Name: Spanning en Calcium Dual Channel Optische kaart brengen van Gekweekte HL-1 atriale Myocyte Monolayer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Leer duale optische mapping van spanning en calcium in HL-1 atriale myocytmonolagen. Deze methode maakt gelijktijdige visualisatie van actiepotentialen en calciumtransiënten mogelijk voor cardiaal elektrofysiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Dr. Claycomb bedanken voor het verstrekken van de HL-1 cellen en gedetailleerde onderhoud protocol. We willen ook graag mevrouw Elena Carrillo en Dr Seth Robia bedanken voor hun hulp bij het genereren van de cel film en Mr. Pete Caron voor zijn hulp bij het maken van een aantal accessoires voor onze dual channel optische mapping systeem. Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association (10GRNT3770030 &amp; 12GRNT12050478 aan XA), National Institutes of Health (HL113640 aan XA), en Loyola University Research Development Fund (XA).

1. Oplossing Voorbereiding <ol><li> Noradrenaline (NP) oplossing <ol><li> Los op 40 mg NP in 25 ml 30 mM ascorbinezuur (0,1475 g ascorbinezuur in 25 ml gezuiverd Milli-Q (MQ) water. Vermijd directe blootstelling aan licht tijdens deze oplossing voorbereiding omdat norepinefrine (NP) is lichtgevoelig. </li><li> Filter de NP-oplossing met een 0,22 pm spuitfilter. Aliquot de oplossing in 1 ml steriele microbuisjes en bewaar bij -20 ° C. Eenmaal bevroren, NP is een maand stabiel. </li></ol></li><li> Aangevulde Wash en Final Claycomb media <ol><li> Begin met 43,5 ml Claycomb medium en aangevuld met 5 ml foetaal runderserum (FBS), 0,5 ml penicilline / streptomycine, 0,5 ml NP en 1: 100 verdund L-Glutamine om 50 ml uiteindelijke aangevuld Claycomb medium. Vermijd directe blootstelling aan licht tijdens deze oplossing voorbereiding omdat Claycomb medium is lichtgevoelig. </li><li> Bereid de Wash Claycomb medium met behulp van hetzelfde recept als de supvuld Claycomb medium behalve voeg 5% FBS en laat de NP en L-glutamine componenten. OPMERKING: De aangevuld Final en Wash Claycomb media zijn goed voor twee weken indien bewaard bij 4 ° C zonder directe blootstelling aan licht. </li></ol></li><li> Sojaboon trypsine remmende oplossing <ol><li> Los 25 mg van sojaboontrypsineremmer in 100 ml Ca-Mg-vrij en vrij Dulbecco&#39;s fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Filtreer de oplossing met behulp van een 0,22 pm spuitfilter. OPMERKING: De gesteriliseerde oplossing is een maand stabiel indien bewaard bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Gelatine / Fibronectine gerecht bedekkingsoplossing <ol><li> Los 0,1 g gelatine in 500 ml MQ water tot 0,02% gelatine maken. </li><li> Autoclaaf, dan verdunnen 1 ml van fibronectine in 199 ml van 0,02% gelatine en meng voorzichtig. </li><li> Aliquot 6 ml gelatine-oplossing in afzonderlijke buizen en bewaar bij -20 ° C. </li></ol></li><li> Hanks &#39;Zout oplossing <ol><li> Met behulp van een roerplaat, los de volgende zouten in MQ water (mmol / L), NaCl (136,9), KCl (5,366), KH 2 PO 4 (0,4409), NaH 2 PO 4 (0,4000), MgSO4 (0,8142), D-Glc (5,051), NaHCO3 (4,162), HEPES (5,042), CaCl2 (1.261). </li></ol></li><li> Calcium gevoelige kleurstof (Rhod2) oplossing <ol><li> Verdun 1 mg Rhod2 droog poeder in 400 pl van 20% Pluronic F-127 in DMSO om een ​​Rhod2 kleurstofvoorraadoplossing en bewaar bij -20 ° C. </li><li> Verdun deze oplossing 1: 1000 met Hanks &#39;Zout oplossing voor een laatste werkende oplossing te maken voor aanvang van het experiment. </li></ol></li><li> Voltage kleurstof (Rh237) oplossing <ol><li> Verdun 5 mg Rh237 met 2 ml DMSO voorraadoplossing en kassa bij -20 ° C. Verdun de voorraad oplossing 1: 1000 met Hanks &#39;Zout oplossing voor een laatste werkende oplossing te maken voor aanvang van het experiment. </li></ol></li></ol> &amp; #160; OPMERKING: 4/1 oplossingen zijn gebaseerd op de Claycomb HL-1 celcultuur protocol met kleine modificatie. 