Name: -Loop gemedieerde Isothermisch Amplification (LAMP) Testen voor de Species-specifieke detectie van Eimeria Dat Kippen infecteren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Leer LAMP-diagnostiek voor Eimeria-infecties bij kippen met soortspecifieke detectie. Deze kosteneffectieve methode biedt snelle, visuele resultaten in 45 minuten zonder dure laboratoriumfaciliteiten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk dat in dit onderzoek is uitgevoerd, werd gedeeltelijk ondersteund door het Royal Veterinary College via het fonds voor studentenonderzoeksprojecten, evenals door de Biotechnology and Biological Sciences Research Council en het Department for International Development (subsidienummer BB/H009337/2). Dit manuscript heeft de referentie PPB_00795 gekregen door de RVC.

1. Template Voorbereiding OPMERKING: genomisch DNA matrijs vermoedelijk DNA afkomstig van één van de zeven soorten Eimeria die kippen infecteren bevatten, kunnen worden gebruikt als template voor LAMP gebaseerde identificatie Eimeria species. Intestinaal weefsel monsters voor veld diagnostische analyse moet worden verzameld tijdens routine postmortale zoals hier beschreven. <ol><li> Kies het onderdeel (of onderdelen) van de darm te testen. Zie tabel 1 voor een gids voor sample selectie van locaties en de Eimeria soorten die het meest waarschijnlijk aanwezig 18 en figuur 1 voor de soortspecifieke verspreidingsgebied en de locatie van de bemonstering locaties te zijn. LET OP: Dit is van groot belang, omdat Eimeria zijn met name host site specifiek. Elke soort dat kippen besmet wordt bepaald door het intestinale gebied dat gericht 19. De beslissing kan worden beïnvloed door eerdere ervaringen van de boerderij, interesse in één of more specifieke Eimeria soorten of andere diagnostische indicatoren 6. </li><li> Accijnzen 5 cm of langere lengtes van de intestinale sectie (s) geselecteerd om te testen voor Eimeria met steriele schaar of een scalpel. Eventueel monsters worden voor verdere analyse in een fixeermiddel zoals bijvoorbeeld RNAlater 18 of 95% ethanol. OPMERKING: Bij opslag in ethanol het monster grondig uitwassen steriele tris-ethyleendiaminetetraazijnzuur (TE) buffer voor gebruik. </li><li> Snij het monster geopend lengterichting, verwijder de meeste darminhoud (indien aanwezig) en schraap cellen uit de mucosale laag vrij met behulp van de rand van een steriele glazen microscoop dia of een ethanol / vlam gesteriliseerd schaar. Optioneel voor een samengevoegd monster omvatten cellen uit alle vier de soortspecifieke intestinale plaatsen in een enkele buis. </li><li> Doe de geschraapt materiaal in een steriele 1,5 ml schroef-top microcentrifugebuis met 100 ul steriele TE-buffer inclusief 10% (w / v) Chelex 100 hars. </li><li> Krachtig schudden elk monster gedurende 1 min. Zorg ervoor dat de schroef top is goed gesloten en vervolgens incubeer in een bad met kokend water gedurende 10 minuten. </li><li> Na het koken kan elke monster afkoelen bij omgevingstemperatuur gedurende 1-2 min. </li><li> Centrifuge elk monster met behulp van een microcentrifuge op topsnelheid (bv ~ 10.000 xg) gedurende 1 min. </li><li> Verzamel 2 pl van de resulterende supernatant om template in elke LAMP assay uit te voeren. Eventueel zwembad meerdere intestinale plaats in een enkele buis naar een multi-site assay verschaffen. </li></ol> 2. Eimeria LAMP Primer Voorbereiding (pre-test) <ol><li> Bereid Eimeria LAMP primer voorraden voldoende voor 100 tests: <ol><li> Reconstitueer elke gevriesdroogde Eimeria LAMP primer door het toevoegen van moleculair-biologische kwaliteit water tot een concentratie van 100 uM (zoals opgegeven door de fabrikant). Indien niet opgegeven, berekent het volume van moleculair-biologische kwaliteit water nodig usinG de fysieke en moleculaire gewichten van elke primer. </li><li> Pipetteer 60 ul moleculair-biologische kwaliteit van water in een aparte 0,5 ml flip-top microcentrifugebuis voor elke Eimeria soorten worden getest. </li><li> Voeg primers FIP, BIP, F3, B3, LF en LB specifiek zijn voor de beoogde Eimeria species aan het water met de in tabel 2 volumes, waardoor een reeks van zeven species-specifieke primer mengsels. </li><li> Kort vortex meng de primer oplossing, dan pols microfugebuizen en bevriezen totdat vereist. </li></ol></li><li> Bereid een LAMP reactie mastermix voor elke Eimeria soorten worden getest. Vermenigvuldig in tabel 3 delen door het aantal monsters en drie aan een positieve controle, negatieve controle en pipetteren reserve. Pipet in een 0,5 of 1,5 ml flip-top microcentrifugebuisje. </li></ol> 3. Eimeria LAMP Assay <ol><li> Pipetteer 23 ul Eimeria soortspecifieke Bst DNA polymerase / LAMP Mastermix in een 0.5 ml microcentrifugebuis. </li><li> Voeg 2 pl DNA-template (opgesteld in paragraaf 1), het maken van een definitieve reactie volume van 25 pi. </li><li> Voeg 2 pi Eimeria species-specifiek genomisch DNA een reactie (positieve controle). Voeg 2 pl moleculair-biologische kwaliteit water tot reactie (negatieve controle). OPMERKING: als soortspecifieke genomisch DNA niet beschikbaar is een eerdere positieve LAMP of standaard PCR-product kan worden gebruikt. </li><li> Incubeer in een waterbad of hitteblok bij 62 ° C gedurende 30 min. Eventueel de-activeren Bst DNA polymerase door verwarming tot 80 ° C gedurende 10 min als de reactie niet zal onmiddellijk worden gelezen. </li></ol> 4. LAMP Assay Read-out <ol><li> Aan het einde van de incubatie beoordelen de kleur van elke reactie op het oog onder kunstlicht. Negatieve resultaten lijken roze tot violet van kleur, positieve resultaten lijken hemelsblauw 20. </li><li> Optioneel, bevestigen de LAMP-test resultaat in een Laboratory van 5 ul LAMP reactieproduct mengen met 1 pl DNA gelbeladingsbuffer voor agarose gel elektroforese met een 2% agarosegel in 1 x Tris / boraat / EDTA (TBE) buffer, vooraf gekleurd met een nucleïnezuur kleurstof (5 gl per 50 ml agarose). Voeg 5 ul van een 1 Kb moleculaire grootte DNA-ladder naar baan 1 van de gel te fragment size berekening mogelijk te maken. </li></ol>

