Geautomatiseerde kwantificering van hematopoietische cellen - stromale cel interacties in histologische afbeeldingen van ontkalkte Bone

Het algemene doel van deze procedure is om de associaties tussen specifieke celsubgroepen in het beenmerg te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst histologische cryo secties te verzamelen van muis femur tumoren. In de tweede stap worden de secties gekleurd voor immunofluorescente analyse en worden confocale beelden verkregen.

De beelden worden vervolgens digitaal geanalyseerd. Uiteindelijk kunnen de posities van de verschillende celtypen worden gesimuleerd om de snelheden en frequentie van contact tussen de specifieke immunologische cellen van belang en hun micro-omgeving te berekenen. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we micro-omgevingsnissen analyseerden voor lang levende plasmacellen in het beenmerg, en we hadden een methode nodig om de cellulaire associaties in het beenmergweefsel ondubbelzinnig te kwantificeren.

RA Maya zal de procedure voor u demonstreren om femurbotten van een volwassen muis te cryo zuigen. Stel eerst de monster- en mestemperatuur van een standaard microtoom uitgerust met een hard weefselmees op negatief 24 graden Celsius in. Na een acclimatisatie van 15 minuten.

Bevestig een monsterblok aan de metalen monstersteun met cryo-inbeddingsmedium en pas de oriëntatie van het blok zo nodig aan. Trim het monster totdat het bot volledig geopend is en het merg zichtbaar is. Pas vervolgens een sectiedikte aan tot zeven microns.

Bevestig vervolgens een stuk kawamoto kleefband met de klevende kant op de bovenkant van een monsterblok met behulp van een duur lederen beklede houten spatel. Snijd het monster en gebruik pincetten. Draai het tape zodat de sectie op de bovenkant is gepositioneerd. Breng het tape vervolgens over naar een glazen microscoopglaasje.

Bevestig het tape met plakband aan het glazen glaasje wanneer de laatste sectie is verzameld. Laat de monsters minimaal 30 minuten drogen en bewaar de glaasjes bij negatief 80 graden Celsius. Twee vrouwen beelden de monsters af, kleuren de ontdooide cryo secties volgens gebruikelijke immunofluorescentieprotocollen.

Zorg ervoor dat een nucleaire kleurstof wordt opgenomen voor het visualiseren van de weefselintegriteit. Nadat de secties zijn gekleurd, voegt u één druppel floor mount toe aan elk monster, gevolgd door een glas deksel nummer één op een laser scanning confocale microscoop. Selecteer het 20 x objectief en stel een veldbeeld van 708 punt 15 bij 708 punt 15 micrometer in.

Beeld vervolgens de monsters een voor een af met 2048 bij 2048 pixels per afbeelding om de resultaten vergelijkbaar te houden. Neem de beelden op in één kanaal voor het visualiseren van de stromale structuren, één kanaal voor de kernen en extra kanalen voor de hematopoietische cellen van belang zoals nodig. Neem de beelden op met behulp van lijngemiddelde.

Idealiter één aangrenzende afbeeldingen vastleggen om de hele femursectie te dekken. Sla vervolgens de beelden op in een microscopie-afbeeldingsbestandsformaat. Exporteer vervolgens één JPEG-bestand per kanaal voor elk beeldgebied, en gebruik een afbeeldingsanalysetool om de afbeeldingssegmentatiekwantificering van colocalisatie en buurtanalyse uit te voeren voordat u de simulaties van de willekeurige cel uitvoert.

Positionering op de geanalyseerde beenmergafbeeldingen voor elke afbeelding die moet worden gesimuleerd. Plaats de volgende bestanden in een enkele map, de enkele CSV-bestanden die worden geleverd door de celcontacttool. De originele DPI-kanaal JPEG-bestanden en de originele stromale kanaal JPEG-bestanden om batchsimulaties uit te voeren op de reeks afbeeldingen van een enkel femurmonster om alle originele JPEG-bestanden en hun bijbehorende enkele CSV-bestanden op dit moment ook naar een andere map over te brengen.

Wanneer alle bestanden zijn samengesteld, start u de simulatietool. Schakel vervolgens het selectievakje automatisch laden van beeldgegevens in. Met deze optie ingeschakeld, worden de CSV-bestanden die overeenkomen met de geanalyseerde afbeeldingen automatisch geopend.

Voer vervolgens de gemeenschappelijke tag voor de CSV-bestanden en het aantal beeldsets in dat moet worden gebruikt voor batchmodussimulatie. Laad vervolgens het J peg-bestand gegenereerd vanuit het S-stroma kanaal met een bestandsnaam die eindigt op drie om de masker voor het DPI-kanaal te genereren. Schakel het selectievakje toepassen masker in en stel de drempel voor het converteren van de DPI-afbeelding naar een binair masker in op 10.

Schakel de acht bits en dilateer vakken in en stel de graad van dilatatie in op vijf pixels. Schakel vervolgens het breedteverliesvakje in. Voer vervolgens de gewenste waarde in voor de nabije straal die wordt gebruikt voor de analyse van de gesimuleerde beelden, en schakel het selectievakje gebruik OSU in om het OSU-algoritme te gebruiken voor de automatische detectie van de stromale structuren voor de hematopoietische cellen.

Gesimuleerd als cirkelvormige vormen. Meet de celgrootteverdeling van de geanalyseerde celtypen met elke afbeeldingsanalysesoftware die de juiste objectsegmentatiefuncties bevat, en bepaal de sigma voor alle hematopoëtische typen uit deze metingen. De celgroottelimiet die de diameter in pixels beschrijft die het kleinste object beschrijft dat nog steeds als de volledige cel wordt herkend door de afbeeldingsanalysetool, kan worden bepaald.

Voer vervolgens de celgroottelimiet en de sigma in pixels in voor de simulatie van de celgrootteverdeling voor de rode, groene en blauwe cellen. Volgende in het tabblad cellen en masker, vink het vakje verwijderen aan om het programma toe te staan een nieuwe positie voor een cel te kiezen als deze overlapt met ten minste één pixel binnen een verboden gebied van het masker. Vink onder het tabblad celafsluiting ook het vakje vermijd celaanvulling aan.

Voer vervolgens de toegestane minimale afstand in tussen de centra van twee cellen in pixels. Als de overlap wordt gedefinieerd door de minimale afstand van het centrum van de ene cel tot het centrum van een andere, stel de maximale overlapgebied in op 100%Stel vervolgens de simulatietool in op 1000 herhalingen. Schakel vervolgens het selectievakje automatische verkoopverkoop in om de coördinaten van de gesimuleerde objecten voor alle herhalingen van elk beeld van de batch op te slaan als vernielde bestanden in tekstformaat.

Voer ook een gemeenschappelijke