Name: Immunohistochemie en Multiple Labeling met antilichamen van dezelfde Host te onderzoeken soorten volwassen hippocampus Neurogenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Leer een sequentiële immunofluorescentieprotocol om volwassen hippocampale neurogenese te kwantificeren in muizenhersenen. Deze methode omzeilt beperkingen van antilichamen uit dezelfde gastsoort.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken S. Tausch voor uitstekende technische assistentie. Het werk werd ondersteund door BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) en DFG (FOR1738).

OPMERKING: Alle procedures waarbij levende dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de EG-richtlijn 86/609 / EEG van de Raad richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren en door de lokale ethische commissie (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz) goedgekeurd uitgevoerd. 1. intraperitoneale injectie van Thymidine Analogs <ol><li> Weeg de dieren op de dag voor injectie. Bereken de hoeveelheid thymidine analoge vereist voor alle injecties gepland op de volgende dag als individuele gewichtsgecorrigeerde injectievolumes van een 10 mg / ml stamoplossing. </li><li> Bereid 10 mg / ml thymidine stamoplossing. (LET OP! Thymidine analogen zijn giftig. Volg de specifieke Material Safety Data Sheets (MSDS) die door de leveranciers, dat wil zeggen, slijtage laboratoriumjas en handschoenen, gebruik een chemische dampkap). <ol><li> Neem thymidine analoog uit de vriezer en breng het naar RT, ong. 21 ° C. Weeg 10 mg en voegsteriele zoutoplossing (voor BrdU en CldU) of 0,04 N NaOH (in steriele zoutoplossing, want IDG), vortex. Gedurende ten minste 10-15 minuten in een 50 ° C waterbad en vortex elke 2-3 min het poeder oplost. OPMERKING: Gebruik oplossingen tot 24 uur indien bewaard bij kamertemperatuur en gedurende enkele weken bij -20 ° C. Bescherm oplossingen van licht (cover met aluminiumfolie). Controleer altijd voor neerslagen en opnieuw te ontbinden indien nodig. </li></ol></li><li> Weerhouden de muis door het nekvel en intraperitoneaal injecteren van een passende, op gewicht aangepast volume van de stockoplossing (bij RT) met een fijne dosis spuit met een 30 G naald. OPMERKING: Indien CldU en IDU sequentieel in hetzelfde dier toegediend, overwegen equimolaire concentraties injecteren (bijvoorbeeld 42,5 mg / kg CldU en 57,5 mg / kg IDU, die overeenkomen met 50 mg / kg BrdU). Daarom dienovereenkomstig aanpassen het injectievolume van 10 mg / ml voorraadoplossingen. </li></ol> 2. Tissue Voorbereiding <ol><li> Prepare 4% formaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer pH 7,4 op de dag voor perfusie. Bewaar bij 4 ° C. </li><li> Transcardially perfuseren de diep verdoofde muizen (3,5% isofluraan) via de linker ventrikel met 10 ml ijskoude PBS, daarna met 40 ml ijskoude formaldehyde (stroomsnelheid 5 ml / min). Prepareer de hersenen en post-fix in hetzelfde fixeermiddel gedurende 24 uur bij 4 ° C. </li><li> Breng de hersenen achtereenvolgens in 10% (24 uur bij 4 ° C) en 30% sucrose (tot de hersenen wastafels, ong. 48 uur). Voor het invriezen, langzaam onderdompelen cryobeschermd hersenen in -25 ° C isopentaan tot er geen luchtbellen ontstaan ​​uit het weefsel. Bewaren bij -80 ° C. </li><li> Snijd coronale secties van 40 pm dikte op een ijskoude microtoom (blok temperatuur op -25 tot -16 ° C). Sequentieel overdracht secties in antivries oplossing met putjes van een 24-well celkweek plaat (zie figuur 1). Bewaren bij -20 ° C. </li></ol><img alt = &quot;Figuur 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52551 / 52551fig1.jpg&quot; /&gt; Figuur 1. Schematische weergave van het overbrengen van microtoom plakjes in een 24-well plaat. Begin bij de A1 en leg daarop plakjes in rij A, na de A6 naar de volgende rij B, enzovoort. Bij het bereiken van D6, ga terug naar de A1 en ga verder. Deze opstelling van segmenten maakt kwantificering van elk nde deel van een gehele hersenen. Voor kwantificering van de pasgeboren cellen nemen elke 6e hersenen gedeelte (gelijk aan de inhoud van één kolom), voor immunofluorescentie fenotypering nemen elke 12de deel (equivalent aan de inhoud van 2 afwisselende rijen van een kolom). 3. Immunokleuring OPMERKING: Secties worden verwerkt vrij zwevende, meestal in 6-well platen uitgerust met een draagplaat en mesh inserts. Bij wijze van uitzondering, het blokkeren, antilichaam incubatie en ABC reactie worden gedaan in 12- of 24-well platen zonder gaas inzetstukken (0,5 tot 1 ml per well voldoende, afhankelijk van het aantal segmenten die moeten worden gekleurd). Tijdens deze stappen overdragen secties met behulp van een fijne borstel (spoelen met elke nieuwe oplossing). Alle incubaties worden uitgevoerd onder voortdurend roeren (max 150 rpm). <ol><li> Immunohistochemie (ABC-methode) <ol><li> Transfer secties van antivries in TBS en naspoelen (eenmaal O / N bij 4 ° C, 5 keer bij kamertemperatuur gedurende 10 min elk) volledig te verwijderen antivries. </li><li> Incubeer gedurende 30 min in 1,5% H 2 O 2 in TBS-T om endogene peroxidase activiteit te blussen. Besteed aandacht aan het borrelen en opnieuw onderdompelen secties indien nodig. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk. </li><li> Optioneel: Verwarm ondertussen een verwarmingskast en 2N HCl tot 37 ° C. Incubeer secties gedurende 30 minuten bij 37 ° C in 2 N HCl DNA denatureren. Voorzichtig afzonderlijke secties met behulp van een borstel. </li><li> Optioneel: Neutraliseren secties 10 min in 0,1 M boraatbuffer pH8.5, RT. Tijdens het overzetten kort zwabberen de mesh inzetstukken met de secties op een papieren handdoek om HCl leavings verwijderen. Spoel 2 maal in TBS gedurende 15 minuten elk. </li><li> Incubeer in TBSplus het weefsel doorlaatbaar en niet-specifieke antilichaam bindingsplaatsen, 1 uur bij kamertemperatuur geblokkeerd. </li><li> Incubeer in primaire antilichaam verdund in TBSplus, O / N bij 4 ° C. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk. </li><li> Incubeer in gebiotinyleerd secundair antilichaam verdund in TBSplus, 3 uur bij kamertemperatuur. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk. Ondertussen ... </li><li> Bereid ABC complex volgens protocol van de fabrikant (1% A + 1% B in TBS-T). Laat gedurende 30 minuten staan ​​bij kamertemperatuur voor gebruik. Incubeer secties AB reagens gedurende 1 uur bij KT. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk. </li><li> Bereid 50 ml 0,5 mg / ml DAB in TBS-T per 6- of 12-well plaat, opgesplitst in twee helften en pipet 4 ml of 2 ml per well, respectievelijk. Transfer secties in DAB-oplossing (LET OP! DAB is giftig. Volg de specific VIB verstrekt door de leverancier, dat wil zeggen, slijtage laboratoriumjas en handschoenen, gebruik een chemische dampkap). </li><li> Voeg 0,5 ml 1% H 2 O 2 de resterende 25 ml DAB oplossing, mengen en pipet dezelfde hoeveelheden als hierboven beschreven om elk putje te peroxidase reactie te starten. Incubeer gedurende 12 min. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk. </li><li> Mount secties om dia&#39;s in gelatine, lucht drogen O / N. Dekglaasje met permanente montage medium. </li><li> Optioneel: tegenkleuring voor het plaatsen van het dekglaasje (zie paragraaf 3.5). OPMERKING: Als de signaal-ruisverhouding is laag vanwege de hoge achtergrond, herhaal H 2 O 2 behandeling na de incubatie met AB reagens (stap 3.1.8). </li></ol></li><li> Multiple-immunofluorescentie <ol><li> Enkelvoudige of meervoudige gelijktijdige immunofluorescentie <ol><li> Transfer secties van antivries in TBS en naspoelen (eenmaal O / N bij 4 ° C, 5 keer bij kamertemperatuur gedurende 10 min elk) volledig te verwijderen eentifreeze. </li><li> Optioneel: als de stappen 3.1.3 - 3.1.4. </li><li> Incubeer in TBSplus het weefsel doorlaatbaar en blok aspecifieke antilichaam bindingsplaatsen, 1 uur bij KT. </li><li> Incubeer in primaire antilichaam cocktail (bijvoorbeeld rat α-BrdU, cavia α-DCX, geit α-GFP) verdund in TBSplus, O / N bij 4 ° C. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk. </li><li> Incubeer in cocktail van fluorochroom-geconjugeerde secundaire antilichamen (bijvoorbeeld, Rhodamine Red α-rat, Alexa-647 α-cavia, Alexa-488 α-geit; allemaal afgeleid in ezel) verdund in TBSplus, 3 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C. Vanaf nu secties bescherming tegen licht. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk. </li><li> Mount secties om dia&#39;s in gelatine, lucht drogen O / N. Dekglaasje met waterige montage medium. </li></ol></li><li> Sequentiële meerdere immunofluorescentie met primaire antilichamen van dezelfde host soorten <ol><li> Zoals stappen 3.2.1.1 - 3.2.1.3. </li><li> Incubeer in fieerste primair antilichaam (bijvoorbeeld konijn α-antigeen A), O / N bij 4 ° C. Spoel 3 keer in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk. </li><li> Incubeer in eerste fluorochroom-geconjugeerd secundair antilichaam (bijvoorbeeld, Rhodamine Rood-conj. Ezel α-konijn), 3 uur RT. Vanaf nu secties bescherming tegen licht. Spoel 3 keer in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk. </li><li> Incubeer in 10% normaal serum van dezelfde host als de primaire antilichamen (bijvoorbeeld, konijn serum) gedurende 3 uur RT open paratopen verzadigen op de eerste secundaire antilichaam. Spoel 3 keer in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk. </li><li> Incubeer in TBSplus met 50 ug / ml niet geconjugeerde monovalente Fab-fragmenten gericht tegen de gastheer van de primaire antilichamen (bijvoorbeeld, α-konijn IgG (H + L)) naar epitopen die kunnen worden herkend door de tweede secundaire antilichaam, O / N in te dekken 4 ° C. </li><li> Spoel minstens 3 maal in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk. Tijdens het overzetten kort swab de mesh inzetstukken met de secties op een papieren handdoek om elke Fab leavings verwijderen. </li><li> Incubeer in tweede primaire antilichaam (bijvoorbeeld konijn α-antigen B), O / N bij 4 ° C. Spoel 3 keer in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk. </li><li> Incubeer in tweede fluorochroom-geconjugeerd secundair antilichaam (bijv Alexa-488-conj. Ezel α-konijn), 3 uur RT. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk, monteren en dekglaasje hierboven. OPMERKING: Om antigenen met antilichamen labelen van verschillende gastheerspecies voeg ze toe aan stap 3.2.2.2 en de respectievelijke secundaire antilichamen naar stap 3.2.2.3. </li></ol></li><li> Een van de secondaire antilichamen van dezelfde soort als één van de primaire antilichamen LET OP: Dit protocol is geschikt voor quadruple-kleuring tegen BrdU of Ki67 samen met GFAP, nestine-GFP en DCX. <ol><li> Volg strikt protocol stappen 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Tot op dit moment alleen te gebruiken ezel serum in TBSplus. </li><li> Incubeer in TBSplus bevattende 3% geit serum gedurende 1 uur bij KT. Dit omvat geopend paratopen op de α-geit secundair antilichaam. Spoel 3 keer in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk. </li><li> Incubeer in het AMCA-conj. geit α-konijn verdund in TBSplus, 3 uur RT of O / N 4 ° C. Driemaal spoelen in TBS gedurende 15 minuten elk, monteren en dekglaasje hierboven. </li></ol></li><li> CldU, IDG co-kleuring <ol><li> Spoelen, denatureren en neutraliseren secties zoals beschreven in paragraaf 3.2.1 (stappen 3.2.1.1 - 3.2.1.2). </li><li> Incubeer bij 20 ug / ml ongeconjugeerd Fab-fragmenten α-muis IgG (H + L) in TBSplus, 1 uur bij KT. Spoel 4 maal in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk. </li><li> Incubeer in primair antilichaam cocktail bevattende rat α-BrdU (1: 400; gezuiverde IgG2) en muis α-BrdU (1: 350) verdund in TBSplus, O / N bij 4 ° C. Spoel 3 keer in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk. </li><li> Incubeer in het secundair antilichaam cocktail met gebiotinyleerd ezel α-rat (1: 500) en FITC-conj. ezel α-muis Fab-fragmenten (1: 100). Spoel 3 keer in TBS en eenmaal in TBS-T gedurende 10 minuten elk. </li><li> Incubeer in Rhodamine Rood-conj. Streptavidin, 2 uur bij KT. Spoel 3 maal in TBS gedurende 15 minuten elk, monteren en dekglaasje hierboven. </li></ol></li><li> Amplificatie van fluorescentiesignaal in nestin-GFP muizen <ol><li> Voeg geit α-GFP aan het primaire antilichaam cocktail. </li><li> Voeg een fluorochroom geconjugeerd secundair antilichaam met spectrale eigenschappen vergelijkbaar met GFP (zoals Alexa 488 conj. Ezel α-geit) aan het secundaire antilichaam cocktail. </li></ol></li></ol></li><li> Epitoopversterking <ol><li> Voeren epitoopversterking na het spoelen uit antivries. Verwarm stomer met 6- of 12-well platen met 0,1 M citraatbuffer pH 6,0-95 - 99 ° C (ongeveer 25 min). </li><li> Breng de secties in de hete citraatbuffer en stoom gedurende 30 min (bovenkant van de platen met aluminiumfolie als plastic lids zijn niet hittebestendig). </li><li> Onmiddellijk plaats de platen in een ijsbad afgekoeld. Dit helpt om weefsel morfologie, hetgeen vooral van belang bij het werken met hersencoupes van postnatale dieren te beschermen. </li><li> Spoel 3 maal in TBS gedurende 10 min elk spoelen en neutraliseren citraat en verder kleuring. </li></ol></li><li> Muizenantistoffen op de muis weefsel <ol><li> Voeg 20 ug / ml monovalente Fab-fragmenten α-muis IgG (H + L, dezelfde gastheersoort dan secundair antilichaam) aan de eerste blokkerende stap (bijvoorbeeld stap 3.1.5 of 3.2.1.3). </li><li> Spoel 4 keer in TBS en eenmaal in TBS-T voor 10 minuten elk, en ga verder met bijbehorende protocol. </li></ol></li><li> Cresylviolet tegenkleuring <ol><li> Verwarm cresylviolet oplossing tot 60 ° C (in glazen pot). Incubeer dia&#39;s in de hete oplossing gedurende 3 min. </li><li> Spoel in aq. dest. en dehydrateren 2 maal gedurende 1 min elk in 70%, 96% en 100% isopropanol. </li&gt; <li> Clear voor 5-6 min in xyleen of een xyleen vervanger en dekglaasje met een compatibele permanente montage medium. </li></ol></li></ol> 4. Data Analyse <ol><li> Telling peroxidase gekleurde pasgeboren cellen in elke 6e doorsnede langs de gehele rostrocaudal omvang van de dentate gyrus. Gebruik een lichtmicroscoop bij 400X vergroting. </li><li> Vermenigvuldig het resulterende celaantallen de kruising interval van een schatting van de totale aantallen pasgeboren cellen te verkrijgen. </li><li> Afbeelding de fluorescentie gemerkte secties met een confocale laser microscoop uitgerust met geschikte lasers en filtersystemen. Neem image stacks op willekeurige posities langs de gehele omvang van de dentate gyrus bij 400X vergroting en analyseren ten minste 50 willekeurig gekozen cellen van belang per halfrond voor co-labeling met andere markers. </li><li> Vermenigvuldig de verkregen percentages van gelijktijdig gelabelde cellen (% / 100) van het totale aantal pasgeboren cellen te berekenen absoluteaantal specifieke pasgeboren celpopulaties. </li></ol>

