Name: Generatie en enten van-Weefselmanipulatieproducten Schepen in een muismodel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Leer functionele vaattransplantaten genereren en enten in muizen met PiPS-cellen en gedecellulariseerde aortascaffolds. Deze methode toont de haalbaarheid van weefselengineering voor cardiovasculaire toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door The British Heart Foundation en The Oak Foundation.

Voer alle dierproeven volgens de protocollen door de Institutional Comité voor gebruik en onderhoud van proefdieren goedgekeurd. 1. Voorbereiding van Cultuur Media <ol><li> Maak kweekmedia voor humane fibroblast cellijn CCL-153: F-12K Medium, 10% foetaal runderserum (FBS) en 100 U / ml penicilline en streptomycine. </li><li> Maak herprogrammeren Media voor PiPSC generatie Knockout Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) dat 20% Knockout Serum vervanging, 0,1 mM β-mercaptoethanol, 0,1 mM Minimum Essential Medium (MEM) Niet-essentiële aminozuren, 10 ng / ml basische fibroblastgroeifactor 2 (bFGF-2) en 100 U / ml penicilline en streptomycine. Voeg bFGF-2 vers elke keer voordat het gebruik van de media. </li><li> Voeg Differentiatie Media (DM) gladde spiercellen induceren (SMC) differentiatie: α-MEM medium dat 10% FBS, 0,1 mM β-mercaptoethanol, 100 U / ml penicilline en streptomycine en 25 ng / ml van bloedplaatjes afgeleide groeifactor(PDGF-ββ). </li><li> Voeg Endotheliale Differentiatie Media (EC-DM) endotheelcellen (EC) differentiatie induceren: Endotheliale groeimedia-2 (EGM-2) medium dat 50 ng / ml Vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en 100 U / ml penicilline en streptomycine. </li></ol> 2. herprogrammeren humane fibroblasten in Gedeeltelijk-geïnduceerde pluripotente stamcellen (PiPSC) <ol><li> Cultuur menselijk fibroblastcellijn CCL-153 op 0,04% gelatine-oplossing gecoat flesjes in kweekmedium. </li><li> Passage cellen elke 3 dagen bij een verhouding van 1: 6. Gebruik cellen vóór doorgang 9 voor een optimale efficiëntie van PiPSC generatie. Cellen zijn klaar voor transfectie bij het bereiken van 80-90% samenvloeiing. </li><li> Lineariseren polycistronische plasmide pCAG2LMKOSimO met 4 herprogrammering factoren octameer-bindende transcriptiefactor 4 (OCT4), SOX2, Krüppel-achtige factor 4 (KLF4) en C-MYC (pCAG-OSKM). Digest 5 ug plasmide met 5 eenheden restrictie-enzym PvuI gedurende 3 uur bij 37 ° C. Zuiverenhet plasmide met een commerciële kit volgens protocol van de fabrikant. </li><li> Transfecteren 2 x 10 6 humane fibroblasten met 4 ug gelineariseerde pCAG-OSKM plasmide door elektroporatie met menselijke dermale fibroblasten (NHDF) nucleofectie kit volgens protocol van de fabrikant. Voorzichtig zaad getransfecteerde cellen op pre- 0,04% gelatine beklede T25 kolf die 5 ml voorverwarmde herprogrammeren Media. </li><li> Na 24 uur, verandert medium met supplementen van 25 ug / ml neomycine om een ​​zuivere populatie getransfecteerde cellen te selecteren. </li><li> Wijzig medium om de andere dag tot dag 4. Opmerking: menselijke fibroblasten geworden PiPSC na 4 dagen van de herprogrammering. </li></ol> 3. Differentiatie van PiPSC in endotheelcellen en gladde spiercellen <ol><li> Zaad PiPSC op collageen IV pre-coated gerechten met DM voor 4 dagen om differentiatie te induceren in SMC&#39;s. Wijzig medium om de andere dag tot dag 4. </li><li> Zaad PiPSC op collageen IV-pre gecoat gerechten containing endotheel-DM 6 dagen differentiatie induceren in endotheelcellen. Wijzig medium om de andere dag tot dag 6. </li></ol> 4. gedecellulariseerde Aorta Graft Voorbereiding Opmerking: Alle oplossingen en apparatuur moet steriel zijn. <ol><li> Offer de muis door cervicale dislocatie en bevestig de muis in een liggende positie onder dissectie microscoop. </li><li> Knip het borstbeen en rond de