2. Passage en het kweken HL-1 atriale Myocyten op Coverslips OPMERKING: De HL-1 cellen kunnen worden verkregen van Dr. Claycomb (Louisiana State University). <ol><li> Grow HL-1 cellen in T25 flessen en voeden met 5 ml aangevuld Claycomb Medium dagelijks. Passage de cellen in T25 kolven vijf dagen volgens de Claycomb HL-1 celcultuur protocol (hierna beschreven) 10. </li><li> Plaats ronde dekglaasjes (20 mm diameter) in 12-putjes 24 uur voordat de cellen in de T25 kolf volledig confluente en klaar om te worden gepasseerd en dek de dekglaasjes met gelatine / fibronectine nacht bij 37 ° C. </li><li> De volgende dag, aspireren en gooi de gelatine / fibronectine uit de kweek platen en vervangen door 1,5 ml aangevuld Final Claycomb medium in elk putje. </li><li> Split cellen van een T25 culture kolf na het bereiken van volledige confluentie op dag 5. Zuig het medium van de T25 kolf die de confluente cultuur en spoel de cultuur kort in PBS bij 37 ° C. </li><li> Zuig PBS en 3 ml 0,05% trypsine / EDTA bij 37 ° C door pipetteren de trypsine / EDTA op de bodem van de T25 kolf direct contact met de cellen te voorkomen. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 min. </li><li> Verwijder trypsine / EDTA door aspiratie en voeg nog eens 1,3 ml trypsine / EDTA per T25 fles. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 min. Onderzoeken onder een microscoop en als cellen zijn nog steeds verbonden aan de kolf, tikt u op om volledig te verjagen overige cellen. </li><li> Voeg 1,3 ml sojaboontrypsineremmer de cellen en overdracht cellen uit de kolf in een 15 ml centrifugebuis. Spoel de lege fles met 5 ml Wash Claycomb medium. Voeg de spoeling aan de cellen in 15 ml centrifugebuis. Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Na centrifugeren, zuig de supernatant en voorzichtig resuspendeer de celpelletin 6 ml aangevuld Final Claycomb medium. </li><li> Seed elk putje van een 12-wells plaat met 0,5 ml celsuspensie van cel passage. Voeden de cellen met vers aangevulde Final Claycomb medium dagelijks. OPMERKING: nauwlettend toezien op de groei van de cellen, meestal de celmonolagen bereiken samenvloeiing-status op dag 4 en de spontane activiteiten blijven zichtbaar. Vervolgens wordt de cultuur monolaag klaar voor optische afbeelding op dag 4-5 zijn. </li></ol> 3. Laden Calcium en Voltage Sensitive Kleurstoffen aan de cellen <ol><li> Voor optische mapping studies, verwijder voorzichtig het dekglaasje van de 12-well celkweekplaat en spoel af met Hanks &#39;Zout oplossing. </li><li> Cellen kleuren met Ca kleurstof Rhod2 Incubeer de cel monolaag op het dekglaasje met 3 ml van de geoxygeneerde (borrelen met 5% CO2 / 95% O2 gas) Rhod2 werkoplossing bij 37 ° C in een waterbad gedurende 30 min . </li><li> Om de cellen met Vm kleurstof vlekkenRh237, dompel de Rhod2 geladen celmonolaag in 3 ml geoxygeneerde Rh237 werkoplossing bij 37 ° C in een waterbad gedurende 15 min. </li></ol> 4. Dual Channel Optical Mapping <ol><li> Plaats de cel monolaag, die dubbel gekleurd met Vm en Ca kleurstoffen, in een circulatiekamer op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Gebruik een verwarmde circulatie systeem om de temperatuur van de celkamer 35 ± 1 ° C te houden. Controle voorzichtig de temperatuur van het perfusaat door de snelheid van de circulatiestroom passen door een kamer naar een helling van meer dan 0,3 ° C in de kamer te vermijden. <ol><li> Voor de opname V m / Ca-signalen, was de cel monolaag met verse Hanks oplossing voor ongeveer 5 minuten om de resterende kleurstof uit de vorige stappen vlekken te verwijderen. </li></ol></li><li> Pace gezonde cel monolagen met een bipolaire elektrode bestaande uit een glazen pipet gevuld met Hanks &#39;Zoutoplossing en een silveh draad gewikkeld rond de pipettip zoals eerder beschreven 12,17. </li><li> Pace gezonde celmonolagen bij een cyclus lengte van 200-500 msec en puls breedte van 2 ms, verwacht een stimulatiedrempel op ongeveer 1 mV. Opmerking: voor elke partij gekweekte monolagen, ten minste twee niet behandelde monolagen worden gebruikt om de toestand van de cel batch testen. Gezonde controle monolagen moeten kunnen worden opgevangen door elektrische stimulatie bij cyclus lengte van 200-500 msec. Als de besturing monolagen niet elektrisch gestimuleerd, suggereert dit dat de gehele cel partij niet geschikt voor optische mapping experimenten zijn. </li><li> Om zowel Vm en Ca gevoelige kleurstoffen wekken, gebruikt een LED lichtbron (520 nm golflengte) gekoppeld aan een excitatie filter (510 nm / 40) en een dichroïsche spiegel (561 nm). <ol><li> Verzamel de fluorescerende signalen van de cellen via een 40X objectief en splitsen met een dichroïsche spiegel (594 nm) in een Vm component