Immunohistochemie en Multiple Labeling met antilichamen van dezelfde Host te onderzoeken soorten volwassen hippocampus Neurogenese

Het algemene doel van deze procedure is om de beperkingen van indirecte immunofluorescentie te omzeilen om neurale stamcellen te bestuderen. Wanneer geschikte primaire antilichamen van verschillende gastheersoorten niet beschikbaar zijn. Aanvankelijk wordt een thymidine-analogon geïnjecteerd om de zich delende cellen te labelen, waarna het weefsel wordt geoogst, verwerkt en in cryogene secties gesneden.

Vervolgens wordt sequentiële meervoudige immunofluorescentie uitgevoerd om te beginnen. Er wordt een ongelabeld primair antilichaam aangebracht, dat vervolgens wordt gebonden door een fluorescentie gelabeld secundair antilichaam. Vervolgens worden de open perikopen op het eerste secundaire antilichaam geblokkeerd met serum van de primaire antilichaamsoort, en alle immunoglobulinen die door het tweede secundaire antilichaam zouden kunnen worden herkend, worden bedekt met ongeconjugeerde fab-fragmenten.

Dit maakt het mogelijk om het weefsel te behandelen met een tweede primair antilichaam, dat kan worden gelabeld door een ander secundair antilichaam. Uiteindelijk worden afbeeldingen van de secties gebruikt om de ontwikkeling en regulatie van neurale stamcellen in reactie op specifieke stimuli en hun betrokkenheid bij specifieke hersenfuncties te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals gelijktijdige meervoudige immunofluorescentie, is dat het problemen omzeilt die gewoonlijk ontstaan door het gebruik van primaire antilichamen die in dezelfde gastheersoort zijn opgewekt.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het gebied van volwassen neurogenese, zoals de proliferatie van hippocampale progenitorsubtypes in reactie op fysiologische of farmacologische stimuli, hersenpathologieën of veroudering. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat de meervoudige labeling met primaire antilichamen van dezelfde gastheersoort kan leiden tot ongewenste antilichaamskruisactiviteiten zonder adequaat blokkeren. Weeg eerst de dieren die geïnjecteerd moeten worden en bereid een verse 10 milligram per milliliter thymidine-analogoplossing voor voor de injectie.

Wanneer de oplossing klaar is, bereid een gewicht aangepaste dosis in een fijne doseringspuit met een naald van 30 gauge voor. Beperk vervolgens de muis door de scruff en injecteer het thymidine-analogon intraperitoneaal op het gewenste tijdstip, diep anesthetiseer de muis en trans cardio. Perfuseer het met 10 milliliter ijskoud PBS, gevolgd door 40 milliliter verse ijskoude formaldehydeoplossing.

Vervolgens wordt de hersenen en het ruggenmerg gedissecteerd en vastgelegd in hetzelfde fixeermiddel volgens de fixatie. Incubeer de verzamelde hersenen gedurende 24 uur in 10% sucrose bij vier graden Celsius. De volgende dag worden de hersenen overgebracht naar 30% sucrose en gedurende nog eens 48 uur geïncubeerd.

Met de hersenen klaar voor cryobescherming, worden ze ingeslagen bij minus 25 graden Celsius in isopentaan. Later, gebruik een cryostat om 40 micron coronale secties voor langdurige opslag te snijden. Breng de secties over naar een antivriesoplossing en bewaar ze bij min 20 graden Celsius.

Begin met het overbrengen van de secties van de antivriesoplossing naar TBS met behulp van een fijne borstel. Spoel de secties grondig af, beginnend met een overnachtelijke wassing bij vier graden Celsius, gevolgd door vijf wasbeurten van 10 minuten bij kamertemperatuur. Al deze incubaties moeten worden uitgevoerd met continue zachte agitatie.

Als een van de antigenen van belang een thymidine-analogon is, moet op dit punt een zoutzuurdenaturatiestap worden uitgevoerd, gevolgd door een neutralisatie-stap in borebuffer. Ga verder met het doorlaatbaar maken en blokkeren van de onspecifieke antilichaambindingsplaatsen in TBS plus. Laat deze incubatie een uur op kamertemperatuur verlopen, en incubeer vervolgens in het eerste primaire antilichaam verdund in TBS plus gedurende een nacht bij vier graden Celsius de volgende dag.

Was de secties drie keer in TBS en eenmaal in TBST. Laat elke bad 10 minuten duren. Incubeer vervolgens in het eerste fluorochroomgeconjugeerde secundaire antilichaam gedurende drie uur bij kamertemperatuur.

Bescherm vanaf nu de secties tegen lichtblootstelling. Na nog een wasserie, breng de secties over in een 10% gastheersoortserumoplossing waaruit de twee primaire antilichamen zijn gemaakt. Incubeer de secties in deze oplossing gedurende drie uur om de open perikopen op het eerste secundaire antilichaam te verzadigen.

Spoel later drie keer in TBS en eenmaal in TBST om het serum te verwijderen. Bereid vervolgens een oplossing van TBS plus met 50 microgram per milliliter ongeconjugeerde monovalente fab-fragmenten gericht tegen de gastheersoort van het primaire antilichaam. Dit dekt de epitopen die anders door het tweede secundaire antilichaam zouden kunnen worden herkend.

Breng de secties over in deze oplossing en incubeer gedurende een nacht bij vier graden Celsius. Na de incubatie, spoel de secties minimaal drie keer in TBS en eenmaal in TBST. Tijdens overdrachten, veeg de mesh-inserts met de secties op een papieren handdoek om resterende fab-resten te verwijderen.

Incubeer nu de secties gedurende een nacht bij vier graden Celsius in het tweede primaire antilichaam. Na nog een wasserie, breng het tweede secundaire antilichaam gedurende drie uur bij kamertemperatuur aan. Was vervolgens de secties drie keer in TBS en ga verder met het monteren van de secties gelatine.

Laat de dia's drogen en dek ze af met een ANTIFA-monteermediumbeeld. Beeld de fluorescentiegelabelde secties af met een confocale laserscanningmicroscoop. Neem beeldstacks op willekeurige posities langs de volledige omvang van de dentate gyrus bij 400-voudige vergroting.

Analyseer ten minste 50 willekeurig geselecteerde cellen van belang per hemisfeer voor co-labeling van de verschillende markers. Om absolute aantallen voor specifieke nieuwgeboren celpopulaties te berekenen, vermenigvuldig de percentages van co-gelabelde cellen met de totale aantallen nieuwgeboren cellen zoals geschat uit DAB-kleuringsanalyse. De beschreven methoden werden gebruikt om nieuwgeboren cellen te kwantificeren en te karakteriseren in de postnatale en volwassen hippocampus van een neurogenese-deficiënte cyclus.

D-twee knock-out muis