<ol><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).</li>
<li>Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+integration+and+plasticity+of+new+neurons+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus.</a> J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).</li>
<li>Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+period+for+enhanced+synaptic+plasticity+in+newly+generated+neurons+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain.</a> Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).</li>
<li>Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+is+adult+hippocampal+neurogenesis+necessary+for+learning%3F+evidence+from+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research.</a> Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).</li>
<li>Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+neurons+and+new+memories%3A+how+does+adult+hippocampal+neurogenesis+affect+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).</li>
<li>Encinas, J. M., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+quantitating+neural+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain.</a> Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).</li>
<li>Burns, K. A., Kuan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+doses+of+bromo-+and+iododeoxyuridine+produce+near-saturation+labeling+of+adult+proliferative+populations+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus.</a> Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).</li>
<li>Cameron, H. A., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+produces+a+large+pool+of+new+granule+cells+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus.</a> J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).</li>
<li>Vega, C. J., Peterson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+proliferative+history+in+tissue+revealed+by+temporal+halogenated+thymidine+analog+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination.</a> Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).</li>
<li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ki-67+protein%3A+from+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).</li>
<li>Brown, D. C., Gatter, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki67+protein%3A+the+immaculate+deception%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Ki67 protein: the immaculate deception.</a> Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).</li>
<li>Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+neurogenesis+in+the+central+nervous+system+using+nestin+promoter-GFP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice.</a> Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).</li>
<li>Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+hippocampal+neurons+in+adult+mice+living+in+an+enriched+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment.</a> Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).</li>
<li>Sicinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin+D2+is+an+FSH-responsive+gene+involved+in+gonadal+cell+proliferation+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis.</a> Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).</li>
<li>Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+kinetics+of+dentate+gyrus+neurogenesis+in+the+absence+of+cyclin+D2%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2.</a> BMC Neurosci. 13, 46(2012).</li>
<li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU+immunohistochemistry+for+studying+adult+neurogenesis%3A+paradigms%2C+pitfalls%2C+limitations%2C+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation.</a> Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).</li>
<li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li>
<li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+for+immunocytochemistry%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).</li>
<li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+%28CldU+and+IdU%29+in+primary+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).</li>
<li>Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+and+epitope+retrieval+in+diagnostic+immunohistochemistry%3A+a+concise+review+with+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Immunohistochem.+Mol+Morphol%22%5BJournal%5D)">Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations.</a> Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Kwantificering en identificatie van subpopulaties van pasgeboren cellen is een centraal thema in het volwassen neurogenese onderzoek. De combinatie van proliferatie markers en antilichamen tegen eiwitten die tijdens bepaalde stadia van volwassen neurogenese maakt immunohistochemische detectie van deze subpopulaties. Sommige antilichamen of antilichaam combinaties vereisen specifieke kleuring omstandigheden. Labeling van delende cellen met synthetische thymidine analogen nog steeds de gouden ...