en een Ca.Filtreer het uitgestraalde licht in de Vm kanaal met een lange pass filter (700 nm) en het uitgezonden licht in de Ca kanaal met een banddoorlaatfilter (585/40 nm). </li><li> Verzamel de gefilterde tl-licht met behulp van twee CCD-camera&#39;s (80 x 80 pixels, 1000 bps; RedShirt Imaging). </li><li> Om kleurstof fotobleken voorkomen, maken opnames voor minder dan 2 seconden op elke gezichtsveld van de tijd van blootstelling aan licht te beperken. Hier, meestal afbeelding vier verschillende gebieden voor elke monolaag. </li></ol></li></ol> 5. Data Processing van V m of Ca Recordings <ol><li> Zowel Vm en Ca signalen (80 x 80 pixels), het gemiddelde van de intensiteitswaarden van vijfentwintig (5 x 5) aangrenzende pixels in een intensiteitswaarde op verschillende opnametijd punten achtergrondruis te verminderen. OPMERKING: Nadat de gegevens middeling, elke opname tijdstip van een individuele actiepotentiaal of Ca voorbijgaande levert een data matrix met 16 x 16 gemiddelde intensiteit waarden (gemiddeldgegevenskanalen) met een ruimtelijke resolutie van 50 pm. </li><li> Definieer activering tijd (AT) van opgenomen V m of Ca-signalen. <ol><li> Een activeringstijd (AT) van een individuele actiepotentiaal of Ca voorbijgaande definiëren, bepalen het tijdstip van 50% van piek amplitude van de Vm of Ca signalen met een op maat gemaakte MATLAB-gebaseerde algoritme zoals eerder beschreven. 12 </li><li> Handmatig nagelezen de geanalyseerde ATs om eventuele fouten die kunnen optreden tijdens het programma-analyse te elimineren. </li><li> Bewaar de gedefinieerde AT matrix (16 x 16 gemiddelde gegevens kanalen) van opgenomen actiepotentiaal en calcium van voorbijgaande aard, die respectievelijk in de gebruikte software. </li></ol></li><li> Bereken actiepotentiaal of calcium voorbijgaande geleidingssnelheid (CV) vectoren op de AT-matrix met behulp van de vector veld analysemethode zoals eerder beschreven met kleine aanpassingen 12,18. <ol><li> Bereken de CV vector van een gegevenskanaal opzichte van de omringende AT datapunten (5 ×; 5 naburige gemiddelde gegevens kanalen) voor het simuleren van een glad oppervlak polynoom van activering tijden (aan de oppervlakte) met behulp van een kleinste-kwadraten algoritme binnen de MATLAB-programma 12,18. </li><li> Bereken geleiding vector met behulp van de onderstaande formules Formule 1: <img alt="Vergelijking 1" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52542/52542eq1.jpg" /> Formule 2: θ = arctan [(dy / dT) / (dx / dT)] OPMERKING: Ve is een CV vector geprojecteerd op x- en y-assen; dx / dT is de projectie van de CV vector x-as; dy / dT is de projectie van de vector in CV y-as. T is het aan de oppervlakte; x, y Raadpleeg de 2-D coördinaten; T x = ∂T / ∂x is de partiële afgeleide van T met betrekking tot x; Ty = ∂T / ∂y is de partiële afgeleide van T met betrekking tot y; θ is de uiteindelijke richting van een CV vector. </li><li> Group alle vectoren van de AT matrix in 36 routes, die elk omvat tien graden sector op het kompas. &lt;/ Li&gt; <li> Selecteer het pad met de grootste bevolking van de CV vectoren onder de 36 geleidingsroutes. Bereken de gemiddelde CV van deze route de CV van de monolaag vormen. </li></ol></li></ol> 6. Visualisatie van het golffront Voortplanting <ol><li> Normaliseren van de intensiteit van het signaal van een individuele actiepotentiaal of Ca voorbijgaande op verschillende opnametijd punten ten opzichte van de piek waarde met behulp van MATLAB-software. </li><li> Tijdelijk de genormaliseerde intensiteit gegevens van elke geregistreerde tijd punt op te slaan in een 16 x 16 intensiteit matrix in de MATLAB-software gebruikt. </li><li> De bouw van een kleurcode intensiteit kaart uit de opgeslagen intensiteit matrix van elke opname tijdstip met behulp van de surf.m functie. OPMERKING: In de kaart intensiteit, rood staat voor een hoge intensiteit van de V m of Ca-signalen, en blauw weerspiegelt lage intensiteit van de fluorescentie-signalen. </li><li> Maak een .avi-bestand met behulp van de avifile.m functie. </li><li> Bewaar alle de intensity kaarten op verschillende opnametijd punten van de actiepotentiaal of Ca voorbijgaande behulp van de addframe.m functie. LET OP: Op dit punt, zal twee aparte avi bestanden van V m en Ca voortplanting worden gegenereerd. </li></ol>

