Name: Geautomatiseerde kwantificering van hematopoietische cellen - stromale cel interacties in histologische afbeeldingen van ontkalkte Bone (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Leer een methode om hematopoietische cel-stromacel interacties te kwantificeren in ontkalkte botsecties met confocale microscopie. Deze techniek biedt inzicht in immuunceldynamiek in het beenmerg.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Andreas Radbruch voor waardevolle discussies. We zijn dankbaar voor Gruczek, Patrick Thiemann en Manuela Ohde Sabine voor hulp bij de verzorging van dieren en Robert Günther voor een uitstekende technische bijstand. Wij danken onze getrainde beoordelaars Laura Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Florence Pache en Katharina Hoorn voor de evaluatie van de histologie monsters en Randy Lindquist voor het proeflezen van het manuscript. Wij danken J. en N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, USA voor MBP-specifieke antilichamen. Dit werk werd ondersteund door DFG HA5354 / 4-1, van Jimi-een DFG kernfaciliteit netwerk subsidie ​​voor opklaren en door TRR130 / TP17, en DFG VOOR 2165 (HA5354 / 6-1) te AEHSZ werd gesteund door de International Max Planck School voor Infectieziekten en Immunologie (IMPRS-IDI), Berlijn.

De dierproeven werden goedgekeurd door de juiste staats-comités voor dierenwelzijn (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlijn) en werden uitgevoerd in overeenstemming met de geldende richtlijnen en voorschriften (dierproef licentie G0194 / 11). 1. Generatie van TL-Bone Marrow Chimerische Muizen Opmerking: Het genereren van fluorescente beenmerg chimere muizen beenmerg stromale cellen zichtbaar wordt uitgevoerd zoals beschreven voor 9. <ol><li> Gaan behandelen Del-Cre x ROSA-tdRFP muizen (muizen die tandem rood fluorescerend eiwit (tdRFP) alomtegenwoordig 11-13) om hen voor te bereiden op bestraling. U kunt ook een andere stam met alomtegenwoordige uitdrukking van fluorescerend eiwit. Dien 1 mg / ml neomycine en 1 mg / ml vitaminen (A, D3, E, C) via het drinkwater twee dagen voor de bestraling. </li><li> Bestralen muizen tweemaal met 3,8 Gray met een Cesium-137 gamma-bestraler within een interval van 3 uur. Hiervoor plaatst u muizen in een bestraling taart kooi geschikt voor de respectieve bestraler. OPMERKING: Voor de bestraling van muizen, doet ons instituut geen verdoving nodig. Volg de lokale institutionele beleid ten aanzien van anesthesie voor bestraling. Dieren behandelen met 5 mg / kg carprofen subcutaan (sc) per dag na bestraling bij tekenen van pijn. </li><li> De volgende dag, reconstitueren muizen door een intraveneuze injectie van 3 x 10 6 beenmergcellen bereid uit lange beenderen van C57BL / 6 donor muizen in transferbuffer 9. Houd de muizen op Neomycine en vitaminen voor maximaal 2 weken en het toezicht op hun welzijn en het gewicht in deze tijd. Wacht minstens 4 weken om voor reconstitutie van het immuunsysteem voordat de specifieke experimentele behandelingen (bijvoorbeeld immunisatie) 9. </li><li> Offeren muizen en leg ze op een dissectie boord, steriliseren de benen met 70% ethanol. Euthanize muizen in overeenstemming met de lokale institutionele beleid. Ons Instituut voert cervicale dislocatie. </li><li> Gebruik een tang en schaar om de huid van de dijen te verwijderen. Verwijder spierweefsel het dijbeen bloot. Ontwrichten de femorale bot van de heup en knie met behulp van een tang en schaar. Wees voorzichtig niet te breken of snijden het bot. </li><li> Verwijder voorzichtig resterende grote stukken van spierweefsel en kraakbeen van het bot met een schaar. Verwijder resterende spierweefsel door te wrijven op het bot met laboratorium vloeipapier. Verzamel de schoongemaakte botten in een petrischaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Fix geheel femorale bot in 4% paraformaldehyde (PFA, elektronenmicroscopie-kwaliteit) gedurende 4 - 6 uur. </li><li> Gooi PFA en incubeer botten in 10% sucrose in PBS O / N. De volgende dag, incubeer de botten in 20% sucrose O / N. De dag na, incubeer de botten in 30% sucrose O / N. </li></ol> 2. cryosectioning van Bones OPMERKING: Na 16-24 uur in 30% sucrose, botten bevriezen en cryosectie ze volgens Kawamoto&#39;s tape methode 14,15. <ol><li> Bereid een grote beker (2000 ml volume) met droog ijs en aceton (ongeveer 2: 1 volume-verhouding, bijvoorbeeld, 400 ml droge ijs en 200 ml aceton) onder een afzuigkap. Plaats een kleine beker (150-250 ml volume) met hexaan binnen (30 - 50 ml ongeveer). Wacht tot het mengsel afkoelen (ongeveer 10 min, tot de vorst op het buiten de grote beker). </li><li> Vul ¾ van de gelabelde cryomold met Super Cryoembedding Medium (SCEM); de botten voorzichtig plaatsen in tot ze volledig ondergedompeld, zorg dat ze niet over de randen van de mal te raken. Met grote tang houdt de cryomold in de beker met de bodem van de matrijs slechts het oppervlak van de hexaan raken. <ol><li> Laat de buitenranden van de SCEM bevriezing (aangegeven dekking, dit duurt ongeveer 15 seconden). Vervolgens volledig te laten vallen de mal in de hexaan en laat het freEze voor 1-2 min. Haal de bevroren monster en verpakken in cellofaan en dan aluminiumfolie (om het monster tegen uitdrogen te beschermen en om de blootstelling aan licht te vermijden). Bewaren bij -80 ° C tot cryosectioning. </li></ol></li><li> Voor cryosectioning van dijbeen botten gebruiken een standaard microtoom en microtoom messen voor harde weefsels. </li><li> Stel het monster en het blad temperatuur van het microtoom tot -24 ° C. Laat het monster in de microtoom zitten voor ongeveer 15 minuten voor het snijden. <ol><li> Fix het monster blok aan het metalen monster houder met SCEM of optimale snijtemperatuur (oktober) medium. Stel de oriëntatie van het blok indien nodig. Knip het monster totdat het bot volledig geopend en het merg zichtbaar. Stel de snijdikte tot 7 micrometer (gooi de eerste sectie). </li><li> Bevestig een stukje Kawamoto tape met de kleverige kant op de bovenkant van het monster blok met behulp van een hert leder-overdekte houten spatel. Vervolgens snijd het monster en draai de tape, zodat de sectie iszich aan de bovenzijde. Breng de tape aan een dia glas met behulp van een tang. Bevestig