Twee hersengebieden constitutief het genereren van nieuwe neuronen gedurende het hele leven, de subventriculaire zone van de laterale ventrikels en de subgranulaire zone (SGZ) van de hippocampus dentate gyrus (DG). De pasgeboren neuronen afkomstig van neurale stamcellen en gaan door verschillende stadia van de morfologische en fysiologische ontwikkeling vóór het bereiken van volwassenheid 1,2. Van een langzaam delende radiale glia-achtige stamcel (type 1) opeenvolgende stadia van doorvoer versterken tussenliggende voorlopercellen ontstaan. Hoe meer ongedifferentieerde subtypes (type 2a en het type 2b) hebben een onregelmatige vorm met korte, tangentiële processen. Zij genereren neuroblasts (type 3) de celcyclus verlaten geleidelijk aan onvolwassen neuronen (met dendrieten uitgebreid tot de moleculaire laag) en tenslotte integreren in de hippocampus netwerk rijpe granule cellen. Vanwege hun bijzondere fysiologische eigenschappen van deze cellen de schakelingen met verhoogde plasticiteit 3 suggesting een unieke rol in de hippocampus functie. Eigenlijk, studies van de laatste tien jaar substantieel bewijs dat volwassen neurogenese bijdraagt ​​aan ruimtelijk geheugen, patroon scheiding en emotioneel gedrag 4,5 gegenereerd. Volwassen neurogenese kan worden bestudeerd met behulp van verschillende benaderingen. Thymidine analogen nemen in DNA tijdens de S-fase van de celcyclus en mogelijk geboorte dating, kwantificering en lot analyse van pasgeboren cellen 6-8. Opeenvolgende toepassing van verschillende thymidine analogen (bv CldU, edu of IDU) kan worden gebruikt voor celvernieuwing of celpopulaties geboren op verschillende tijdstippen in de loop van een experiment 9 bestuderen. Een alternatief, endogene marker voor celproliferatie is Ki67. Het wordt uitgedrukt in delende cellen gedurende alle fasen van de celcyclus (G1, S, G2, M), behalve de rustfase (G0) en begin G1 10,11. Om het fenotype van de pasgeboren celpopulaties analyseren de volwassen dentate gyrus verschillende fase-specifieke moleculaire markers kunnen worden gebruikt, zoals GFAP, nestine, DCX en NeuN 1,6. GFAP is een merker rijpe astrocyten maar zich ook in radiale glia-achtige cellen in de volwassen voorhersenen. Nestin een intermediair filament specifiek voor radiale glia-achtige cellen en vroege tussenproduct progenitorcellen. DCX is een microtubule geassocieerde eiwit expressie intermediair progenitors, neuroblasts en onvolwassen neuronen. Op basis van de (co-) expressie van deze drie markers en de morfologische kenmerken van de gelabelde cellen vier verschillende progenitorcel subtypen worden onderscheiden: type 1 (GFAP +, nestine +, DCX -), het type 2a (GFAP -, nestine + , DCX -), het type 2b (GFAP -, nestine +, DCX +) en type 3 (GFAP -, nestine -, DCX +) 1. Co-etikettering van DCX met NeuN, dat wordt uitgedrukt in postmitotische neuronen, maakt de differentiatie van immature (DCX +, NeuN +) en volwassen (DCX -, NeuN +) korrel neuronen. De hierboven vermelde merkers worden vaak gebruikt voor immunofluorescentie co-labeling en daaropvolgende confocale microscopie met het aantal en de identiteit van pasgeboren cellen geanalyseerd. Dit vereist gewoonlijk antilichamen van verschillende gastheersoorten ongewenste antilichaam kruisreactiviteit voorkomen. De meeste primaire antilichamen geschikt voor neurogenese onderzoek worden gebracht hetzij in konijnen of muizen (bijvoorbeeld muizen α-BrdU, muis α-NeuN, konijn α-Ki67, konijn α-GFAP). Dit leidt tot ernstige beperkingen in het aantal en de combinatie van antigenen die in één segment kan worden geëvalueerd. Hierdoor verhoogt niet alleen de kleuring inspanning, als meervoudige kleuringen moeten worden uitgevoerd, maar kan ook gevaar opleveren voor de betrouwbaarheid van de resultaten. Bovendien zijn sommige antigenen zijn gevoelig voor formaline-fixatie geïnduceerde epitoop maskeren (bijvoorbeeld Ki67, Nestine). We beschrijven hierin wijzigingen van de klassieke enkelvoudige als meervoudige immunokleuring protocollen (bijvoorbeeld epitoop, meerdere opeenvolgende immunokleuring, gebruik van nestin-GFP transgene muizen 12) dat veel van deze problemen overwinnen. Met name de sequentiële multipele immunofluorescentie kleuring protocol maakt tegen maximaal vier verschillende antigenen, zelfs indien een deel van de antilichamen afgeleid van dezelfde gastheer. Dit maakt de gelijktijdige detectie van het type 1, type 2a, het type 2b en type 3 progenitorcellen, alsook hun proliferatie activiteit in één sectie.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Thymidine analog administration</td></tr><tr><td>5-Bromo-2&prime;-deoxyuridine, BrdU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9285</td><td>toxic (mutageen, teratogeen)</td></tr><tr><td>5-Chloro-2&prime;-deoxyuridine, CldU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6891</td><td>toxic (mutageen, teratogeen)</td></tr><tr><td>5-Chloro-2&prime;-deoxyuridine, CldU</td><td>MP Biomedicals</td><td>2105478</td><td>toxic (mutageen, teratogeen)</td></tr><tr><td>5-Iodo-2&prime;-deoxyuridine, IdU</td><td>MP Biomedicals</td><td>2100357</td><td>toxic (mutageen, teratogeen)</td></tr><tr><td colspan="4">Weefselvoorbereiding</td></tr><tr><td>Isoflurane-Actavis</td><td>Piramal Healthcare</td><td>700211</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde poeder (PFA)</td><td>Riedel-De H&auml;en</td><td>16005</td><td>toxisch, ontvlambaar</td></tr><tr><td>Perfusie pomp PD5206</td><td>Heidolph Instruments</td><td>523-52060-00</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Tygon lab slang, &Oslash; 0,8 mm</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>06409-13</td><td></td></tr><tr><td>Voedingsnaald, recht, 21 G, 1,75 mm olijfpunt, 40 mm</td><td>Agnthos</td><td>1036</td><td></td></tr><tr><td>Freezing microtome Microm HM 400</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-well Cell cultuur multiwell platen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Immunohistochemie</td></tr><tr><td>Tefal vitacuisine stoomgenerator</td><td>Tefal</td><td>VS 4001</td><td></td></tr><tr><td>Netwell 24 mm polyester gaas membraan inzetstukken</td><td>Corning</td><td>3479</td><td>voorgeladen in 6-well kweekplaten</td></tr><tr><td>Netwell 15 mm polyester gaas membraan inzetstukken</td><td>Corning</td><td>3477</td><td>voorgeladen in 12-well kweekplaten</td></tr><tr><td>Netwell kunststof 6-well carrier kit</td><td>Corning</td><td>3521</td><td>voor 24 mm polyester gaas membraan inzetstukken</td></tr><tr><td>Netwell kunststof 12-well carrier kit</td><td>Corning</td><td>3520</td><td>voor 15 mm polyester gaas membraan inzetstukken</td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>DAB (3,3&prime;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydraat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5637</td><td>carcinogeen, lichtgevoelig</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Primaire antilichamen</td></tr><tr><td>Rabbit IgG1 &alpha;-Ki67</td><td>Novocastra/ Leica Biosystems</td><td>NCL-L-Ki67MM1</td><td>DAB 1:400/IF 1:100; vereist epitoopgevoel</td></tr><tr><td>Rabbit &alpha;-GFAP, AS-3-GF</td><td>Synaptic Systems</td><td>173 002</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Goat IgG (H+L) &alpha;-GFP</td><td>Acris Antibodies</td><td>R1091P</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 &alpha;-nestin</td><td>Abcam</td><td>ab6142</td><td>1:200; vereist epitoopgevoel</td></tr><tr><td>Guinea pig IgG (H+L) &alpha;-Doublecortin</td><td>Merck Millipore</td><td>AB2253</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Rat IgG2a &alpha;-BrdU (ascites)</td><td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td><td>OBT0030CX</td><td>voor detectie van BrdU; DAB 1:500/IF 1:400</td></tr><tr><td>Rat IgG2a &alpha;-BrdU (gezuiverd)</td><td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td><td>OBT0030&nbsp;&nbsp;</td><td>voor detectie van CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 &alpha;-NeuN</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB377</td><td>1:500</td></tr><tr><td>mouse IgG1&#954; &#945;-BrdU</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>Voor detectie van IdU; DAB 1:500/IF 1:350</td></tr><tr><td colspan="4">Secundaire antilichamen</td></tr><tr><td>Donkey &alpha;-guinea pig IgG (H+L)-Biotin</td><td>Dianova</td><td>711-065-152</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Donkey &alpha;-rat IgG (H+L)-Biotin</td><td>Dianova</td><td>712-065-150</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Donkey &alpha;-mouse IgG (H+L)-Biotin</td><td>Dianova</td><td>715-065-151</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Goat &alpha;-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11006</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Donkey &alpha;-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11055</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Donkey &alpha;-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment</td><td>Dianova</td><td>715-097-003</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Donkey &alpha;-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td><td>Dianova</td><td>715-605-151</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Donkey &alpha;-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td><td>Dianova</td><td>706-605-148</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Donkey &alpha;-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td><td>Dianova</td><td>712-295-150</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Donkey &alpha;-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td><td>Dianova</td><td>711-295-152</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Donkey &alpha;-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td><td>Dianova</td><td>706-296-148</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Streptavidin-rhodamine Red-X</td><td>Dianova</td><td>016-290-084</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Goat &alpha;-rabbit IgG (H+L)-AMCA</td><td>Dianova</td><td>111-155-144</td><td>1:250, werkt alleen met rabbit &alpha;-GFAP</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Molecular Probes</td><td>H3570</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td>1:1000</td></tr><tr><td colspan="4">Blocking<

