Name: Analyse van autofagie in Penicillium chrysogenum Door gebruikmaken van uithongering pads in combinatie met fluorescentiemicroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Leer autofagie analyseren in Penicillium chrysogenum met uithongeringspads en fluorescentiemicroscopie. Deze methode volgt fluorescente markers naar vacuolen en helpt bij het identificeren van verbindingen die het autofagieproces moduleren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

CQS ontvangt een beurs van de LOEWE Excellence Cluster voor Integrative Fungal Research (IPF). De auteur wil Ida J. van der Klei bedanken voor de P. chrysogenum stammen die in dit werk zijn gebruikt en Andreas S. Reichert voor de gift van rapamycine.

1. Bereiding van P. chrysogenum voor de Verhongering Experimenten <ol><li> Als de P. chrysogenum stam van belang wordt van rijst (groene rijst &quot;) gehouden, plaats 2-3 rijstkorrels bedekt met sporulerende mycelium in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Vul het met 500 ul YGG (10 g / l KCl, 20 g / l glucose, 10 g / l giststikstofbase, 5 g / l K 2 HPO 4, 20 g / l gistextract). <ol><li> Vortex de buis gedurende 30 seconden zodat sporen efficiënt losmaken van de rijst. </li><li> Incubeer de buis gedurende 1 dag bij kamertemperatuur (bijvoorbeeld tussen 20 en 25 ° C). </li><li> Bereid een 1/50 verdunning van deze sporesuspensie in steriel leidingwater, meng goed. </li></ol></li><li> Als de P. chrysogenum stam van belang wordt op een agarplaat (bijv YGG agarplaat) gehouden, maken kleine stukjes van het mycelium in een 1,5 ml microcentrifugebuis met 400 ul steriel kraanwater en ongeveer 100 mg glass kralen met behulp van een steriele tandenstoker of pipettip. <ol><li> Vortex de buis gedurende 2 minuten, zodat het mycelium gefragmenteerd. Met de inhoud van de buis onmiddellijk. </li></ol></li></ol> 2. voorbereidende stappen voor de teelt van P. chrysogenum op Verhongering Pads <ol><li> Schakelen op een verwarmingsplaat en zet deze op ongeveer 60 ° C. </li><li> Los 2 g agarose in 100 ml leidingwater door koken van de oplossing in een magnetron. Zorg ervoor dat deze oplossing is volledig helder na verhitting. Zo niet, koken totdat de agarose volledig is opgelost. Laat de agarose oplossing afkoelen tot ongeveer 60 ° C vóór gebruik. </li><li> Vul 1,5 ml microcentrifuge buizen (2-4, afhankelijk van het aantal monsters) met 400 pl steriel leidingwater per (geen additionele verbindingen toegevoegd) of 400 x gl (toevoeging van x gl van verbinding oplossing in stap 2.5) en plaats ze op de verwarmingsplaat gedurende tenminste 1 minuut zodat het wateh binnenkant wordt warm. </li><li> Plaats objectglaasjes die een centrale holte bevat op de verwarmingsplaat gedurende tenminste 1 minuut. </li><li> Voeg 400 ul 2% agarose aan de oplossing in 1,5 ml microcentrifuge buizen en vortex kort. Na deze stap, indien gewenst, voeg additionele verbindingen (dwz 1 uM rapamycine). Wanneer dit gebeurt, vortex kort na elke bijkomende stof wordt gepipetteerd op de buis. Plaats de buizen weer op de verwarmings- tafel om voortijdige stolling te voorkomen. OPMERKING: Het totale volume in de microcentrifugebuis moet 800 pi. </li></ol> 3. Voorbereiding van Microscope Slides bevattende Verhongering Pads <ol><li> Pipetteer 140 ul van de agarose oplossing in de holte van het microscoopglaasje (die nog steeds op de verwarmingsplaat). Probeer te voorkomen dat bellen indien mogelijk. </li><li> Plaats onmiddellijk een dekglas op de agarose-oplossing. Opmerking: Dit resulteert in een plat vlak. </li><li> Zet het microreikwijdte dia op het lab bank voor ongeveer 4 minuten om de agarose pad te stollen. </li><li> Verwijder voorzichtig het dekglaasje uit de agarose pad door af te schuiven met de hulp van een duim of wijsvinger (draag handschoenen om besmetting te voorkomen!). </li><li> Plaats de microscoop dia met de pad in een natte kamer om uitdroging te voorkomen. Aanbeveling: Gebruik een lege tip doos die nog steeds heeft het inzetstuk voor het vasthouden van de pipet tips. Voeg steriel water om de doos, zodat de bodem bedekt is. Plaats de microscoop dia&#39;s op te voeren en sluit de doos. </li></ol> 4. inenten van de Verhongering Pads met P. chrysogenum en Incubation <ol><li> Pipetteer 5 ul van de verdunning 1/50 spore (indien de kweken werden gekweekt op rijst) of 5 pl van de verdunde oplossing die mycelium fragmenten (indien de kweken werden gekweekt op een agar plaat) op het midden van de honger pad. </li><li> Sluit de natte kamer en wikkel het in een plastic zak (dit dient alsextra bescherming tegen uitdrogen van de hongerdood pads). Wees voorzichtig niet om de doos te bewegen te veel, want anders wordt de inenting druppels zal worden verstoord. </li><li> Bewaar het verpakte doos bij kamertemperatuur gedurende ten minste 20 uur voor analyse van de monsters. </li></ol> 5. Microscopische analyse van de monsters <ol><li> Na 20 uur incubatie van de monsters zijn klaar voor microscopische analyse; zet de microscoop dia op droge tissue papier (de onderkant heeft de neiging om nat is geworden). </li><li> Pipetteer een kleine hoeveelheid water (ongeveer 50 ui) op ​​de uithongering pad. Zet een dekglaasje op het pad en knijp het overtollige water. Verwijder het overtollige water met een tissue. </li><li> Zet de microscoop dia op de observatie tafel van de fluorescentie microscoop. Voor een overzicht van mycelium groei te krijgen, gebruik dan een 20X objectief. Gebruik 63x of 100x voor het bestuderen van de lokalisatie van GFP in de hyfen. Om een ​​geleidelijke uitdroging voorkomen dat het monster niet analyseren monsterslanger dan 15 minuten voordat u ze weer in de natte kamer. </li><li> Herhaal 5.3 op regelmatige tijdstippen (bijvoorbeeld na 40 uur en 60 uur van groei). OPMERKING: Het monster kan worden teruggeplaatst in de natte kamer. Het is niet noodzakelijk om het dekglaasje verwijderd omdat het geen invloed myceliumgroei. </li></ol>

