectie voor muizen</td></tr><tr><td>Rag1 -/- muizen</td><td>Jackson laboratories</td><td>Stock no: 002216</td><td>Ontvanger muizen</td></tr><tr><td>CD45.1 congenic muizen</td><td>Jackson laboratories</td><td>Stock no:002014&nbsp;</td><td>Donor Th17 cellen</td></tr><tr><td>CB17-SCID muizen</td><td>Jackson laboratories</td><td>Stock no: 001303</td><td>Ontvanger muizen</td></tr><tr><td>Balb/c muizen</td><td>Jackson laboratories</td><td>Stock no: 000651</td><td>Donor Th17 cellen</td></tr></tbody></table>

th17 ontsteking model van orofaryngeale candidiasis in immunodeficient muizen

Th17 Inflammation Model of Oropharyngeal Candidiasis in Immunodeficient Mice

Orofaryngeale candidiasis (OPC) wordt niet alleen veroorzaakt door het ontbreken van immuunresistentie van de gastheer, maar ook door de afwezigheid van een passende regulering van infectie-geïnduceerde immunopathologie. Hoewel Th17-cellen betrokken zijn bij de antifungische verdediging, is hun rol in immunopathologie onduidelijk. Deze studie presenteert een methode voor het vaststellen van orale Th17 immunopathologie geassocieerd met orale candida-infectie bij immunodeficiënte muizen. De methode is gebaseerd op het reconstitueren van lymfopenische muizen met in vitro gekweekte Th17-cellen, gevolgd door orale infectie met Candida albicans (C. albicans). De resultaten tonen aan dat ongeremde Th17-cellen ontsteking en pathologie veroorzaken, en zijn geassocieerd met verschillende meetbare uitkomsten, waaronder gewichtsverlies, productie van pro-inflammatoire cytokinen, histopathologie van de tong en mortaliteit, wat aantoont dat dit model waardevol kan zijn in het bestuderen van OPC-immunopathologie. Adoptieve overdracht van regulerende cellen (Tregs) controleert en vermindert de ontstekingsreactie, wat aantoont dat dit model kan worden gebruikt om nieuwe strategieën te testen om orale ontsteking tegen te gaan. Dit model kan ook toepasbaar zijn in het bestuderen van orale Th17-immunopathologie in het algemeen in de context van andere orale ziekten.

In dit model, zowel de Candida geïnfecteerde muizen en niet-geïnfecteerde muizen in Rag-1 - / - immuundeficiënte achtergrond werden adoptief overgebracht met Th17 cellen 3-5 dagen voor de infectie. Een totaal van 10-12 muizen werden gebruikt voor de experimenten met 2 muizen in elke Sham geïnfecteerde groepen en 4-5 in elk van de Candida geïnfecteerde groepen. Naïeve cellen werden afgeleid van congenic Thy1.1 of CD45.1 muizen, zodat ingespoten Th17 cellen werden bijgehouden in vivo ...

Hoewel er Candida infectiemodellen beschikbaar zijn om de immuunresistentie van de gastheer te bestuderen, ontbreekt een model om T-celgemedieerde immunopathologie in de context van Candida infectie te bestuderen. Hier beschrijven we een methode om Th17 immunopathologie geassocieerd met orale Candida infectie in immuungecompromitteerde muizen te vestigen.

Th17 Ontsteking Model van orofaryngeale candidiasis in Immunodeficient Muizen

Oropharyngeal Candidiasis (OPC) disease is caused not only due to the lack of host immune resistance, but also the absence of appropriate regulation of ...

Het algemene doel van deze procedure is het ontwikkelen van een model van infectie-afhankelijke orale ontsteking die wordt gemedieerd door pathologische TH 17-cellen. Dit wordt bereikt door eerst TH 17-cellen in immuundeficiënte muizen te injecteren. De volgende stap is het kweken van de schimmel Candida albicans, het verzamelen van de blastosporen en het prepareren hiervan in PBS.De laatste stap is het oraal injecteren van de muizen met blastosporen om de proliferatie van de geïnjecteerde th 17-cellen te stimuleren en orale ontsteking op te wekken. De resultaten tonen aan dat th 17-geïnjecteerde muizen last krijgen van gewichtsverlies en tongontsteking, gebaseerd op flowcytometrie en immunohistochemische analyse van de tong. De implicaties van deze techniek strekken zich dus uit tot orale immunotherapie via dit muismodel.Het TH17-ontstekingsmodel kan ook worden gebruikt om TH17-ontsteking te bestuderen in de context van andere orale aandoeningen; de procedure wordt gedemonstreerd door me en nitrogen vascular, en een post-structural fellow in mijn laboratorium. Deze procedure vereist gesorteerde, naïeve T-cellen en optioneel treg-cellen om TH17-celculturen te vestigen. CD4-positiev

th17-inflammation-model-oropharyngeal-candidiasis-immunodeficient

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Belangrijke technieken om te worden gebruikt bij de evaluatie...