<ol><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li>
<li>Salama, G., Hwang, S. M., et al. Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSalama%2C+G+%22Current+protocols+in+cytometry+%2F+editorial+board%2C+J.+Paul+Robinson%2C+managing+editor+...+%5Bet+al.%5D%22">Current protocols in cytometry / editorial board, J. Paul Robinson, managing editor ... [et al.]</a>. 12 (Unit 12 17), (2009).</li>
<li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280 (5), H2053-H2060 (2001).</li>
<li>Fast, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+optical+imaging+of+membrane+potential+and+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electrocardiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous optical imaging of membrane potential and intracellular calcium.</a> J Electrocardiol. 38 (4 Suppl), 107-112 (2005).</li>
<li>Sowell, B., Fast, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+mechanism+of+shock-induced+arrhythmias%3A+role+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Ionic mechanism of shock-induced arrhythmias: role of intracellular calcium.</a> Heart Rhythm. 9 (1), 96-104 (2012).</li>
<li>Fast, V. G., Kleber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+conduction+in+cultured+strands+of+neonatal+rat+heart+cells+measured+with+voltage-sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Microscopic conduction in cultured strands of neonatal rat heart cells measured with voltage-sensitive dyes.</a> Circ Res. 73 (5), 914-925 (1993).</li>
<li>Hou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+role+for+HERG+in+determining+frequency+of+reentry+in+neonatal+rat+ventricular+myocyte+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">A major role for HERG in determining frequency of reentry in neonatal rat ventricular myocyte monolayer.</a> Circ Res. 107 (12), 1503-1511 (2010).</li>
<li>Beauchamp, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+contributions+of+connexins+40+and+43+to+atrial+impulse+propagation+in+synthetic+strands+of+neonatal+and+fetal+murine+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Relative contributions of connexins 40 and 43 to atrial impulse propagation in synthetic strands of neonatal and fetal murine cardiomyocytes.</a> Circ Res. 99 (11), 1216-1224 (2006).</li>
<li>Xia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+L-+and+T-type+Ca2%2B+channels+in+murine+HL-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Functional expression of L- and T-type Ca2+ channels in murine HL-1 cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 36 (1), 111-119 (2004).</li>
<li>Claycomb, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HL-1+cells%3A+a+cardiac+muscle+cell+line+that+contracts+and+retains+phenotypic+characteristics+of+the+adult+cardiomyocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (6), 2979-2984 (1998).</li>
<li>Fahrenbach, J. P., Ai, X., Banach, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+intercellular+coupling+improves+the+function+of+cardiac+pacemakers+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Decreased intercellular coupling improves the function of cardiac pacemakers derived from mouse embryonic stem cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 45 (5), 642-649 (2008).</li>
<li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Jun+N-terminal+kinase+activation+contributes+to+reduced+connexin43+and+development+of+atrial+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">c-Jun N-terminal kinase activation contributes to reduced connexin43 and development of atrial arrhythmias.</a> Cardiovasc Res. 97 (3), 589-597 (2013).</li>
<li>White, S. M., Constantin, P. E., Claycomb, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+physiology+at+the+cellular+level%3A+use+of+cultured+HL-1+cardiomyocytes+for+studies+of+cardiac+muscle+cell+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac physiology at the cellular level: use of cultured HL-1 cardiomyocytes for studies of cardiac muscle cell structure and function.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H823-H829 (2004).</li>
<li>Yang, Z., Shen, W., Rottman, J. N., Wikswo, J. P., Murray, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+stimulation+causes+electrical+remodeling+in+cultured+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Rapid stimulation causes electrical remodeling in cultured atrial myocytes.</a> J Mol Cell Cardiol. 38 (2), 299-308 (2005).</li>
<li>Brundel, B. J., Kampinga, H. H., Henning, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain+inhibition+prevents+pacing-induced+cellular+remodeling+in+a+HL-1+myocyte+model+for+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Calpain inhibition prevents pacing-induced cellular remodeling in a HL-1 myocyte model for atrial fibrillation.</a> Cardiovasc Res. 62 (3), 521-528 (2004).</li>
<li>Umapathy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrogram+fractionation+in+murine+HL-1+atrial+monolayer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Electrogram fractionation in murine HL-1 atrial monolayer model.</a> Heart Rhythm. 5 (7), 1029-1035 (2008).</li>
<li>Fast, V. G., Cheek, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+arrhythmias+induced+by+strong+electrical+shocks+in+myocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of arrhythmias induced by strong electrical shocks in myocyte cultures.</a> Circ Res. 90 (6), 664-670 (2002).</li>
<li>Bayly, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+conduction+velocity+vector+fields+from+epicardial+mapping+data%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Estimation of conduction velocity vector fields from epicardial mapping data.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 45 (5), 563-571 (1998).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten zijn aangegeven.