<ol><li>Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+quality+control%3A+an+integrated+network+of+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).</li>
<li>Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Autophagy in filamentous fungi.</a> Fungal Genet. Biol. 46 (1), 1-8 (2009).</li>
<li>Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podospora+anserina%3A+a+model+organism+to+study+mechanisms+of+healthy+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing.</a> Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).</li>
<li>Pinan-Lucarré, B., Iraqui, I., Clavé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podospora+anserina+target+of+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">Podospora anserina target of rapamycin.</a> Curr. Genet. 50 (1), 23-31 (2006).</li>
<li>Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+ATG8+homologue+Aoatg8+and+role+of+autophagy+in+differentiation+and+germination+in+Aspergillus+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae.</a> Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).</li>
<li>Pinan-Lucarré, B., Balguerie, A., Clavé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+cell+death+in+Podospora+autophagy+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants.</a> Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).</li>
<li>Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+fungal+cell+death+is+necessary+for+infection+by+the+rice+blast+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus.</a> Science. 312 (5773), 580-583 (2006).</li>
<li>Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+deficiency+promotes+beta-lactam+production+in+Penicillium+chrysogenum%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).</li>
<li>Meijer, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomes+are+required+for+efficient+penicillin+biosynthesis+in+Penicillium+chrysogenum%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).</li>
<li>Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding%2C+improving+and+using+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Understanding, improving and using green fluorescent proteins.</a> Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).</li>
<li>Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+regulation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">mTOR regulation of autophagy.</a> FEBS Lett. 584 (7), 1287-1295 (2010).</li>
<li>Hickey, P. C., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+living+cells+of+Aspergillus+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Imaging living cells of Aspergillus in vitro.</a> Med. Mycol. 47, Suppl 1. S110-S119 (2009).</li>
</ol>

De auteur heeft niets te onthullen.