<ol><li>Chapman, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+review+of+advances+in+coccidiosis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A selective review of advances in coccidiosis research.</a> Adv Parasitol. 83, 93-171 (2013).</li>
<li>Shirley, M. W., Smith, A. L., Tomley, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+avian+Eimeria+with+an+emphasis+on+their+control+by+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The biology of avian Eimeria with an emphasis on their control by vaccination.</a> Adv Parasitol. 60, 285-330 (2005).</li>
<li>Fornace, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+Eimeria+species+parasites+on+small-scale+commercial+chicken+farms+in+Africa+and+indication+of+economic+profitability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Occurrence of Eimeria species parasites on small-scale commercial chicken farms in Africa and indication of economic profitability.</a> PLoS ONE. 8 (12), e84254(2013).</li>
<li>Schwarz, R. S., Jenkins, M. C., Klopp, S., Miska, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+Eimeria+spp.+populations+in+relation+to+performance+levels+of+broiler+chicken+farms+in+Arkansas+and+North+Carolina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of Eimeria spp. populations in relation to performance levels of broiler chicken farms in Arkansas and North Carolina.</a> J Parasitol. 95 (4), 871-880 (2009).</li>
<li>Peek, H. W., Landman, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coccidiosis+in+poultry%3A+anticoccidial+products%2C+vaccines+and+other+prevention+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Q%22%5BJournal%5D)">Coccidiosis in poultry: anticoccidial products, vaccines and other prevention strategies.</a> Vet Q. 31 (3), 143-161 (2011).</li>
<li>Johnson, J., Reid, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticoccidial+drugs%3A+lesion+scoring+techniques+in+battery+and+floor-pen+experiments+with+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Anticoccidial drugs: lesion scoring techniques in battery and floor-pen experiments with chickens.</a> Exp Parasitol. 28 (1), 30-36 (1970).</li>
<li>Haug, A., Gjevre, A. G., Skjerve, E., Kaldhusdal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+economic+impact+of+subclinical+Eimeria+infections+in+broiler+chickens+in+Norway%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Pathol%22%5BJournal%5D)">A survey of the economic impact of subclinical Eimeria infections in broiler chickens in Norway.</a> Avian Pathol. 37 (3), 333-341 (2008).</li>
<li>Procunier, J., Fernando, M., Barta, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+and+strain+differentiation+of+Eimeria+spp.+of+the+domestic+fowl+using+DNA+polymorphisms+amplified+by+arbitrary+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Research%22%5BJournal%5D)">Species and strain differentiation of Eimeria spp. of the domestic fowl using DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers.</a> Parasitology Research. 79 (2), 98-102 (1993).</li>
<li>Schnitzler, B. E., Thebo, P. L., Mattsson, J. G., Tomley, F. M., Shirley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+diagnostic+PCR+assay+for+the+detection+and+discrimination+of+four+pathogenic+Eimeria+species+of+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Pathol%22%5BJournal%5D)">Development of a diagnostic PCR assay for the detection and discrimination of four pathogenic Eimeria species of the chicken.</a> Avian Pathol. 27 (5), 490-497 (1998).</li>
<li>Vrba, V., Blake, D. P., Poplstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+assays+for+detection+and+quantification+of+all+seven+Eimeria+species+that+infect+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR assays for detection and quantification of all seven Eimeria species that infect the chicken.</a> Vet Parasitol. 174 (3-4), 183-190 (2010).</li>
<li>Morris, G. M., Gasser, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotechnological+advances+in+the+diagnosis+of+avian+coccidiosis+and+the+analysis+of+genetic+variation+in+Eimeria%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Biotechnological advances in the diagnosis of avian coccidiosis and the analysis of genetic variation in Eimeria.</a> Biotechnol Adv. 24 (6), 590-603 (2006).</li>
<li>Perry, B., Randolph, T., McDermott, J., Sones, K., Thornton, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerry%2C+B+%22Investing+in+animal+health+research+to+alleviate+poverty%22">Investing in animal health research to alleviate poverty</a>. , ILRI (International Livestock Research Institute). Nairobi, Kenya. (2002).</li>
<li>Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+reaction+by+loop-mediated+isothermal+amplification+using+loop+primers%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Probes%22%5BJournal%5D)">Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers).</a> Mol Cell Probes. 16 (3), 223-229 (2002).</li>
<li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28 (12), E63(2000).</li>
<li>Kaneko, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+enterotoxigenic+Clostridium+perfringens+in+meat+samples+by+using+molecular+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens in meat samples by using molecular methods.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7526-7532 (2011).</li>
<li>Karanis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+preliminary+evaluation+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+procedure+for+sensitive+detection+of+cryptosporidium+oocysts+in+fecal+and+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and preliminary evaluation of a loop-mediated isothermal amplification procedure for sensitive detection of cryptosporidium oocysts in fecal and water samples.</a> Appl Environ Microbiol. 73 (17), 5660-5662 (2007).</li>
<li>Xue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+Infectious+bursal+disease+virus+by+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Diagn+Invest%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of Infectious bursal disease virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay.</a> J Vet Diagn Invest. 21 (6), 841-843 (2009).</li>
<li>Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+assays+for+the+species-specific+detection+of+Eimeria+that+infect+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens.</a> BMC Vet Res. 7 (1), 67(2011).</li>
<li>Long, P., Joyner, L., Millard, B., Norton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+laboratory+techniques+used+in+the+study+and+diagnosis+of+avian+coccidiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Veterinaria+Latina%22%5BJournal%5D)">A guide to laboratory techniques used in the study and diagnosis of avian coccidiosis.</a> Folia Veterinaria Latina. 6 (3), 201-217 (1976).</li>
<li>Goto, M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+detection+of+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+by+using+hydroxy+naphthol+blue%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue.</a> BioTechniques. 46 (3), 167-172 (2009).</li>
<li>Arakawa, A., Baba, E., Fukata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eimeria+tenella+infection+enhances+Salmonella+typhimurium+infection+in+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Poult+Sci%22%5BJournal%5D)">Eimeria tenella infection enhances Salmonella typhimurium infection in chickens.</a> Poult Sci. 60 (10), 2203-2209 (1981).</li>
<li>Blake, D. P., Smith, A. L., Shirley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+fragment+length+polymorphism+analyses+of+Eimeria+spp.%3A+an+improved+process+for+genetic+studies+of+recombinant+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Amplified fragment length polymorphism analyses of Eimeria spp.: an improved process for genetic studies of recombinant parasites.</a> Parasitol Res. 90 (6), 473-475 (2003).</li>
<li>Lund, M., Nordentoft, S., Pedersen, K., Madsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Campylobacter+spp.+in+chicken+fecal+samples+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of Campylobacter spp. in chicken fecal samples by real-time PCR.</a> J Clin Microbiol. 42 (11), 5125-5132 (2004).</li>
<li>Raj, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR-based+quantification+of+Eimeria+genomes%3A+a+method+to+outweigh+underestimation+of+genome+numbers+due+to+PCR+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Pathol%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR-based quantification of Eimeria genomes: a method to outweigh underestimation of genome numbers due to PCR inhibition.</a> Avian Pathol. 42 (4), 304-308 (2013).</li>
<li>Blake, D. P., Hesketh, P., Archer, A., Shirley, M. W., Smith, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eimeria+maxima%3A+the+influence+of+host+genotype+on+parasite+reproduction+as+revealed+by+quantitative+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Eimeria maxima: the influence of host genotype on parasite reproduction as revealed by quantitative real-time PCR.</a> Int J Parasitol. 36 (1), 97-105 (2006).</li>
<li>Beck, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+approaches+to+diversity+of+populations+of+apicomplexan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Molecular approaches to diversity of populations of apicomplexan parasites.</a> Int J Parasitol. 39 (2), 175-189 (2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De in dit artikel beschreven soortspecifieke LAMP-tests voor Eimeria bieden een nieuw diagnostisch gereedschap om de bestrijding van coccidiën en de ziekte coccidiose effectief te ondersteunen. De gevolgen van een eimerian-infectie kunnen ernstige economische verliezen zijn, evenals een ernstig verslechterde welzijn van vogels en een verhoogde gevoeligheid voor kolonisatie door zoönotische pathogenen21. Mogelijkheden om kuddes te controleren op het voorkomen van sommige of alle Eimeria-soorten kunnen een vroege waarschuwing geven voor een verslechtering van de effectiviteit van de anticoccidiale bestrijding. Belangrijke voordelen van LAMP zijn de robuuste doelspecificiteit, die voortkomt uit de vereiste voor zes verschillende DNA-sequentiedoelen, evenals een hoge gevoeligheid, versterkt door de opname van loop-primers13, hoewel de kwalitatieve, niet kwantitatieve aard van LAMP als een beperking kan worden beschouwd. Het is momenteel niet mogelijk om een lage parasietenontsnapping uit routinematige chemoprofylaxe of replicatie van levend vaccin te onderscheiden van ongecontroleerde eimerian-replicatie. Desondanks biedt de technische eenvoud van het protocol en de definitieve uitlezing een aanzienlijke verbetering ten opzichte van de bestaande gespecialiseerde en vaak subjectieve pathologie- en morfologie-gestuurde benaderingen6,7. Elke test kan worden uitgevoerd tegen een kosten van ongeveer £0,75 per monster, onafhankelijk van arbeids- en uitrustingskosten. Daarom zijn LAMP-tests ook kosteneffectiever dan andere moleculaire diagnostiek zoals PCR, omdat ze een isotherme incubatie vereisen zonder dat er speciaal apparatuur nodig is. 
Jarenlang heeft de toegang tot Eimeria genoom-DNA als template de ontwikkeling en toepassing van moleculaire velddiagnostiek beperkt. De oöcyst is de meest gemakkelijk toegankelijke fase van de eimerian-levenscyclus, maar routinematige DNA-extractie vereist laboratoriumvoorzieningen22. Andere, meer instabiele darmlevenscyclusstadia vereisen zuivering voorafgaand aan DNA-voorbereiding om PCR-remming en een gevolglijk verlies van gevoeligheid te voorkomen23,24. De mogelijkheid om eimerian-DNA van een kwaliteit te extraheren die geschikt is voor LAMP met behulp van apparatuur die niet gespecialiseerder is dan een microcentrifuge en een waterbad, aangevuld met remmeradsorptie met behulp van chelex-hars, bevordert nu het bredere gebruik van moleculaire biologie in eimerian-diagnostiek. Intrigerend is de melding van kwantitatief PCR-meetbaar Eimeria DNA in darmweefsel 20 dagen na het begin van de parasietinfectie, 11 dagen na de laatste detecteerbare oöcystuitvoer, wat de suggestie geeft dat LAMP kan worden gebruikt om opgelost parasietblootstelling evenals aanhoudende infectie te detecteren, zelfs nadat eventuele zichtbare laesies zijn verdwenen25. 
De relatief lage kosten en lage technische vereisten van LAMP Eimeria-diagnostiek kunnen hun toepassing bevorderen in de ontwikkelingswereld waar andere, meer gevestigde benaderingen mogelijk niet beschikbaar of geschikt zijn. Om dit toepasbaar te maken, moet elke test in staat zijn om alle stammen te detecteren die binnen elke regio kunnen circuleren. Hoewel de kennis van de genetische diversiteit die heerst onder Eimeria-soorten beperkt is26, biedt het gebruik van doelsequenties die eerder zijn gevalideerd voor gebruik in kwantitatieve PCR met stammen uit Afrika, Azië, Europa en Zuid-Amerika enig bewijs van conservering, wat de bruikbaarheid van deze LAMP-tests wereldwijd ondersteunt10.