de tape aan de dia glas met Scotch tape. </li></ol></li><li> Laat secties drogen gedurende ten minste 30 min en opgeslagen bij -80 ° C tot gebruik. WINKEL ongekleurd en gemonteerde dia in plastic dozen dia afstandhouders tussen dia&#39;s uit om te voorkomen dat ze aan elkaar kleven. Gekleurd en gemonteerde dia&#39;s kunnen worden opgeslagen voor maximaal een week in kartonnen mappen glijbaan bij 4 ° C. </li></ol> 3. Image Collection <ol><li> Ontdooien en vlek cryocoupes volgens gemeenschappelijke immunofluorescentie protocollen 9. Neem een nucleaire kleuring, bijvoorbeeld, 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenylindool dihydrochloride (DAPI) voor weefselintegriteit visualiseren. OPMERKING: Stain bijvoorbeeld voor RFP naar stromale cellen (anti-RFP-biotine antilichaam en streptavidine-Alexa Fluor 555), vlek eosinofielen met rat anti-major basic protein (MBP) antilichamen en anti-rat-Alexa Fluor 647-antilichaam visualiseren B-cellenmet rat anti-B220-Alexa Fluor 594 antilichaam en pc&#39;s met anti-κ lichte keten-fluoresceïne-iso-thiocyanaat (FITC) en anti-λ1 lichte keten-FITC antilichamen (details van de kleuringsprocedure worden beschreven in 9). </li><li> Monteer gekleurde coupes: zet één druppel Fluoromount op de afdeling en dan bedekken met een # 1 glas dekglas, terwijl de vorming van luchtbellen zorgvuldig vermeden. Vervolgens voeren laser scanning confocale microscopie met een toestel met laserlijnen geschikt voor de kleuring. </li><li> Om de beelden voor automatische co-lokalisatie analyse van beenmerg hematopoietische cellen met stromale cellen met behulp van de Wimasis tool, de volgende instellingen toe te passen op te nemen: <ol><li> Gebruik een 20X objectief en een gezichtsveld van 708,15 x 708,15 urn. Voor geautomatiseerde analyse houdt de grootte van alle beelden dat ten 2048 x 2048 pixels (px) om de resultaten vergelijkbaar te houden. </li><li> Noteer één kanaal voor stromale structuren (bijvoorbeeld, </em&gt; 561 nm laser lijn), een kanaal voor de kernen (bijvoorbeeld DAPI, 405 nm) en extra kanalen voor de hematopoietische cellen van belang (bijvoorbeeld, 3 kanalen, 488/594/633 nm voor eosinofielen, B-cellen en PC&#39;s). </li><li> Beelden opnemen met lijn van gemiddeld 4 16. In het ideale geval het gehele dijbeen sectie door het nemen van enkele aangrenzende beelden. U kunt ook niet-aangrenzende foto&#39;s uit verschillende regio&#39;s van het beenmerg (diafysaire evenals epiphyseal). LET OP: Wees voorzichtig niet te overlappingen tussen aangrenzende beelden (tot herhaalde analyse van cellen in de overlappende gebieden te vermijden) te produceren. </li></ol></li><li> Sla de beelden in een microscopie beeldbestandsformaat. Controleren en eventueel contrast voor alle kanalen in de viewer / analysesoftware passen. </li><li> Export 3 .jpg bestanden per beeldbestand: een .jpg-bestand voor de DAPI kanaal (rood / groen / blauw (RGB) formaat, valse kleur gecodeerd in het geel), een .jpg-bestand voor het stroma kanaal (grijswaarden) en één .jpg bestand metde kanalen voor hematopoietische cellen (maximaal 3 kanalen, RGB-formaat, bijvoorbeeld FITC (pc&#39;s, valse kleur: groen) / Alexa Fluor 594 (B-cellen, valse kleur: blauw) / Alexa Fluor 647 (eosinofielen, valse kleur: rood)) . </li></ol> 4. Automated Image Analysis <ol><li> Gebruik een afbeelding analyse tool om beeldsegmentatie, kwantificering van co-lokalisatie en buurt analyse (zie Discussie) uit te voeren. </li><li> Bij gebruik van de Wimasis gereedschappen, gaat u als volgt te werk: <ol><li> Upload de sets van 3 .jpg bestanden per beeld met dezelfde bestandsnaam, gevolgd door een underscore en een vermelding van het type van het beeld. </li><li> Gebruik _1 voor de .jpg-bestand met hematopoietische cellen, _2 voor de .jpg-bestand voor de DAPI kanaal, _3 voor de .jpg-bestand voor het stroma kanaal. Bijvoorbeeld: Image1_1.jpg (hematopoietische cellen), Image1_2.jpg (DAPI kanaal), en Image1_3.jpg (stroma-kanaal). Upload de foto&#39;s via de klant rekening. </li><li> Voor celcontact kwantificeringkies de cel contact instrument door te klikken op de respectievelijke veld. Voor mobiele omgeving kwantificeren, kiest de cel omgeving gereedschap en voer de voorkeur omgeving straal in micrometer (die wordt gemeten vanaf de randen van de cellen). </li><li> Download de resultaten. Opmerking: De resultaten worden als .jpg bestanden waarin de hematopoietische cellen en stroma kanaal met de grenzen van de gedetecteerde objecten gemarkeerd, evenals enige CSV bestanden met de metingen voor elke afbeelding, naast een overzicht CSV bestand bevat de gegevens voor alle geüploade afbeeldingen. </li></ol></li><li> Van contactmetingen bepalen de frequentie van hematopoietische cellen (rood, groen of blauw cellen) in contact met stromale cellen of de frequenties van rode, groene of blauwe cellen contact andere hematopoëtische celtypen (een voorbeeld is getoond in Representatieve resultaten Figuur 4). Om de frequentie te bepalen, verdeel het de contact tellingen per afbeelding doorde totale cel telt per beeld. <ol><li> Voor experimenten met individuele muizen, een samenvatting van de totale contact tellingen van alle beelden die voor de enkele muizen en verdeel ze door de som van de totale cel tellingen van alle afbeeldingen. </li></ol></li><li> Uit de nabijheid metingen bepaalt de frequentie van rood, groen of blauw cellen in de geselecteerde afstand van stromale cellen en / of de frequenties van rode, groene of blauwe cellen in de gewenste nabijheid van de andere hematopoietische celtypes zoals beschreven in stap 4.3 ( zie ook Representatieve resultaten, figuur 4). </li></ol> 5. Simulatie van Random Bone Marrow Positioning <ol><li> Voor het uitvoeren van de simulaties van willekeurige cel positionering op de geanalyseerde beenmerg histologische beelden, de voorbereiding van de volgende bestanden op voorhand: de enkelvoudige .csv-bestanden die door de cel contact tool, de originele .jpg bestanden voor de DAPI kanaal en de originele .jpg bestanden voor de stromale kanaal. </li><li> Om voerenbatch simulaties op een reeks beelden (bijvoorbeeld alle afbeeldingen van de ene dij sectie), het verzamelen van alle originele .jpg bestanden (_1, _2 en _3) en de corresponderende