High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen
March 3rd, 2015
Hier beschrijven we een celgebaseerde reportergen-test als waardevol hulpmiddel om chemische bibliotheken te screenen op verbindingen die post-transcriptionele controlemechanismen moduleren die worden uitgeoefend via 3’ UTR.
Dit experiment screent chemische bibliotheken op verbindingen die post-transcriptionele controlemechanismen moduleren via het drie-primaire niet-getransleerde gebied van transcripten. Identificeer eerst het drie-primaire niet-getransleerde gebied van interesse in het doelgen. Cloneer dit drie-primaire UTR in El luciferase controle reporter plasmide om El luciferase drie-primaire UTR chimere transcript te creëren.
Integreer vervolgens stabiel de twee plasmiden in een ziekterelevante cellijn. Zaai de cellen die het chimere transcript dragen in 96-well platen, behandel ze met een bibliotheek van verbindingen gedurende 24 uur en identificeer vervolgens de moleculen die de luciferase-activiteit beïnvloeden.
Kies de geselecteerde moleculen voor verdere validatiescreening, en behandel vervolgens zowel de controlecellen als de cellen die luciferase drie-primaire UTR chimere transcript dragen met een uitgekozen bibliotheeksubset. De resultaten zullen differentiëren of het effect van een verbinding wordt gemedieerd via het drie-primaire niet-getransleerde gebied of via andere vectorsequenties. In tegenstelling tot de meeste op reporter gebaseerde screeningsverhalen.
Assays die zich richten op transcriptieregulatie, deze rapportagecelgebaseerde assay richt zich op de identificatie van verbindingen die mRNA-transcriptniveaus moduleren via drie-primaire en vertaalde regio. Oogst de stabiel getransfecteerde neuroblastoomcellen door trypsine Aziatisch. Verdun de cellen tot een concentratie van twee keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter.
In RPMI met 10%FBS en 1%L-glutamine voor 27 platen. Bereid ten minste 250 milliliter celsuspensie voor, rekening houdend met vloeistofbehartiging, doorlopende dode volumes en herhaalde pipetteringsstappen. Giet vervolgens de celsuspensie in een steriele reservoir en plaats deze op het robotschrijftafel.
Laad negen gestreepte witte platte bodem 96-well platen en een doos met 200 microliter steriele pipette tips op het robotschrijftafel. Meng de celsuspensie en verdeel vervolgens 75 microliter cellen in elk putje van negen platen.
Dek de platen af en laat de cellen 30 minuten naar de bodem van het putje sedimenteren om randeffecten te minimaliseren. Plaats vervolgens alle negen platen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide en incubeer gedurende 24 uur. Procedeer op dezelfde manier met de resterende platen, negen per keer.
Ontdooi de verbindingsbibliotheekplaten op kamertemperatuur. Vul één trog met steriele PBS en een andere met 0,5%DMSO in PBS-oplossing en plaats ze op het robotschrijftafel. Voor elke bibliotheekplaat.
Bereid en label dienovereenkomstig. Eén verdunningsplaat. Vul nu elk putje van kolommen, twee tot 11 van de verdunningsplaten met 398 microliters steriele PBS.
Vul vervolgens kolommen één en 12 met 50 microliters 0,5%DMSO in steriele PBS. Laad vervolgens de twee verdunningsplaten. Twee bibliotheekplaten, twee dozen met 50 microliters steriele tips en zes celplaten op het robotschrijftafel.
Ontdek nu de celplaten, pipet twee microliters van de 10 millimolair stockoplossing van een van de twee bibliotheekplaten in de overeenkomstige verdunningsplaat en meng goed. Gebruik dezelfde set tips. Breng drie microliters van de 50 micromolair verdunning over in de drie gestreepte witte 96-well platen die de cellen bevatten.
Vervang de volledige set tips en herhaal celinductie voor de tweede bibliotheekplaat. Dek de culturen af en incubeer gedurende 24 uur. Herhaal vervolgens het verbindingsverdunnings- en celinductieproces voor de resterende bibliotheekplaten.