Global kip productie is tien keer in de afgelopen 50 jaar toegenomen met de derde wereld hosting bijna vier keer de uitbreiding getuige in de ontwikkelde wereld <a href="http://www.faostat.org">(www.faostat.org)</a> . Als de relevantie van de productie van kippen tot de mondiale voedselzekerheid is inmiddels zo heeft ook het profiel van pathogenen die ernstige ziekte bij kippen kan veroorzaken. Een goed voorbeeld zijn de Eimeria soorten, alomtegenwoordige protozoaire parasieten die de darmziekte coccidiose 1 kan veroorzaken. Waar kippen worden gehouden één of meer Eimeria soorten zijn waarschijnlijk gemeenschappelijke 2-4 te zijn. In de ontwikkelde wereld Eimeria worden voornamelijk gecontroleerd door chemoprofylaxe, in dienst shuttle of rotatie programma&#39;s om de impact van de weerstand 5 minimaliseren. Levende vaccins worden ook gebruikt in systemen waar vogelwaarden voldoende is om de kosten te rechtvaardigen (bijv fokdieren, lagen en sommige vleeskuikens 5). Als een result van deze maatregelen klinische coccidiose is vaak goed onder controle, hoewel subklinische infectie is gebruikelijk 5. In de derde wereld vaccinatie is zeldzaam en drug aanvraag vaak minder goed op de hoogte. Bijgevolg subklinisch en klinische coccidiose is gebruikelijker en oefent een grote economische gevolgen 3. Diagnose van eimerian infectie is van oudsher vertrouwd op laesie scoren post-mortem, hoewel zelfs de auteurs van de meest gebruikte scoresysteem merkte op dat voor sommige soorten &quot;het lijkt twijfelachtig of een dergelijke procedure moet worden geprobeerd in ieder maar matig ernstige infecties&quot; 6. Aanvullend bewijs kan worden verzameld door middel van microscopische detectie van de milieuvriendelijke resistente fase oocyst levenscyclus in faecale en strooisel monsters, hoewel overlappende morfologie kunnen alle beschamen, maar de expert 6,7. Moleculaire alternatieven met polymerase kettingreactie (PCR), willekeurig amplification van polymorfe DNA-PCR (RAPD-PCR) en kwantitatieve PCR-technologieën zijn beschikbaar voor maximaal 20 jaar 8-10 geweest, maar tot op heden hebben ze niet populair geworden. Relatieve kosten en de eis voor specialistische laboratorium apparatuur of verwerking hebben hun opname beperkt, ondanks de vaak subjectief en technisch veeleisende karakter van de oudere pathology- en-microscopie gebaseerde benaderingen 10,11. Dergelijke beperkingen kunnen in veel van de armere regio&#39;s van de wereld, zoals Zuid-Oost-Azië, waar de invloed van coccidiose op de armoede verhoudingsgewijs groter 12 kan worden overdreven. In reactie is er een duidelijke behoefte aan nieuwe eenvoudige en gevoelige, maar kosteneffectieve, Eimeria species-specifieke diagnostische assays. Loop-gemedieerde isothermische amplificatie (LAMP) is een eenvoudige DNA-polymerase aangedreven techniek die kan amplificeren grote hoeveelheden DNA te bereiden. Belangrijker nog, LAMP maakt gebruik van een Bst DNA polymerase plaats van het Taq DNA polymerase vaak gebruikt bij PCR, waarbij DNA amplificatie vergemakkelijkt op één constante temperatuur zonder de noodzaak voor de temperatuurcycli 13,14. LAMP kunnen vatbaar zijn voor toepassing in zelfs de meest rudimentaire laboratorium of in het veld. Gekenmerkt door relatieve bestendigheid tegen vele PCR remmers, hoge gevoeligheid en specificiteit, zijn LAMP assays ontwikkeld voor een breed scala van pathogenen waaronder infectieuze bursitis virus, Clostridium perfringens en Cryptosporidium 15-17. In antwoord op de vraag naar nieuwe rendabele Eimeria soortspecifiek diagnose een panel van LAMP assays specifiek zijn voor elk van de zeven soorten Eimeria die kippen infecteren ontwikkeld 18. Aanvragen voor de nieuwe assays omvatten bewaking parasiet optreden, met name van belang gezien de vereniging van soorten zoals Eimeria maxima of Eimeria necatrix met slechte economische performance 3,4. Andere toepassingen zijn onder meer de beoordeling van de werkzaamheid van coccidiose strategie, diagnose van subklinische infectie of klinische ziekte en evaluatie van de risico&#39;s van Eimeria naar een boerderij van een boerderij.