enkele CSV-bestanden in een map. OPMERKING: De simulatietool voor willekeurige beenmergcel positionering is op aanvraag beschikbaar. </li><li> Start de simulatie-tool, vink het vakje &quot;Auto-load beeldgegevens&quot;. OPMERKING: Het programma zal de cellen en gemiddelde celgrootte van het CSV-bestand automatisch gelezen. Deze waarden worden weergegeven in de vakjes &quot;Cell number&quot; en &quot;Vakgrootte AVG&quot; (figuur 5A). </li><li> Voer de gemeenschappelijke tag voor de CSV-bestanden, dat wil zeggen, de gemeenschappelijke factor in hun naam. Voer het nummer van de afbeelding sets die moeten worden gebruikt voor batch-modus simulatie. </li><li> Laad het .jpg-bestand gegenereerd uit de stroma-kanaal (met bestandsnaam die eindigt _3). </li><li> Voer de instellingen voor het genereren van het masker van de DAPI kanaal: <ol><li> Vink het vakje &quot;? Breng het masker &quot;Stel de drempel voor het de DAPI omzetten in een binair masker tot 10 (range 0-255). </li><li> Vink het vakje &quot;8-bit?&quot; Vink het vakje &quot;Homothetie?&quot; En stel de rang van dilatatie tot 5 px. Vink het vakje &quot;w / erosie?&quot;. </li><li> Geef de waarde voor de nabijheid radius (buurt radius) gebruikt bij de analyse van de gesimuleerde afbeeldingen. Voor een beeld van 708,15 x 708,15 urn met een grootte van 2048 x 2048 px (pixel scaling xy: 0,346 micrometer), 29 px overeen met 10 micrometer. </li></ol></li><li> Vakje &quot;Gebruik Otsu?&quot; Naar Otsu&#39;s algoritme 17 te gebruiken voor automatische detectie van stromale structuren. Opmerking: Dit is hetzelfde algoritme dat wordt gebruikt door het contact en omgeving tool. Met behulp van dezelfde afbeelding segmentatie-algoritme in de geautomatiseerde analyse van het opgenomen beeld en de gesimuleerde afbeelding is van cruciaal belang om de gegevens vergelijkbaar te houden. </li><li> Voer de instellingen voor hematopoietische cellen, die are gesimuleerd als ronde vormen. OPMERKING: De mobiele nummers voor rood, groen en blauw cellen zijn, worden rechtstreeks van het CSV-bestand (zie ook stap 5.6). <ol><li> Gebruik het simulatieprogramma de gemiddelde diameter berekenen px rode, groene en blauwe cellen. Bepaal het gemiddelde oppervlak van een cel als het totale oppervlak van elk celtype in de afbeelding px gedeeld door het totale aantal cellen per beeld. Gebruik de gemiddelde gebied om de straal van een schijf met de formule berekenen. Dubbele straal tot de gemiddelde diameter bepalen. </li></ol></li><li> Meet de celgrootteverdeling van de geanalyseerde celtypen met elke software voor beeldanalyse dat object segmentatie functies omvat. Bepaal σ voor hematopoëtische celtypen (18 en figuur 5B). Opmerking: omdat de celgrootte verdelingen van de opgenomen cellen niet worden bepaald door de geautomatiseerde beeldanalyse gebruikt een Gaussische verdeling als een benadering van de werkelijke verdelingen. De breedte van de thij verdelingskromme wordt door σ en kan heel verschillend voor verschillende celtypen. (Voor meer informatie, zie figuur 5B). <ol><li> Uit deze metingen, bepalen de &quot;cel grootte cutoff&quot;: de diameter in px dat de kleinste object nog steeds erkend als een complete cel door het beeld analyse-instrument beschrijft. </li></ol></li><li> Voer parameters in de respectievelijke vakken op de grafische gebruikersinterface (figuur 5A). <ol><li> Voer de celgrootte afgesneden, dat wil zeggen, de minimale celgrootte toegelaten in de simulatie, een diameter px. </li><li> Voer σ in px voor de simulatie van de celgrootteverdeling voor rood, groen en blauw cellen (uit stap 5.9). </li><li> Vink het vakje &quot;Verwijderen&quot; in de subsectie &quot;Cellen in Mask&quot;. Met deze instelling zal het programma een nieuwe positie gekozen voor een cel als het overlapt met ten minste één pixel met een verboden gebied van het masker. Vink het vakje &quot;Vermijd cel overlap? ̶1; in de subsectie &quot;Cell uitsluiting&quot;. </li><li> Voer de toegestane minimale afstand tussen de middelpunten van twee cellen in px. OPMERKING: De minimale afstand moet worden bepaald op basis van de opgenomen beelden. Verkeerd gemeten minimale afstanden zal leiden tot vertekende / kunstmatige resultaten voor de vergelijking van opgenomen en gesimuleerde afbeeldingen. </li><li> Stel de maximale oppervlakte van overlap tot 100% indien de overlap wordt bepaald door de minimale afstand van centrum tot centrum. </li><li> Stel de simulatietool tot 1.000 herhalingen. </li><li> Vink het vakje &quot;Automatisch opslaan cellen?&quot; Om de coördinaten van de gesimuleerde objecten sparen voor alle herhalingen van elk beeld van de partij als .rect bestanden (tekst-formaat). Vink het vakje &quot;Automatisch opslaan beelden?&quot; Naar een .tiff bestand op te slaan voor elk beeld gesimuleerd. Voer een gemeenschappelijke tag voor de opgeslagen bestanden. OPMERKING: De &quot;? Automatisch opslaan cellen&quot; optie vermindert simulatie looptijd en de totale hoeveelheid gegevens, in vergelijking met het opslaan van de werkelijke gesimuleerde images. De .rect bestanden de coördinaten van de gesimuleerde cellen rechthoeken en kunnen dus worden omgezet in gesimuleerde beelden indien nodig. </li></ol></li><li> Start de simulatie door te klikken op &quot;Run simulatie&quot;. OPMERKING: De simulatie-tool genereert een CSV-bestand automatisch voor de 1.000 simulaties van elk beeld, inclusief de gemiddelde contact tellingen en omgeving telt voor rood, groen en blauw cellen met rood, groen, blauw, en stromale cellen voor elke set van herhaalde simulaties . Bovendien, voor al deze waarden gemiddelden van 1000 simulaties met standaarddeviatie (STD) en standaardfout van het gemiddelde (SEM) zijn voorzien. </li><li> Bepaal de gemiddelde contact frequenties en omgeving frequenties van een set van 1000 gesimuleerde afbeeldingen. Voor deze, verdeel de gemiddelde contactgegevens en omgeving tellingen door de opgenomen celgetal per beeld. Vergelijk de frequenties de resultaten van het geautomatiseerde co-lokalisatie analyse van het opgenomen beeld. </li><li> Pas geschikte statistical methoden, afhankelijk van de analyse 19 (voor figuur 7, hebben we gebruik gemaakt van een tweezijdig Wilcoxon signed rank test). </li></ol>