Protocollen voor Vaginale Inenting en Sample Collection in het experimenteel muismodel van Candida Vaginitis

Met effector functies te onderscheiden van andere T-cel subsets, zijn Th17 cellen centraal zijn betrokken bij inflammatoire auto-immuniteit. Deze in vitro Th17 differentiatie protocol verschaft een middel om te bepalen of naïeve CD4 + T-lymfocyten kunnen differentiëren in Th17 cellen en hun rol bij auto-immuniteit en gastheerrespons verder te onderzoeken.

Isolatie en Th17 Differentiatie van naïeve CD4 T-lymfocyten

De gastheer immuunrespons op pathogene infectie een strak gereguleerd proces. Met behulp van een lipopolysaccharide long exposure model in muizen, is het mogelijk om hoge resolutie evaluaties van de complexe mechanismen van pathogenese voeren.

Het gebruik van Oropharyngeal Intratracheaal PAMP Administratie en bronchoalveolaire lavage om de immuunrespons van de gastheer in Muizen Evalueer

Wasmot fungeert als een ongewervelde model voor gedissemineerde candidiasis. Hier, we detail de infectie protocol en ondersteunende gegevens verstrekken voor de effectiviteit van het model.

De wasmot Waxworm infectie Model voor verspreid Candidiasis

Hier presenteren we een effectieve en efficiënte methode voor injecties met knaagdierstaartaders met behulp van een uniek ontworpen opwarmings- / beperkingsapparaat. Door het stroomlijnen van de initiatie van vasodilatatie- en inperkingsprocessen, maakt dit protocol nauwkeurige en tijdige intraveneuze injecties van grote groepen dieren met minimale nood mogelijk.

Een eigentijds opwarmings-/inperkingsapparaat voor efficiënte staartaderinjecties in een murien schimmel sepsismodel

Periprothetische gewrichtsinfectie (PJI) veroorzaakt door gevaarlijke ziekteverwekkers komt vaak voor in de klinische orthopedie. Bestaande diermodellen kunnen de werkelijke situatie van PJI niet nauwkeurig simuleren. Hier hebben we een Candida albicans biofilm-geassocieerd PJI-muismodel opgezet om nieuwe therapieën voor PJI te onderzoeken en te ontwikkelen.

Een periprothetisch gewrichtsinfectiemodel van Candida albicans bij muizen

We stellen een muismodel op van C.albicans-geassocieerde kathetergerelateerde infectie (CRI), waarbij biofilm zich vormt op de katheter, en de interactie tussen C.albicans en gastheer goed correleert met de klinische CRI. Dit model helpt bij het screenen van therapieën voor C.albicans biofilm-geassocieerde CRI, waarmee een basis wordt gelegd voor klinische transformatie.

Een kathetergerelateerd Candida albicans-infectiemodel bij muizen

Dit protocol beschrijft de toepassing van antimicrobiële fotodynamische therapie (aPDT) in een muizenmodel van orale candidiasis. aPDT werd uitgevoerd met behulp van een in water oplosbaar mengsel van curcuminoïden en blauw LED-licht.

Curcuminoïde-gemedieerde antimicrobiële fotodynamische therapie op een muizenmodel van orale candidiasis

Dit protocol beschrijft de differentiatie van naïeve CD4+ T-cellen tot pathogene Th17-cellen in vitro. In combinatie met een op flowcytometrie gebaseerde benadering met meerdere parameters kan met behulp van deze differentiatiemethode een zuiverheid van 90% van pathogene Th17-cellen worden verkregen uit naïeve CD4+ T-cellen.

In vitro differentiatie van naïeve CD4+ T-cellen tot pathogene Th17-cellen in muizen

Het huidige protocol schetst de toepassing van organotypische weefselmodellen voor het onderzoeken van gastheer-pathogeen interacties in vitro. Concreet maakt het beschreven modelsysteem gebruik van een meerlagig oraal epitheel dat wordt blootgesteld aan micro-organismen geassocieerd met biofilms (tandplak) in de context van mondgezondheid versus ziekte.

Organotypische weefselmodelsystemen voor het onderzoeken van gastheer-pathogeen interacties in vitro

Leer een Th17-inflammatiemodel van orofaryngeale candidiasis bij immuundeficiënte muizen. Deze methode helpt onderzoekers de rol van T-cel-gemedieerde immunopathologie bij Candida-infecties te bestuderen.

Th17 Ontsteking Model van orofaryngeale candidiasis in Immunodeficient Muizen

Meer video's verkennen