ribbenkast tot de borstholte geopend. Verwijder het hart, de longen en de slokdarm naar de aorta bloot te leggen. Verwijder voorzichtig de peri-aorta vet met een pincet. </li><li> Snijd de aorta van het voorste einde met een schaar en voorzichtig houd het uiteinde met stompe pincet. Maak de aorta uit de kolom wervelkolom achter door stompe dissectie. Sluit zorgvuldig de vertakking slagaders van de aorta door ligatie met een bipolaire electrocoagulator en snijden van het uiteinde van de ligatie met een schaar. </li><li> Gebruik een spuit 5 ml aan de aorta lumen spoelen met 3 ml zoutoplossing bevattende 100 U heparine om de vorming van bloedstolsels. </li><li> Knip het achterste uiteinde van de aorta voordat het vertakt in de nier. Houd de integriteit van de aorta is bijzonder belangrijk tijdens de gehele procedure. </li><li> Spoel de aorta lumen met 5 ml 0,075% natriumdodecylsulfaat (SDS) verdund in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Week de thoracale aorta 0,075% SDS oplossing in een 10 cm Petrischaal. Plaats de petrischaal op een orbitale schudder gedurende 2 uur bij 150 rpm bij kamertemperatuur. </li><li> Spoel de aorta lumen met 5 ml PBS. </li><li> Week de aorta in PBS in een 10 cm Petrischaal. Plaats de petrischaal op de orbitale schudder gedurende 2 uur bij 150 rpm bij kamertemperatuur. Vernieuwen PBS om de 20 min. </li><li> Spoel de aorta lumen met 5 ml PBS. </li><li> Laat cellen ontdane aorta graft in PBS bij 4 ° C gedurende maximaal een week. </li></ol> 5. Dual Zaaien van PiPSC en Bioreactor Conditioning Opmerking: Alle oplossings en apparatuur moeten steriel zijn. Voer alle activiteiten in een weefselkweek kap. <ol><li> Monteer de bioreactor stroomcircuit zie figuur 1. Sluit incubatiekamer, media reservoir, peristaltische pomp en naleving kamer met slangen. Minimaal volume medium nodig voor circulatie 40 ml. </li><li> Voorwaarde het ontcelde vat kweekmedium door het weken van de aorta in DM medium in een 10 cm Petrischaal. Plaats de petrischaal op de orbitale schudder gedurende 1 uur bij 50 rpm bij kamertemperatuur. </li><li> Plaats 1 cm lengte nylon buizen (OD 0.9 mm, 0.75 mm ID) in beide uiteinden van de ontcelde vat onder de microscoop. Bind het schip en de buizen met 8-0 zijde hechtingen. </li><li> Monteer de ontcelde aorta graft in de incubatiekamer op door de nylon buizen met de inlaat- en uitlaatpoorten (1/32 &quot;slang) van de kamerwand. Onderhouden incubatiekamer met 5mls van medium elke keer. </li><li> Trypsinize PiPSC door toevoeging voorverwarmdetrypsine om de cultuur schotel te dekken en schud de schotel 10 keer. Gooi de trypsine en laat de schotel in incubator gedurende 2-3 min. Voeg voorverwarmd kweekmedium in de schaal en meng het medium met de cellen. </li><li> Tellen van het aantal cellen met behulp van een hemocytometer. Centrifuge twee aliquots van celsuspensies met 5 x 10 5 cellen per 5 minuten bij 300 x g. Volledig Zuig de supernatant. </li><li> Na volledig opzuigen het supernatant, resuspendeer pellet 1 van de PiPS celpellets in 50 pl DM. Injecteren deze celsuspensie in de gedecellulariseerde vaatlumen. </li><li> Vervolgens resuspendeer de andere PiPS celpellet in 100 ui Matrigel. Zorgvuldig pipet het mengsel op de gedecellulariseerde aorta graft. </li><li> Wacht 10-15 minuten totdat er een gelachtige toestand gelijkmatig wikkelt rond het vat buitenoppervlak. Vul het incubatiekamer met DM. </li><li> Plaats het geheel bioreactor instelling in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C. Handmatig draaien de ontcelde transplantaat 90 ° om de langsas elk half uur in de eerste 2 uur. </li><li> Houd statische cultuur gedurende 12 uur naar cel adhesie te schakelen. </li><li> Lever DM door het lumen van de peristaltische pomp gladde spiercellen differentiatie induceren. Start initiële debiet bij 5 