De hier gepresenteerde methode maakt het handig en reproduceerbare studie van autofagie in P. chrysogenum. Zo kan het worden gebruikt voor het screenen van de effectiviteit van verschillende verbindingen of zij kunnen moduleren de autophagy respons van deze schimmel of niet. De resultaten met rapamycine bewijzen dat remming van TOR signaal leidt tot een uitgesproken inductie van autofagie in P. chrysogenum die is ook aangetoond voor andere organismen 11. Het is m...

Filamenteuze schimmels zijn uitstekend modelsysteem voor het bestuderen van ontwikkelingsprocessen. Ze bieden verschillende experimentele voordelen zoals goedkope teelt, de hoge aantallen van de nakomelingen en genetische toegankelijkheid. Het laatste punt is van bijzonder belang voor de bouw van transformanten die het mogelijk maken het onderzoek naar het belang van zo-ver uncharacterized genen voor verschillende cellulaire mechanismen. Schimmels zijn voor het ophelderen van verschillende elementen en mechanismen van cellulaire kwaliteitscontrole trajecten protease activiteit voor de afbraak van afwijkende eiwitten, mitochondriale dynamiek lid voor het handhaven mitochondriale integriteit en autophagy voor het verwijderen van overtollige en / of disfunctionele celbestanddelen en onderhouden levensvatbaarheid van de cellen in tijden van hongersnood 1,2,3. Er zijn verschillende experimentele technieken beschikbaar voor de studie van autofagie in draadschimmels 2: (i) onderzoek vacuolen if zij dichte autofagocytische lichamen vertonen wanneer proteasen worden geremd door transmissie elektronenmicroscopie 4, (ii) visualisatie van autofagosomen door toezicht GFP-Atg8 foci via fluorescentiemicroscopie 5,6 en (iii) detectie van aangezuurde autophagosomal structuren met de fluorescerende kleurstof monodansylcadaverine 7. Hier wordt een nieuwe kweekmethode Penicillium chrysogenum voor autophagy studies gepresenteerd. Het belangrijkste element is de &#39;honger pad&#39; die gewoon bestaat uit 1% agarose opgelost in gesteriliseerd kraanwater. Extra verbindingen (bijv stressoren, scavengers, autophagy modulatoren) worden aan de pad toegevoegd zolang zij niet automatisch fluorescentie geven. Het pad ligt in de microscoop dia&#39;s die een ondiepe centrale holte bevatten. Deze pad in geënt ofwel met een sporesuspensie of met kleine mycelium fragmenten. Dit laatste is geboden als de stam van belang niet sporulate efficiënt (bijv Δ atg1 stammen 8). Monsters worden geplaatst in vochtige kamers (deze kunnen gemakkelijk worden geconstrueerd met behulp lege pipetpunt dozen) verdroging voorkomen dat het monster en geïncubeerd bij kamertemperatuur. P. chrysogenum kan groeien enkele dagen onder deze omstandigheden. Autofagie kan microscopisch worden waargenomen door de vacuole uitbreiding, die een positieve marker voor schimmel autofagie. In deze bijdrage, een P. chrysogenum stam (Wisconsin 54-1255) gebruikt die groen fluorescent eiwit dat is gericht naar peroxisomen door zijn C-terminale &#39;SKL-sequentie 9 vormt. Daarom is het mogelijk om de afbraak van peroxisomen controleren. Het is mogelijk om ook labelen andere compartimenten van de cel (bijvoorbeeld mitochondria) waarbij geschikte lokalisatie signalen en hun degradatie analyseren. Hoewel gegevens van P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) wordt hier voorgesteld, is het zeker mogelijkde &quot;honger pad methode ook voor andere filamenteuze schimmels (bijvoorbeeld Neurospora crassa, Sordaria macrospora, Aspergillus species, etc.).

<table><tbody><tr><td>Microscope slides with central cavity</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>H884.1</td><td>Deze kunnen na reiniging meerdere keren worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Glass beads</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>A553.1</td><td>Diameter: 0,25 - 0,50 mm</td></tr></tbody></table>

analyse van autofagie in<em&gt; penicillium chrysogenum</em&gt; door gebruikmaken van uithongering pads in combinatie met fluorescentiemicroscopie