immunohistochemie en multiple labeling met antilichamen van dezelfde host te onderzoeken soorten volwassen hippocampus neurogenese

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Volwassen neurogenese is een sterk gereguleerd, meertraps proces waarbij nieuwe neuronen worden gegenereerd uit een geactiveerde neurale stamcel via steeds gecommitteerde tussenliggende progenitor subtypes. Elk van deze subtypen drukt een reeks specifieke moleculaire merkers die, samen met specifieke morfologische criteria, kunnen worden gebruikt voor hun identificatie. Typisch worden immunofluorescentie technieken toegepast waarbij subtype-specifieke antilichamen in combinatie met exo- of endogene proliferatiemerkers. We beschrijven hierin immunokleuring werkwijzen voor de detectie en kwantificering van alle stadia van volwassen hippocampale neurogenese. Deze bestaan ​​uit de toepassing van thymidine-analogen, transcardial perfusie, weefsel verwerking, warmte-geïnduceerde epitoopversterking, ABC immunohistochemie, meerdere indirecte immunofluorescentie, confocale microscopie en cel kwantificering. Verder presenteren we een sequentiële multipele immunofluorescentie protocol welke problemen u omzeiltsually voortvloeien uit de noodzaak van het gebruik van primaire antilichamen opgewekt in dezelfde soort gastheer. Het maakt het mogelijk een nauwkeurige identificatie van alle hippocampus voorlopercellen subtypen samen met een wildgroei marker binnen één sectie. Deze technieken zijn een krachtig instrument om de regelgeving van de diverse voorlopercellen subtypes in parallel, hun betrokkenheid bij de hersenen pathologieën en hun rol in specifieke hersenfuncties te bestuderen.

We pasten de hierboven beschreven kwantificeren en karakteriseren pasgeboren cellen in de postnatale en volwassen hippocampus methoden. Daarom gebruikten we wildtype en neurogenese-deficiënte cycline D2 knock-out (Ccnd2 KO) muizen gehuisvest onder voorwaarden bekend om de snelheid van neurogenese (dwz, verrijkt milieu, EE) 13,14 beïnvloeden. Immunohistochemische kleuring met DAB of Ki67, BrdU, CldU of IDU consistent gebleken verschillen pasgeboren aantal cellen tussen wildtype en Ccnd2</...

Deze video-artikel illustreert een uitgebreid protocol om alle stadia van neurogenese van de hippocampus bij volwassenen binnen dezelfde weefselsectie te detecteren en te kwantificeren. We hebben een methode ontwikkeld om de beperkingen van indirecte meervoudige immunofluorescentie te overwinnen die zich voordoen wanneer geschikte antilichamen van verschillende gastheersoorten niet beschikbaar zijn.

Immunohistochemie en Multiple Labeling met antilichamen van dezelfde Host te onderzoeken soorten volwassen hippocampus Neurogenese