<ol><li>Kunisaki, Y., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secrets+of+the+bone+marrow+niche%3A+Enigmatic+niche+brings+challenge+for+HSC+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion.</a> Nat Med. 18, 864-865 (2012).</li>
<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505, 327-334 (2014).</li>
<li>Tokoyoda, K., Egawa, T., Sugiyama, T., Choi, B. I., Nagasawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+niches+controlling+B+lymphocyte+behavior+within+bone+marrow+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development.</a> Immunity. 20, 707-718 (2004).</li>
<li>Cariappa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perisinusoidal+B+cells+in+the+bone+marrow+participate+in+T-independent+responses+to+blood-borne+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes.</a> Immunity. 23, 397-407 (2005).</li>
<li>Sapoznikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+clusters+of+dendritic+cells+provide+critical+survival+signals+to+B+cells+in+bone+marrow+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Perivascular clusters of dendritic cells provide critical survival signals to B cells in bone marrow niches.</a> Nat Immunol. 9, 388-395 (2008).</li>
<li>Tokoyoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Professional+memory+CD4%2B+T+lymphocytes+preferentially+reside+and+rest+in+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Professional memory CD4+ T lymphocytes preferentially reside and rest in the bone marrow.</a> Immunity. 30, 721-730 (2009).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+is+a+major+reservoir+and+site+of+recruitment+for+central+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells.</a> Immunity. 22, 259-270 (2005).</li>
<li>Lin, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+4-1BBL+on+radioresistant+cells+in+providing+survival+signals+through+4-1BB+expressed+on+CD8%28%2B%29+memory+T+cells+in+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Contribution of 4-1BBL on radioresistant cells in providing survival signals through 4-1BB expressed on CD8(+) memory T cells in the bone marrow.</a> Eur J Immunol. 42, 2861-2874 (2012).</li>
<li>Zehentmeier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+and+dynamic+components+synergize+to+form+a+stable+survival+niche+for+bone+marrow+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Static and dynamic components synergize to form a stable survival niche for bone marrow plasma cells.</a> Eur J Immunol. 44, 2306-2317 (2014).</li>
<li>Nagasawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+niches+in+the+bone+marrow+required+for+B-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development.</a> Nat Rev Immunol. 6, 107-116 (2006).</li>
<li>Luche, H., Weber, O., Nageswara Rao, T., Blum, C., Fehling, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faithful+activation+of+an+extra-bright+red+fluorescent+protein+in+%27knock-in%27+Cre-reporter+mice+ideally+suited+for+lineage+tracing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Faithful activation of an extra-bright red fluorescent protein in 'knock-in' Cre-reporter mice ideally suited for lineage tracing studies.</a> Eur J Immunol. 37, 43-53 (2007).</li>
<li>Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cre-transgenic+mouse+strain+for+the+ubiquitous+deletion+of+loxP-flanked+gene+segments+including+deletion+in+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells.</a> Nucleic Acids Res. 23, 5080-5081 (1995).</li>
<li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues%2C+whole-animals%2C+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Histol+Cytol%22%5BJournal%5D)">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).</li>
<li>Kawamoto, T., Kawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+thin+frozen+sections+from+nonfixed+and+undecalcified+hard+tissues+using+Kawamot%27s+film+method%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Histol+Cytol%22%5BJournal%5D)">Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method.</a> Arch Histol Cytol. 1130 (2012), 149-164 (2012).</li>
<li>Smith, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+neuroscience+%2F+editorial+board%2C+Jacqueline+N.+Crawley+...+%5Bet+al.%5D%22%5BJournal%5D)">Basic confocal microscopy.</a> Current protocols in neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. 2 (Unit 2.2), (2001).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+threshold+selection+method+from+gray-level+histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Sys.%2C+Man.%2C+Cyber%22%5BJournal%5D)">A threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Trans. Sys., Man., Cyber. 9, 62-66 (1979).</li>
<li>Hughes, I., Hase, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHughes%2C+I+%22Measurements+and+Their+Uncertainties%3A+A+Practical+Guide+To+Modern+Error+Analysis%22">Measurements and Their Uncertainties: A Practical Guide To Modern Error Analysis</a>. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2010).</li>
<li>Quinn, G. P., Keough, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQuinn%2C+GP+%22Experimental+Design+and+Data+Analysis+for+Biologists%22">Experimental Design and Data Analysis for Biologists</a>. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2002).</li>
<li>Kiel, M. J., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncertainty+in+the+niches+that+maintain+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells.</a> Nat Rev Immunol. 8, 290-301 (2008).</li>
<li>MacQueen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+Methods+for+classification+and+Analysis+of+Multivariate+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+5th+Berkeley+Symposium+on+Mathematical+Statistics+and+Probability+Vol.+1%22%5BJournal%5D)">Some Methods for classification and Analysis of Multivariate Observations.</a> Proceedings of 5th Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability Vol. 1. 1965 Jun 21-Jul 18, Statistical Laboratory of the University of California, Berkeley, , University of California Press. Berkeley, CA. 666(1967).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
<li>Jarjour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+reveals+origin+and+dynamics+of+lymph+node+follicular+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Fate mapping reveals origin and dynamics of lymph node follicular dendritic cells.</a> J Exp Med. 211, 1109-1122 (2014).</li>
<li>Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histo-cytometry%3A+a+method+for+highly+multiplex+quantitative+tissue+imaging+analysis+applied+to+dendritic+cell+subset+microanatomy+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes.</a> Immunity. 37, 364-376 (2012).</li>
<li>Moreau, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37, 351-363 (2012).</li>
<li>Siffrin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+partially+reversible+th17+cell-induced+neuronal+dysfunction+in+the+course+of+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis.</a> Immunity. 33, 424-436 (2010).</li>
<li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+SVZ+stem+cells+lie+in+a+vascular+niche%3A+a+quantitative+analysis+of+niche+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions.</a> Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).</li>
<li>Danielsson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euclidian+distance+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Computer+Graphics+and+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">Euclidian distance mapping.</a> Computer Graphics and Image Processing. 14, 21(1980).</li>
<li>Tellier, J., Kallies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+home+for+plasma+cells+-+a+niche+to+survive%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Finding a home for plasma cells - a niche to survive.</a> Eur J Immunol. , (2014).</li>
<li>Winter, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocytes+constitute+a+functional+component+of+a+plasma+cell+niche+in+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow.</a> Blood. 116, 1867-1875 (2010).</li>
<li>Rozanski, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+antibody+responses+depend+on+CD28+function+in+bone+marrow-resident+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Sustained antibody responses depend on CD28 function in bone marrow-resident plasma cells.</a> J Exp Med. 208, 1435-1446 (2011).</li>
<li>Rodriguez Gomez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basophils+support+the+survival+of+plasma+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Basophils support the survival of plasma cells in mice.</a> J Immunol. 185, 7180-7185 (2010).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homing+and+adhesion+patterns+determine+the+cellular+composition+of+the+bone+marrow+plasma+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche.</a> J Immunol. 188, 1283-1291 (2012).</li>
<li>Kohler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-CSF-mediated+thrombopoietin+release+triggers+neutrophil+motility+and+mobilization+from+bone+marrow+via+induction+of+Cxcr2+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">G-CSF-mediated thrombopoietin release triggers neutrophil motility and mobilization from bone marrow via induction of Cxcr2 ligands.</a> Blood. 117, 4349-4357 (2011).</li>
</ol>

