Een methode voor het selecteren-Structure schakelen Aptameren Toegepast op een Colorimetric gouden nanodeeltjes Assay
28 februari 2015
Er wordt een protocol geboden om structure-switching aptameren voor kleine molecuuldoelen te selecteren op basis van een instelbare strengheid magneetparel selectiemethode. Aptameren geselecteerd met structure-switching eigenschappen zijn gunstig voor assays die een conformationele verandering vereisen om de aanwezigheid van een doel aan te geven, zoals de beschreven gouden nanodeeltjes assay.
Het algemene doel van het volgende experiment is om structuurschakelaars apti te genereren voor integratie als herkenningselementen op detectieplatforms die functioneren door een verandering in aptamer-bevestiging bij doelbinding aan te geven. Dit wordt bereikt door een biotinylerende vastleggingssonde en een complementaire DNA-bibliotheek toe te voegen aan strep tabin-gecoate magnetische kralen om de DNA-bibliotheek op het kraaloppervlak te immobiliseren. Vervolgens wordt een magneet aan de oplossing toegepast om de bindingssequenties te scheiden van de niet-bindende sequenties die op de kralen achterblijven.
De behouden sequenties worden vervolgens gezuiverd en versterkt voor de volgende ronde van selectie. Na een paar rondes selectie wordt een negatieve selectiestap toegevoegd aan het proces. Na verschillende rondes selectie, toont de geselecteerde aptr een structurele verandering bij doelbinding op basis van een goudnanodeeltjes-doeldetectie-assay.
Het gemaakte voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken zoals op oplossing gebaseerde cel X, is dat we het doel niet hoeven te immobiliseren op een vaste drager. De implicaties van deze techniek zijn dus in de risicobeoordeling van de fysiologische toestand van een individu, en dit komt door het feit dat cortisol een indicator is van stress, wat kan leiden tot de beoordeling van gezondheidsproblemen. Gebruik altijd vers bereide DNA-oplossingen voor dit protocol, specifiek voor het doel en de controle.
De voorbereiding van het DNA vereist speciale aandacht. Breng een aliquot van 100 microliter van de DNA-bibliotheek over in een thermocyclerbuis en verwarm deze gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius in een thermomixer. Breng vervolgens de buis op ijs totdat deze nodig is voordat deze DNA wordt gebruikt om de exacte concentratie op een spectrofotometer te bepalen.
Bereid vervolgens de magnetische kralen voor, vortex strept-gecodeerde magnetische kralen en breng 400 microliter ervan over naar een nieuwe microcentrifugebuis. Plaats deze buis gedurende twee minuten op de magneet en verwijder het supernatant, was vervolgens de kralen. Voeg 400 microliter bindingsbuffer toe en vortex ze om de wasbeurt te voltooien.
Gebruik een magneet om de kralen te scheiden en gooi het supernatant weg. Herhaal dit wasproces drie keer. Immobiliseer vervolgens de vastleggingssonde op de magnetische kralen.
Begin door de kralen en 400 microliter bindingsbuffer met 50 micromolair vastleggingssonde te resuspenderen. Bewaar vervolgens de kralen gedurende 10 minuten met zachte agitatie op kamertemperatuur. Om de vrije vastleggingssonde te verwijderen, was de kralen nog drie keer zoals eerder, met 400 microliter bindingsbuffer per wasbeurt.
Na de drie wasbeurten, voeg nog eens 400 microliter buffer toe en verzamel 100 microliter kraaloplossing voor de resterende stappen terwijl u de rest op vier graden Celsius bewaart. De rest kan worden gebruikt voor volgende rondes van selectie gedurende maximaal drie weken. Wanneer er meer kralen nodig zijn, kunnen ze worden voorbereid met langere sondes voor verhoogde strengheid in dit selectieschema.
Bijvoorbeeld, langere sondes werden gebruikt na ronde 13, op dat moment is significant verrijking bereikt met andere strengheden. Wanneer u kralen gebruikt die uit de opslag zijn genomen, begint u met het wassen van de werkelijke aliquot twee keer, met 200 microliter bindingsbuffer per wasbeurt. Anders zijn vers gemaakte kralen al schoon.
Voeg nu 100 microliter snap cool DNA toe aan de kralen en incubeer ze gedurende een half uur op kamertemperatuur met zachte agitatie. Na de incubatie, isoleer de kralen voordat u het supernatant weggooit. Bereken de concentratie van het bevattende DNA om te bepalen hoeveel DNA aan de kralen is gebonden.
Was vervolgens de kralen drie keer met 200 microliter bindingsbuffer. Laat de bindingsbuffer de kralen met zachte agitatie gedurende vijf minuten per keer wassen. Bereid vervolgens de doelmolecuul in bindingsbuffer bij 100 micromolair voor en resuspendeer de kralen in 200 microliter van deze voorbereiding, de doelmolecuul.
