Een methode voor het selecteren-Structure schakelen Aptameren Toegepast op een Colorimetric gouden nanodeeltjes Assay
February 28th, 2015
Er wordt een protocol geboden om structure-switching aptameren voor kleine molecuuldoelen te selecteren op basis van een instelbare strengheid magneetparel selectiemethode. Aptameren geselecteerd met structure-switching eigenschappen zijn gunstig voor assays die een conformationele verandering vereisen om de aanwezigheid van een doel aan te geven, zoals de beschreven gouden nanodeeltjes assay.
Het algemene doel van het volgende experiment is om structuurschakelaars apti te genereren voor integratie als herkenningselementen op detectieplatforms die functioneren door een verandering in aptamer-bevestiging bij doelbinding aan te geven. Dit wordt bereikt door een biotinylerende vastleggingssonde en een complementaire DNA-bibliotheek toe te voegen aan strep tabin-gecoate magnetische kralen om de DNA-bibliotheek op het kraaloppervlak te immobiliseren. Vervolgens wordt een magneet aan de oplossing toegepast om de bindingssequenties te scheiden van de niet-bindende sequenties die op de kralen achterblijven.
De behouden sequenties worden vervolgens gezuiverd en versterkt voor de volgende ronde van selectie. Na een paar rondes selectie wordt een negatieve selectiestap toegevoegd aan het proces. Na verschillende rondes selectie, toont de geselecteerde aptr een structurele verandering bij doelbinding op basis van een goudnanodeeltjes-doeldetectie-assay.
Het gemaakte voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken zoals op oplossing gebaseerde cel X, is dat we het doel niet hoeven te immobiliseren op een vaste drager. De implicaties van deze techniek zijn dus in de risicobeoordeling van de fysiologische toestand van een individu, en dit komt door het feit dat cortisol een indicator is van stress, wat kan leiden tot de beoordeling van gezondheidsproblemen. Gebruik altijd vers bereide DNA-oplossingen voor dit protocol, specifiek voor het doel en de controle.
De voorbereiding van het DNA vereist speciale aandacht. Breng een aliquot van 100 microliter van de DNA-bibliotheek over in een thermocyclerbuis en verwarm deze gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius in een thermomixer. Breng vervolgens de buis op ijs totdat deze nodig is voordat deze DNA wordt gebruikt om de exacte concentratie op een spectrofotometer te bepalen.
Bereid vervolgens de magnetische kralen voor, vortex strept-gecodeerde magnetische kralen en breng 400 microliter ervan over naar een nieuwe microcentrifugebuis. Plaats deze buis gedurende twee minuten op de magneet en verwijder het supernatant, was vervolgens de kralen. Voeg 400 microliter bindingsbuffer toe en vortex ze om de wasbeurt te voltooien.
Gebruik een magneet om de kralen te scheiden en gooi het supernatant weg. Herhaal dit wasproces drie keer. Immobiliseer vervolgens de vastleggingssonde op de magnetische kralen.
Begin door de kralen en 400 microliter bindingsbuffer met 50 micromolair vastleggingssonde te resuspenderen. Bewaar vervolgens de kralen gedurende 10 minuten met zachte agitatie op kamertemperatuur. Om de vrije vastleggingssonde te verwijderen, was de kralen nog drie keer zoals eerder, met 400 microliter bindingsbuffer per wasbeurt.
Na de drie wasbeurten, voeg nog eens 400 microliter buffer toe en verzamel 100 microliter kraaloplossing voor de resterende stappen terwijl u de rest op vier graden Celsius bewaart. De rest kan worden gebruikt voor volgende rondes van selectie gedurende maximaal drie weken. Wanneer er meer kralen nodig zijn, kunnen ze worden voorbereid met langere sondes voor verhoogde strengheid in dit selectieschema.
Bijvoorbeeld, langere sondes werden gebruikt na ronde 13, op dat moment is significant verrijking bereikt met andere strengheden. Wanneer u kralen gebruikt die uit de opslag zijn genomen, begint u met het wassen van de werkelijke aliquot twee keer, met 200 microliter bindingsbuffer per wasbeurt. Anders zijn vers gemaakte kralen al schoon.