Juan Escribano Navarro is verbonden aan Wimasis GmbH, München, Duitsland. De andere auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Ondanks de vooruitgang in de moderne optische beeldvorming methoden, is de analyse van histologische gegevens nog vaak gehinderd door het ontbreken van een goede kwantificering instrumenten en methoden, of door bevooroordeelde analyses die zich richten op een klein gebied van belang. De synergetische aanpak hier gepresenteerde combineert beeldanalyse die het hele beenmerg regio, geautomatiseerde segmentatie en het herkennen van objecten van verschillende hematopoietische en stromale celtypen, co-lokalisatie analyse, en ...

Door recente snelle technologische ontwikkelingen microscopie, waaronder optische, heeft de analyse van cellen in de context van het gehele weefsel steeds toegankelijker voor immunologen worden. De karakterisering van afzonderlijke cellen in suspensie een waardevolle en onmisbare methode cellulaire en moleculaire functie begrijpen. De analyse van de cellen in hun (micro) -anatomical milieu essentieel voor het begrijpen van de interacties tussen verschillende celtypen die samenwerken in complexe processen zoals de ontwikkeling van immuunresponsen. Hoewel het relatief gemakkelijk microscopisten kwalitatieve informatie uit beelden te verkrijgen, blijft het een uitdaging om deze gegevens te kwantificeren, mede door het feit dat analysemethoden op dit gebied blijft achter met wat mogelijk is in beeldacquisitie. Veel onderzoekers nog steeds rekenen op tijdrovende handmatige cel tellen in hun histologie beelden,om zo voor een vertekening tussen de verschillende beoordelaars en belemmeren replicatie door andere groepen. Vaak wordt een representatief beeld gekozen om een ​​verklaring over cellulaire positie of co-lokalisatie onderstrepen in een publicatie, waardoor het moeilijk voor de lezer om de statistische relevantie van een dergelijke gebeurtenis te beoordelen. Samen met het feit dat de volledige informatie-inhoud van beeldgegevens zelden wordt uitgebuit, benadrukt dit de noodzaak van een meer onpartijdige, sneller en alomvattende aanpak van de histologische beelden te analyseren. Het beenmerg een complex weefsel dat neemt belangrijke vitale functies als orgaan van hematopoiese bij volwassen vertebraten. Naast het feit dat de geboorteplaats van hematopoietische cellen 1,2 en spelen een belangrijke rol in de B-lymfocyten ontwikkeling 3, fungeert het ook als een site waar immuunreacties worden geïnitieerd 4 en ondersteunt volwassen, recirculatie B-cellen 5. Daarnaast zijn rol in het handhaven van immunological geheugen is steeds meer gewaardeerd in de afgelopen tien jaar, zoals verschillende soorten cellen vormen immunologisch geheugen zijn gevonden aldaar te verblijven 6-9. De verhouding tussen het complex weefsel architectuur van het beenmerg en de functies nog steeds blijven ongrijpbaar. In tegenstelling tot de secundaire lymfoïde organen, die worden georganiseerd in macro-compartimenten zoals T- en B-cel zones, het beenmerg ontbreekt een duidelijke macro-verkokering. Tot dusver verschillende compartimenten in het beenmerg worden gedefinieerd door hun nabijheid tot de botcortex of vasculatuur. Het belang van de verschillende resident stromale cel populaties in het beenmerg voor een aantal processen zoals ondersteuning stamcellen, ontwikkeling van B-cellen of het onderhoud van immuungeheugen celpopulaties (zoals langlevende plasmacellen (PC), CD4 + en CD8 + geheugen T-cellen) blijkt duidelijk dat er een zekere mate van micro-compartimentering in het beenmerg. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Deze waarnemingen hebben geleid tot het concept afzonderlijke microanatomical nissen, die gespecialiseerd zijn in bepaalde functionaliteiten (stamcel onderhoud, B-cel ontwikkeling in diverse stadia en onderhoud van immunologisch geheugen) in het beenmerg. Hoewel er lijkt een zekere mate van heterogeniteit tussen de nissen die verschillende functies te dienen sommige van de door stromale cellen, zoals CXC-chemokine ligand 12 (CXCL12) of interleukine 7 (IL-7), factoren cruciale onderdelen voor verscheidene van deze niches 10. De visualisatie en karakterisatie van stromale cellen in het beenmerg is moeilijk vanwege hun morfologische kenmerken met lange, dunne dendritische verlengingen vormen van een netwerk in het beenmerg en het ontbreken van geschikte markers om stromale subpopulaties discrimineren. Het is nog niet duidelijk in hoeverre deze niches gemeenschappelijke kenmerken met betrekking tot hun cellulaire en moleculaire composition, en welke elementen maken een bepaalde niche uniek. Naast stromale cellen, hematopoëtische celtypen hebben aangetoond dat het een cruciale rol spelen door bepaalde signalen althans voor sommige niches. Is duidelijk dat de complexiteit van de niche preparaat vereist de analyse in situ, en het is steeds belangrijker geworden voor immunologen en hematologen inzoomen op beenmerg microarchitectuur, bijvoorbeeld door analyse van de ruimtelijke relaties tussen de cellulaire componenten. Hier strategie cellulaire co-localisatie en buurt verhoudingen in het beenmerg op geautomatiseerde en onpartijdige wijze kwantificeren gepresenteerd. Een gedetailleerde workflow inclusief het genereren van chimere muizen harboring fluorescerende stromale cellen en niet fluorescerende hematopoietische cellen, bereiding van histologische coupes van niet ontkalkte beenderen, verwerving van confocale afbeeldingen die het gehele bot, en de geautomatiseerde beeldanalyse van cellulaire co-lokalisatie en de validatie / discriminatie van willekeurige positionering door een simulatie-tool is voorzien (Figuur 8).