In dit geval is cortisol typisch hoog geconcentreerd in de eerste ronde van selectie. Incubeer de kralen met het doel gedurende een half uur met zachte agitatie onder omgevingsomstandigheden. Na de incubatie, sla het snat op dat de doel allude sequenties bevat.
Neem na elke andere ronde van verrijking een monster van de uiteindelijke supernatant om het proces voor monitoring te controleren. Verwijder het cortisol uit het supernatant door middel van dialyse. Dit kan worden overgeslagen als de doelmolecuul niet interfereert met het meten van DNA-absorbantie bij 260 nanometer na elke ronde, versterk het doelbindende DNA door PCR met behulp van het verzamelde supernatant uit de positieve selectiestap als template.
Voer voorlopig altijd een kleine test-PCR uit om het optimale aantal versterkingen te bepalen. Neem na elke cyclus monsters van 10 microliter en vergelijk de monsters met een 25 basenpaar ladder. Hier zou de bibliotheek 85 basenpaar moeten lopen over geamplificeerde producten worden gezien na de 10e cyclus, dus er zouden minder cycli moeten worden gebruikt.
Dit resultaat kan van ronde tot ronde variëren, dus een testrun is altijd noodzakelijk. Voer vervolgens een grootschalige PCR uit met het geselecteerde aantal cycli met behulp van acht stripbuizen. Versterk zes tot acht milliliter reactiemengsel om de vereiste hoeveelheid amplicon voor de volgende ronde van selectie te krijgen, wat tussen de één en 2,5 nanomol DNA is.
Controleer twee keer een monster van de PCR-producten met behulp van een gel. Converteer vervolgens het grootste deel van de producten naar enkelstrengs DNA met behulp van niet-magnetische strept-gecoate kralen. Laad 300 microliter kralen in een kleine kolom geblokkeerd door fritz.
Was vervolgens de kralen voorzichtig met vijf milliliter bindingsbuffer met behulp van een lure lock spuit. Wanneer u de oplossing verandert om de kolom te wassen, verwijdert u de spuit uit de kolom en verwijdert u de zuiger uit de spuit. Dit voorkomt onnodige verstoring van de kralen.
Maak en was voldoende kralenkolommen voor één milliliter PCR-product per kolom. Laat een PCR-product door de kolommen passeren met zachte druk. De DNA-producten worden vastge
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het selecteren van structuur-switch aptameren voor kleine molecuuldoelwitten met behulp van een selectiemethode met magnetische kraaltjes. De geselecteerde aptameren vertonen conformationele veranderingen bij binding aan het doelwit, wat voordelig is voor detectie-assays.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Biochemie
- Moleculaire biologie
- Analytische chemie
Achtergrond
- Aptameren zijn korte, enkelstrengse DNA- of RNA-moleculen die kunnen binden aan specifieke targets.
- Structuur-switchings-aptameren veranderen van conformatie bij binding aan het target, wat de detectiecapaciteiten verbetert.
- Goudnanopartikel-assays maken gebruik van deze conformationele veranderingen voor signalering.
- Deze methode maakt de detectie van kleine moleculen mogelijk zonder dat het target geïmmobiliseerd hoeft te worden.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een protocol voor het selecteren van structuur-switch aptameren.
- Het verbeteren van detectiemethoden voor kleine moleculen zoals cortisol.
- Het beoordelen van fysiologische toestanden op basis van stressindicatoren.
Gebruikte methoden
- Biotine-geconjugeerde capture-probes en een complementaire DNA-bibliotheek worden gebruikt met magnetische beads.
- Magnetische scheiding wordt aangewend om bindende sequenties te isoleren van niet-bindende sequenties.
- Meerdere ronden van selectie en amplificatie worden uitgevoerd om de gewenste aptameren te verrijken.
- Goudnanodeeltjes-assays worden gebruikt om de functionaliteit van de aptameren aan te tonen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle selectie van aptameren die structurele veranderingen vertonen bij binding aan het doelwit.
- Aangetoonde effectiviteit bij het detecteren van cortisol als stressindicator.
- Het protocol maakt het gebruik van vers bereide DNA-oplossingen mogelijk voor optimale resultaten.
- De verrijking van aptameren verbetert bij langere probes en verhoogde stringentie.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het selecteren van structuurschakelende aptameren.
- Deze aptameren kunnen de gevoeligheid van assays voor de detectie van kleine moleculen verbeteren.