<table><tbody><tr><td>RNAlater</td><td>Ambion</td><td>AM7024</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.321</td><td>Let op, zeer ontvlambaar</td></tr><tr><td>100 x Tris-EDTA (TE) buffer concentraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100 hars</td><td>Bio-Rad</td><td>142-1253</td><td></td></tr><tr><td>Moleculair kwaliteitswater</td><td>Invitrogen</td><td>10977035</td><td></td></tr><tr><td>E. acervulina F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CCTAACATTTCGCTTCACGGAC</td></tr><tr><td>E. acervulina B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*ATGAGCAAGTGGAACACCTTG</td></tr><tr><td>E. acervulina FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*AGAGCACAGTGGCAGTGC-AGCAGACAGCATGGCTTACCT</td></tr><tr><td>E. acervulina BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GAAGACCCTCTGAAGAACGGA-CCTTCTCACCGCTTACCGG</td></tr><tr><td>E. acervulina LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TAAGGTTACACCCGTGGAGG</td></tr><tr><td>E. acervulina LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCCATGCACAAAGCGACTT</td></tr><tr><td>E. brunetti F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GGCCATCAAGTTCCATGAGC</td></tr><tr><td>E. brunetti B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TCAACCTCCTGAGTGTGGTT</td></tr><tr><td>E. brunetti FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GAAAATGCCTTCGTAGCTGCT-GCTGGGTACGGAGCGTCTT</td></tr><tr><td>E. brunetti BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TACTTCCTAGGATCCATCCTCGC-AGTTTCGCTGCCGCCTC</td></tr><tr><td>E. brunetti LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GAAACGCTCGAACATGGC</td></tr><tr><td>E. brunetti LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CTTCTCCACAGACCCAGAGGT</td></tr><tr><td>E. maxima F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*ACTACGGAAAAGTGCGTAGCT</td></tr><tr><td>E. maxima B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CCTTCCTCCCTTCTGAAAACTG</td></tr><tr><td>E. maxima FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GAGTCACTGCTGATGTACCAAA AG-GAACTATGCCGCTTTCCCCTG</td></tr><tr><td>E. maxima BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*AGAATGCGGATTTGTTAGCAGC-AGCAAGTCCAAGGTGTGTGTA</td></tr><tr><td>E. maxima LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CAAGCCTACGCGGACATC</td></tr><tr><td>E. maxima LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TTATGCAGCTGGGTCAACG</td></tr><tr><td>E. mitis F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*ACGATAGCCAAGACACGTAAGG</td></tr><tr><td>E. mitis B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CCCCGTGATAAGAGTAGGAACA</td></tr><tr><td>E. mitis FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGCGGGTCGTGAGATTTAAATT AT-GGAAGATCAGGACGGGCACT</td></tr><tr><td>E. mitis BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GTTTCAGTTGATGAACAAGCGA GA-TGCGCCTCTAGAATCAAGACG</td></tr><tr><td>E. mitis LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TCCATGCATCCCCTTGTT</td></tr><tr><td>E. mitis LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGTGGGCACAGATTGATTC</td></tr><tr><td>E. necatrix F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*TGGCTTTCCCGCGTACC</td></tr><tr><td>E. necatrix B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGGCCCAACACAAAGACTG</td></tr><tr><td>E. necatrix FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGCTTGAGTTTTAAGCTATGCA CA-GACCCAAGCAGCTCACCAA</td></tr><tr><td>E. necatrix BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGCCATGCCATTCAATGAACG-*GAGGCATACCGGCGTTGTC</td></tr><tr><td>E. necatrix LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GTCTGTAACTTGGGACGTTGT</td></tr><tr><td>E. necatrix LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GAACAGCCGGAGCCTCTC</td></tr><tr><td>E. praecox F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCCCTTGTATGTTGCTGTTTCT</td></tr><tr><td>E. praecox B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCGCACGAATCTGAATCACAC</td></tr><tr><td>E. praecox FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*ATCTCCTCAAAGACTTTCGCGT A-GCGCTTGGCTATATCCATAGG</td></tr><tr><td>E. praecox BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCTCTCGTGGCATACTTGC-GCCAGGAGCCACTGATTGT</td></tr><tr><td>E. praecox LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GAATAGCATTGCCAGGTGG</td></tr><tr><td>E. praecox LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GTCCACTGTCATTAATATTGC TGC</td></tr><tr><td>E. tenella F3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCTTGTGAAGGTCAGCGTG</td></tr><tr><td>E. tenella B3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCTGAGTCCATACGTACTTCCT</td></tr><tr><td>E. tenella FIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GCCACTGCTATGGAAAGTCAC AC-CATAACTGGCATGCAGGGGT</td></tr><tr><td>E. tenella BIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*GTTTGGCCCGAAAGTTGTGAA GA-CGTCAGAAATTGCTGCCCAAT</td></tr><tr><td>E. tenella LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CGCATGTGCAGTTGAAGACA</td></tr><tr><td>E. tenella LF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>VC00021</td><td>*CCAAATGTATCTGCTAGTTATA TTAACAAG</td></tr><tr><td>10 x ThermoPol reactiebuffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B9004S</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1330</td><td></td></tr><tr><td>Betaïne-oplossing (5 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300</td><td></td></tr><tr><td>Bst-polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0275S</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxynaftaalblauw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33936</td><td>Opgelost in moleculair kwaliteitswater.</td></tr><tr><td>UltraPure agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>10 x Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer</td><td>Invitrogen</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>Blue/Orange DNA-loading dye (x6)</td><td>Promega</td><td>G1881</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1Kb DNA ladder</td><td>

