-Loop gemedieerde Isothermisch Amplification (LAMP) Testen voor de Species-specifieke detectie van

Het algemene doel van deze procedure is om de aanwezigheid van I myea-soort parasieten bij een kip of een kippenkudde te diagnosticeren. Dit wordt bereikt door eerst de reagentia voor de loop-gemedieerde isotherme amplificatie of lamp-reactie voor te bereiden. Vervolgens wordt totaal genoom-DNA bereid uit een of meer darmlocaties na de dood.

Daarna wordt het genomische DNA toegevoegd aan de lamp-mastermix en geïncubeerd. Ten slotte wordt het resultaat van de lamp-test beoordeeld. Uiteindelijk wordt LAMP gebruikt om de aanwezigheid van specifieke I miria-soorten te bepalen om het beheer van het vee te verbeteren en als hulpmiddel voor diagnose van ziekten.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van traditionele methoden zoals morfologische microscopie of PCR is dat het minder subjectief is en geen dure laboratoriumfaciliteiten vereist. Het gebruik van deze aanpak kan de gezondheid en het welzijn van kippen verbeteren door de diagnose van Arian-infectie te verbeteren. Om de template voor de Erea lamp-ase voor te bereiden, kies het gedeelte van de darm dat getest moet worden.

Gebruik deze tabel als gids voor de selectie van monsterlocaties en de eria-soorten die het meest waarschijnlijk aanwezig zijn. Dit is van cruciaal belang omdat elke soort die kippen infecteert, wordt gedefinieerd door het darmgebied dat het aantast met behulp van steriele schaar of een scalpel. Verwijder vijf centimeter of langere delen van de darmsecties die geselecteerd zijn om op eria te testen.

Snijd het monster longitudinaal open. Verwijder het grootste deel van de darminhoud en gebruik de rand van een steriele glazen microscoop. Schuif of steriele schaar om de cellen van de mucosale laag te schrappen.

Doe het geschraapte materiaal in een steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuis met schroefdop die 100 microliters steriele TE met 10% gewicht, maar volumecel X 100 hars bevat en schroef de bovenkant stevig vast. Schud de monsters krachtig gedurende één minuut en incubeer vervolgens in een kokend waterbad gedurende 10 minuten. Laat na het koken elke monster gedurende één tot twee minuten afkoelen bij kamertemperatuur.

Centrifugeer de monsters gedurende één minuut bij 10.000 keer G voordat u twee microliters van het supernatant per lamp-assay verzamelt om als template te gebruiken om I miria lamp-primerstocks voor te bereiden die voldoende zijn voor 100 assays. Herstel elke gelyofiliseerd I miria lamp-primer door moleculaire water toe te voegen tot een concentratie van 100 micromolair, pipet 60 microliters moleculaire water in een afzonderlijke 0,5 milliliter microcentrifugebuis met klepdeksel voor elke iria-soort die moet worden onderzocht. Gebruik het volume dat in deze tabel wordt weergegeven.

Voeg primers, F-I-P-B-I-P-F drie B drie LF en LB specifiek voor de doel-eria-soort toe aan het water. Maak een reeks van zeven soortspecifieke primermixen. Draai de primeroplossingen kort om ze te mengen, pulseer vervolgens microfuge en vries totdat het nodig is.

Gebruik de volumes die in deze tabel zijn vermeld en de richtlijnen in het tekstprotocol om een lamp-reactie mastermix voor elke iria-soort voor te bereiden die moet worden onderzocht om de lamp-assay uit te voeren. Pipet 23 microliters van IEA-soortspecifiek B-S-G-D-N-A polymerase lamp-mastermix in een 0,5 milliliter microcentrifugebuis. Voeg twee microliters eerder bereid DNA-template toe om een ​​laatste reactievolume van 25 microliters als positieve controle te maken. Voeg twee microliters eria-soortspecifiek genoom-DNA toe aan één reactie.

Voeg twee microliters moleculaire water toe aan een reactie als negatieve controle en incubeer in een waterbad of heat block op 62 graden Celsius gedurende 30 minuten. Deactiveer optioneel het B-S-T-D-N-A polymerase door 10 minuten te verwarmen tot 80 graden Celsius. Als de reactie niet onmiddellijk na afloop van de incubatie onder binnenlicht wordt gelezen, beoordeel de kleur van elke reactie met het oog.

Negatieve resultaten zullen roze tot violet van kleur zijn en positieve resultaten zullen hemelblauw zijn, optioneel. Om het lamp-assayresultaat te bevestigen, meng vijf microliters lamp-reactieproduct met één microliter DNA gel-loading buffer en draai op een prestain 2%ARO-gel.

Gebruik een DNA-ladder met een molecuulgrootte van één kilobase om de fragmentgrootte te bepalen en test drie. Vogels verzameld van een Amerikaanse vleeskuikenboerderij als onderdeel van een bewakingsprogramma, leverden drie sets darmmonsters op zoals hier getoond. Gerichte toepassing van de soortspecifieke lamp-assays en het prioriteren van de voorkeursdarmsteden voor elke I miria.

Soort toegestaan ​​visuele identificatie van een iriële infectie bij alle geteste vogels met behulp van hydroxy natal blauw als indicator. De kleur die met een negatieve lamp-reactie wordt bereikt bij gebruik van hydroxy kan variëren van violet tot roze, maar is altijd verschillend van de blauw die wordt bereikt door een positief resultaat. Bevestiging door aose gelelektroforese leverde vergelijkbare resultaten op zoals hier getoond.

Het bereiden van het DNA van één getrokken monster per vogel dat materiaal vertegenwoordigt dat is verzameld van elk van de specifieke darmlocaties en getest met alle zeven lamp-assays, leverde hetzelfde resultaat op als wanneer elke darmlocatie afzonderlijk werd verwerkt. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in 45 minuten worden uitgevoerd als het correct wordt uitgevoerd volgens deze procedure. Andere technieken zoals laesiescorering kunnen ook worden uitgevoerd om de algehele darmgezondheid te beoordelen.