Dit artikel beschrijft de belangrijkste aspecten van de optische kaart brengen in een beschaafde HL-1 atriale myocyt monolaag gekleurd met calcium en spanning gevoelige fluorescerende kleurstoffen. Het omvat het kweken van een optimale HL-1 celmonolaag, setup van het in kaart brengen van apparatuur, in kaart brengen van een beschaafde monolaag, en data-analyse. Om gekweekte cellen succesvol kaart, de sleutel is om een ​​gelijkmatig verdeelde monolaag bereiden. Wanneer zaaien de cellen op de ...

Een uniek calcium (Ca) en spanning (V m) dual channel optische mapping techniek 1-5 is in opkomst als een efficiënt instrument om tegelijkertijd op te nemen V m en Ca-signalen in zowel intacte hart en gekweekte celmonolagen. Deze techniek maakt het mogelijk om krachtige informatie over de relatie tussen calcium transiënten en actiepotentialen beter inzicht in de onderliggende elektrofysiologische mechanismen van cardiale aritmieën verkrijgen. Gekweekte cel monolagen heeft bewezen een geschikte cellulaire model cardiale elektrofysiologie en het onderliggende mechanisme van aritmieën bestuderen. 4,6-8 HL-1-cellen zijn een goed gekarakteriseerde atriale myocyt cultuur lijn. HL-1 cellen houden ook een unieke, gedifferentieerde genotype en fenotype dat morfologische, elektrofysiologische en farmacologische karakteristieken van volwassen atriale myocytes omvat. Deze cellen brengen cardiale genen en eiwitten, waaronder important cardiale ionenkanalen (bijvoorbeeld L- en T-type calciumkanalen) 9 en volwassen isovormen van sarcomeer contractiele eiwitten normaal bij volwassen atriale myocyten zoals anderen en we hebben eerder gemeld. 13/10 Bovendien kan HL-1 cellen gekweekt om een ​​2-dimensionaal (2-D) myocyt monolaag vormen. Aldus, de voordelen van gekweekte HL-1 monolagen omvatten: 1) relatief goedkoper en gemakkelijker om myocyten cultuur lijn dan isoleren en kweken van primaire neonatale myocyten handhaven; 2) een confluente monolaag van cellen vermindert de structurele complexiteit als gevolg van de 3-D structuur van het hart; 3) een cel monolaag kan de interferentie van interstitiële fibrose die optreedt in het intacte hart elimineren. Dit kan worden gebruikt om specifieke elektrofysiologische functies van een groep myocyten ontleden zonder tussenkomst van fibroblasten en interstitiële matrix; 4) de beoordeling van de functionele gevolgen van farmacologische of genetische manipulatie in culreerde celmonolagen effectief worden bereikt. Daarom hebben HL-1 cellen een veelgebruikt cellulair model voor de studie diverse aspecten van myocyten fysiologie evenals stimulatie geïnduceerde abnormale elektrische activiteiten. 13-16 echter speciale behandeling en zorg nodig cultuur gezonde cel monolagen die reageren op externe elektrische pacing voor optische mapping studies. Bovendien kunnen duale fluorescente kleurstof kleuring procedure gemakkelijk de integriteit van gekweekte confluente celmonolagen beschadigen. Zo, het uitvoeren van V m / CA dual channel optische mapping in gekweekte HL-1 monolagen is een grote uitdaging. Het doel van deze methode is om de sleutel te stappen bieden voor het succesvol uitvoeren van dual channel optische mapping in gekweekte HL-1 monolagen. Hier hebben we uitgebreide informatie verstrekt over een geoptimaliseerd protocol voor HL-1 celmonolaag voorbereiding, dual channel optische kaart brengen van een gekweekte cel monolaag, en in kaart brengen dataverwerking.