Voeg nu 100 microliter snap cool DNA toe aan de kralen en incubeer ze gedurende een half uur op kamertemperatuur met zachte agitatie. Na de incubatie, isoleer de kralen voordat u het supernatant weggooit. Bereken de concentratie van het bevattende DNA om te bepalen hoeveel DNA aan de kralen is gebonden.
Was vervolgens de kralen drie keer met 200 microliter bindingsbuffer. Laat de bindingsbuffer de kralen met zachte agitatie gedurende vijf minuten per keer wassen. Bereid vervolgens de doelmolecuul in bindingsbuffer bij 100 micromolair voor en resuspendeer de kralen in 200 microliter van deze voorbereiding, de doelmolecuul.
In dit geval is cortisol typisch hoog geconcentreerd in de eerste ronde van selectie. Incubeer de kralen met het doel gedurende een half uur met zachte agitatie onder omgevingsomstandigheden. Na de incubatie, sla het snat op dat de doel allude sequenties bevat.
Neem na elke andere ronde van verrijking een monster van de uiteindelijke supernatant om het proces voor monitoring te controleren. Verwijder het cortisol uit het supernatant door middel van dialyse. Dit kan worden overgeslagen als de doelmolecuul niet interfereert met het meten van DNA-absorbantie bij 260 nanometer na elke ronde, versterk het doelbindende DNA door PCR met behulp van het verzamelde supernatant uit de positieve selectiestap als template.
Voer voorlopig altijd een kleine test-PCR uit om het optimale aantal versterkingen te bepalen. Neem na elke cyclus monsters van 10 microliter en vergelijk de monsters met een 25 basenpaar ladder. Hier zou de bibliotheek 85 basenpaar moeten lopen over geamplificeerde producten worden gezien na de 10e cyclus, dus er zouden minder cycli moeten worden gebruikt.
Dit resultaat kan van ronde tot ronde variëren, dus een testrun is altijd noodzakelijk. Voer vervolgens een grootschalige PCR uit met het geselecteerde aantal cycli met behulp van acht stripbuizen. Versterk zes tot acht milliliter reactiemengsel om de vereiste hoeveelheid amplicon voor de volgende ronde van selectie te krijgen, wat tussen de één en 2,5 nanomol DNA is.
Controleer twee keer een monster van de PCR-producten met behulp van een gel. Converteer vervolgens het grootste deel van de producten naar enkelstrengs DNA met behulp van niet-magnetische strept-gecoate kralen. Laad 300 microliter kralen in een kleine kolom geblokkeerd door fritz.
Was vervolgens de kralen voorzichtig met vijf milliliter bindingsbuffer met behulp van een lure lock spuit. Wanneer u de oplossing verandert om de kolom te wassen, verwijdert u de spuit uit de kolom en verwijdert u de zuiger uit de spuit. Dit voorkomt onnodige verstoring van de kralen.
Maak en was voldoende kralenkolommen voor één milliliter PCR-product per kolom. Laat een PCR-product door de kolommen passeren met zachte druk. De DNA-producten worden vastge
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het selecteren van structuur-switching aptameren voor doelen van kleine moleculen met behulp van een magnetische kraal selectiemethode. De geselecteerde aptameren vertonen conformationele veranderingen bij doelbinding, wat voordelig is voor detectie-assays.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Molecuulbiologie
- Analytische chemie
Achtergrond
- Aptameren zijn korte, enkelstrengs DNA- of RNA-moleculen die zich kunnen binden aan specifieke doelen.
- Structuur-switching aptameren veranderen van conformatie bij doelbinding, wat de detectiecapaciteiten verbetert.
- Gouden nanodeeltjesassays gebruiken deze conformationele veranderingen voor signalering.
- Deze methode maakt de detectie van kleine moleculen mogelijk zonder het doel te immobiliseren.
Doel van de studie
- Om een protocol te ontwikkelen voor het selecteren van structuur-switching aptameren.
- Om detectiemethoden voor kleine moleculen zoals cortisol te verbeteren.
- Om fysiologische toestanden te beoordelen op basis van stressindicatoren.
