Analyse van autofagie in

Het doel van deze procedure is om autofagie op te wekken en te observeren in een filamenteuze schimmel. Dit wordt bereikt door eerst kleine volumes van een voedingsmedium te inoculeren met sporen of kleine stukjes mycelium. In de tweede stap worden uithongeringskussentjes voorbereid in de holtes van glazen microscopieplaatjes, waarna het inoculaat op de kussentjes wordt overgedragen.

In de laatste stap worden de uithongeringspads geïncubeerd in een vochtige kamer om autofagie te induceren. Uiteindelijk kan de autofagie worden gevolgd door met behulp van fluorescentiemicroscopie de translocatie van fluorescerende marker-eiwitten van belang naar de vacuolen te monitoren. Deze methode kan helpen bij het bestuderen van kernvraagstukken binnen het veld van de celbiologie, zoals de identificatie van nieuwe verbindingen die het autofagieproces moduleren.

Ter voorbereiding op een uithongeringsexperiment: indien de gewenste P cresa-stam op groene rijst wordt gehouden, plaats dan eerst twee tot drie rijstkorrels bedekt met witte mycelia in een 1,5 µL centrifugebuisje en vul het buisje met 500 µL gistextract-glucose-groeimedium of GG-medium. Vortex vervolgens het buisje gedurende 30 seconden zodat de sporen loslaten van de rijst en incubeer het buisje één dag op kamertemperatuur. Verdun de volgende dag de sporenсусpensie tot een concentratie van 1:50 in steriel kraanwater en meng dit goed; indien P cresa op agar wordt gehouden.

Gebruik een pipetpunt om kleine stukjes van het mycelium over te brengen naar een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter met 400 microliters steriel kraanwater en ongeveer 100 milligram glazen kralen. Vortex vervolgens de buis gedurende twee minuten zodat het mycelium wordt gefragmenteerd. Om het PCE-gen op een starvation pad te kweken, wordt eerst de warmteplaat opgewarmd tot ongeveer 60 graden Celsius.

Los vervolgens twee gram agar op in 100 milliliters kraanwater in een magnetron tot de resulterende oplossing volledig helder is, terwijl de agar afkoelt tot ongeveer 60 °C. Vul één 1,5 milliliter microcentrifugeebuisje per monster met 400 µL steriel kraanwater of verbinding-oplossing. Warm vervolgens de buisjes en microscopische glaasjes gedurende ten minste 60 seconden op op de warmteplaat.

Breng 400 µL aros van 60 °C over naar alle buisjes, zodat het totale volume in elk buisje 800 µL bedraagt, en vortex de buisjes kort; plaats de buisjes vervolgens terug op de warmteplaat om voortijdige stolling te voorkomen. Pipetteer nu 140 µL van de betreffende aros-oplossing in de holte van elk microscoopglasje. Dek de aros onmiddellijk af met dekglasjes, waarbij u erop let dat er geen luchtbellen ontstaan, en laat de glasjes vervolgens ongeveer vier minuten rusten.

Wanneer de aros-pads bij kamertemperatuur gestold zijn, schuif dan de dekglasplaatjes voorzichtig weg met een duim of wijsvinger en plaats de microscopiepreparaten en pads in een bevochtigingskamer. Pipetteer vervolgens vijf microliters van de eerder voorbereide P er genum op het midden van de uithongeringspad en wikkel de bevochtigingskamer in een plastic zak voor extra bescherming tegen uitdroging, waarbij u er nauwkeurig op toeziet dat de doos niet te veel wordt bewogen of de culturen worden verstoord. Bewaar de inoculaten vervolgens gedurende ten minste 20 uur bij kamertemperatuur voordat de monsters worden geanalyseerd.

Verplaats de objectglaasjes de volgende dag naar droog weefselpapier en breng vervolgens 50 µL water aan op elk uithongeringsveld. Gebruik een dekglas om het overtollige water uit te drukken en verwijder dit met schoon weefselpapier. Gebruik vervolgens voor elk objectglas een 20 x objectief om een overzicht van de myceliegroei vast te leggen.

Om de lokalisatie van het GFP in de Hy-Fi te beoordelen, worden de beelden geopend met het 63 x of 100 x objectief. Plaats de slides na elke observatie terug in de vochtkamer tot het volgende experimentele tijdstip.

Op deze afbeeldingen werd de G-F-P-S-K-L-P Creo Genum-stam gebruikt om de degradatie van peroxisomen te beoordelen na 20 uur incubatie. Er werd geen GFP waargenomen in de vacuolen, noch waren deze organellen vergroot. Echter, na 40 uur groei konden GFP-gelabelde VACUOLEN worden gevisualiseerd in enkele van de hyfen, wat wijst op de activering van autofagie, met verdere waarneming van GFP-fluorescentie en vergrote vacuolen na 60 uur.

In dit experiment werd een delta 80 G één-mutant van p caressa Genum gebruikt als negatieve controle. Let op het uitblijven van vacuolevergroting en GFP, zelfs na 60 uur groei; als positieve controle werd het autofagiestimulerende medicijn rapamycine gebruikt, zoals waargenomen bij de onbehandelde G-F-P-S-K-L-stam. GFP-gelabelde vacuolen werden zichtbaar na 40 uur groei, waarbij de Hy-Fi tegen 60 uur volledig gevuld was met enorme GFP-bevattende vacuolen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe autophagy in mentis-schimmels kan worden geanalyseerd.