- De benadering heeft potentiële toepassingen in gezondheidsbeoordelingen met betrekking tot stress.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze methode maakt de selectie van structuur-switchende aptameren voor kleine moleculaire targets mogelijk zonder immobilisatie van het target, wat de ontwikkeling van biosensoren voor fysiologische biomarkers ondersteunt. De aanpak verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van targets door aptameren te verrijken die een conformationele verandering ondergaan bij binding, waardoor fout-positieven door aspecifieke interacties met beads worden verminderd. Het biedt een herbruikbare ontdekkingsworkflow voor de ontwikkeling van assays in vroege stadia van geneesmiddelenonderzoek, in het bijzonder voor targets zoals cortisol, waarbij een snelle, colorimetrische uitlezing waardevol is voor decentrale testen. De nadruk van het protocol op negatieve selectie en het verlengen van de probelengte verbetert de stringentie, wat helpt bij de identificatie van lead-moleculen door achtergrondsequenties te minimaliseren en binders met een hoge affiniteit te verrijken.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door aptameren te selecteren die een doelwit-geïnduceerde conformationele verandering ondergaan, wat zorgt voor functionele validatie van de bindingsspecificiteit.
- Operationele waarde: Elimineert de noodzaak voor immobilisatie van het doelwit, waardoor de workflow wordt vereenvoudigd en artefacten door oppervlakte-interacties worden verminderd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door sequenties te verrijken met aantoonbare structurele schakeling, wat het vertrouwen in de target engagement vergroot.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert aptameren die compatibel zijn met goudnanodeeltjes-assays, waardoor een kwantitatieve, colorimetrische uitlezing voor high-throughput screening mogelijk wordt.
- Operationele waarde: Produceert gestandaardiseerde bindingspools via herhaalde selectie en amplificatie, wat de reproduceerbaarheid van de assay over verschillende runs verbetert.
- Schaalbaarheid: Een verlengde lengte van de capture-probe na verrijking verhoogt de stringentie, waardoor hergebruik van het selectieplatform voor meerdere targets wordt ondersteund.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: De geselecteerde aptameren vertonen detectiecapaciteit in buffer, wat een basis vormt voor uitbreiding naar fysiologische vloeistoffen zoals speeksel of zweet.
- Afstemming op Biomarkers: Cortisoldetectie is in overeenstemming met de monitoring van stressgerelateerde biomarkers, wat relevant is voor het beoordelen van de fysiologische toestand in preklinische veiligheidsstudies.
- Risico-geoptimaliseerde Vooruitgang: Monitoring van verrijking via elutie en sequencing maakt go/no-go-beslissingen mogelijk op basis van aptameerspecificiteit en kopiegetalfrequentie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot lead-identificatie, waardoor de overgang van aptameerselectie naar de ontwikkeling van functionele assays voor de detectie van kleine moleculen mogelijk wordt gemaakt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door aptameren te isoleren die doelwit-geïnduceerde structurele veranderingen weerspiegelen, waardoor het bindingsmechanisme en de specificiteit worden verduidelijkt.
- Screening: Levert assay-klare aptameren met aangetoonde prestaties in colorimetrische formaten, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen of liganden mogelijk maakt.
- Analytica: Levert kwantitatieve resultaten via de signaalverschuiving van goudnanodeeltjes, waardoor vergelijking van bindingscondities en de voortgang van verrijking mogelijk is.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische workflows via buffer-gebaseerde proof-of-principle gegevens, wat toekomstige aanpassing aan complexe matrices informeert.
- Herbruikbaarheid op bedrijfsniveau: Magnetische kraalselectie met aanpasbare probelengte creëert een herbruikbaar platform voor meerdere kleine moleculaire doelwitten, waardoor de inspanning voor herontwikkeling wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: VerhoogtHet voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door aptameren te selecteren met verifieerbare conformationele schakeling, waardoor mechanische ambiguïteit wordt verminderd.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie via negatieve selectiestappen en gedefinieerde wasprotocollen, waardoor batchvariabiliteit wordt geminimaliseerd.
- Strategische waarde: Verbetert de efficiëntie van go/no-go-beslissingen door een vroege beoordeling van de aptameerfunctionaliteit mogelijk te maken, wat investeringen in niet-levensvatbare kandidaten vermindert.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering via verrijkingsmonitoring en sequeneringsgegevens, wat informs de verdere ontwikkeling op basis van kopiegetaldominantie en specificiteit.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in de hantering van nucleïnezuren, magnetische kraal-scheiding en PCR-optimalisatie om amplificatiebias te voorkomen.
- Afhankelijk van magnetische scheidingsapparatuur, thermocyclers en spectrofotometrie voor DNA-kwantificering en kwaliteitscontrole.
- Necessiteert cross-team standaardisatie van bindingsbuffercondities en negatieve selectieverbindingen (bijv. progesteron) om reproduceerbaarheid te garanderen.
- Aanpassing aan fysiologische vloeistoffen kan optimalisatie van zoutconcentratie en temperatuur vereisen om de stabiliteit van het aptameer en de targetbinding te behouden.
- Praktische beperking: De partitioneringsefficiëntie wordt beperkt doordat de smelttemperatuur nabij kamertemperatuur moet blijven, wat meerdere selectierondes noodzakelijk maakt om de achtergrondruis te verminderen.