<table><tbody><tr><td>Rhod2 droog poeder</td><td>AAT Bioquest</td><td>21062</td><td></td></tr><tr><td>pluronic</td><td>AAT Bioquest</td><td>20050</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Rh237</td><td>Invitrogen</td><td>S-1109</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>HEPEs</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr></tbody></table>

spanning en calcium dual channel optische kaart brengen van gekweekte hl-1 atriale myocyte monolayer

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optische mapping heeft bewezen een waardevolle techniek cardiale elektrische activiteit te detecteren op zowel intacte ex vivo hart en in gekweekte myocyten monolagen zijn. HL-1-cellen zijn op grote schaal gebruikt als een 2-dimensionale cellulaire model voor het bestuderen van verschillende aspecten van cardiale fysiologie. Echter, is het een grote uitdaging om optisch kaart calcium (Ca) transiënten en actiepotentialen tegelijkertijd uit hetzelfde gezichtsveld in een beschaafde HL-1 atriale celmonolaag. Dit is omdat speciale behandeling en zorg nodig gezonde cellen die elektrisch kunnen worden vastgelegd en optisch gekoppeld bereiden. Daarom hebben wij een optimale werking protocol voor dual channel optische mapping ontwikkeld. In dit manuscript, hebben we in detail beschreven hoe de dual channel optische mapping experiment uit te voeren. Dit protocol is een nuttig instrument om het begrip van de actiepotentiaal vermeerdering en Ca kinetiek in aritmie ontwikkeling te vergroten.

Een beschaafde samenvloeiende monolaag vertoont een regelmatige intrinsieke ritme zoals aangetoond in Film 1. We vervolgens uitgevoerd V m / Ca dual channel optische mapping in een volledig samenvloeiende HL-1 monolaag. Figuur 1A toont bijvoorbeeld sporen van V m en Ca-signalen van een opgenomen enkele verslaan. Representatieve isochrone kaarten gelijkmatig gekweekte Vm en Ca signalen via de tweekanaals optische mapping systeem getoond in figuren...

Dit artikel beschrijft de techniek die wordt gebruikt om dubbelkanaals optisch karteren uit te voeren in gekweekte HL-1 atriale celmonolagen. Dit unieke protocol maakt de gelijktijdige visualisatie van zowel calcium (Ca) als spanning (Vm) activiteit in hetzelfde gebied mogelijk voor de gedetailleerde detectie en analyse van elektrofysiologische eigenschappen van gekweekte monolagen.