ml / min en de stapsgewijze verhoging tot 20 ml / min gedurende 24 uur. </li><li> Houd het circulerende medium debiet 20 ml / min gedurende 24 uur. </li><li> Stop met het medium flow en verplaats de bioreactor waarin van de incubator. </li><li> Opnieuw zaad het lumen van het implantaat met PiPSC. Trypsinize, tellen en centrifuge 1 x 10 6 PiPSC als in de stappen 5,5-5,6. Resuspendeer de cellen in 50 ul EGM-2 medium dat 50 ng / ml VEGF. Injecteer de cel mengsel in het lumen van het implantaat. </li><li> Verander het medium in de incubatiekamer en hele omloop EGM-2 medium dat 50 ng / ml VEGF in endotheliale differentiatie induceren. </li><li> Beweeg de bioreactor instelling terug naar the incubator. Handmatig draaien de graft 90 ° 30 min in de eerste 2 uur en vervolgens houdt een statische kweek gedurende 12 uur. </li><li> Begin circulatiestroom van 5 ml / min en stapsgewijze verhoging tot 35 ml / min. Houd het debiet 35 ml / min gedurende 5 dagen. Veranderen circulerende en kamermuziek medium om de andere dag. </li><li> Oogst de engineered graft voor verdere enten op de muis. </li></ol> 6. Het enten van Double-geplaatste PiPSC Graft in Muizen <ol><li> Gebruik NOD.CB17-Prkdc scid / NcrCrl mannelijke muizen als vaartuig transplantaat ontvangers. Zorg er altijd voor dat de muizen zijn ongeveer 10 weken oud, weegt ongeveer 25 - 35 g, en zijn in goede hygiënische omstandigheden. </li><li> Verdoven ontvanger muizen door toediening van een combinatie van Hypnorm (25 mg / kg) en Hypnovel (25 mg / kg) intraperitoneaal. Breng petrolatum oogzalf op ogen droog voorkomen terwijl onder verdoving. Bevestig efficiënte verdoving door ervoor te zorgen dat de muizen hebben ontspannen spieren en gestaag ademen. <ol><li> Bevestig de muis in een liggende positie met zijn nek geschoren en uitgebreid. Dien atropinesulfaat (1,7 mg / kg) in combinatie met de anesthetica zodat de muis luchtwegen vrij blijft. </li></ol></li><li> Bereid een middellijn incisie van de onderkaak tot borstbeen van de muis. Onder een dissectiemicroscoop met 5- tot 10-voudige amplificatie, til de juiste speekselklieren lateraal en verwijder het cleidomastoid spier rechts halsslagader bloot. </li><li> Verwijder voorzichtig gehecht weefsel rechts halsslagader mobiliseren van het distale uiteinde naar het proximale uiteinde. Afbinden het middelste gedeelte van de gemeenschappelijke halsslagader tweemaal met een 8-0 zijden hechtdraad en ontleden tussen de twee banden. </li><li> Door een manchet gemaakt van autoclaveerbaar nylon buis in elk uiteinde vat en zet elk uiteinde met microhemostat klemmen. </li><li> Verwijder hechting band aan het ene uiteinde en een daling van heparine (100 U / ml) toegepast. Onmiddellijk na Draai het distale eind van The slagader om de hele manchet lichaam te bedekken fix de omgekeerde schip met een 8-0 zijden hechtdraad om de manchet en. <ol><li> Herhaal dezelfde procedure voor het andere deel van de slagader. Flush slagader met een zoutoplossing om bloedstolsels te verwijderen. </li></ol></li><li> Implanteren een gedecellulariseerde vaartuig transplantaat tussen twee uiteinden van de halsslagader door het schuiven van de gedecellulariseerde uiteinden vaartuig van de meer dan de slagader manchetten en de vaststelling van het met 8-0 zijde hechtingen. Verwijder vasculaire klemmen aan beide uiteinden voor het evalueren van de pulsatie van de graft. </li><li> Plaats de rechter speekselklier terug naar zijn oorspronkelijke positie. Sluit de huid op de chirurgische locatie met een onderbroken hechtdraad met een 6-0 polyglactine hechtdraad. </li><li> Consequent acht vitale functies van muis nadat de procedure is voltooid, totdat hervat bewustzijn. Offer ontvangende muizen door cervicale dislocatie en oogst verblijf enten ofwel 24 uur of 3 weken later voor verdere analyse. </li></ol>