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

De studie van cellulaire kwaliteitscontrolesystemen is uitgegroeid tot een zeer dynamisch en relevant veld van hedendaags onderzoek. Het is duidelijk geworden dat cellen over verschillende verdedigingslijnen beschikken tegen schade aan biologisch relevante moleculen zoals nucleïnezuren, lipiden en eiwitten. Naast orgaandynamica (fusie/fissie/beweeglijkheid/erfelijkheid) en nauwkeurig gecontroleerde protease-activiteit, heeft de afbraak van overtollige, beschadigde of aangetaste organellen door autofagie (cellulair ‘zelfetens’) veel aandacht gekregen van de wetenschappelijke gemeenschap. De regulatie van autofagie is behoorlijk complex en hangt af van genetische en omgevingsfactoren, waarvan er tot dusver vele niet zijn opgehelderd. Hier wordt een nieuwe methode gepresenteerd die het gemakkelijk bestuderen van autofagie in de filamenteuze schimmel Penicillium chrysogenum mogelijk maakt. Het is gebaseerd op de groei van de schimmel op zogenaamde ‘hongerpaden’ voor het op een reproduceerbare manier stimuleren van autofagie. monsters worden direct onderzocht door middel van microscopie en geëvalueerd op autofagie-inductie / voortgang. Het hier gepresenteerde protocol is niet beperkt tot gebruik met P. chrysogenum en kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik in andere filamenteuze schimmels.

Om het nut van de bovenstaande protocol peroxisoomafbraak beschreven in P. tonen chrysogenum stam Ws54-1255 (GFP-SKL) werd geanalyseerd. In deze stam GFP-SKL wordt meestal geïmporteerd in peroxisomen 9. Dit resulteert in het verschijnen van meerdere bolvormen wanneer het monster wordt geanalyseerd door fluorescentiemicroscopie. Als autofagie optreedt, vacuolen vergroten. GFP-SKL wordt in vacuolen opgenomen door autofagie (pexophagy). Vanwege het feit dat GFP is tegen afbraak door proteasen v...

Een handige en krachtige methode voor het bestuderen van autofagie in Penicillium chrysogenum door het gebruik van hongerpaden (mengsels van agarose en leidingwater in een microscoopglas met een centrale holte) wordt hier gepresenteerd.

Analyse van autofagie in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Door gebruikmaken van uithongering pads in combinatie met fluorescentiemicroscopie