<table><tbody><tr><td>Neomycine</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma</a></td><td>N6386 SIGMA</td><td>Neomycine-trisulfaatzout-hydraat, EU-gevarencode: GHS08</td></tr><tr><td>Ursovit AD3EC</td><td>Serumwerke Bernburg</td><td></td><td>1 ml bevat: 50.000 I.E. retinylpalmitaat, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopherylacetaat, 100 mg ascorbinezuur, 1 mg sorbinezuur, 200 mg polyoxyl 35 castorolie, 0,5 mg propylgallaat</td></tr><tr><td>Transferbuffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicilline/streptomycine)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma</a></td><td>P4333, H3375</td><td></td></tr><tr><td>4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl-hapteen geconjugeerd aan kippen-gamma-globuline</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kippengammaglobuline (CGG) 100 mg</td><td><a href="http://www.rockland-inc.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Rockland</a></td><td>D602-0100</td><td></td></tr><tr><td>20% paraformaldehyde-oplossing (EM-grade)</td><td>Wetenschappelijke diensten</td><td>15713</td><td>EU-gevaarsymbolen: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08</td></tr><tr><td>D(+)-sucrose</td><td><a href="http://www.carlroth.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Carl Roth</a></td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Droogijs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>179124 SIGMA-ALDRICH</td><td>EU-gevarencodes: GHS02, GHS07</td></tr><tr><td>Hexaan</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma-Aldrich</a></td><td>208752 SIGMA-ALDRICH</td><td>EU-gevarencodes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09</td></tr><tr><td>Tissue-Tek cryovormen (standaard)</td><td><a href="http://www.sakuraus.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sakura</a></td><td>4557</td><td>25 x 20 x 5 mm</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T.</td><td><a href="http://www.sakuraus.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sakura</a></td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Kawamoto's SCEM-inbedmedium</td><td><a href="http://section-lab.jp/index.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sectie-Lab, JP</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kawamoto's cryosectie-preparatiekit&amp;nbsp;</td><td><a href="http://section-lab.jp/index.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sectie-Lab, JP</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kawamoto's cryofilm type 2C(9)</td><td><a href="http://section-lab.jp/index.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sectie-Lab, JP</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtoommes MX35 premier plus, laag profiel</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>3052835</td><td>L x B: 80 x 8 mm (31,5 x 3,13"), dikte: 0,25 mm (0,01")</td></tr><tr><td>Polykloonaal konijnen anti-RFP-antilichaam, gebiotinyleerd</td><td><a href="http://www.rockland-inc.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Rockland</a></td><td>600-406-379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 streptavidine</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>S-32355</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-MBP</td><td>J. en N. Lee</td><td></td><td>verkregen van: J. en N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ, V.S.A., kloon MT-14.7</td></tr><tr><td>Geit anti-rat-Alexa Fluor 647</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594</td><td></td><td></td><td>in-house geproduceerd en gekoppeld (DRFZ), kloon RA3.6B2, Alexa Fluor 594 van Life Technologies</td></tr><tr><td>Muis anti-l1 lichte keten-FITC</td><td></td><td></td><td>in-house geproduceerd en gekoppeld (DRFZ), kloon LS136</td></tr><tr><td>Rat anti-k lichte keten - FITC</td><td></td><td></td><td>in-house geproduceerd en gekoppeld (DRFZ), kloon 187.1</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindool)&amp;prime;,6-diamidino-2-fenylindole dihydrochloride)</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sigma</a></td><td>D9542 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescerend insluitmedium</td><td><a href="http://www.dako.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> DAKO</a></td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes (24 x 24 x 0,13-0,16 mm)</td><td><a href="http://www.carlroth.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Carl Roth</a></td><td>H875.2</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost objectglazen (75 x 25 mm)</td><td><a href="http://www.vwr.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> VWR</a></td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Laser-scanning confocale microscoop</td><td></td><td></td><td>uitgerust met laserlijnen van 405, 488, 561, 594, 633 nm en een 20X/0,8 NA luchtobjectief. We hebben gebruikgemaakt van een Zeiss LSM710 en Zen 2010 Version 6.0 software.</td></tr><tr><td>Geautomatiseerde beeldanalysemiddelen voor beenmerg</td><td><a href="http://www.wimasis.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Wimasis, München</a></td><td></td><td>De cell contact tool en de cell vicinity tool zullen op verzoek beschikbaar worden gesteld door Wimasis.</td></tr><tr><td>VC2012-runtime</td><td>Microsoft</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679" target="_blank"&gt;gratis downloaden&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Simulatietool voor willekeurige celpositionering</td><td></td><td></td><td>op aanvraag bij ons verkrijgbaar</td></tr><tr><td>Beeldanalysesoftware met functies voor beeldsegmentatie</td><td></td><td></td><td>We hebben Volocity (Perkin Elmer) gebruikt voor het meten van de celgrootteverdelingen van hematopoëtische celtypen in het beenmerg (&lt;strong&gt;Figuur 5&lt;/strong&gt;). Alternatieven zijn Definiens Image Analysis (Definiens) of Cell Profiler (&lt;a href="http://www.cellprofiler.org" target="_blank"&gt;gratis downloaden&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>Fiji-software voor beeldanalyse&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>&lt;a href="http://fiji.sc/Fiji" target="_blank"&gt;gratis downloaden&lt;/a&gt;Fiji werd door getrainde beoordelaars gebruikt voor handmatige celtelling (&lt;strong&gt;Figuur 3&lt;/strong&gt;).</td></tr></tbody></table>

geautomatiseerde kwantificering van hematopoietische cellen - stromale cel interacties in histologische afbeeldingen van ontkalkte bone

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocale microscopie is de voorkeurswerkwijze voor de analyse van de lokalisatie van meerdere celtypen binnen complexe weefsels zoals het beenmerg. De analyse en kwantificering van cellulaire lokalisatie is moeilijk, omdat in veel gevallen het berust op handmatige telling, waardoor met het risico van het introduceren van een beoordelaar afhankelijke voorspanning en verminderen interwaarnemersbetrouwbaarheid. Bovendien is het vaak moeilijk te beoordelen of de co-lokalisatie tussen twee cellen resulteert uit willekeurige positie, vooral wanneer celtypen sterk verschillen in de frequentie van voorkomen. Hier wordt een werkwijze voor onpartijdige kwantificering van cellulaire co-localisatie in het beenmerg ingevoerd. Het protocol beschrijft de bereiding van de monsters gebruikt voor histologische coupes van de hele muizen lange botten, waaronder het beenmerg te verkrijgen, evenals de kleuringsprotocol en de overname van beelden met hoge resolutie. Een analyse workflow variërend van de erkenning van hematopoietische en niet-Hematopoietic celtypes in 2-dimensionale (2D) beenmerg beelden naar de kwantificering van de rechtstreekse contacten tussen die cellen wordt gepresenteerd. Dit omvat tevens een wijk analyse, om informatie over de cellulaire micromilieu rond een bepaald celtype verkrijgen. Om te beoordelen of co-lokalisatie van twee celtypen is de resultante van willekeurige cel positioneren of reflecteert preferentiële associaties tussen de cellen een simulatie instrument dat geschikt is voor het testen van deze hypothese bij hematopoïetische en stromale cellen, is gebruikt. Deze benadering is niet beperkt tot het beenmerg, en kan worden uitgebreid tot andere weefsels reproduceerbare, kwantitatieve analyse van histologische gegevens mogelijk.

Snijden cryosecties van ontkalkte bot met Kawamoto tape methode maakt het hele bot te snijden als een intact deel, het beenmerg van de endosteale regio nog aan de gemineraliseerde bot, zowel in de diafyse als in de epifyse gebieden met hun hoge dichtheid van trabeculair bot (Figuur 1). Nucleaire kleuring van secties blijkt dat hoewel kleine barsten in het preparaat niet volledig kan worden vermeden, de structuur van de sinusoïden en slagaders en de reticulaire netwerk van het parenchym blijft intact. </...

Er wordt een strategie gepresenteerd om histologisch data in het beenmerg kwantitatief te analyseren. Confocale microscopie van fluorescent gelabelde cellen in weefselsecties resulteert in 2-dimensionale beelden, die automatisch worden geanalyseerd. Co-lokalisatieanalyses van verschillende celtypen worden vergeleken met gegevens van gesimuleerde beelden, waardoor kwantitatieve informatie over cellulaire interacties wordt verkregen.