Spanning en Calcium Dual Channel Optische kaart brengen van Gekweekte HL-1 atriale Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Het algemene doel van deze procedure is om gelijktijdig transmembraanpotentialen en calciumtransiënten in kaart te brengen in HL one atriummonolagen die zijn geladen met zowel calcium- als voltagesensitieve kleurstoffen. Dit wordt bereikt door de HL one-cellen eerst op een dekglas te kweken tot een geschikte confluente dichtheid. De tweede stap is het laden van de calcium- en voltagesensitieve kleurstoffen in de cellen.Vervolgens wordt de HL-monolaag gestimuleerd met een bipolaire elektrode. De laatste stap is het registreren van het actiepotentiaal en de calciumtransiënte signalen via fluorescentiemicroscopie. Uiteindelijk kunnen de sporen van het actiepotentiaal en de calciumtransiënten worden samengesteld om de propagatie van de signalen over de confluente monolaag in de tijd weer te geven.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de cardiale elektrofysiologie, zoals de relatie tussen calcium, transiënten en actiepotentialen. In de elektrofysiologische eigenschappen van gecultiveerde HL-1-cellen die zijn blootgesteld aan diverse medicamenteuze behandelingen, kan deze methode inzicht bieden in patronen van actiepotentialen en de propagatie van calciumtransiënten op microscopisch niveau. Het kan tevens worden toegepast op biologische systemen, zoals pathologisch geremodeleerde menselijke harten en aritmogene diermodellen.Over het algemeen hebben personen die nieuw zijn met deze methode moeite, omdat HL-1-cellen die cardiale muisfenotypes behouden moeilijk te kweken zijn en zorgvuldig moeten worden geoptimaliseerd. Het protocol is vereist voor de kweekpassage en de stabiele monolaag. Begin met het maken van alle stokoplossingen voor het experiment zoals aangegeven in het tekstprotocol; kweek de HL-1-cellen in T25-flasks en vervang het medium dagelijks door 5 mL vers aangevuld Claycomb-medium.De cellen moeten op dag 5 klaar zijn voor passage, 24 uur voordat de HL-60-cellen confluente worden. Plaats ronde dekglasplaatjes van 20 millimeter in de wells van een 12-wells kweekplaat. Voeg één milliliter van de gelatine-fibronectine-oplossing toe aan elke well om de dekglasplaatjes te coaten, en incubeer de plaat vervolgens gedurende de nacht bij 37 °C.Aspireer de volgende dag de gelatine-fibronectine-oplossing uit de wells van de kweekplaat en voeg vervolgens 1,5 milliliters aangevuld finaal clay home-medium toe aan elke well. Aspireer daarna het medium uit de T 25-fles met de HL-1-cellen en spoel de kweek kort af met PBS bij 37 degrees Celsius. Aspireer het PBS uit de fles en voeg drie milliliters van de trypsine-EDTA-oplossing toe aan de bodem van de T 25-fles; laat de fles voorzichtig zakken en roteer deze om de cellen met de oplossing te bedekken zonder de cellen te verstoren, en plaats de fles vervolgens gedurende één minuut in de incubator bij 37 degrees Celsius.Aspire vervolgens voorzichtig de tripsine-EDTA-oplossing uit de kweek, zodat de cellen niet worden verstoord. Voeg daarna nog eens 1,3 milliliters tripsine-EDTA-oplossing toe aan de kolf. Incubeer de kolf nog één minuut bij kamertemperatuur.Observeer de cellen onder een microscoop om vast te stellen of ze zijn losgekomen van het oppervlak van de kolf. Tik voorzichtig tegen de kolf om eventuele cellen die nog vastzitten los te maken. Zodra alle cellen zijn losgekomen, voegt u 1,3 milliliters van de soja-trypsine-remmingsoplossing toe aan de cellen en brengt u de cellen vervolgens over naar een 15 milliliter centrifugebuis.Spoel de lege kolf met vijf milliliters van het wasmedium en voeg het spoelmiddel toe aan de cellen in de buis. Centrifugeer de buis bij 500 ×g gedurende vijf minuten en aspireer vervolgens de S supernatant zonder het celpellet te verstoren. Resuspendeer het celpellet voorzichtig in zes milliliters gesupplementeerd medium.Voeg 0,5 milliliters van de celсусpensie toe aan elke well van de kweekplaat. Incubeer de platen bij 37 degrees Celsius en ververs het medium dagelijks totdat de culturen confluent zijn. Om de werkende kleuringsoplossingen te bereiden, worden de road two en de RH 2 37 stokoplossingen 1:1000 verdund in Hank's zoutoplossing.Observeer de 12-well kweekplaten onder een microscoop om vast te stellen of de HL one-cellen confluent zijn. Meestal zijn de cellen vier dagen na het uitplaten confluent; verwijder dan voorzichtig het dekglas uit de well en spoel het dekglas af met Hank's zoutoplossing. Plaats het dekglas in een Petri-schaal van 35 millimeter met drie milliliter road two-werkoplossing.Plaats de Petrischaal in een waterbad van 37 °C en leid een continue gasstroom door de oplossing voor oxygenatie. Incubeer gedurende 30 minuten om de cellen te kleuren met de calciumgevoelige kleurstof. Breng het dekglas vervolgens over naar 3 mL oxygenatieve RH 2 37-oplossing en incubeer gedurende 15 minuten.De cellaag moet nu gekleurd zijn met zowel calcium- als spanningsgevoelige kleurstoffen. Om de cellen klaar te maken voor beeldvorming, plaatst u het dekglas met de dubbel gekleurde cellaag in een circulatiekamer op een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop. Pas de stroomsnelheid door de kamer aan om de temperatuur op 35 °C te houden, met een gradiënt van maximaal 0,3 °C over de kamer.Spoel gedurende vijf minuten met een Hank's gebalanceerde zoutoplossing over de cellaag om eventuele overtollige kleurstof te verwijderen. Plaats na het wassen van de cellaag een bipolaire elektrode in de oplossing, zo dicht mogelijk bij de cellaag zonder de cellen aan te raken. Controleer de integriteit van de cellaag volgens het tekstprotocol.Om de monolaag te stimuleren. Programmeer de elektrode om pulsen met een breedte van 2 ms toe te dienen voor maximaal 500 ms per cyclus. Terwijl de monolaag wordt gestimuleerd, worden de cellen afgebeeld met een 40 x objectief en worden de calcium- en voltagesensoren geëxciteerd.Gebruik een LED-lichtbron gekoppeld aan een excitatiefilter en een dichroïsche spiegel, leid de uitgezonden fluorescentie door een dichroïsche spiegel om de calcium- en spanningsgevoelige signalen te scheiden en verzamel de fluorescentiesignalen afzonderlijk met twee CCD-camera's. Beeld vier verschillende gebieden van de monolaag af om een volledige dekking te verkrijgen en zorg ervoor dat het signaal per veld minder dan twee seconden wordt geregistreerd om fotobleken te voorkomen.Een confluente HL one-monolaag vertoont een regelmatig contractieritme wanneer deze door de elektrode wordt gepaced. De spannings- en calciumsignalen werden geregistreerd voor één enkele elektrisch gepace beat van de HL one-monolaag in een cyclus van 500 milliseconden; het begin van het spanningssignaal vindt kort voor de calciumtransiënt plaats. Terwijl het calciumsignaal langer aanhoudt dan het spanningssignaal aan het oppervlak.Intensiteitskaarten werden gegenereerd op basis van de spannings- en calciumfluorescentiesignalen over de HL one-cell monolayer. Gedurende een tijdsverloop van 200 milliseconden geeft blauw een laag signaal aan, terwijl rood een hoog signaal aangeeft. Beide signalen beginnen aan de linkerzijde van de monolayer en planten zich over en naar de rechterzijde van de monolayer voort.Na verloop van tijd propageren de actiepotentialen en keren ze veel sneller terug naar de baseline dan het calciumsignaal. Deze mapping-procedure kan in één uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om cellen met een optimale dichtheid te gebruiken en voorzichtig te zijn bij het plaatsen van de pacing-elektroden om beschadiging van de monocouche te voorkomen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u optisch in kaart gebrachte, HO-atriumcelmonolagen prepareert, waarbij gebruik wordt gemaakt van zowel calcium- als spanningsgevoelige kleurstoffen.