<ol><li>Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+Tissue-Engineered+Vascular+Grafts+for+Cardiac+Surgery%3A+Past%2C+Present%2C+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future.</a> Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).</li>
<li>Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+follow-up+of+patients+with+synthetic+right+heart+conduits%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term follow-up of patients with synthetic right heart conduits.</a> Circulation. 72, II77-II83 (1985).</li>
<li>Heureux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technology+insight%3A+the+evolution+of+tissue-engineered+vascular+grafts-from+research+to+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Clin+Pract+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Technology insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice.</a> Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, 389-395 (2007).</li>
<li>Zhang, W. J., Liu, W., Cui, L., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+blood+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of blood vessel.</a> J Cell Mol Med. 11, 945-957 (2007).</li>
<li>Cearbhaill, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+mesenchymal+stem+cells+to+the+biomechanical+environment+of+the+endothelium+on+a+flexible+tubular+silicone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Response of mesenchymal stem cells to the biomechanical environment of the endothelium on a flexible tubular silicone substrate.</a> Biomaterials. 29, 1610-1619 (2008).</li>
<li>Gong, Z., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-diameter+human+vessel+wall+engineered+from+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+%28hMSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs).</a> FASEB J. 22, 1635-1648 (2008).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+HSP47+augments+mouse+embryonic+stem+cell+smooth+muscle+differentiation+and+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Over-expression of HSP47 augments mouse embryonic stem cell smooth muscle differentiation and chemotaxis.</a> PLoS One. 9 (1), e86118(2014).</li>
<li>Park, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+functional+CD34%2B+progenitor+cells+by+combined+modulation+of+the+MEK%2FERK+and+BMP4+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into functional CD34+ progenitor cells by combined modulation of the MEK/ERK and BMP4 signaling pathways.</a> Blood. 116, 5762-5772 (2010).</li>
<li>Samuel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functionally+competent+and+durable+engineered+blood+vessels+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of functionally competent and durable engineered blood vessels from human induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 12774-12779 (2013).</li>
<li>Margariti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+fibroblasts+into+endothelial+cells+capacble+of+angiogenesis+and+reendothelialization+in+tissue-engineered+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of fibroblasts into endothelial cells capacble of angiogenesis and reendothelialization in tissue-engineered vessels.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 13793-13798 (2012).</li>
<li>Karamariti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+cells+differentiated+from+reprogrammed+embryonic+lung+fibroblasts+through+DKK3+signaling+are+potent+for+tissue+engineering+of+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle cells differentiated from reprogrammed embryonic lung fibroblasts through DKK3 signaling are potent for tissue engineering of vascular grafts.</a> Circ Res. 112, 1433-1443 (2013).</li>
<li>Udelsman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+operator-independent+method+for+seeding+tissue-engineered+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of an operator-independent method for seeding tissue-engineered vascular grafts.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17 (7), 731-736 (2011).</li>
<li>Cearbhaill, E. D., Murphy, M., Barry, F., McHugh, P. E., Barron, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+human+mesenchymal+stem+cells+in+fibrin-based+vascular+tissue+engineering+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Behavior of human mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular tissue engineering constructs.</a> Ann Biomed Eng. 38 (3), 649-657 (2010).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+control+vascular+stem%2Fprogenitor+cell+plasticity+through+tumor+necrosis+factor-%CE%B1-mediated+nuclear+factor-%CE%BAB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Macrophages control vascular stem/progenitor cell plasticity through tumor necrosis factor-α-mediated nuclear factor-κB activation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (3), 635-643 (2014).</li>
<li>Wong, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirolimus+stimulates+vascular+stem%2Fprogenitor+cell+migration+and+differentiation+into+smooth+muscle+cells+via+epidermal+growth+factor+receptor%2Fextracellular+signal-regulated+kinase%2F%CE%B2-catenin+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Sirolimus stimulates vascular stem/progenitor cell migration and differentiation into smooth muscle cells via epidermal growth factor receptor/extracellular signal-regulated kinase/β-catenin signaling pathway.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (10), 2397-2406 (2013).</li>
<li>Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+matrices%3A+State+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture matrices: State of the art.</a> Tissue Eng Part B Rev. 14, 61-86 (2008).</li>
<li>Hung, H. S., Hsu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Advances+of+stem+cell-based+approaches+to+tissue-engineering+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22OA+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Current Advances of stem cell-based approaches to tissue-engineering vascular grafts.</a> OA Tissue Engineering. 1 (1), 2(2013).</li>
<li>Quint, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (22), 9214-9219 (2011).</li>
<li>Zhang, X., Xu, Y., Thomas, V., Bellis, S. L., Vohra, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+antiplatelet+adhesion+layer+on+an+electrospun+scaffold+using+porcine+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Engineering an antiplatelet adhesion layer on an electrospun scaffold using porcine endothelial progenitor cells.</a> J Biomed Mater Res A. 97 (2), 145-151 (2011).</li>
<li>Hibino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+use+of+an+induced+puripotent+stem+cell+sheet+for+the+construction+of+tissue-engineered+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the use of an induced puripotent stem cell sheet for the construction of tissue-engineered vascular grafts.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 143 (3), 696-703 (2012).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+to+engineer+small-diameter+vascular+grafts+from+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">A novel strategy to engineer small-diameter vascular grafts from marrow-derived mesenchymal stem cells.</a> Artif Organs. 36 (1), 93-101 (2012).</li>
<li>Tsai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+stem+cells+to+neointimal+formation+of+decellularized+vessel+grafts+in+a+novel+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Contribution of stem cells to neointimal formation of decellularized vessel grafts in a novel mouse model.</a> Am J Pathol. 181 (1), 362-373 (2012).</li>
<li>Kasimir, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+decellularization+procedures+of+porcine+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves.</a> Int J Artif Organs. 26 (5), 421-427 (2003).</li>
<li>Stephenson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+propagation+of+human+embryonic+stem+cell+lines+from+frozen+embryos+in+an+animal+product-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and propagation of human embryonic stem cell lines from frozen embryos in an animal product-free environment.</a> Nature Protocols. 7, 1366-1381 (2012).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).</li>
<li>McCall, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarction+and+intramyocardial+injection+models+in+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine.</a> Nature Protocols. 7, 1479-1496 (2012).</li>
<li>Olausson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+an+allogeneic+vein+bioengineered+with+autologous+stem+cells%3A+a+proof-of-concept+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study.</a> Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen.