Geautomatiseerde kwantificering van hematopoietische cellen - stromale cel interacties in histologische afbeeldingen van ontkalkte Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Het algemene doel van deze procedure is het kwantificeren van de associaties tussen specifieke cel-subsets in het beenmerg. Dit wordt bereikt door eerst histologische cryosneden te nemen van tumoren in muizenfemuren. In de tweede stap worden de sneden gekleurd voor immunofluorescentieanalyse en worden confocale beelden verkregen.De beelden worden vervolgens digitaal geanalyseerd. Uiteindelijk kunnen de posities van de verschillende celtypen worden gesimuleerd om de snelheden en de frequentie van contact tussen de specifieke immunologische cellen van belang en hun micro-omgeving te berekenen. We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we micro-omgevingsniches voor langlevende plasmacellen in het beenmerg analyseerden en behoefte hadden aan een methode om de cellulaire associaties binnen het beenmergweefsel eenduidig te kwantificeren.RA Maya demonstreert de procedure voor het cryo-zuigen van femurs van een volwassen muis. Stel eerst de temperatuur van het monster en het mes van een standaard microtoom, uitgerust met een mes voor hard weefsel, in op -24 °C. Laat dit 15 minuten acclimatiseren.Bevestig een monsterblok aan de metalen monsterhouder met cryo-insluitmedium en pas de oriëntatie van het blok naar behoefte aan. Trim het monster totdat het bot volledig geopend is en het merg zichtbaar is. Stel vervolgens de coupesdikte in op zeven micron.Bevestig vervolgens een stukje Kawamoto-kleefband met de plakzijde naar boven op een monsterblok met behulp van een houten spatel met lederen bekleding. Snijd het monster en gebruik een pincet om de tape om te draaien, zodat het monster aan de bovenzijde is gepositioneerd. Breng de tape vervolgens over op een glazen microscoopglaasje.Bevestig de tape aan de glazen objectglas met plakband zodra de laatste sectie is verzameld. Laat de monsters minimaal 30 minuten drogen en bewaar de objectglazen bij -80 °C. Beeld de monsters af en kleur de ontdooide cryosecties volgens gangbare immunofluorescentieprotocollen.Zorg ervoor dat een kernkleuring wordt toegevoegd om de integriteit van het weefsel te visualiseren. Nadat de coupes zijn gekleurd, wordt er één druppel montagemedium aan elk monster toegevoegd, gevolgd door een glasplaatje van nummer één op een laser scanning confocale microscoop. Selecteer de 20 x objectieflens en stel een gezichtsveld in van 708,15 bij 708,15 microns.Beeld dan de monsters één voor één af met een resolutie van 2048 bij 2048 pixels per afbeelding om de resultaten vergelijkbaar te houden. Leg de beelden vast in één kanaal voor de visualisatie van de stromale structuren, één kanaal voor de kernen en naar behoefte aanvullende kanalen voor de hematopoëtische cellen van belang. Neem de beelden op met behulp van lijn-averaging.Ideaal gezien worden opeenvolgende beelden vastgelegd die samen de gehele femursectie beslaan. Sla de beelden vervolgens op in een bestandsformaat voor microscopiebeelden. Exporteer daarna per kanaal één JPEG-bestand voor elk gefotografeerde gebied en gebruik een instrument voor beeldanalyse om de kwantificering van de beeldsegmentatie, de colokalisatie en de nabuurschapsanalyse uit te voeren voordat de simulaties van de willekeurige cel worden uitgevoerd.Positionering op de geanalyseerde beenmergbeelden voor elk beeld dat gesimuleerd moet worden. Plaats de volgende bestanden in één enkele map: de enkele CSV-bestanden die door de celcontacttool zijn geleverd, de originele JPEG-bestanden van het DPI-kanaal en de originele JPEG-bestanden van het stromale kanaal om batchsimulaties uit te voeren op de serie beelden van één enkel femura-monster; kopieer op dit moment ook alle originele JPEG-bestanden en de bijbehorende enkele CSV-bestanden naar een andere map.Zodra alle bestanden zijn verzameld, start u de simulatietool. Vink vervolgens het vakje 'auto load image data' aan. Wanneer deze optie is geselecteerd, worden de CSV-bestanden die horen bij de geanalyseerde afbeeldingen automatisch geopend.Voer vervolgens de algemene tag voor de CSV-bestanden en het aantal beeldsets in dat voor de batchmodus-simulatie moet worden gebruikt. Laad daarna het JPEG-bestand dat is gegenereerd uit het S stroma-kanaal met een bestandsnaam die eindigt op drie om het masker voor het DPI-kanaal te genereren. Vink het vakje 'masker toepassen' aan en stel de drempelwaarde voor het converteren van de DPI-afbeelding naar een binair masker in op 10.Vink de vakjes 'eight bit' en 'dilate' aan en stel de dilatatiegraad in op vijf pixels. Vink vervolgens het vakje 'width erosion' aan. Voer daarna de gewenste waarde in voor de nabijheidsstraal die wordt gebruikt voor de analyse van de gesimuleerde beelden, en vink het vakje 'use OSU' aan om het OSU-algoritme te gebruiken voor de automatische detectie van de stromale structuren voor de hematopoëtische cellen.Gesimuleerd als cirkelvormige objecten. Meet de celgrootteverdeling van de geanalyseerde celtypen met behulp van een willekeurige beeldanalyse-software die beschikt over de juiste functies voor objectsegmentatie, en bepaal op basis van deze metingen de sigma voor alle hematopoëtische typen. De afkapwaarde voor de celgrootte, namelijk de diameter in pixels van het kleinste object dat door de beeldanalyse-tool nog als een volledige cel wordt herkend, kan worden bepaald.Voer vervolgens de celgrootte-afkapwaarde en de sigma in pixels in voor de simulatie van de celgrootteverdeling voor de rode, groene en blauwe cellen. Vink daarna in het tabblad 'cells and mask' het selectievakje 'delete' aan, zodat het programma een nieuwe positie voor een cel kan kiezen als deze overlapt met ten minste één pixel binnen een verboden gebied van het masker. Vink onder het tabblad 'cell exclusion' ook het selectievakje 'avoid cell overlap' aan.Voer vervolgens de toegestane minimale afstand tussen de centra van twee cellen in pixels in. Als de overlap wordt gedefinieerd door de minimale afstand van het centrum van de ene cel naar het centrum van een andere, stel dan het maximale overlapoppervlak in op 100%. Stel vervolgens de simulatietool in op 1000 herhalingen. Vink daarna het vakje 'auto save sales' aan om de coördinaten van de gesimuleerde objecten voor alle herhalingen van elke afbeelding in de batch op te slaan als tekstbestanden.Voer ook een algemene tag in voor de opgeslagen bestanden. Klik ten slotte op 'run simulation' en bepaal de gemiddelde contact- en nabijheidsfrequenties van de sets van 1000 gesimuleerde beelden die overeenkomen met elk opgenomen beeld. Deel hiervoor de gemiddelde contact- en nabijheidsaantallen door het opgenomen celaantal per beeld en vergelijk de frequenties met de resultaten van de geautomatiseerde colocalisatieanalyse van het opgenomen beeld.In deze figuur wordt een lokalisatieanalyse gepresenteerd van eosinofielen, plasmacellen en B-cellen met de stromale celmicro-omgeving met fluorescent chimeer beenmerg. De CSV-bestanden die zijn gegenereerd door de instrumenten voor celcontact en nabijheid bevatten het celaantal en het totale oppervlak voor elke celpopulatie in pixels, evenals de aantallen contacten of nabijheden. Voordat een simulatie van de willekeurige celpositionering wordt uitgevoerd, moeten de parameters die de celgrootteverdeling als een Gaussische verdeling beschrijven, in deze simulatie worden bepaald; de relatieve waarden van de gemeten sigma voor de drie celpopulaties werden gehandhaafd.Terwijl de in pixels gedefinieerde Sigma-waarden werden ingesteld om overeen te komen met het visuele uiterlijk van de geregistreerde cellen om de gebieden te definiëren waar de cellen kunnen worden geplaatst, werd er een masker gegenereerd vanuit het DAPI-kanaal. Vervolgens werd een waarde van 10 bepaald als de optimale dichtheidsdrempel voor het genereren van de binaire beelden. De relevantie van de contacten van de plasmacellen, eosinofielen of B-cellen met de stromale cellen werd daarna, zoals verwacht, getest.Deze analyses onthulden significant hogere contactfrequenties in de opgenomen beelden vergeleken met de simulatie voor de plasmacellen en B-cellen. In contrast hiermee werd geen duidelijk verschil waargenomen voor het contact tussen eosinofielen en stromale cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in elk vakgebied waar analyse van de complexe weefselstructuur van het beenmerg vereist is, zoals immunologie, hematologie, pathologie of stamcelbiologie.