voltage-calcium-dual-channel-optical-mapping-cultured-hl-1-atrial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft de basisprocedures voor het uitvoeren van optische in kaart brengen van experimenten in de Langendorff-geperfuseerde konijn hart met behulp van het panoramische imaging systeem, en de dubbele (spanning en calcium) beeldvormende modaliteit.

Multiparametrische Optische kaart brengen van de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

Dit document beschrijft de dissectie procedure, instrumentale setup, en de experimentele omstandigheden tijdens de optische in kaart brengen van de transmembraan potentiaal (Vm) en intracellulair calcium van voorbijgaande aard (CAT) in intacte geïsoleerde Langendorff doorbloed muis harten.

Optische kaart brengen van actiepotentialen en Calcium Transiënten in de muis Hart

Dit artikel beschrijft de gedetailleerde protocol en de apparatuur die nodig is voor dual optische kaart brengen van transmembraan potentiaal (V m) en gratis intra-sarcoplasmatisch reticulum (SR) Ca 2+ in de Langendorff-doorbloed konijn hart. Deze methode maakt directe observatie en kwantificering van Vm en SR Ca 2+ dynamiek in het intacte hart.

Optische kaart brengen van Intra-sarcoplasmareticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; En Transmembrane potentieel in de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

Dit protocol beschrijft de elektrofysiologische evaluatie van lymfkliertest atria met behulp van een optische mapping systeem met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, met inbegrip van dubbele opnamen van de membraan spanning en Ca2 + voorbijgaande onder geprogrammeerd stimulatie door middel van een speciale elektrode-katheter.

Elektrofysiologische beoordelingvan lymfkliertest Atria met hoge resolutie optische Mapping

We presenteren de methodologie voor het isoleren van Murine myocyten en het verkrijgen van spannings-of calcium sporen tegelijk met sarcomere inkorten van sporen met fluorescentie fotometrie met gelijktijdige metingen van digitale cellen geometrie.

Optische beeldvorming van geïsoleerde Murine ventriculaire Myocyten

Dit protocol beschrijft de procedure voor het doorsnijden en kweken van menselijke cardiale plakjes voor preklinische geneesmiddelentesten en beschrijft het gebruik van optische mapping voor het opnemen van transmembranespanning en intracellulaire calciumsignalen gelijktijdig van deze plakjes.

Preklinische Cardiale Elektrofysiologie Beoordeling door Dual Voltage en Calcium Optical Mapping van human organotypic cardiale plakjes

Hier beschrijven we optische acquisitie en karakterisering van actiepotentiaalen van geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten met behulp van een snel modulair fotometriesysteem.

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Muismodellen maken het mogelijk om belangrijke mechanismen van aritmogenese te bestuderen. Voor dit doel zijn cardiomyocyten van hoge kwaliteit nodig om patchklemmetingen uit te voeren. Hier wordt een methode beschreven om murine atriale en ventriculaire myocyten te isoleren via retrograde enzymgebaseerde Langendorff-perfusie, die gelijktijdige metingen van calciumtransiënten en L-type calciumstroom mogelijk maakt.

Isolatie van hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca2+ transiënten en L-type calciumstroom

Dit protocol introduceert dual-dye optische mapping van muizenharten verkregen van wildtype en knock-in dieren die zijn aangetast door catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie, inclusief elektrofysiologische metingen van transmembraanspanning en intracellulaire Ca2+ transiënten met hoge temporele en ruimtelijke resolutie.

Dual-Dye optische mapping van harten van RyR2R2474S Knock-in muizen van catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie

Het gebruik van licht om hartcellen en -weefsel te controleren, maakt contactloze stimulatie mogelijk, waardoor de natuurlijke staat en functie van de cellen behouden blijven, waardoor het een waardevolle benadering is voor zowel fundamenteel onderzoek als therapeutische toepassingen.

Een cardiaal microfysiologisch systeem voor het bestuderen van Ca2+ propagatie via niet-genetische optische stimulatie

Leer duale optische mapping van spanning en calcium in HL-1 atriale myocytmonolagen. Deze methode maakt gelijktijdige visualisatie van actiepotentialen en calciumtransiënten mogelijk voor cardiaal elektrofysiologisch onderzoek.

Spanning en Calcium Dual Channel Optische kaart brengen van Gekweekte HL-1 atriale Myocyte Monolayer

Meer video's verkennen