Het huidige protocol geeft een goed, snel, eenvoudig, efficiënt en reproduceerbaar strategie waarbij functionele tissue engineered schepen kunnen worden gegenereerd met behulp PiPSC uit humane fibroblasten. Deze techniek is een waardevol instrument voor de regeneratieve geneeskunde, tissue engineering en potentieel patiënt-specifieke celtherapie in de nabije toekomst. Kritische stappen om de effectiviteit van het protocol omvatten de bereiding van PiPSC, bereiding van steriele en volledig ontcelde aortische transplantat...

De bouw van vasculaire leidingen is een fundamentele strategie voor chirurgische reparatie van beschadigde en gewonden schepen als gevolg van hart- en vaatziekten. Tot op heden, graft materialen die worden gebruikt in de chirurgie omvatten biocompatibele synthetische polymeren (polytetrafluoretheen [Teflon], geëxpandeerd polytetrafluorethyleen [ePTFE; Gore-Tex] of polyethyleentereftalaat [Dacron]), allogene, autoloog weefsel (pericardium of vene) en xenograften 1. Terwijl kunstmatige transplantaten (bv Gore-Tex en Dacron) worden het meest gebruikt, deze materialen waarschijnlijk leiden tot tal van korte en lange termijn complicaties die stenose, calcium afzetting, trombo-embolisatie en infecties omvatten. Hoewel patiënten met biologische enten aanwezig met verminderde trombo-embolische gebeurtenissen, ze nog steeds beperkingen tegenkomen zoals secundaire transplantaat falen en een kortere levensduur als gevolg van verkalking degradatie 2. Daarom, ondanks aanzienlijke verbeteringen in chirurgische techniques de jaren, onderzoekers en clinici nog belast met het nodig zijn de ideale geleider voor vaatziekten. Meer recent heeft het onderzoeksveld van de vasculaire tissue engineering een concept waarbij cellen worden opgenomen in biologisch afbreekbare steigers, met als doel het creëren van een biomimetische omgeving die een functioneel schip voor succesvolle enting 1 belichaamt gegenereerd. Fundamenteel, het succes van de vasculaire constructen afhankelijk drie essentiële componenten; cellen die de steiger, dwz een endotheliale binnenlaag en een gladde spiercel laag, een scaffold dat het geschikte extracellulaire matrix mechanische eigenschappen vergelijkbaar met de natieve vasculatuur verschaffen, en de moleculaire / cellulaire signalering die nodig is voor het initiëren / regulerend omvatten reparatie. Lange termijn patency en duurzame ontwikkeling van de neo-weefsels sterk afhankelijk effectieve zaaien van cellen van steigers, thereby waardoor de beslissing van celtype van cruciaal belang. Verscheidene rapporten tonen het gebruik van volwassen endotheliale en gladde spiercellen uit diverse bronnen kleine diameter leidingen 3-6 ontwikkelen. Hoewel veelbelovend, het ontbreken van voldoende autologe schepen te verkrijgen mature endotheelcellen en gladde spiercellen blijven een aanzienlijke last. Recenter zijn stamcellen uit diverse bronnen zijn gebruikt voor vaatweefsel technische toepassingen. Inderdaad, verschillende types stamcellen waaronder embryonale stamcellen 7, geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, beenmerg afgeleide mononucleaire cellen 12, mesenchymale stamcellen 13, endotheliale progenitor cellen en wand volwassen vat -afgeleide stamcel antigeen-1 (Sca-1) + stam / progenitorcellen 14,15 zijn allemaal aangetoond kan differentiatie worden in ofwel functioneel endotheel of gladde spiercellen in reactie op gedefinieerde media enkweekomstandigheden. Bovendien is de onbeperkte zelfvernieuwing capaciteit van de stamcellen ze betere kandidaten tegenstelling volwassen endotheliale en gladde spiercellen die slechts delen een eindig aantal malen ondergaan groeistop en afsterven. De keuze van dragermateriaal succesvol tissue engineered verblijf genereren voor enten afhankelijk van verschillende factoren zoals biocompatibiliteit, biomechanische eigenschappen en biologische afbraaksnelheden. Fundamenteel, materialen voor scaffolds voor het enten creëren biologisch afbreekbaar zijn en mogen geen onnodige ontvanger immuunreacties monteren. Bovendien moet een geschikte porositeit en microstructuur voor celhechting en daaropvolgende overleving omvatten. Tot op heden de meest voorkomende materialen voor steigers vaatweefsel techniek omvatten polymeren van polyglycolzuur, polymelkzuur, en poly ε-caprolacton 16. Recenter cellen ontdaan biologische materialenook toegepast met enig succes. Verschillende laboratoria hebben aangetoond dat het zaaien gedecellulariseerde mens, honden of varkens schepen met autologe cellen voorzien van een biologische graft die verzette stolling en intima hyperplasie 17-19. Andere strategieën in vasculaire tissue engineering omvatten extracellulaire matrix eiwitten gebaseerde vaattransplantaten bv, zaaien cellen in fibrine gel 13 en het genereren cel vellen zonder steiger steun 20, 21. Het huidige protocol toont de differentiatie van humane PiPSC in functionele endotheel- en gladde spiercellen, het genereren van een bioreactor die bestaat uit een gedecellulariseerde vaartuig scaffold functionele PiPSC afgeleide vasculaire cellen haven en enten van de tissue engineered vaartuigen in ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (SCID ) muizen. PiPSC zijn een optimale celtype te gebruiken voor tissue engineering van het schip enten omdat deze cellen niet tumoren bij muizen te vormen of te verhogen ethische enallo- immuunresponsen. Verder hebben we aangetoond dat de strategie voor het genereren PiPS-endotheelcellen en PiPS gladde spiercellen efficiënt en reproduceerbaar 10,11. Daarna hebben we een gedecellulariseerde vaartuig voor het zaaien van PiPSC-afgeleide vasculaire cellen naar de matrix eiwitten die binnen een native vat bestaat na te bootsen, waardoor het verbeteren van enten en overleving werkzaamheid. Bovendien, de cellen ontdoen van de bloedvaten vóór PiPSC enten voorkomt het optreden van ontstekingsreacties gemonteerd immuunceltypen zoals macrofagen. Bovendien houdt dit protocol vormen niet alleen een methode voor het genereren veelbelovende vasculaire leidingen voor translatie in mensen, maar ook waardevol middel van het bestuderen en begrijpen van de moleculaire mechanismen die vasculair weefselregeneratie regeren door muismodellen.