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Het doel van deze procedure is om autofagie op te wekken en te observeren in een filamenteuze schimmel. Dit wordt bereikt door eerst kleine volumes van een voedingsmedium te inoculeren met sporen of kleine stukjes mycelium. In de tweede stap worden uithongeringskussentjes voorbereid in de holtes van glazen microscopieplaatjes, waarna het inoculaat op de kussentjes wordt overgedragen.In de laatste stap worden de uithongeringspads geïncubeerd in een vochtige kamer om autofagie te induceren. Uiteindelijk kan de autofagie worden gevolgd door met behulp van fluorescentiemicroscopie de translocatie van fluorescerende marker-eiwitten van belang naar de vacuolen te monitoren. Deze methode kan helpen bij het bestuderen van kernvraagstukken binnen het veld van de celbiologie, zoals de identificatie van nieuwe verbindingen die het autofagieproces moduleren.Ter voorbereiding op een uithongeringsexperiment: indien de gewenste P cresa-stam op groene rijst wordt gehouden, plaats dan eerst twee tot drie rijstkorrels bedekt met witte mycelia in een 1,5 µL centrifugebuisje en vul het buisje met 500 µL gistextract-glucose-groeimedium of GG-medium. Vortex vervolgens het buisje gedurende 30 seconden zodat de sporen loslaten van de rijst en incubeer het buisje één dag op kamertemperatuur. Verdun de volgende dag de sporenсусpensie tot een concentratie van 1:50 in steriel kraanwater en meng dit goed; indien P cresa op agar wordt gehouden.Gebruik een pipetpunt om kleine stukjes van het mycelium over te brengen naar een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter met 400 microliters steriel kraanwater en ongeveer 100 milligram glazen kralen. Vortex vervolgens de buis gedurende twee minuten zodat het mycelium wordt gefragmenteerd. Om het PCE-gen op een starvation pad te kweken, wordt eerst de warmteplaat opgewarmd tot ongeveer 60 graden Celsius.Los vervolgens twee gram agar op in 100 milliliters kraanwater in een magnetron tot de resulterende oplossing volledig helder is, terwijl de agar afkoelt tot ongeveer 60 °C. Vul één 1,5 milliliter microcentrifugeebuisje per monster met 400 µL steriel kraanwater of verbinding-oplossing. Warm vervolgens de buisjes en microscopische glaasjes gedurende ten minste 60 seconden op op de warmteplaat.Breng 400 µL aros van 60 °C over naar alle buisjes, zodat het totale volume in elk buisje 800 µL bedraagt, en vortex de buisjes kort; plaats de buisjes vervolgens terug op de warmteplaat om voortijdige stolling te voorkomen. Pipetteer nu 140 µL van de betreffende aros-oplossing in de holte van elk microscoopglasje. Dek de aros onmiddellijk af met dekglasjes, waarbij u erop let dat er geen luchtbellen ontstaan, en laat de glasjes vervolgens ongeveer vier minuten rusten.Wanneer de aros-pads bij kamertemperatuur gestold zijn, schuif dan de dekglasplaatjes voorzichtig weg met een duim of wijsvinger en plaats de microscopiepreparaten en pads in een bevochtigingskamer. Pipetteer vervolgens vijf microliters van de eerder voorbereide P er genum op het midden van de uithongeringspad en wikkel de bevochtigingskamer in een plastic zak voor extra bescherming tegen uitdroging, waarbij u er nauwkeurig op toeziet dat de doos niet te veel wordt bewogen of de culturen worden verstoord. Bewaar de inoculaten vervolgens gedurende ten minste 20 uur bij kamertemperatuur voordat de monsters worden geanalyseerd.Verplaats de objectglaasjes de volgende dag naar droog weefselpapier en breng vervolgens 50 µL water aan op elk uithongeringsveld. Gebruik een dekglas om het overtollige water uit te drukken en verwijder dit met schoon weefselpapier. Gebruik vervolgens voor elk objectglas een 20 x objectief om een overzicht van de myceliegroei vast te leggen.Om de lokalisatie van het GFP in de Hy-Fi te beoordelen, worden de beelden geopend met het 63 x of 100 x objectief. Plaats de slides na elke observatie terug in de vochtkamer tot het volgende experimentele tijdstip.Op deze afbeeldingen werd de G-F-P-S-K-L-P Creo Genum-stam gebruikt om de degradatie van peroxisomen te beoordelen na 20 uur incubatie. Er werd geen GFP waargenomen in de vacuolen, noch waren deze organellen vergroot. Echter, na 40 uur groei konden GFP-gelabelde VACUOLEN worden gevisualiseerd in enkele van de hyfen, wat wijst op de activering van autofagie, met verdere waarneming van GFP-fluorescentie en vergrote vacuolen na 60 uur.In dit experiment werd een delta 80 G één-mutant van p caressa Genum gebruikt als negatieve controle. Let op het uitblijven van vacuolevergroting en GFP, zelfs na 60 uur groei; als positieve controle werd het autofagiestimulerende medicijn rapamycine gebruikt, zoals waargenomen bij de onbehandelde G-F-P-S-K-L-stam. GFP-gelabelde vacuolen werden zichtbaar na 40 uur groei, waarbij de Hy-Fi tegen 60 uur volledig gevuld was met enorme GFP-bevattende vacuolen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe autophagy in mentis-schimmels kan worden geanalyseerd.

analysis-autophagy-penicillium-chrysogenum-using-starvation-pads

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een robuuste benadering van de levering van organellen monitor aan op de zure lumen van de gist vacuole voor afbraak en recycling wordt beschreven. De methode is gebaseerd op de specifieke etikettering van target organellen met een genetisch gecodeerd dual-emissie fluorescentie pH-biosensor, en visualisatie van individuele cellen met behulp van fluorescentie microscopie.

Een fluorescentie microscopie Assay voor de bewaking Mitophagy in de Gist Saccharomyces cerevisiae

Autofagie is een alomtegenwoordige proces waarmee cellen om eiwitten en organellen degraderen en te recyclen. We passen geavanceerde fluorescentie microscopie te visualiseren en kwantificeren van de kleine, maar essentiële, fysieke veranderingen geassocieerd met de inductie van autofagie, waaronder de vorming en verspreiding van autofagosomen en lysosomen, en hun fusie in autolysosomes.

Kwantitatieve analyse van Autophagy met Advanced 3D Fluorescentiemicroscopie

Time-lapse microscopie van fluorescent gelabelde autofagie markers zorgt voor de opvolging van de dynamische autofagie respons met een hoge temporele resolutie. Met specifieke autofagie en organel markers in een combinatie van 3 verschillende kleuren, kunnen we de bijdrage van een eiwit autophagosome vorming in een robuuste ruimtelijke en temporele context volgen.