-loop gemedieerde isothermisch amplification (lamp) testen voor de species-specifieke detectie van<em&gt; eimeria</em&gt; dat kippen infecteren

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria-soorten parasieten, protozoa die de darmziekte coccidiose veroorzaken, vormen een ernstige bedreiging voor de productie en het welzijn van kippen. Bij afwezigheid van effectieve controle kan klinische coccidiose verwoestend zijn. Weerstand tegen de chemoprophylactica die vaak worden gebruikt om Eimeria te bestrijden, is gebruikelijk en subklinische infectie is wijdverbreid, wat de voerconversieratio's en gevoeligheid voor andere ziekteverwekkers zoals Clostridium perfringens beïnvloedt. Ondanks de beschikbaarheid van polymerasekettingreactie (PCR)-gebaseerde hulpmiddelen, is de diagnose van Eimeria-infectie nog steeds bijna volledig afhankelijk van traditionele benaderingen zoals letselscoring en oöcystmorfologie, maar geen van beide is eenvoudig. Beperkingen van de bestaande moleculaire hulpmiddelen omvatten de behoefte aan speciaal apparatuur en moeilijkheden bij het verkrijgen van DNA als template. Als reactie hierop zijn een eenvoudig DNA-voorbereidingsprotocol voor het veld en een reeks soortspecifieke loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-assays ontwikkeld voor de zeven Eimeria die erkend zijn om de kip te infecteren. We bieden nu een gedetailleerd protocol dat de voorbereiding van genomisch DNA van darmweefsel beschrijft dat post-mortem wordt verzameld, gevolgd door de opstelling en uitlezing van de LAMP-assays. Soortspecifiek LAMP voor Eimeria kan worden gebruikt om de voorkomens van parasieten te monitoren, de effectiviteit van de anticoccidiale strategie van een boerderij te beoordelen en om subklinische infectie of klinische ziekte te diagnosticeren, met bijzondere waarde wanneer deskundige surveillance niet beschikbaar is.

