A Time Differential kleuringstechniek combinatie met Full Bilaterale Gill denervatie te Ionocytes Studie in Fish

Het algemene doel van deze procedure is om de proliferatie van brachiale cyten in de kieuwen van goudvissen te onderzoeken, zonder extrinsieke innervatie. Dit wordt bereikt door de vissen eerst in een mitochondrion-specifiek kleurbad te plaatsen om de reeds bestaande mitochondriën, rijke brachiale cyten, te kleuren. De tweede stap is om volledige bilaterale denervatie van de kieuwen uit te voeren.

Vervolgens worden de vissen geëuthanaseerd. De kieuwen worden geoogst. En cyten worden gelabeld met behulp van een antilichaam tegen natriumkalium bij TPA's.

Vervolgens is de laatste stap het afbeelden en tellen van bestaande en nieuw gedifferentieerde cyten. Uiteindelijk wordt deze tijdsdifferentiële kleuringstechniek met bilaterale guild denervatie gebruikt om de proliferatie en verdeling van kieuwcyten bij goudvissen zonder enige zenuwinput van het centrale zenuwstelsel te tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden gebruikt om de dynamische opname van ionen te begrijpen en de herverdeling van cyten in het GI-epitheel van vissen te onderzoeken.

Maak eerst een milimolair mitraal tracker rood stamoplossing door 50 microgram op te lossen in 94 microliter dimethylsulfoxide en bescherm het tegen licht. Bereid vervolgens drie tot zes donkere dozen met een maximaal volume van 600 milliliter. Vul elke doos met 400 milliliter systeemwater en plaats een luchtsteen in elke doos om een bron van zuurstof te bieden.

Plaats goudvissen met een gewicht van 30 tot 40 gram in de dozen. Voeg na 30 minuten de Mitre tracker-oplossing toe om een volledige concentratie van 0,1 micromolair kleurstof en 0,01%DMSO te verkrijgen. Laat de vissen vier uur in het bad liggen.

Na vier uur zet de watertoevoer naar de dozen aan en laat de kleurstof eruit spoelen. Als dit controledieren zijn, herstel de vissen gedurende drie tot vijf dagen en ga vervolgens door met immunohistochemie, anders ga je verder met de volledige bilaterale denervatieprocedure. Anesthesieer eerst de vissen door de vissen in een geaëereerd benzocaine waterbad te plaatsen.

Zodra de ademhaling is gestopt, plaats de vissen op een operatietafel en steek een buis in de buccale holte. Om de kieuwen te irrigeren met een geaëereerd anesthesieoplossing, positioneer de vissen zodat de kop iets naar beneden is gekanteld om betere toegang tot het gebied achter de vierde kieuwboog mogelijk te maken. Til voorzichtig het operculum op met een rechte standaard forceps en plaats vervolgens weefsel retractoren tussen het operculum en de binnenkant van het hoofd. Open voorzichtig de weefsel retractoren om het operculum uit de buurt van het hoofd te houden en de kieuwen bloot te leggen.

Rust de retractor handvatten naast het hoofd. Om toegang te bieden tot alle vier kieuwbogen. Controleer of de anesthesieoplossing de kieuwen irrigert en plaats gebogen of rechte standaard forceps tussen de vierde kieuwboog en de achterkant van het hoofd. Open voorzichtig de forceps om spanning in het ligament te creëren.

Bevestig de vierde kieuwboog aan het hoofd met een paar nummer vijf forceps. Maak een opening van twee tot drie millimeter door het epitheel te doorboren en verbind het dorsale uiteinde van de kieuwbogen met de auriculaire holte. Wees voorzichtig om niet te diep te gaan omdat er een risico bestaat op beschadiging van een belangrijke bloedvat.

Houd vervolgens een kleine wattenstaafje met nummer vijf forceps vast en gebruik deze om de incisie voorzichtig te vergroten om de negende en tiende zenuwen bloot te leggen. Bevrijd de zenuwen van eventueel bindweefsel door de nummer vijf forceps te gebruiken. Weer voorzichtig om bloedvaten niet te beschadigen.

Zodra de zenuwen zijn blootgelegd en geïdentificeerd, gebruikt u de gebogen veerschaar om de zenuwen voorzichtig te snijden terwijl u de incisie vasthoudt. Open met de rechte standaardvormige forceps. Nadat de zenuwen zijn doorgesneden, trekt u voorzichtig de gebogen forceps terug en verwijdert u het weefsel.

Retractor naden zijn niet nodig omdat de incisie zichzelf binnen 24 tot 48 uur zou moeten sluiten. Nadat de procedure aan de andere kant van het hoofd is herhaald, verander de irrigatie van de kieuwen van anesthesie naar vers geaereerd water en laat de vissen herstellen van de anesthesie. Zodra de auriculaire bewegingen zijn hervat, verplaatst u de vissen naar experimentele tanks om minstens 24 uur te recupereren.

Voer tenslotte een schijnprocedure uit op een aparte set vissen door het epitheel achter de vierde kieuwboog te doorboren zonder de zenuwen door te snijden voordat de vissen worden geëuthanaseerd. Plaats drie tot vier milliliter 4%PFA in een scintillatieglas. Gebruik één glas per kieuwboog.

Neem bovendien een kleine wei boot en vul het met één XPBS. Dit wordt gebruikt om het weefsel te wassen nadat het is verwijderd. Bewaar alle oplossingen op ijs.

Nadat de vissen zijn geëuthanaseerd met een overdosis benzocaine, gebruikt u stompe forceps om de perm aan één kant van het hoofd op te tillen en gebogen schaar om elk uiteinde van de brachiale kieuwmand door te snijden. Gebruik vervolgens stompe forceps om voorzichtig de kieuw op te pakken door de Rackers en deze uit de auriculaire holte te tillen. Was de kieuw onmiddellijk in ijskoud één XPBS om overtollig benzeen en bloed te verwijderen en plaats de verwijderde kieuw in een glas gevuld met 4%PFA. Fixeer alle verwijderde kieuwen een nacht bij vier graden Celsius na fixatie.

Was X-S-P-F-A af in één XPBS en plaats het weefsel in een twee milliliter bulletbuis gevuld met 1,5 milliliter 1%Tritton x. Plaats de bulletbuizen op een shaker gedurende zes uur bij kamertemperatuur of een nacht bij vier graden Celsius. Om het weefsel te doordringen, bereidt u een een tot 250 verdunning van elk primair antilichaam voor door vier microliter van zowel de NKA als ZN 12 primaire antilichamen toe te voegen aan 992 microliter van één XPBS.

Zorg ervoor dat beide