Live cell imaging van Vroege Autophagy Evenementen: Omegasomes en Beyond

Experimentele sepsis kan worden geïnduceerd in muizen met de blindedarm ligatie en punctie (CLP) methode. Voor deze protocollen autofagie in vivo beoordelen in het kader van CLP-geïnduceerde sepsis worden hier gepresenteerd: Een protocol voor het gebruik autofagie (GFP)-LC3 muizen, en een protocol voor autophagosome vorming van elektronenmicroscopie.

Cecal ligatie en punctie-geïnduceerde Sepsis als een model om Autophagy studie bij muizen

Pathogeen verspreiding tegen te gaan, gastheercellen reorganiseren hun cytoskelet om bacteriën te grendelen en veroorzaken autofagie. Met behulp van Shigella infectie van weefselkweek cellen, gastheer en pathogeen determinanten ten grondslag liggen aan dit proces worden geïdentificeerd en gekarakteriseerd. Met behulp van zebravis modellen van Shigella-infectie, de rol van de ontdekte moleculen en mechanismen worden onderzocht in vivo.

Gebruik van<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Naar Autophagy-cytoskelet interacties te bestuderen

Hier, multispectrale beeldvormende flowcytometrie met een analytische functie die heldere detailafbeeldingen van 3 autofagie markers vergelijkt en kwantificeert hun co-lokalisatie, samen met LC3 spot counting, werd gebruikt om autofagie op objectieve, kwantitatieve en statistisch robuuste wijze te meten.

Autofagische Flux beoordelen door LC3-, P62- en LAMP1-co-lokalisatie met behulp van Multispectrale Imaging Flow Cytometry

Hebben we een eenvoudige en flexibele workflow om kwantitatieve gegevens extract van fluorescentie imaging-gebaseerde cel biologische studies van aggregatie van eiwitten en autophagic flux in het centrale zenuwstelsel van Drosophila modellen van neurodegeneratie.

Kwantitatieve celbiologie van neurodegeneratie in Drosophila door onbevooroordeelde analyse van Fluorescently Tagged eiwitten met behulp van ImageJ

Dit papier is een protocol voor de voorbereiding van een co-cultuur van crypto Kokken cellen en eencellige die wordt bestudeerd met behulp van stilstaand, fluorescerende beelden en hoge-resolutie transmissie elektronen microscoop beelden. Hier wordt geïllustreerd hoe kwantitatieve gegevens dergelijke kwalitatieve informatie kunnen aanvullen.

Aanvullend gebruik van microscopische technieken en fluorescentie lezen in het bestuderen van interacties Cryptococcus-amoeba

Het huidige protocol beschrijft de inductie van autofagie in het Drosophila melanogaster larvaal vetlichaam via nutriëntendepletie en analyseert veranderingen in autofagie met behulp van transgene vliegenstammen.

Analyse van door uithongering geïnduceerde autofagie in het Drosophila melanogaster larvale vetlichaam

Het doel van dit protocol is om autofagische niveaus in alvleesklierkanker en pancreasacinaire cellen te bepalen door middel van LC3-immunofluorescentie en LC3-puntkwantificering.

Evaluatie van autofagieniveaus in twee verschillende pancreascelmodellen met behulp van LC3-immunofluorescentie

Hier presenteren we een protocol voor geoptimaliseerde on-section correlatieve licht-elektronenmicroscopie op basis van endogene, fluorescerende labeling als een hulpmiddel om de lokalisatie van zeldzame eiwitten in relatie tot cellulaire ultrastructuur te onderzoeken. De kracht van deze aanpak wordt aangetoond door ultrastructurele lokalisatie van endogene LC3 in uitgehongerde cellen zonder behandeling met Bafilomycine.

Ultrastructurele lokalisatie van endogene LC3 door middel van on-section correlatieve licht-elektronenmicroscopie

Leer autofagie analyseren in Penicillium chrysogenum met uithongeringspads en fluorescentiemicroscopie. Deze methode volgt fluorescente markers naar vacuolen en helpt bij het identificeren van verbindingen die het autofagieproces moduleren.

Analyse van autofagie in Penicillium chrysogenum Door gebruikmaken van uithongering pads in combinatie met fluorescentiemicroscopie (Video) | JoVE Journal

Analyse van autofagie in

Meer video's verkennen