Assay validatie Tijdens validatie elk Eimeria soortspecifiek LAMP assay getest met een panel van zuiver DNA monsters die alle zeven soorten Eimeria dat de kip, en kip genomisch DNA als gastheer controle infecteren. Agarose gel-elektroforese werd gebruikt om elke assay lossen en aangetoond absolute soortspecificiteit zonder gastheer kruisreactiviteit 18. Vervolgens werd een tienvoudige seriële verdunningsreeks bereid met gezuiverde Eimeria tenella genomisch DNA onthulde een grens assay gevoeligheid van één tot tien genoomkopieën 18. Geen bovengrens werd bepaald met bereikt tot positieve resultaten en met de hoogste concentratie (100.000 exemplaren van het genoom) 18. Toepassing met veld monsters Monsters verzameld voor Eimeria testen zullen waarschijnlijk worden afgeleid van kippen dood gevonden, geruimd als gevolg van poor de gezondheid of geruimd voor sentinel gezondheidstoezicht, wat wijst op een waarschijnlijke steekproefgrootte van tussen de een en drie als onderdeel van een routine. Het testen van drie vogels verzameld van een Amerikaanse vleeskuikenbedrijf als onderdeel van een surveillance programma leverde drie sets van darmmonsters. Gerichte toepassing van de soortspecifieke LAMP assays, prioriteit de voorkeur intestinale gebieden voor elk Eimeria soorten (Tabel 1), toegestaan ​​visuele identificatie van eimerian infectie bij alle dieren getest met behulp Hydroxynaftolblauw blauw als indicator (Figuur 2A). De kleur bereikt met een negatieve LAMP reactie bij gebruik Hydroxynaftolblauw blauwe kan variëren van violet naar roze, maar altijd verschillend van de blauwe bereikt met een positief resultaat. Bevestiging met agarosegelelektroforese ontvangen vergelijkbare resultaten (Figuur 2B). Tijdens veld applicatie kan de gebruiker ervoor kiezen om het volledige scherm te passen tegen alle zeven soorten, of doel alleen die soorten geprioriteerd alsbelangrijk of bekend te circuleren op de boerderij of omgeving. Het falen van PCR gebaseerde benaderingen vestigen als diagnostica voor het optreden van Eimeria benadrukt de behoefte aan eenvoud nieuwe test. Terwijl LAMP biedt eenvoudigere voorbereiding en verwerking dan PCR, de eis om meerdere intestinale plaatsen per vogel testen blijft ontmoedigend. Productie van een samengevoegd DNA monster per vogel, die vervolgens kunnen worden getest met één of meer LAMP assays, waarschijnlijk aantrekkelijker zijn. Hetzelfde resultaat als wanneer elk intestinale locatie afzonderlijk verwerkt (Figuur 2 verwerkt een samengevoegd monster per vogel, die materiaal Van elk van de specifieke intestinale plaatsen in tabel 1 beschreven en samengevoegd voor DNA preparaat, testen alle zeven LAMP assays ontvangen vergeleken met figuur 3). <img alt="Figuur 1" src=&quot;/files/ftp_upload/52552/52552fig1.jpg&quot; /&gt; Figuur 1. Intestinale monsternemingspunten voor LAMP detectie van Eimeria soorten parasieten die kippen infecteren. De darm regio gericht door elk soort Eimeria wordt benadrukt door de gekleurde lijnen met de voorkeursplaatsen van bemonstering aangegeven door het cijfer tussen de gestippelde zwarte lijnen (E. acervulina: geel / 1, E. Brunetti: roze / 2, E. maxima: blauw / 3, E. mitis: oranje / 4, E. necatrix: rood / 5, E. praecox: groen / 6 en E. tenella: grijs / 7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/52552/52552fig2.jpg" /> Figuur 2. LAMP diagnose van eimerian infectie from drie commerciële slachtkippen. LAMP reacties opgelost met behulp van (A) Hydroxynaftolblauw blauw, waar een hemelsblauwe reactie was positief en een paars tot roze reactie was negatief, en (B) agarosegelelektroforese. De intestinale bemonsterde waren zoals weergegeven in Tabel 1 voor elke soort parasiet. A = E. acervulina, B = E. Brunetti, Ma = E. maxima, Mi = E. mitis, N = E. necatrix, P = E. praecox en T = E. tenella. Baan 1 bevatte de GeneRuler 1kb DNA-ladder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/52552/52552fig3.jpg" /> Figuur 3. LAMP diagnose van eimerian infectie met behulp van gepoolde monsters uit drie afzonderlijke commerciële slachtkippen. LAMP reacties opgelost met Hydroxynaftolblauw blauw, waar een hemelsblauwe reactie was positief en paars tot roze reactie was negatief. A = E. acervulina, B = E. Brunetti, Ma = E. maxima, Mi = E. mitis, N = E. necatrix, P = E. praecox en T = E. tenella. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52552/52552fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Monster website </td><td> Eimeria species assay (waarschijnlijk) </td></tr><tr><td> Twaalfvingerige darm (D) </td><td> E. acervulina, E. praecox </td></tr><tr><td> Jejunum / ileum * (J / I) </td><td> E. maxima, E. necatrix </td></tr><tr><td> Caeca (C) </td><td> E. necatrix, E. tenella </td></tr><tr><td> Ileum (TI) </td><td> E. brunetti, E. mitis </td></tr&gt; <tr><td> Samengevoegd monster (P) </td><td> E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox, E. tenella </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Intestinale regiospecifieke selectie van kandidaat Eimeria soorten assays. De keuze van de regio bemonsteren varieert per Eimeria species zoals geïllustreerd in figuur 1. Gepoolde monsters omvatten materiaal vanuit alle vier specifieke plaatsen die vervolgens werden samengevoegd voor DNA-bereiding. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Primer * </td><td> De concentratie (uM) </td><td> Volume (pl) </td></tr><tr><td> Water </td><td> - </td><td> 60 </td></tr><tr><td> Forward Inner Primer (FIP) </td><td> 100 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Achteruit Inner Primer (BIP) </td><td> 100 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Forward Outer Primer (F3) </td><td> 100 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Achteruit Outer Primer (B3) </td><td> 100 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Loop vooruit (LF) </td><td> 100 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Loop achteruit (LB) </td><td> 100 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Totaal </td><td></td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Bereiding van een LAMP primer voormengsel. De componenten en verhoudingen nodig een primer voormengsel bereiden LAMP. Volumes getoond zijn voor 100 LAMP reacties. * Primer identiteiten zoals in de materialen en Barkway et al (2011) 18. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Stock conc n </td><td> Laatste reactie conc n </td><td> Volume per reactie (pl) </td></tr><tr><td> DDW </td><td> - </td><td> - </td><td> 10.1 </td></tr><tr><td> Thermopol buffer </td><td> 10 x </td><td> 1 x </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> MgSO4 </td><td> 100 mM </td><td> 2 mM </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> Primermengsel * </td><td colspan="2"> Tabel 2 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> 25 mM </td><td> 400 uM </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> Betaine </td><td> 5 M </td><td> 1 M </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Hydroxynaftolblauw blauw </td><td> 3 mM </td><td> 120 uM </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Bst DNA polymerase </td><td> 8000 U / ml </td><td> 8 U </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Totaal </td><td></td><td></td><td> 23 </td></tr></tbody></table> Tabel 3. Voorbereiding van een LAMP reactie mastermix. * Eimeria soortspecifiek.