Breng het gereconstitueerde luciferasereagens van keuze in evenwicht op kamertemperatuur. Plaats de luciferase reservoir op het robotschrijftafel en giet reagens erin. Verwijder negen platen van geïnduceerde culturen uit de incubator.
Plaats ze op het robotschrijftafel, ontdek en breng in evenwicht op kamertemperatuur. Voeg vervolgens 50 microliters van het luciferasereagens per putje toe tussen de platen. Introduceer een vertraging gelijk aan de luminescentie leestijd van één plaat.
Na een incubatie van 30 minuten. Noteer eerst de streepjescode van de plaat om deze te koppelen aan het overeenkomstige databestand. Plaats vervolgens de eerste plaat in de luminometer en meet luminescentie.
Na een korte schudstap, herhaal de luminescentiemetingen voor alle platen van inducties. Verzamel vervolgens het resterende Luciferase reagens en bewaar het bij min 20 graden Celsius. Zodra de experimentele gegevens van de primaire screening zijn verwerkt, selecteer de hits om de verbindingsspecificiteit te bevestigen door een tegenscreeningscherry.
Kies de geselecteerde hits en maak een lay-out voor de nieuwe screeningplaat, inclusief posities voor controles. Maak vervolgens nieuwe HIIT-platen van de aliquots die in enkele 2D gestreepte buizen zijn opgeslagen. Volg hetzelfde protocol voor de screening.
Bereid 3 96-well platen van elke stabiele cellijn per hi-plaat voor. Behandel de cellen de volgende dag met bibliotheekverbindingen. Gebruik elke hi-plaat om drie platen van CHP 1 34 micken, drie-primaire UTR en drie platen met controlecellen te behandelen bij een werkconcentratie van twee micromolair gedurende 24 uur.
Meet luciferase-activiteit in alle CHP 1 34 platen, de drie-primaire niet-getransleerde en controlesets. Normaliseer zoals bij de gegevensanalyse in de primaire screening experimentele gegevens van behandelde putjes naar het gemiddelde van op plaat voertuig-behandelde controles. Bereken vervolgens het gemiddelde en de standaardafwijking over de replica's voor elke geteste verbinding.
De voudwisseling van luciferase-activiteit in CHP 1 34 McIn drie-primaire UTR versus CHP 1 34. Selecteer willekeurige volledige veranderingssnijpunten van groter dan 1,5 en significantie P-waarden van minder dan 0,01. Dit experiment screende een bibliotheek van 2000 verbindingen op mogelijke modulatoren van post-transcriptionele controlemechanismen die worden uitgeoefend via de drie-primaire UTR van de mic en oncogene. De resultaten van luciferase-signalen van een enkel uit 25 representatieve bibliotheekplaat worden weerg
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een celgebaseerde reportergenassay die is ontworpen om chemische bibliotheken te screenen op verbindingen die post-transcriptionele controlemechanieken moduleren via de 3’ niet-getranslateerde regio (UTR) van transcripten. De methodologie omvat het klonen van de 3’ UTR in een luciferase controlereporterplasmide en het integreren ervan in een relevante cellijn.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Genexpressie
- Farmacologie
Achtergrond
- Post-transcriptionele controlemechanieken spelen een cruciale rol in genregulatie.
- De 3’ UTR is een sleutelrego die de mRNA-stabiliteit en translatie beïnvloedt.
- Het screenen van chemische bibliotheken kan nieuwe verbindingen identificeren die deze mechanismen beïnvloeden.
- Reporterassays zijn waardevolle hulpmiddelen voor het bestuderen van genregulatie.
Doel van het onderzoek
- Om een robuuste assay te ontwikkelen voor het screenen van verbindingen die post-transcriptionele regulatie beïnvloeden.
- Om de 3’ UTR te gebruiken als een doelwit voor het moduleren van genexpressie.
- Om het begrip van chemische invloeden op genregulatie te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Identificatie van de 3’ UTR van belang in het doelwitgen.
- Klonen van de 3’ UTR in een luciferase controlereporterplasmide.