<table><tbody><tr><td>Human Fibroblasts CCL-153</td><td>ATCC</td><td>CCL-153</td><td>Prenatal human embryonic fibroblasts</td></tr><tr><td>ATCC F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium)</td><td>ATCC</td><td>30-2004</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells</td><td>Life technologies (Gibco)</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Life technologies (Invitrogen)</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Human Basic FGF-2&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-837</td><td></td></tr><tr><td>alpha-MEM medium</td><td>Life technologies (Invitrogen)</td><td>32571093</td><td></td></tr><tr><td>Human PDGF</td><td>R&amp;D System</td><td>120-HD-001</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin Solution 2%</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC)</td><td>Addgene</td><td>20866</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;PvuI Restriction Enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>RO150S</td><td></td></tr><tr><td>SureClean Plus</td><td>Bioline</td><td>BIO-37047</td><td></td></tr><tr><td>Nucelofection Kit (NHDF Kit)</td><td>LONZA</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>SIGMA</td><td>G418</td><td></td></tr><tr><td>KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy</td><td>SCHOTT</td><td>KL 1500 LCD</td><td>Cold light illumination for stereo microscopy</td></tr><tr><td>Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent</td><td>Severn Biotech</td><td>CAS 151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (10mg/ml)</td><td>BD</td><td>A6661</td><td></td></tr><tr><td>Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7&nbsp;</td><td>Jepson Bolton's, Janke&amp;Kunkel</td><td>S32-102</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digital Pump Drive</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-15</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S large cartridges for pump head</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07519-75</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft</td><td>Cole-Parmer&nbsp;</td><td>WZ-96410-14</td><td>Tubing goes through the peristaltic pump</td></tr><tr><td>0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing</td><td>SILEX</td><td>N/A</td><td>Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber&nbsp;</td></tr><tr><td>Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline</td><td>Ibidi</td><td>10829</td><td>Adapter connect above two types of tubings</td></tr><tr><td>1/32" Tubing, ID 0.01" (250&micro;m) Material: PEEK</td><td>LabSmith</td><td>T-132-010P</td><td>Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing</td></tr><tr><td>One-Piece Fittings&nbsp;</td><td>LabSmith</td><td>T-132-100</td><td>Fix the above tubings through the incubation chamber wall</td></tr><tr><td>Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm)&nbsp;</td><td>Smiths Medical</td><td>N/A</td><td>Tubings insert into two ends of the aorta graft</td></tr><tr><td>NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mouse</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical sutures, 8-0&nbsp; silk</td><td>ETHICON</td><td>W819</td><td></td></tr><tr><td>Hypnorm</td><td>Vetapharm</td><td>Vm21757/4000</td><td>Neuroleptanalgesic for use in mice</td></tr><tr><td>Hypnovel (Midazolam)</td><td>Roche</td><td>59467-70-8</td><td>Induction of anaesthesia</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Nylon Tubing</td><td>Portex LTD</td><td>800/200/100/200</td><td>0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff</td></tr><tr><td>Electrocoagulator</td><td>Martin&nbsp;</td><td>SN 54.131</td><td>Ligation of artery branches on aorta</td></tr><tr><td>Bipolar micro hemostat forceps</td><td>Martin</td><td>80-91-12-04</td><td>Fixation of vessel ends</td></tr><tr><td>Vessel Dilator</td><td>S&amp;T</td><td>JFX-7</td><td></td></tr><tr><td>Vessel Dilator</td><td>S&amp;T</td><td>JFL-3dZ</td><td></td></tr><tr><td>Vessel Dilator</td><td>S&amp;T</td><td>D-5aZ</td><td></td></tr><tr><td>Mini applier&nbsp;</td><td>AESCULAP</td><td>FE572K</td><td></td></tr><tr><td>Micro hemostats clips</td><td>AESCULAP</td><td>FE720K</td><td></td></tr><tr><td>Surgical sutures, 6-0 VICRYL</td><td>ETHICON</td><td>V489</td><td></td></tr></tbody></table>