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Het algemene doel van deze procedure is om de beperkingen van indirecte immunofluorescentie te omzeilen bij het bestuderen van neurale progenitorcellen wanneer geschikte primaire antilichamen van verschillende gastdiersoorten niet beschikbaar zijn. In eerste instantie wordt een thymidine-analoog geïnjecteerd om de delende cellen te labelen, waarna het weefsel wordt geoogst, verwerkt en gesneden in cryosecties.Vervolgens wordt begonnen met sequentiële meerdere immunofluorescentie. Er wordt een niet-gelabeld primair antilichaam aangebracht, dat vervolgens wordt gebonden door een fluorescent gelabeld secundair antilichaam. Daarna worden de open pericopen op het eerste secundaire antilichaam geblokkeerd met serum van de soort van het primaire antilichaam, en worden alle immunoglobulinen die door het tweede secundaire antilichaam herkend zouden kunnen worden, afgedekt met niet-geconjugeerde fab-fragmenten.Hierdoor kan het weefsel worden behandeld met een tweede primaire antilichaam, dat gelabeld kan worden door een ander secundair antilichaam. Uiteindelijk worden beelden van de coupes gebruikt om de ontwikkeling en regulatie van neurale progenitorcellen als reactie op specifieke stimuli en hun betrokkenheid bij bepaalde hersenfuncties te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals simultane multiple immunofluorescentie, is dat het problemen omzeilt die gewoonlijk ontstaan door de noodzaak om primaire antilichamen te gebruiken die in dezelfde gastsoort zijn opgebracht.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van volwassen neurogenese, zoals de proliferatie van hippocampale progenitor-subsets als reactie op fysiologische of farmacologische stimuli, hersenpathologieën of veroudering. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat meervoudige labeling met primaire antilichamen van dezelfde gastdiersoort kan leiden tot ongewenste kruisreactiviteiten van antilichamen zonder adequate blokkering. Weeg eerst de dieren die geïnjecteerd moeten worden en bereid een verse stockoplossing van 10 mg/mL thymidine-analoog voor de injectie.Wanneer de oplossing klaar is, bereid dan een op het gewicht aangepaste dosis voor in een fijne doseerspuit met een naald van 30 gauge. Fixeer de muis vervolgens door de nekvelhuid vast te pakken en injecteer de thymidine-analoog intraperitoneaal op het gewenste tijdstip; anestheseer de muis vervolgens diep en voer een transcardiale perfusie uit. Perfuseer met 10 milliliters ijskoud PBS, gevolgd door 40 milliliters verse ijskoude formaldehydelossing.Disseceer vervolgens de hersenen en het ruggenmerg uit en fixeer deze in hetzelfde fixeerder volgens de fixatieprocedure. Incubeer de verzamelde hersenen gedurende 24 uur in 10% sucrose bij vier graden Celsius. Breng de hersenen de volgende dag over naar 30% sucrose en incubeer deze nog eens 48 uur.Wanneer de hersenen gereed zijn voor cryoprotectie, worden deze ingevroren in isopentaan bij -25 °C. Gebruik vervolgens een cryostaat om coronale coupes van 40 micron te maken voor langetermijnopslag. Breng de coupes over naar een antivriesoplossing en bewaar deze bij -20 °C.Begin met het overbrengen van de coupes van de antivriesoplossing naar TBS met behulp van een fijn penseel. Spoel de coupes grondig, beginnend met een overnight wasbeurt bij vier graden Celsius, gevolgd door vijf wasbeurten van 10 minuten bij kamertemperatuur. Al deze incubaties moeten worden uitgevoerd onder continue zachte agitatie.Als een van de antigenen van belang een thymidine-analogon is, moet op dit punt een denaturatiestap met zoutzuur worden uitgevoerd, gevolgd door een neutralisatiestap in boraatbuffer. Ga verder met de permeabilisatie en het blokkeren van de aspecifieke antilichaambindingsplaatsen in TBS plus. Laat deze incubatie één uur duren bij kamertemperatuur, en incubeer vervolgens de volgende dag gedurende de nacht bij vier graden Celsius in het eerste primaire antilichaam, verdund in TBS plus.Was de coupes drie keer in TBS en één keer in TBST. Laat elke wasbeurt 10 minuten duren. Incubeer vervolgens drie uur bij kamertemperatuur in het eerste met fluorochroom geconjugeerde secundaire antilichaam.Bescherm de coupes vanaf nu tegen blootstelling aan licht. Na een volgende reeks wasbeurten worden de coupes overgebracht naar een 10% serumoplossing van de gastsoort waarvan de twee primaire antilichamen zijn gemaakt. Incubeer de coupes drie uur in deze oplossing om de open bindingsplaatsen voor het eerste secundaire antilichaam te verzadigen.Spoel vervolgens drie keer met TBS en één keer met TBST om het serum te verwijderen. Bereid daarna een TBS-oplossing voor met 50 µg/mL niet-geconjugeerde monovalente Fab-fragmenten gericht tegen de gastsoort van het primaire antilichaam. Dit blokkeert de epitopen die anders door het tweede secundaire antilichaam herkend zouden kunnen worden.Breng de coupes over naar deze oplossing en incubeer ze een nacht bij vier graden Celsius. Spoel de coupes na de incubatie minstens drie keer met TBS en één keer met TBST. Dep tijdens het overbrengen de mesh-inzetten met de coupes op een papieren handdoek om resterende fab-resten te verwijderen.Incubeer de coupes nu gedurende de nacht in het tweede primaire antilichaam bij vier graden Celsius. Voer na een volgende reeks wasstappen het tweede secundaire antilichaam toe gedurende drie uur bij kamertemperatuur. Was de coupes tot slot drie keer in TBS en ga over tot het monteren van de coupes met gelatine.Laat de objectglazen aan de lucht drogen en dek ze af met een ANTIFA montage medium image. Bekijk de fluorescentie-gelabelde coupes met een confocale laserscanmicroscoop. Neem beeldstacks op willekeurige posities over de gehele omvang van de gyrus dentatus bij een 400-voudige vergroting.Analyseer per hemisfeer ten minste 50 willekeurig geselecteerde cellen van belang op co-labeling van de verschillende markers. Om absolute aantallen voor specifieke populaties pasgeboren cellen te berekenen, vermenigvuldigt u de percentages co-gelabelde cellen met het totale aantal pasgeboren cellen, zoals geschat op basis van de DAB-kleuringsanalyse. De beschreven methoden werden gebruikt om pasgeboren cellen te kwantificeren en te karakteriseren in de postnatale en volwassen hippocampus van een neurogenese-deficiënte cyclus.Bij het D two knockout-muismodel onthulde DAB-kleuring tegen verschillende proliferatiemarkers zoals KI 67 of BRDU consequent verschillen in het aantal nieuw gevormde cellen tussen wild-type en knockout-muizen. BRDU-gelabelde nieuw gevormde cellen konden worden gefenotypeerd met een conventioneel multipel immunofluorescentieprotocol waarbij primaire antilichamen tegen B-R-D-U-G-F-A-P nest in GFP en double courtin gelijktijdig werden toegepast. Dit maakte een succesvolle identificatie van nieuw gevormde type one, type twee A, type twee B en type drie progenitorcellen binnen één enkel specimen mogelijk.Als alternatief, bij langere tijdsintervallen tussen de BrdU-injectie en het opofferen van het dier, kunnen de uiteindelijke aantallen pasgeboren neuronen worden geanalyseerd door gelijktijdige BrdU-immunokleuring. Het sequentiële immunolabelingsprotocol werkte perfect wanneer coupes eerst gelijktijdig werden geïncubeerd met konijn anti-Ki67, geit anti-GFP en cavia anti-doublecortine antilichamen, en daarna met konijn anti-GFAP antilichaam, maar niet andersom. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u tot vier verschillende antigenen in een enkele weefselcoupe kunt visualiseren met behulp van primaire antilichamen die in dezelfde gastheer zijn opgewekt.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om passende controles op te nemen om de mogelijkheid van antilichaam-kruisreactiviteit of fout-positieven uit te sluiten. Houd er rekening mee dat de volgorde van de incubaties met primaire antilichamen de uitkomst van het protocol sterk kan beïnvloeden.

immunohistochemistry-multiple-labeling-with-antibodies-from-same-host

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

The video illustrates an immunofluorescence staining method used to examine neurogenesis in the adult hippocampus. Initially, a mouse brain section undergoes treatment with primary antibodies directed at marker proteins associated with neurogenesis in neuronal progenitor cells. Next, it is labeled with secondary antibodies tagged with fluorophores. The brain section is then observed under a confocal microscope to distinguish various subtypes of progenitor cells, based on the expression patterns...