Gebruikte methoden
- Biotinyleerde vastlegproben en een complementaire DNA-bibliotheek worden gebruikt met magnetische kralen.
- Magnetische scheiding wordt gebruikt om bindende sequenties te isoleren van niet-bindende.
- Meerdere rondes van selectie en amplificatie worden uitgevoerd om gewenste aptameren te verrijken.
- Gouden nanodeeltjesassays worden gebruikt om de functionaliteit van de aptameren te demonstreren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle selectie van aptameren die structurele veranderingen vertonen bij doelbinding.
- Aangetoond effectieve detectie van cortisol als stressindicator.
- Protocol staat het gebruik van vers bereide DNA-oplossingen toe voor optimale resultaten.
- Verrijking van aptameren verbetert met langere probes en verhoogde strengheid.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het selecteren van structuur-switching aptameren.
- Deze aptameren kunnen de gevoeligheid van assays voor kleine molecuuldetectie verbeteren.
- De aanpak heeft potentiële toepassingen in gezondheidsbeoordelingen met betrekking tot stress.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables the selection of structure-switching aptamers for small molecule targets without target immobilization, supporting biosensor development for physiological biomarkers. The approach enhances predictive confidence in target validation by enriching aptamers that undergo conformational change upon binding, reducing false positives from non-specific bead interactions. It provides a reusable discovery workflow for assay development in early-stage drug discovery, particularly for targets like cortisol where rapid, colorimetric readout is valuable for decentralized testing. The protocol’s emphasis on negative selection and probe length extension improves stringency, aiding in lead identification by minimizing background sequences and enriching high-affinity binders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by selecting aptamers that undergo target-induced conformational change, providing functional validation of binding specificity.
- Operational Value: Eliminates need for target immobilization, simplifying workflow and reducing artifacts from surface-based interactions.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by enriching sequences with demonstrable structural switching, increasing confidence in target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates aptamers compatible with gold nanoparticle assays, enabling quantitative, colorimetric readout for high-throughput screening.
- Operational Value: Produces standardized binding pools through repeated selection and amplification, improving assay reproducibility across runs.
- Scalability: Extended capture probe length after enrichment increases stringency, supporting reuse of the selection platform for multiple targets.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Selected aptamers demonstrate detection capability in buffer, providing a foundation for extension to physiological fluids like saliva or sweat.
- Biomarker Alignment: Cortisol detection aligns with stress-related biomarker monitoring, relevant for assessing physiological state in preclinical safety studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Enrichment monitoring via elution and sequencing allows go/no-go decisions based on aptamer specificity and copy number frequency.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling progression from aptamer selection to functional assay development for small molecule detection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating aptamers that reflect target-induced structural changes, clarifying binding mechanism and specificity.
- Screening: Delivers assay-ready aptamers with demonstrated performance in colorimetric formats, enabling reliable compound or ligand evaluation.
- Analytics: Provides quantitative outputs via gold nanoparticle signal shift, allowing comparison of binding conditions and enrichment progress.
- Translational Research: Connects to preclinical workflows through buffer-based proof-of-principle data, informing future adaptation to complex matrices.
- Enterprise Reuse: Magnetic bead selection with modifiable probe length creates a reusable platform for multiple small molecule targets, reducing redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by selecting aptamers with verifiable conformational switching, reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through negative selection steps and defined washing protocols, minimizing batch variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by enabling early assessment of aptamer functionality, reducing investment in non-viable candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through enrichment tracking and sequencing data, informing advancement based on copy number dominance and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling, magnetic bead separation, and PCR optimization to avoid amplification bias.
- Dependent on magnetic separation equipment, thermocyclers, and spectrophotometry for DNA quantification and quality control.
- Necessitates cross-team standardization of binding buffer conditions and negative selection compounds (e.g., progesterone) to ensure reproducibility.
- Adaptation to physiological fluids may require optimization of salt concentration and temperature to maintain aptamer stability and target binding.
- Practical limitation: Partitioning efficiency is constrained by keeping melting temperature near room temperature, necessitating multiple selection rounds to reduce background.