generatie en enten van-weefselmanipulatieproducten schepen in een muismodel

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

De constructie van vasculaire geleiders is een fundamentele strategie voor chirurgische reparatie van beschadigde en gewonde vaten als gevolg van cardiovasculaire aandoeningen. Het huidige protocol presenteert een efficiënte en reproduceerbare strategie waarbij functionele, door weefseltechniek ontwikkelde vaattransplantaten kunnen worden gegenereerd met behulp van gedeeltelijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (PiPSC) van menselijke fibroblasten. We ontwierpen een bioreactor voor een gedecellulariseerd vaatvat, die de matrix-eiwitstructuur en de bloedstroom die in een natuurlijk vat aanwezig is, nauw nabootst, voor het zaaien van PiPSC-endotheelcellen of gladde spiercellen voorafgaand aan het implanteren in muizen. Deze aanpak bleek voordelig te zijn omdat immuungedeficieënte muizen die waren geënt met de PiPSC-afgeleide transplantaten een aanzienlijk verhoogde overlevingssnelheid vertoonden 3 weken na de operatie. Dit protocol vertegenwoordigt een waardevol hulpmiddel voor regeneratieve geneeskunde, weefseltechniek en mogelijk patiëntspecifieke celtherapie in de nabije toekomst.

De succesvolle generatie PiPSC werd 4 dagen bevestigd na nucleofecting humane fibroblasten met een gelineariseerde pCAG2LMKOSimO plasmide dat 4 transcriptiefactoren, OCT4, SOX2, KLF4 en c-MYC (OSKM). PiPSC vertoonde een duidelijk onderscheiden fenotype in vergelijking met fibroblasten (Figuur 2A) en uitgedrukt 4 herprogrammering factoren mRNA (Figuur 2B) en eiwit (Figuur 2C) niveau 10. De werkzaamheid van een PiPSC gebaseerde vasculaire transplantaat is sterk...

Hier presenteren we een protocol om tissue engineered vaartuig enten die functioneel zijn voor het enten in muizen door dubbel zaaien gedeeltelijk geïnduceerde pluripotente stamcellen genereren (PiPSC) - afgeleide gladde spiercellen en PiPSC - afgeleide endotheelcellen op een gedecellulariseerde schip steiger bioreactor.

Generatie en enten van-Weefselmanipulatieproducten Schepen in een muismodel

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van weefseltechnisch vervaardigde vaattransplantaten die functioneel zijn voor transplantatie in muizen. Dit wordt bereikt door eerst menselijke fibroblasten in vitro te herprogrammeren tot gedeeltelijk geïnduceerde pluripotente stamcellen, die in staat zijn tot differentiatie in endotheelcellen en gladde spiercellen. Vervolgens wordt een aorta verwijderd uit een geofferde muis en gedecellulariseerd met een natriumdodecylsulfaat- of SDS-oplossing om de gedecellulariseerde aortatransplantaten voor te bereiden.Vervolgens wordt het doorstroomcircuit van de bioreactor klaargemaakt voor de dubbele seeding van gedeeltelijk geïnduceerde pluripotente stamcellen. De laatste stap is het transplanteren van het dubbel geseeded graft van gedeeltelijk geïnduceerde pluripotente stamcellen in muizen. Uiteindelijk wordt de analyse van de mortaliteitscijfers van de muizen drie weken na transplantatie gebruikt om de functionaliteit van de weefseltechnische vaatgrafts aan te tonen.De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie van cardiovasculaire aandoeningen, omdat is aangetoond dat het in korte tijd succesvol functionele bloedvaten kan

generation-and-grafting-of-tissue-engineered-vessels-in-a-mouse-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

We beschrijven een techniek waarbij een deel van de abdominale aorta van een muis getransplanteerd orthotopically is om net onder de nierslagaders in een allogene of syngene ontvanger. Deze techniek kan nuttig zijn in studies waarin transplantatie van grote slagaders van gelijke grootte is als voordelig.