De diagnose van Eimeria-infectie bij kippen blijft veeleisend. Aanpakken gebaseerd op parasietenmorfologie en pathologie van de gastheer zijn vaak niet doorslaggevend, terwijl moleculaire benaderingen op basis van PCR veeleisend zijn gebleken in termen van kosten en expertise. Het doel van dit protocol is om lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) te vestigen als een eenvoudige moleculaire diagnose voor eimerian-infectie.

-Loop gemedieerde Isothermisch Amplification (LAMP) Testen voor de Species-specifieke detectie van<em&gt; Eimeria</em&gt; Dat Kippen infecteren

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Het algemene doel van deze procedure is om de aanwezigheid van I myea-soort parasieten bij een kip of een kippenkudde te diagnosticeren. Dit wordt bereikt door eerst de reagentia voor de loop-gemedieerde isotherme amplificatie of lamp-reactie voor te bereiden. Vervolgens wordt totaal genoom-DNA bereid uit een of meer darmlocaties na de dood.Daarna wordt het genomische DNA toegevoegd aan de lamp-mastermix en geïncubeerd. Ten slotte wordt het resultaat van de lamp-test beoordeeld. Uiteindelijk wordt LAMP gebruikt om de aanwezigheid van specifieke I miria-soorten te bepalen om het beheer van het vee te verbeteren en als hulpmiddel voor diagnose van ziekten.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van traditionele methoden zoals morfologische microscopie of PCR is dat het minder subjectief is en geen dure laboratoriumfaciliteiten vereist. Het gebruik van deze aanpak kan de gezondheid en het welzijn van kippen verbeteren door de diagnose van Arian-infectie te verbeteren. Om de template voor de Erea lamp-ase voor te bereiden, kies het gedeelte van de darm dat getest moet worden.Gebruik deze tabel als gids voor de selectie van monsterlocaties en de eria-soorten die het meest waarschijnlijk aanwezig zijn. Dit is van cruciaal belang omdat elke soort die kippen infecteert, wordt gedefinieerd door het darmgebied dat het aantast met behulp van steriele schaar of een scalpel. Verwijder vijf centimeter of langere delen van de darmsecties die geselecteerd zijn om op eria te testen.Snijd het monster longitudinaal open. Verwijder het grootste deel van de darminhoud en gebruik de rand van een steriele glazen microscoop. Schuif of steriele schaar om de cellen van de mucosale laag te schrappen.Doe het geschraapte materiaal in een steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuis met schroefdop die 100 microliters steriele TE met 10% gewicht, maar volumecel X 100 hars bevat en schroef de bovenkant stevig vast. Schud de monsters krachtig gedurende één minuut en incubeer vervolgens in een kokend waterbad gedurende 10 minuten. Laat na het koken elke monster gedurende één tot twee minuten afkoelen bij kamertemperatuur.Centrifugeer de monsters gedurende één minuut bij 10.000 keer G voordat u twee microliters van het supernatant per lamp-assay verzamelt om als template te gebruiken om I miria lamp-primerstocks voor te bereiden die voldoende zijn voor 100 assays. Herstel elke gelyofiliseerd I miria lamp-primer door moleculaire water toe te voegen tot een concentratie van 100 micromolair, pipet 60 microliters moleculaire water in een afzonderlijke 0,5 milliliter microcentrifugebuis met klepdeksel voor elke iria-soort die moet worden onderzocht. Gebruik het volume dat in deze tabel wordt weergegeven.Voeg primers, F-I-P-B-I-P-F drie B drie LF en LB specifiek voor de doel-eria-soort toe aan het water. Maak een reeks van zeven soortspecifieke primermixen. Draai de primeroplossingen kort om ze te mengen, pulseer vervolgens microfuge en vries totdat het nodig is.Gebruik de volumes die in deze tabel zijn vermeld en de richtlijnen in het tekstprotocol om een lamp-reactie mastermix voor elke iria-soort voor te bereiden die moet worden onderzocht om de lamp-assay uit te voeren. Pipet 23 microliters van IEA-soortspecifiek B-S-G-D-N-A polymerase lamp-mastermix in een 0,5 milliliter microcentrifugebuis. Voeg twee microliters eerder bereid DNA-template toe om een ​​laatste reactievolume van 25 microliters als positieve controle te maken. Voeg twee microliters eria-soortspecifiek genoom-DNA toe aan één reactie.Voeg twee microliters moleculaire water toe aan een reactie als negatieve controle en incubeer in een waterbad of heat block op 62 graden Celsius gedurende 30 minuten. Deactiveer optioneel het B-S-T-D-N-A polymerase door 10 minuten te verwarmen tot 80 graden Celsius. Als de reactie niet onmiddellijk na afloop van de incubatie onder binnenlicht wordt gelezen, beoordeel de kleur van elke reactie met het oog.Negatieve resultaten zullen roze tot violet van kleur zijn en positieve resultaten zullen hemelblauw zijn, optioneel. Om het lamp-assayresultaat te bevestigen, meng vijf microliters lamp-reactieproduct met één microliter DNA gel-loading buffer en draai op een prestain 2%ARO-gel.Gebruik een DNA-ladder met een molecuulgrootte van één kilobase om de fragmentgrootte te bepalen en test drie. Vogels verzameld van een Amerikaanse vleeskuikenboerderij als onderdeel van een bewakingsprogramma, leverden drie sets darmmonsters op zoals hier getoond. Gerichte toepassing van de soortspecifieke lamp-assays en het prioriteren van de voorkeursdarmsteden voor elke I miria.Soort toegestaan ​​visuele identificatie van een iriële infectie bij alle geteste vogels met behulp van hydroxy natal blauw als indicator. De kleur die met een negatieve lamp-reactie wordt bereikt bij gebruik van hydroxy kan variëren van violet tot roze, maar is altijd verschillend van de blauw die wordt bereikt door een positief resultaat. Bevestiging door aose gelelektroforese leverde vergelijkbare resultaten op zoals hier getoond.Het bereiden van het DNA van één getrokken monster per vogel dat materiaal vertegenwoordigt dat is verzameld van elk van de specifieke darmlocaties en getest met alle zeven lamp-assays, leverde hetzelfde resultaat op als wanneer elke darmlocatie afzonderlijk werd verwerkt. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in 45 minuten worden uitgevoerd als het correct wordt uitgevoerd volgens deze procedure. Andere technieken zoals laesiescorering kunnen ook worden uitgevoerd om de algehele darmgezondheid te beoordelen.