An Immunofluorescence Staining Technique to Detect Adult Hippocampal Neurogenesis

This video demonstrates the procedure for staining newly proliferated neural stem cells in brain tissue sections using EdU incorporation, followed by immunofluorescence to visualize specific proteins, enhancing the understanding of cell dynamics and proliferation.

Immunofluorescence Staining for Visualizing Proliferated Neural Stem Cells in Mouse Brain Sections

De lokalisatie en distributie van eiwitten leveren belangrijke informatie voor het begrijpen van hun cellulaire functies. De superieure ruimtelijke resolutie van elektronenmicroscopie (EM) kan worden gebruikt om de subcellulaire lokalisatie van een bepaald antigeen na immunohistochemie bepalen. Voor weefsels van het centrale zenuwstelsel (CNS), behouden de structurele integriteit behoud antigeniciteit is vooral moeilijk EM studies. Hier nemen we een procedure die is gebruikt om structuren en...

Post-inbedding immunogold Etikettering van Synaptic eiwitten in de hippocampus slice culturen

Tijdens neurogenese van de hippocampus bij volwassenen wordt een specifieke set genetische markers tot expressie gebracht wanneer een inactieve neurale stamcel sequentieel progresseert en zich ontwikkelt tot een functioneel geïntegreerde neuron in de circuit. Met behulp van warmte-geïnduceerde antigeenretrieval worden progenitorceltypen die anders moeilijk te detecteren zijn, met verbeterde effectiviteit geïdentificeerd.

Hitte-geïnduceerde antigeentraughering: een effectieve methode om stamcellentypen te detecteren en identificeren tijdens neurogenese van de hippocampus bij volwassenen

Dit protocol op inleidend niveau beschrijft de reagentia, apparatuur en technieken die nodig zijn om immunohistochemische kleuring van knaagdierhersenen te voltooien, gebruikmakend van markeringen voor microglia en neuronale elementen als voorbeeld.

Primer voor Immunohistochemie op Cryosectioned Rat Brain Tissue: Voorbeeld kleuring voor Microglia en Neuronen

We beschrijven een immunohistochemie protocol om het profiel van de hippocampus neuron activering studeren na blootstelling aan een ruimtelijke leertaak in een muismodel gekenmerkt door cognitieve tekorten van neurologische oorsprong. Dit protocol kan worden toegepast op zowel genetische of farmacologische muismodellen gekenmerkt door cognitieve tekorten.

Immunohistochemische Visualisatie van hippocampus Neuron activiteit na Ruimtelijke Leren in een muismodel van Neurodevelopmental Disorders

Het lokaliseren van genexpressie naar specifieke celtypen kan een uitdaging zijn vanwege het ontbreken van specifieke antilichamen. Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige driedubbele detectie van genexpressie door dubbele fluorescentie RNA in situ hybridisatie te combineren met immunokleuring.

De combinatie van Double Fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie met immunolabel voor detectie van de expressie van drie genen in de hersenen van muizen Secties

Het doel van dit protocol is om een aanpak te beschrijven voor het analyseren van gedrag van volwassen neurale stam/voorlopercellen in reactie op chemogenetische manipulatie van een specifiek lokaal neuraal circuit.

Asgezegde circuit specifieke regulering van volwassen Hippocampal neurale precursor cellen

Dit artikel presenteert vier van de meest voorkomende technieken voor het visualiseren van BrdU-positieve cellen om volwassen neurogenese bij ratten te meten. Dit werk omvat instructies voor reagenspreparaatatie, thymidine-analoge toediening, transcardiale perfusie, weefselvoorbereiding, peroxidase immunohistochemische reactie, immunofluorescentie, signaalversterking, counterstaining, microscopiebeeldvorming en celanalyse.

Immunohistochemische technieken om cellulaire proliferatie en neurogenese bij ratten te analyseren met behulp van de Thymidine Analog BrdU

Hier beschrijft het protocol hoe dubbele labeling immunofluorescentie kan worden uitgevoerd met behulp van primaire antilichamen die in dezelfde soort zijn grootgebracht om gastheer-pathogeeninteracties te bestuderen. Ook kan het het derde antilichaam van een andere gastheer in dit protocol opnemen. Deze aanpak kan worden gemaakt in elk celtype en pathogenen.

Dubbele etikettering van immunofluorescentie met behulp van antilichamen van dezelfde soort om gastheer-pathogeeninteracties te bestuderen

Hier wordt een methode gepresenteerd om enkele kernen geïsoleerd uit de gyrus van de muis te sequencen die de meeste neuronen uitsluit door fluorescentie-geactiveerde kernen (FAN) -sortering. Deze aanpak genereert hoogwaardige expressieprofielen en vergemakkelijkt de studie van de meeste andere celtypen die in de niche zijn vertegenwoordigd, inclusief schaarse populaties zoals neurale stamcellen.

Fluorescentie-geactiveerde kernen negatieve sortering van neuronen gecombineerd met single nuclei RNA-sequencing om de hippocampale neurogene niche te bestuderen

Leer een sequentiële immunofluorescentieprotocol om volwassen hippocampale neurogenese te kwantificeren in muizenhersenen. Deze methode omzeilt beperkingen van antilichamen uit dezelfde gastsoort.

Immunohistochemie en Multiple Labeling met antilichamen van dezelfde Host te onderzoeken soorten volwassen hippocampus Neurogenese (Video) | JoVE Journal

Immunohistochemie en Multiple Labeling met antilichamen van dezelfde Host te onderzoeken soorten volwassen hippocampus Neurogenese

Meer video's verkennen