Orthotope Aorta Transplantatie in Muizen voor de Studie van vasculaire aandoeningen

We beschrijven protocollen voor onze muis graft arteriosclerois (GA) modellen die tussenkomst van een muis bloedvatsegment betrekken in een ontvanger van dezelfde inteeltstam. Door terugkruisen extra genetische veranderingen in het vat donor kan het model het effect van specifieke genen op GA beoordelen.

Muismodellen voor Graft Arteriosclerosis

Het murine cervicale harttransplantatie model is geschikt voor immunologische en ischemie-reperfusie schade studies. We pasten de procedure met een niet-hechtingsmanchet techniek en uitgevoerd meer dan 1000 succesvolle transplantaties met deze benadering.  Hierin geven we meer details van deze techniek om de video te vullen.

Muizen Baarmoederhalskanker harttransplantatie Model met een aangepaste manchet Techniek

Om onze kennis van cellulaire en moleculaire neotissue vorming te verbeteren, werd een muizenmodel van het TEVG recent ontwikkelde. De transplantaten werden geïmplanteerd infrarenale vena cava tussenvoeging enten in C57BL / 6 muizen. Dit model behaalt dezelfde resultaten als die bereikt bij onze klinische onderzoek, maar over een veel kortere tijd-cursus.

Implantatie van de vena cava inferior Interpositie Graft in muismodel

Een stap-voor-stap protocol voor de inter-positionele plaatsing van weefselengineering Vessels (Tevs) in de halsslagader van een schaap met end-to-end anastomose en real-time digitale evaluatie in vivo tot dierenoffers.

Chirurgische techniek voor de inplanting van Tissue Engineered vaattransplantaten en de daaropvolgende<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoring

Om gecombineerde transplantatie van vaste organen en vaatvoorziene samengestelde allogene transplantaten te bestuderen, beschrijven we een nieuw heterotopisch en bloc model voor borstwand-, thymus- en harttransplantatie bij muizen, waarbij gebruik wordt gemaakt van een cervicale niet-naadloze manchettechniek.

A Novel Microchirurgische Model voor Heterotope, En Bloc borstwand, Thymus, en harttransplantatie in Muizen

Presenteren we een orthotopic aortaklep transplantatie model met behulp van de mouw techniek in muizen. Het is een zeer snelle wapendrager-methode, die kan worden ingezet in studies van vasculaire ziekte.

Met behulp van de mouw techniek in een muismodel van aorta transplantatie - een instructie Video

Graft stenose vormt een kritische obstakel in weefsel ontworpen airway vervanging. Om te onderzoeken cellulaire mechanismen ten grondslag liggen aan stenose, gebruiken we een lymfkliertest model van weefsel ontworpen tracheale vervanging met geplaatste beenmerg mononucleaire cellen (BM-MNC). Hier, detail we onze protocol, met inbegrip van de steiger productie, BM-MNC isolatie, graft zaaien en implantatie.

Zaaien en implantatie van een Biosynthetic weefsel-engineered tracheale Graft in een muismodel

Harttransplantatiemodellen bij muizen vertegenwoordigen waardevolle onderzoeksinstrumenten voor het bestuderen van de immunologie van transplantaties. Het huidige protocol beschrijft muis heterotopische cervicale harttransplantatie waarbij manchetten op de gemeenschappelijke halsslagader van de ontvanger en de longslagaderstam van de donor worden geplaatst om laminaire bloedstroom mogelijk te maken.

Muis heterotopische cervicale harttransplantatie met behulp van vasculaire manchetten

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implantatie van een weefselgemanipuleerd vasculair transplantaat in de halsslagader van de muis met behulp van de manchettechniek, waardoor een geschikt diermodel wordt geboden voor het onderzoeken van mechanismen voor de regeneratie van vasculair weefsel.

Implantatie van weefselgemanipuleerd vasculair transplantaat in de halsslagader van muizen via manchettechniek

Deze studie presenteert een varkensmodel voor het evalueren van transplantaten met een kleine diameter in dijbeenslagaders. Het model bootst de menselijke vasculaire dynamiek na en beoordeelt uitgebreid de doorgankelijkheid van het transplantaat, de hemodynamica en de vasculaire remodellering. Het biedt een waardevol platform voor het testen van vasculaire transplantaten en het monitoren ervan met Doppler-echografie en angiografie.

Implantatie van een femurvasculair transplantaat in een varkensmodel om vasculaire transplantaten met een kleine diameter te testen

Leer functionele vaattransplantaten genereren en enten in muizen met PiPS-cellen en gedecellulariseerde aortascaffolds. Deze methode toont de haalbaarheid van weefselengineering voor cardiovasculaire toepassingen.

Generatie en enten van-Weefselmanipulatieproducten Schepen in een muismodel

Meer video's verkennen