loop-mediated-isothermal-amplification-lamp-assays-for-species

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Domesle, K. J., et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technique for detecting a target bacterial gene by amplifying DNA at a constant temperature. The reaction mixture is prepared by adding an isothermal master mix, specific primers for the target gene, and samples containing DNA templates. The...

Loop-Mediated Isothermal Amplification for Bacterial Gene Detection

We beschreven hier een eenvoudige loop-mediated isothermal amplification (LAMP) methode met behulp van gelyofiliseerd reagens voor de detectie van C. burnetii in monsters van patiënten.

De ontwikkeling van gevriesdroogde Loop-gemedieerde Isotherme Amplification reagentia voor de detectie van<em&gt; Coxiella burnetii</em

Huidige multiplexed diagnostiek te detecteren Zika, chikungunya, dengue virussen vereisen complexe monstervoorbereiding en dure instrumentatie en moeilijk te gebruiken in omgevingen met lage resource. Laten we een diagnose die gebruikmaakt van isotherme amplificatie met doelgroepen gerichte strand verschuifbare sondes op te sporen en deze virussen onderscheiden met hoge gevoeligheid en specificiteit.

Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1

Deze paper meldt het protocol voor een snelle identificatie assay voor Bemisia tabaci gebaseerd op lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) technologie. Het protocol vereist minimale laboratorium opleiding en kan, daarom, ter plaatse op de punten van binnenkomst voor de plant invoer zoals zeehavens en luchthavens worden uitgevoerd.

Een lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) Assay voor snelle identificatie van Bemisia tabaci

Hier hebben we een methode om stabiele transfection van kip Eimeria parasieten te bereiken door nucleofecting sporozoites of tweede generatie merozoiten. Genetisch gemodificeerde eimerian parasieten die heterologe antigene genen uitdrukken, kunnen worden gebruikt als vaccinleveringsvoertuigen.

Nucleofection en in Vivo propagatie van kippeneimeria parasieten

We presenteren een RT-LAMP test voor de detectie van TiLV in tilapia vissen met behulp van eenvoudige instrumenten over een relatief korte periode van tijd in vergelijking met conventionele RT-PCR technieken. Dit protocol kan helpen bij de bestrijding van de epidemische verspreiding van TiLVD, vooral in ontwikkelingslanden.

Reverse Transcription Loop-Bemiddelde Isothermale Versterking (RT-LAMP) Assay voor de specifieke en snelle detectie van Tilapia Lake Virus

Loopgemedieerde isothermale versterking (LAMP) is een isothermische nucleïnezuurversterkingstest (iNAAT) die brede belangstelling heeft getrokken voor het detectieveld van ziekteverwekkers. Hier presenteren we een multilaboratorium gevalideerd Salmonella LAMP-protocol als een snelle, betrouwbare en robuuste methode voor het screenen van Salmonella in dierlijk voedsel en het bevestigen van vermoedelijke Salmonella uit cultuurisolatie.

Lusgemedieerde isothermale versterking voor het screenen van salmonella in dierlijk voedsel en het bevestigen van Salmonella uit cultuurisolatie

We ontwikkelden een methode om Phytophthora capsici zoospores in waterbronnen te detecteren met behulp van een filter papier DNA-extractie methode in combinatie met een lus-gemedieerde isothermale versterking (LAMP) test die kan worden geanalyseerd in het veld of in het lab.

Detectie van Phytophthora capsici in irrigatiewater met behulp van loop-gemedieerde isothermale versterking

Verschillende bacteriële ziekteverwekkers kunnen luchtweginfecties veroorzaken en tot ernstige gezondheidsproblemen leiden als ze niet nauwkeurig worden gedetecteerd en onmiddellijk worden behandeld. Snelle en nauwkeurige detectie van deze ziekteverwekkers via lusgemedieerde isotherme amplificatie zorgt voor een effectief beheer en controle van luchtweginfecties in klinische omgevingen.

Snelle detectie van bacteriële pathogenen die infecties van de onderste luchtwegen veroorzaken via op microfluïdische-chips gebaseerde lus-gemedieerde isotherme amplificatie

Dit protocol beschrijft een eenvoudige zelfklevende tape-gebaseerde aanpak voor de bemonstering van de tomaten en andere verse producten oppervlakken, gevolgd door een snelle volledige cel detectie...

Combinatie van Adhesive-tape-gebaseerde Sampling en fluorescentie In situ Hybridisatie voor snelle detectie van Salmonella Op Fresh Produce

Leer LAMP-diagnostiek voor Eimeria-infecties bij kippen met soortspecifieke detectie. Deze kosteneffectieve methode biedt snelle, visuele resultaten in 45 minuten zonder dure laboratoriumfaciliteiten.

-Loop gemedieerde Isothermisch Amplification (LAMP) Testen voor de Species-specifieke detectie van Eimeria Dat Kippen infecteren (Video) | JoVE Journal

-Loop gemedieerde Isothermisch Amplification (LAMP) Testen voor de Species-specifieke detectie van

Meer video's verkennen