- Stabile integratie van de plasmiden in een ziekterelevante cellijn.
- Cellen zaaien in 96-well platen en behandelen met een bibliotheek van verbindingen.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van verbindingen die de luciferaseactiviteit significant beïnvloeden.
- Demonstratie van de effectiviteit van de assay bij het screenen van chemische bibliotheken.
- Inzichten in de modulatie van post-transcriptionele controlemechanieken.
- Mogelijke toepassingen in geneesmiddelontdekking en studies naar genregulatie.
Conclusies
- De ontwikkelde assay is een waardevol hulpmiddel voor het screenen van verbindingen.
- Het biedt inzichten in de rol van 3’ UTR in genregulatie.
- Deze aanpak kan de ontdekking van nieuwe therapeutische middelen vergemakkelijken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This assay addresses a critical gap in early drug discovery by enabling the identification of compounds that modulate gene expression through post-transcriptional mechanisms, a regulatory layer often overlooked in transcriptional-focused screens. By linking 3’ UTR activity to luciferase readouts in disease-relevant cells, it provides a mechanistic de-risking step for target validation, helping prioritize compounds with specific modes of action before downstream investment. The approach supports predictive confidence in lead identification by distinguishing UTR-mediated effects from promoter-driven or cytotoxic artifacts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses involving post-transcriptional regulation by linking 3’ UTR activity to compound treatment.
- Operational Value: Uses a luciferase reporter system to quantitatively assess mRNA fate modulation via the 3’ UTR in a stable, disease-relevant cellular context.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by isolating compounds that specifically affect mRNA stability or translation through defined UTR sequences.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces normalized luminescence readouts that enable dose-dependent assessment of compound effects on 3’ UTR-mediated gene regulation.
- Operational Value: Employs a counter-screening strategy to discriminate true 3’ UTR modulators from compounds acting via promoter elements or general cytotoxicity.
- Scientific Value: Generates fold-change and statistical thresholds (e.g., >1.5 fold change, p<0.01) to define hit criteria for follow-up validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant cell lines (e.g., neuroblastoma) to ensure biological context aligns with pathophysiological mechanisms of interest.
- Operational Value: Requires stable integration of the 3’ UTR-luciferase construct, enabling consistent, long-term assay performance across screening campaigns.
- Scientific Value: Facilitates translational continuity by validating hits against endogenous target expression, connecting reporter activity to native gene regulation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation and lead identification by providing mechanistic insight into post-transcriptional gene regulation before significant investment in lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of UTR-dependent gene regulation by measuring luciferase activity as a proxy for mRNA stability and translation.
- Screening: Enables high-throughput evaluation of chemical libraries with built-in counterscreening to reduce false positives from non-specific effects.
- Analytics: Delivers quantitative, normalized luminescence data with statistical cutoffs to prioritize compounds for secondary validation.
- Translational Research: Connects reporter-based findings to endogenous gene expression, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular platform where different 3’ UTRs can be swapped to screen for regulators of multiple disease-relevant genes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by confirming compound effects are mediated through the 3’ UTR rather than transcriptional or cytotoxic mechanisms.
- Operational Value: Promotes assay reproducibility through stable cell line integration and standardized liquid handling protocols for compound delivery and detection.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by filtering out promiscuous or toxic compounds early, reducing failure rates in later-stage preclinical studies.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of hits based on mechanism-specific activity, supporting better go/no-go decisions in target-focused programs.
Implementation Considerations
- Requires molecular biology expertise to clone and validate the 3’ UTR-luciferase reporter construct.
- Depends on access to high-throughput liquid handling robots and luminometers for automated compound delivery and detection.
- Necessitates cross-team standardization between assay developers, screening technologists, and data analysts to ensure consistent hit calling.
- Involves adaptation considerations when transferring the assay to different cell lines or UTR sequences, including validation of stable integration and signal window.
- Includes practical limitations such as the need to distinguish true UTR effects from artifacts via counter-screening in control cells lacking the 3’ UTR insert.