automated-quantification-hematopoietic-cell-stromal-cell-interactions

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

De aard van de interactie tussen hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPCs) en beenmerg nissen wordt slecht begrepen. Aangepaste hardware wijzigingen en een meerstaps overname protocol maken het gebruik van twee-foton en confocale microscopie beeld ex vivo gemerkte HSPCs geadopteerd in beenmerg gebieden volgen interacties en beweging.

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

De MDS-diagnose is moeilijk in de afwezigheid van morfologische criteria of niet-informatieve cytogenetica. MFC kan helpen verfijnen van het diagnostisch proces van MDS. Om te worden nuttig zijn voor de klinische praktijk, de MFC analyse moet worden gebaseerd op parameters met voldoende gevoeligheid en specificiteit en gegevens moeten worden gereproduceerd tussen verschillende exploitanten.

Database-geleide Flow-cytometry voor evaluatie van het beenmerg myeloïde cel rijping

De ex vivo cultuur van botexplants kan een waardevol instrument zijn voor de studie van de botfysiologie en de mogelijke evaluatie van geneesmiddelen bij botremodellering en botziekten. Het gepresenteerde protocol beschrijft de voorbereiding en cultuur van calvarias geïsoleerd van pasgeboren muizen schedels, evenals de toepassingen ervan.

Het meten van bot remodelleren en recreëren van de Tumor-Bone Microenvironment Met behulp van Calvaria Co-cultuur en Histomorphometrie

We presenteren een methode, die gebruik maakt van een generaliseerbare gebiedsgebaseerde beeldanalysebenadering om celtellingen te identificeren. Analyse van verschillende celpopulaties maakte gebruik van de significante celhoogte en structuurverschillen tussen verschillende celtypen binnen een adaptief algoritme.

Gebiedsgebaseerd beeldanalysealgoritme voor kwantificering van macrofaag-fibroblastcoculturen

Real-time cel metabole flux assay meet het zuurstofverbruik en de extracellulaire verzuringssnelheid, die overeenkomt met mitochondriale en glycolytische adenosinetrifosfaatproductie, met behulp van pH- en zuurstofsensoren. Het manuscript legt een methode uit om de energiestatus van osteoblasten en de karakterisering en interpretatie van de cellulaire bio-energetische status te begrijpen.

Real-time cell metabolic flux analyzer gebruiken om osteoblast bio-energetica te monitoren

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor de isolatie en kleuring van muriene beenmergcellen tot fenotype hemopoietische stam- en voorlopercellen, samen met de ondersteunende niche endotheel- en mesenchymale stamcellen. Een methode om cellen in endosteale en centrale beenmerggebieden te verrijken, is ook inbegrepen.

Flowcytometrie-analyse van hematopoëtische stam- en voorlopercellen van muizenbeenmerg en stromale nichecellen

Hier beschrijven we een eenvoudig te implementeren, gestandaardiseerd, microfysiologisch systeem dat de complexiteit van de in vivo structuur van het menselijk beenmerg weerspiegelt en een relevant model biedt om een breed scala aan normale en pathologische gebeurtenissen nauwkeurig te bestuderen.

Een menselijk beenmerg 3D-model om de dynamiek en interacties tussen residente cellen in fysiologische of tumorale contexten te onderzoeken

Dit protocol presenteert een economische en efficiënte methode voor kwantitatieve evaluatie van botmicroarchitectuur in een muismodel van osteoporose door Hematoxyline-Eosine (HE) kleuring en micro-computertomografie (Micro-CT) technieken te combineren.

Evaluatie van de microarchitectuur van het trabeculaire bot in een muismodel met osteoporose

Hier hebben we in vivo osteo-organoïden ontwikkeld die worden getriggerd door botmorfogenetische eiwit-2-geladen gelatineschars om therapeutische hematopoëtische stam-/voorlopercellen te oogsten voor de reconstructie van een beschadigd hematopoëtisch en immuunsysteem. Over het algemeen kan deze aanpak een veelbelovende celbron zijn voor celtherapieën.

In vivo osteo-organoïde benadering voor het oogsten van therapeutische hematopoëtische stam-/voorlopercellen

Hier presenteren we protocollen die isolatie van stromale cellen uit muizenbot, beenmerg, thymus en menselijk thymusweefsel mogelijk maken die compatibel zijn met single-cell multiomics.

Stromale celisolatie van hematopoëtische organen

Dit protocol presenteert de differentiatie van humane osteoclasten van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) en beschrijft methoden voor de karakterisering van osteoclasten en osteoclastprecursoren.

Differentiatie en karakterisering van osteoclasten van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Leer een methode om hematopoietische cel-stromacel interacties te kwantificeren in ontkalkte botsecties met confocale microscopie. Deze techniek biedt inzicht in immuunceldynamiek in het beenmerg.

Geautomatiseerde kwantificering van hematopoietische cellen - stromale cel interacties in histologische afbeeldingen van ontkalkte Bone (Video) | JoVE Journal

Geautomatiseerde kwantificering van hematopoietische cellen - stromale cel interacties in histologische afbeeldingen van ontkalkte Bone

Meer video's verkennen